この作品は、LPにウェルカムトラスト助成金によって支えられて

1。機器と材料<ol><li>これらの実験は、刺激、刺激分離ユニット、二つの微小電極増幅器、データ収集システムおよびコレクションのソフトウェアを備えたコンピュータで構成される標準的な電気生理学のセットアップを使用してください。追加の機器は、ファラデーケージ、ブームスタンドに実体顕微鏡、除振テーブル、光源、および記録のプラットフォームが含まれています。 </li><li>五マイクロマニピュレータが使用されます。他の3つのマイクロマニピュレータは2つだけ刺激電極と接地電極を配置するグロスコントロールを必要としながら二つのマイクロマニピュレーターは、記録電極を位置決めするための細かいコントロールを必要とする。 DLMの記録電極のためのマニピュレータは、準備の末尾に置かれます（実験者の左）とTTM記録電極のためのマニピュレータは、準備の実験と側面（やや実験者の左側にある）の間に配置されます。シミュレーションの電極を保持する2つのマイクロマニピュレーターは、準備の頭部（実験者の右側）に配置されます。接地電極用マイクロマニピュレータは、準備の遠い側に配置されています</li><li> MΩ40から60の抵抗とガラスの記録電極を引いて、ワックスでサポートされている皿に平らに保存。刺激には、2つの電解（NaOH）をシャープにタングステン電極が使用されます。タングステン線、またはサード電解作製電極は接地として使用されます。刺激と接地電極が準備され、マイクロマニピュレータに取り付けられ、実験セッションの開始前とセッションの期間中に交換する必要はない。 </li></ol> 2。 D.の準備キイロ <ol><li>お使いの機器が設定されたら、それはハエを準備する時間です。その上に氷を冷却することにより、またはCO 2を使用して、ハエを麻酔。 CO 2が使用されている場合には、ガスの影響のための十分な時間が（20分程度）の実験を開始する前に脱ぎ履きすることができます。 </li><li>約45 °の角度で傾斜ソフトワックスのプラットフォームを含む皿に自分の足でゆっくりとハエを転送するために鉗子を使用してください。次の4つのステップは、（ただし、これらに近い）の録音機器から離れて解剖顕微鏡下で行われます。 </li><li>次のステップは、ワックスでハエを確保することです。オリエントは、斜面上で、その前方に面した上にして、腹側を下に飛ぶ。細かいピンセットを使って、ペアで、足を外側に拡張し、ワックスにそれらを押してください。 </li><li>背縦走筋、またはDLM、およびtergotrochanteral筋肉、またはTTM：から記録される筋肉の位置を把握しておきましょう。 DLMSの表皮下の結合部位は、胸部正中線と前背側（または剛毛）毛の間の領域に対応しています。 TTMの付着部位は上記、鼻翼が剛毛後部と前部の背側に位置しています。ワックスにして、翼がDLMまたはTTM繊維へのアクセスを妨害しないことを確認して外側の翼を持ち、&quot;接着剤&quot;。 </li><li>鉗子の罰金ペアを使用して、外側に慎重に口吻を引いて、そしてワックスにそれを浸漬することによってそれを固定します。これは、口吻が柔らかく、簡単にヘッドの他の部分から切り離されているので、いくつかの練習を必要とする重要なステップです。その場合、フライを破棄して最初からやり直す。目を通して刺激電極を挿入するときにこの方法で頭を保護するために障害が問題につながります。 </li></ol> 3。電極を配置<ol><li>フライがワックスに固定されると、ファラデーケージ内部に配置されている実体顕微鏡の下に接続されたフライで皿を転送する。オリエントは、実験者の右にハエの頭で横飛び。 </li><li>次のステップは、電極を挿入することです。地面と刺激電極を顕微鏡で見ることなく挿入することができます。良い記録が正確な串刺しの刑に依存している、それはマニピュレーターを扱う練習する良いアイデアですので。それらの適切な配置とそれに続くレコーディングを容易にするためにマイクロマニピュレータの助けを借りて、挿入部位の近くに電極をもたらす。 </li><li>マイクロマニピュレータの調整ホイールを使って腹部の後端に接地電極を下ろします。脳内で鋭利なタングステン刺激電極を配置するには、それだけでハエの目の一つに触れるように一方の電極の先端の位置をマイクロマニピュレーターを使用してください。両電極は、単にそれぞれの目の外側に触れているので、他のと同じ操作を行います。その後、電極を押し、順番に、それぞれの目を通して、電極の先端が頭部カプセルの背面（2〜3ミリメートル程度）に位置する脳に達するので。 </li><li>正しく配置された電極は、ジャイアントファイバーシステムがアクティブになります。刺激電極が正しく配置されていることをテストするには、30から60までの短い（0.03ミリ）の刺激を適用する刺激電極、および飛行/脚部筋肉の翼とけいれんの動きのための外観全体のV&#39; </li><li>次のステップは、ハミルトンや熱引っ張らプラスチックシリンジを使用して3M KClをガラス微小電極を埋戻し、及び微制御マニピュレーターにそれらを置くことです。適切に挿入された微小電極は、実験のいくつかのラウンドに使用することができます。 </li><li>最初の記録電極は、DLMの繊維に挿入されます。 two左右対称DLMSがありますが、それぞれは6つの個々の筋線維で構成されています。録音は、6つの繊維のいずれかから行うことができますが、最も一般的に使用さDLM繊維胸部キューティクルの背側を介してそれらの良好なアクセス性のために45aと45bは、両方の繊維が同じmotorneuronによって支配されているという事実である。 </li><li>お客様から最も遠い側にマイクロマニピュレーターを用いて、DLM繊維45Aまたはbに記録電極を挿入するプラットフォームの傾斜は、DLM電極の浸透を助ける〜60から90 °の角度、で背側クチクラを入力することができます。オシロスコープモードでソフトウェアを使用し、胸部に記録電極を挿入しながら、コンピュータのモニターを見ながら行ってください。電極は、筋肉を入力したときのベースラインはほぼゼロまたは負の値に低下します。あなたが筋肉の反応を観察できるかどうかを確認するために、単一の刺激とテスト。 </li><li>あなたに一番近いTTMに他の記録電極を挿入します。この電極は、筋肉の付着部位の位置のために、あなたの前に、横方向に挿入されます。トレースは、電極が筋肉であることを示すと、単一の刺激でこれとテストをしながら、もう一度モニターを観察。 </li></ol> 4。刺激と記録<ol><li>これで、脚と飛翔筋から脳と記録の応答を刺激開始する準備が整いました。 30 Vから始まると（コンピュータのモニタ上で観察されるように、すなわち筋収縮、および筋細胞の脱分極）が応答を観測するまで、60 Vに増加させる刺激電極間のショート（0.03ミリ）刺激を適用します。実験の残りの部分では、応答の閾値以上の電圧が50から10 Vに設定します。 </li><li>応答の遅延を測定するには、各刺激の間に5秒間の残りの期間で、少なくとも5つの刺激を与える。 </li><li>異なるレートで刺激の列車を提供することにより、&quot;以下の周波数を&quot;決定する。通常10刺激の10列車は、200Hzの（各刺激の間に5msの）と300Hzのは、（各刺激の間に3msの）、100Hzの（各刺激の間に10msの）で与えられる。刺激の各列車の間に2秒の休止期間を許可する。 </li></ol> 5。結果：ジャイアント線維経路で、次の応答のレイテンシと周波数<ol><li>応答待ち時間は、脳の刺激と筋肉の脱分極までの時間です。この図は、単一刺激にDLMとTTMの応答待ち時間を比較します。 0.7 GF - DLM経路用GF - TTM経路用と1.3と1.7ミリから1.2ミリ秒の間のレイテンシは、健全な準備と適切な録音のテクニックを示している。待ち時間は、遺伝子型、遺伝的背景、温度と加齢とともに変化することができます。 図1（AおよびB）。脳に適用される単一の刺激に続くTTMSとDLMSから記録された応答を示す代表的なトレース。 </li><li>ここに示されているように、TTMからの録音は、振幅と大きなDLM繊維からのものに比べてシナプス後電位（PSP）の形状の面でより多くの変動を示し、この増加の変動は、TTM筋線維のサイズが小さいためです。この可変性は、しかし、巨大なファイバーツーTTM経路の応答の待ち時間の値には影響しません。 図1（CおよびD）。TTMとDLMの両方のための4つの個別ハエからさらに&quot;応答の待ち時間&quot;のトレース。 TTMのトレースは、PSPの形状の変動を示すが、応答の遅延は影響を受けませんされます。 DLMのためにPSPの形状にあまりばらつきがある。 <img src="/files/ftp_upload/2412/2412fig1.jpg" alt="図1 - D" /> </li><li>各刺激の周波数でのDLMとTTMの経路の両方に成功応答（10点満点）の割合を計算することによって100 Hz、200 Hzの、300 Hzで、&quot;以下の周波数を&quot;比較。 100 Hzで、TTMとDLMの両方が刺激1:1に従ってください。 100 Hzの上記の刺激の周波数では、DLMの応答は、2つの介在ニューロンの間の仲介の化学シナプスは、刺激間で回復するのに十分な時間がないため、障害の表示を開始します。 TTMの応答は、しかし、さらに300Hzのを超えて刺激と1:1のままである。 図2の録音を&quot;以下の周波数&quot;を示す代表的なトレース。 100Hzで、TTMSとDLMS両方がすべての10の刺激（左）に対応。 200Hzの時に、DLM応答は（アスタリスク）が失敗し始めます。 <img src="/files/ftp_upload/2412/2412fig2.jpg" alt="図2" /> </li></ol>6。代表的な結果野生型短潜時応答は、（刺激電極が目に配置され、感覚受容器をバイパスし、直接GF回路が作動）遺伝子型、遺伝的背景、温度、年齢、およびGF - TTMの経路は0.7と1.2ミリ秒の間の範囲に依存し、 GF - DLM経路1.3 and1.7ミリ秒（Tanouyeとワイマン、1980;トーマスとワイマン、1984年、エンゲルと呉、1992;アレンやマーフィー、2007;フェランら、2008;。オーギュら 、未発表。） 。この非常に短いTTMの待ち時間は単シナプス経路の堅牢なGF - TTMn電気シナプスによるもので、長くDLM待ち時間が原因経路のdisynaptic性質だけでなく、化学シナプス（PSI - DLMn）の存在が原因で発生します。 GFの求心性神経の活性化と低強度の刺激を使用するか、視覚的な（&quot;ライトオフ&quot;）信号を提供することによって、どちらかが達成されているから中間とレイテンシの長い応答（&gt; 3ミリ秒）の結果。 100HzでTTMとDLMの両方が刺激1:1に従ってください。 100HzのDLMの応答の上にPSIとDLMnsの間の化学シナプスが離れて10ミリ秒未満の刺激の間に回復するために十分な時間を持っていないので、障害を表示するために開始されます。 TTMの応答は、しかし、さらに300Hzの（;エンゲルと呉、1992;。Allenら、2007;。マルティネスら 、2007 Tanouyeとワイマン、1980）を超えて刺激と1:1のままになります。 GF - DLMのブランチの応答がない間、 ショウジョウバエのギャップジャンクションチャネル（&quot;innexinを&quot;）をコードするshakB遺伝子の突然変異は、、大幅にGF - TTM経路（〜1.5ミリ秒）の応答の待ち時間が増加（アレンやマーフィー、2007;フェランら 、2008）。変異体の応答が遅延効果が中断神経筋伝達によるものではないことを示す、直接胸神経節を刺激することによって復元することができます。高い周波数の刺激に従う能力はまた、野生型GF - DLMとGF - TTM経路は通常、それぞれ100 Hzと300 Hzの、1:1の比率で10刺激をフォローアップすることができる場所飛ぶと比較して、これらの変異体では低下している。これらの周波数はかなり持続飛行時の収縮筋（3-10 Hz）の（Hummonとコステロ、1989）によって受信された正常な刺激の周波数を超えていることに注意する必要があります。 GFSの出力の安定性を記述するために使用される別のパラメータには、&quot;不応期&quot;、または、まだ筋肉から2つの応答を生成するツイン刺激パルス間の最小時間です。耐火時間はTTMS 1-4の間にmsおよびDLMSのための7から15ミリ秒を変化させます。 Gorczycaとホール、1984; DLMSのための比較的長い不応期が比較的PSI - DLMnジャンクション（Tanouyeとワイマン、1980での化学シナプスを不安定なことになっているエンゲルと呉、1992;。Banerjeeさんら 、2004;アレンとGodenschwege、 2010）。

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	<li>Allen, M. J., Godenschwege, T., Zhang, B., Freeman, M. R., Wadde, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+Recordings+from+the+Drosophila+Giant+Fiber+System.">Electrophysiological Recordings from the Drosophila Giant Fiber System.</a> Drosophila Neurobiology: A Laboratory Manual. , (2010).</li><li>Allen, M. J., Godenschwege, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+an+escape:+development+and+function+of+the+Drosophila+giant+fibre+system.">Making an escape: development and function of the Drosophila giant fibre system.</a> Semin Cell Dev Biol. 17, 31-41 (2006).</li><li>Allen, M. J., Murphey, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+component+of+the+mixed+GF-TTMn+synapse+in+Drosophila+melanogaster+uses+acetylcholine+as+its+neurotransmitter.">The chemical component of the mixed GF-TTMn synapse in Drosophila melanogaster uses acetylcholine as its neurotransmitter.</a> Eur J Neurosci. 26, 439-445 (2007).</li><li>Banerjee, S., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+flight+and+associated+neuronal+rhythmicity+in+inositol+1,4,5-trisphosphate+receptor+mutants+of+Drosophila.">Loss of flight and associated neuronal rhythmicity in inositol 1,4,5-trisphosphate receptor mutants of Drosophila.</a> J Neurosci. 24, 7869-7878 (2004).</li><li>Engel, J. E., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+membrane+excitability+mutations+affecting+potassium+and+sodium+currents+in+the+flight+and+giant+fiber+escape+systems+of+Drosophila.">Interactions of membrane excitability mutations affecting potassium and sodium currents in the flight and giant fiber escape systems of Drosophila.</a> J Comp Physiol A. 171, 93-104 (1992).</li><li>Gorczyca, M., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+cholinergic+synapse+in+the+giant+fiber+pathway+of+Drosophila+using+conditional+mutations+of+acetylcholine+synthesis.">Identification of a cholinergic synapse in the giant fiber pathway of Drosophila using conditional mutations of acetylcholine synthesis.</a> J Neurogenet. 1, 289-313 (1984).</li><li>Hummon, M. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+rectification+at+identified+electrical+synapses+in+the+Drosophila+giant+fiber+system.">Molecular mechanism of rectification at identified electrical synapses in the Drosophila giant fiber system.</a> Curr Biol. 18, 1955-1960 (2008).</li><li>Power, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thoracico-abdominal+nervous+system+of+an+adult+insect,+Drosophila+melanogaster.">The thoracico-abdominal nervous system of an adult insect, Drosophila melanogaster.</a> J Comp Neurol. 88, 347-409 (1948).</li><li>Tanouye, M. A., Wyman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+outputs+of+giant+nerve+fiber+in+Drosophila.">Motor outputs of giant nerve fiber in Drosophila.</a> J Neurophysiol. 44, 405-421 (1980).</li><li>Thomas, J. B., Wyman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+altering+synaptic+connectivity+between+identified+neurons+in+Drosophila.">Mutations altering synaptic connectivity between identified neurons in Drosophila.</a> J Neurosci. 4, 530-538 (1984).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

いずれかの高品質の録音を取得しようとしたときに注意を払わなければならない最も重要なことの一つは、準備の適切な方向と健康です。理想的には、ハエはまだレコーディングセッションの終了時に生きていると電気刺激に応答してください。記録電極は、最も効率的に胸部外骨格を浸透させるには、フライは、電極と直角を形成するような方法で表面に接着する必要がある、必要な場合は、電極の挿入はの部分を除去することによって促進することができます。 DLM飛翔筋を（このステップは、ガラス電極の先端が破損することが困難にするという追加の利点を提供しています）公開するため、メスタングステンと背側胸部キューティクル。また、介護がsubcuticularlyあるDLMSとTTMS介して電極を押ししないように注意する必要があります。ハエの頭がよく適切に脳内に挿入される刺激電極を可能にするために、それらは、記録セッション中に引き出されるのを防ぐためにセキュリティで保護する必要があります。 その大きさとよく説明した形態に起因する、GFSは、 ショウジョウバエで最もアクセス神経経路のいずれかを表します。小さ ​​な分子量のトレーサーの染料に電気シナプスの透過性は、電気的に結合ニューロンの可視化を可能にし、いくつかの利用可能なGAL4ラインは、セルまたはセルのグループ（Jacobs ら 、2000のサブセットの遺伝子発現レベルを操作することが可能に。。アレンら 、2006） ショウジョウバエ GFS神経可塑性を研究するための便利なモデルシステム（エンゲルと呉作る上記の利点が、そのような習慣性、自然回復と脱馴化などの回路の表示プロパティの両方求心性と胸部のコンポーネントに加えて、 1996年）。

<table border="1"><tbody><tr><td> NAME </td><td> COMPANY </td><td> CAT。 ＃ </td><td> コメント </td></tr><tr><td> S48スクエアパルス刺激</td><td>グラスの楽器</td><td></td><td> http://www.grasstechnologies.com/ </td></tr><tr><td>刺激ユニット</td><td>グラスの楽器</td><td></td><td> http://www.grasstechnologies.com/ </td></tr><tr><td> SIU5 RFトランスのアイソレーションユニット</td><td>グラスの楽器</td><td></td><td> http://www.grasstechnologies.com/ </td></tr><tr><td> 5A 2チャネル細胞内微小電極増幅器</td><td>楽器を入手する</td><td></td><td> http://www.gettinginstruments.com/ </td></tr><tr><td> Digidata 1440Aデータ収集システム</td><td>分子デバイス</td><td></td><td> http://www.moleculardevices.com/ </td></tr><tr><td>アナログ - デジタルDigidata 1320とAxoscope 9.0ソフトウェア</td><td>分子デバイス</td><td></td><td> http://www.moleculardevices.com/ </td></tr><tr><td>手動マニピュレーターとレコーディングプラットフォーム</td><td>成茂、サターイン。、世界の精密イン。 </td><td></td><td> http://narishige-group.com/ http://www.sutter.com/index.html http://www.wpi-europe.com/en/ </td></tr><tr><td>光源</td><td> Fostec </td><td></td><td> http://www.nuhsbaum.com/FOSTEC.htm </td></tr><tr><td>ワイルドM5の実体顕微鏡</td><td>ワイルドHeerbrugg </td><td></td><td> http://www.wild-heerbrugg.com/ </td></tr><tr><td>防振テーブル</td><td> TMC </td><td></td><td> http://www.techmfg.com/ </td></tr><tr><td>微小電極用ホウケイ酸塩チューブ</td><td>サターのインストゥルメント</td><td></td><td> http://www.sutter.com/index.html </td></tr><tr><td> P - 95マイクロピペットプラー</td><td>サターのインストゥルメント</td><td></td><td> http://www.sutter.com/index.html </td></tr><tr><td> Microfil 34ゲージ、67ミリ（電極の充填材） </td><td>世界の精密機器</td><td> MF34G - 5 </td><td> http://www.wpi-europe.com/en/ </td></tr><tr><td>マイクロダイセクションのツール（鉗子、...） </td><td>ファイン科学ツール</td><td></td><td> www.finescience.com </td></tr><tr><td>解剖（ステレオ）顕微鏡</td><td>ライカ</td><td></td><td> http://www.leica-microsystems.com/ </td></tr><tr><td>ファラデー箱</td><td>未知のメーカー</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>その他：プラスチック製の注射器、タングステンのアース線とNaOHシャープタングステン電極、塩化カリウム、ワックスのプラットフォーム、モニターとPCを...

electrophysiological recordings from the giant fiber pathway of d. melanogaster

ときに大人を驚かせたD.キイロは空中にジャンプし、離れて飛んで反応する。 D.を含む多くの脊椎動物種、でキイロ 、&quot;エスケープ&quot;（または&quot;驚愕&quot;）成人段階で応答が多成分の神経回路によって媒介されるには、ジャイアントファイバーシステム（GFS）と呼ばれる。ニューロン、彼らの独特の形態とシンプルな接続性の比較大きなサイズは、GFS神経回路を研究するための魅力的なモデルシステムにします。 GFSの経路は、その軸索は子宮頸部の結合を介して胸部神経節への正中線に沿って脳から降りるtwo左右対称の巨大な繊維（GF）介在ニューロンで構成されています。腹側神経節tergotrochanteral筋肉を駆動する同側motorneuron 1）大規模な内側デンドライト（TTMn）（TTM）、mesothoracic大腿骨/足の主な伸筋とGFSのフォームは、電気化学的シナプスのmesothoracic神経分節（T2）で、および2）対側には、末梢背側縦筋（DLMS）、翼圧子のmotorneurons（DLMns）とターン形態の化学物質（コリン作動性）シナプス介在ニューロン（PSI）をsynapsing。彼らは翼に直接接続されるのではなく、移動 - dorsovental筋肉（DVMs）への神経経路（複数可）、翼エレベーターは、まだ（DLMSとDVMsが間接飛翔筋と共同で知られて働いたされていない歪曲近くの胸部キューティクルによって間接的に翼）（キングとワイマン、1980;。Allenら 、2006）。 DLMSのジ - シナプス活性化（PSIを介して）はTTMSが最初に大腿骨を延長して推進することができますTTMの単シナプス活性化（〜0.5 ms）の相対的なこれらの筋肉の収縮のタイミングで小さいながらも重要な遅延を引き起こす地面を飛んでいく。順番に相互に飛行の間、DVMsをストレッチアクティブストレッチアクティブDLMS同時にTTMS。 GFの経路は、脳に超えたしきい値電気刺激（ここで説明する）によって直接感覚（例：&quot;空気パフ&quot;または&quot;ライトオフ&quot;）刺激を適用することによって間接的に活性化、またはすることができます。 TTMnsとDLMnsはまだ正体不明の、感覚入力として、他の持っていないものの、どちらの場合でも、活動電位は、単独でGFS、PSIS、とTTM / DLM運動ニューロンを介してTTMSとDLMSに達する。 &quot;遅延の応答&quot;（刺激と筋肉の脱分極間の時間）とを測定（高周波の刺激の一定の数に成功したレスポンスの数）&quot;高頻度の刺激に続くのは、&quot;再現性と定量機能状態を評価する方法を提供します中央のシナプス（GF - TTMn、GF - PSI、PSI - DLMn）と化学の両方を含むGFS成分、（グルタミン酸）の神​​経筋接合部（TTMn - TTMとDLMn - DLM）。それは中央のシナプス形成に関与する遺伝子を同定し、中枢神経系機能を評価するために使用されています。

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Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

ジャイアントファイバシステムでは、成人の単純な神経回路です。<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;フライの最大のニューロンを含む。私たちは、ジャイアントファイバ介在の直接の刺激後に背側縦（DLM）とtergotrochanteral（TTM）の筋肉に後シナプス電位を記録することによって、この経路を介してシナプス伝達を監視するためのプロトコルについて説明します。

の巨大線維経路からの電気生理学的記録 D.キイロ</em

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" ...

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Research

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Neuroscience

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

14.4K ビュー.  University College London - UCL. ジャイアントファイバシステムでは、成人の単純な神経回路です。キイロショウジョウバエフライの最大のニューロンを含む。私たちは、ジャイアントファイバ介在の直接の刺激後に背側縦（DLM）とtergotrochanteral（TTM）の筋肉に後シナプス電位を記録することによって、この経路を介してシナプス伝達を監視するためのプロトコルについて説明...

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Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

昆虫における単一感覚子録音キイロショウジョウバエとハマダラカ</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

神経科学

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled samples with little to no tissue damage enables us to analyze cell morphology and to compare individual samples to each other, hence allowing the identification of mutant anomalies.
In the demonstrated dissection method the nervous system remains mostly inside the adult fly. Through a dorsal incision, the abdomen and thorax are opened and most of the internal organs are removed. Only the dorsal side of the ventral nerve cord (VNC) and the cervical connective 
(CvC) containing the big axons of the giant fibers (GFs)1 are exposed, while the brain containing the GF cell body and dendrites remains2 in the 
intact head. In this preparation most nerves of the VNC should remain attached to their muscles. 
Following the dissection, the intracellular filling of the giant fiber (GF) with a fluorescent dye is demonstrated. In the CvC the GF axons are located at the dorsal surface and thus can be easily visualized under a microscope with differential interference contrast (DIC) optics. This allows the injection of the GF axons with dye at this site to label the entire GF including the axons and their terminals in the VNC. This method results in reliable and strong staining of the GFs allowing the neurons to be imaged immediately after filling with an epifluorescent microscope. Alternatively, the fluorescent signal can be enhanced using standard immunohistochemistry procedures3 suitable for high resolution confocal microscopy.

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

An in vivo dissection of the adult Drosophila ventral nerve cord (VNC) is demonstrated. This particular dissection method causes little damage to the VNC allowing the subsequent labeling of the giant fiber neurons with fluorescent dye for high resolution imaging.

成人の全体のマウントの準備ショウジョウバエ</emジャイアント繊維染料注入のための>腹神経索

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We developed a novel nanoinjection/electrophysiology assay that allows the detection of bioactive modulatory effects of compounds on the function of a neuronal circuit that mediates the escape response in Drosophila melanogaster3,4. Our in vivo assay, which uses the Drosophila Giant Fiber System (GFS, Figure 1) allows screening of different types of compounds, such as small molecules or peptides, and requires only minimal quantities to elicit an effect. In addition, the Drosophila GFS offers a large variety of potential molecular targets on neurons or muscles. The Giant Fibers (GFs) synapse electrically (Gap Junctions) as well as chemically (cholinergic) onto a Peripheral Synapsing Interneuron (PSI) and the Tergo Trochanteral Muscle neuron (TTMn)5. The PSI to DLMn (Dorsal Longitudinal Muscle neuron) connection is dependent on D&alpha;7 nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs)6. Finally, the neuromuscular junctions (NMJ) of the TTMn and the DLMn with the jump (TTM) and flight muscles (DLM) are glutamatergic7-12. Here, we demonstrate how to inject nanoliter quantities of a compound, while obtaining electrophysiological intracellular recordings from the Giant Fiber System13 and how to monitor the effects of the compound on the function of this circuit. We show specificity of the assay with methyllycaconitine citrate (MLA), a nAChR antagonist, which disrupts the PSI to DLMn connection but not the GF to TTMn connection or the function of the NMJ at the jump or flight muscles.
Before beginning this video it is critical that you carefully watch and become familiar with the JoVE video titled "Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster " from Augustin et al7, as the video presented here is intended as an expansion to this existing technique. Here we use the electrophysiological recordings method and focus in detail only on the addition of the paired nanoinjections and monitoring technique.

Paired Nanoinjection and Electrophysiology Assay to Screen for Bioactivity of Compounds using the Drosophila melanogaster Giant Fiber System

A rapid in vivo assay to test for neuromodulatory compounds using the Giant Fiber System (GFS) of Drosophila melanogaster is described. Nanoinjections in the head of the animal along with electrophysiological recordings of the GFS can reveal bioactivity of compounds on neurons or muscles.

用いて、化合物の生理活性をスクリーニングするためのペアNanoinjectionと電気生理学的アッセイキイロショウジョウバエジャイアントファイバシステム

Screening compounds for in vivo activity can be used as a first step to identify candidates that may be developed into pharmacological agents1,2. We ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

急性海馬スライスにおけるシナプス誘発アストログリアとニューロン活動の二重の電気生理学的記録

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

無傷アダルトゼブラフィッシュの脳における電気生理学的記録

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Design and Fabrication of Ultralight Weight, Adjustable Multi-electrode Probes for Electrophysiological Recordings in Mice

The number of physiological investigations in the mouse, mus musculus, has experienced a recent surge, paralleling the growth in methods of genetic targeting for microcircuit dissection and disease modeling. The introduction of optogenetics, for example, has allowed for bidirectional manipulation of genetically-identified neurons, at an unprecedented temporal resolution. To capitalize on these tools and gain insight into dynamic interactions among brain microcircuits, it is essential that one has the ability to record from ensembles of neurons deep within the brain of this small rodent, in both head-fixed and freely behaving preparations. To record from deep structures and distinct cell layers requires a preparation that allows precise advancement of electrodes towards desired brain regions. To record neural ensembles, it is necessary that each electrode be independently movable, allowing the experimenter to resolve individual cells while leaving neighboring electrodes undisturbed. To do both in a freely behaving mouse requires an electrode drive that is lightweight, resilient, and highly customizable for targeting specific brain structures.
A technique for designing and fabricating miniature, ultralight weight, microdrive electrode arrays that are individually customizable and easily assembled from commercially available parts is presented. These devices are easily scalable and can be customized to the structure being targeted; it has been used successfully to record from thalamic and cortical regions in a freely behaving animal during natural behavior.

Understanding the neural substrates of behavior requires brain circuit ensemble recording. Because of its genetic tractability, the mouse offers a model for circuit dissection and disease mimicry. Here, a method of designing and fabricating miniaturized probes is described that is suitable for targeting deep brain structure in the mouse.

マウスの電気生理学的記録のための設計と超軽量重量の作製、調整可能なマルチ電極プローブ

The number of physiological investigations in the mouse, mus musculus, has experienced a recent surge, paralleling the growth in methods of genetic ...

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular recording has historically been a common technique used to study sensitivities of individual photoreceptor cells to different light stimuli that is still being used today. However, there remains a dearth of detailed methodology in the literature for researchers wishing to replicate intracellular recording experiments in the eye. Here we present the insect as a model for examining eye physiology more generally. Insect photoreceptor cells are located near the surface of the eye and are therefore easy to reach, and many of the mechanisms involved in vision are conserved across animal phyla. We describe the basic procedure for in vivo intracellular recording of photoreceptor cells in the eye of a butterfly, with the goal of making this technique more accessible to researchers with little prior experience in electrophysiology. We introduce the basic equipment needed, how to prepare a live butterfly for recording, how to insert a glass microelectrode into a single cell, and finally the recording procedure itself. We also explain the basic analysis of raw response data for determining spectral sensitivity of individual cell types. Although our protocol focuses on determining spectral sensitivity, other stimuli (e.g., polarized light) and variations of the method are applicable to this setup.

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

The electrophysiological technique of intracellular recording is demonstrated and used to determine spectral sensitivities of single photoreceptor cells in the compound eye of a butterfly.

昆虫モデルにおける視細胞分光感度の決意から<em&gt;インビボ</em&gt;細胞内記録

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular ...

A Visual Guide to Sorting Electrophysiological Recordings Using 'SpikeSorter'

Few stand-alone software applications are available for sorting spikes from recordings made with multi-electrode arrays. Ideally, an application should be user friendly with a graphical user interface, able to read data files in a variety of formats, and provide users with a flexible set of tools giving them the ability to detect and sort extracellular voltage waveforms from different units with some degree of reliability. Previously published spike sorting methods are now available in a software program, SpikeSorter, intended to provide electrophysiologists with a complete set of tools for sorting, starting from raw recorded data file and ending with the export of sorted spikes times. Procedures are automated to the extent this is currently possible. The article explains and illustrates the use of the program. A representative data file is opened, extracellular traces are filtered, events are detected and then clustered. A number of problems that commonly occur during sorting are illustrated, including the artefactual over-splitting of units due to the tendency of some units to fire spikes in pairs where the second spike is significantly smaller than the first, and over-splitting caused by slow variation in spike height over time encountered in some units. The accuracy of SpikeSorter's performance has been tested with surrogate ground truth data and found to be comparable to that of other algorithms in current development.

A Visual Guide to Sorting Electrophysiological Recordings Using &#039;SpikeSorter&#039;

The article shows how to use the program SpikeSorter to detect and sort spikes in extracellular recordings made with multi-electrode arrays.

「SpikeSorter」を使用した電気生理学的記録をソートするビジュアルガイド

Few stand-alone software applications are available for sorting spikes from recordings made with multi-electrode arrays. Ideally, an application should be ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.

チャンネルロドプシンにおけるイオン選択性の電気生理学的測定のための全細胞パッチクランプ記録

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

ゼブラフィッシュ<em&gt;その場での</em&gt;脊髄脊髄感覚運動ニューロンからの電気生理学的記録のための準備

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...