このプロトコルは、視覚障害のあるショウジョウバエ変異体の遺伝子スクリーニングに特に適している。これは、ショウジョウバエの光伝達、特に光色素レベルとティアピア関連機能の小さな異常でも検出できるためです。この技術はin vivoで深遠であり、実行が容易で堅牢性が高く、光伝達タンパク質の活性の小さな変化を検出することができます。
私の意見では、生存率を維持しながらハエを修正することは、おそらくこの方法の重要な部分です。コンピュータの電源を入れ、Clampexソフトウェアを開きます。アンプとMaster-8パルス発生器の電源を入れてから、キセノンランプとシャッターコントローラーをオンにします。
プーラーのスイッチを入れ、プラーにガラスキャピラリーを入れて引っ張ります。ガラスキャピラリーをプーラーから取り外します。細長いチップシリンジを使用して、ろ過したリンガー溶液でガラスキャピラリーを満たします。
ワイヤ電極をガラスキャピラリーに挿入します。キャピラリー内の溶液が銀線と接触していることを確認してください。電極ホルダーを2つの電極マイクロマニピュレーターに挿入します。
はんだごての電源をオンにします。電流を約2.25アンペアに設定します。この電流は、0.25ミリメートルのプラチナイリジウムフィラメントを摂氏約55〜56度に加熱するはずです。
はんだごてに溶融温度の低いワックスを一滴置きます。ボトル内のハエを麻酔します。麻酔をかけたハエを枕木の容器に注ぎ、1匹のハエを選び、残りのハエをペトリ皿で覆います。
鋭利なピンセットを使用してハエを翼で慎重に持ち、フライホルダーに置きます。フライホルダーに、フライを横にして背中を手に向けて置きます。ピンセットを使用して、フライを翼から持ち上げ、はんだごてを使用して翼をフライホルダーに固定します。
はんだごてを使用して、フライの背中をワックスでスタンド面に接続します。はんだごての先端を脚の接合点まで下げてから、ワックスを溶かしてすべての脚を一緒に覆います。首の部分の頭と首の間にワックスを少し置きます。
フライホルダーをマグネットブロックの暗いファラデーケージに入れ、フライがライトガイドの端から約5ミリメートル離れていることを確認します。マイクロマニピュレーターを使用して、記録電極をハエの目の上に置き、接地電極をハエの背中の上部に配置します。次に、マイクロマニピュレーターを使用して、接地電極をフライの背面に挿入します。
記録電極をハエの目の外周に挿入し、好ましくはマイクロマニピュレータを使用する。ファラデーケージを閉じて部屋の明かりを消して、5分間暗闇に適応できるようにします。毎秒500mのパルス幅、60秒のパルス間隔、6に設定したパルス数からパラメータを入力します。
PDAを測定するには、Master-8パルス発生器をTRAINモードに設定し、オレンジ色のフィルターを使用して最大強度の5秒間の光パルスを与えます。電圧応答を確認してください。オレンジ色のフィルターを広帯域の青色フィルターに交換し、最大強度で5秒間の光パルスを3回与えます。
電圧応答を確認してください。暗闇の中で少なくとも60秒待ちます。青色のフィルターを以前のオレンジ色のフィルターに置き換えます。
次に、60秒間隔で2つの5秒の光パルスを与えます。電圧応答を確認してください。ERP M電位を測定するには、定常状態の電圧応答に達するまで連続的な青色光パルスを与えます。
20ナノメートルのバンドパスフィルターを使用して、350〜700ナノメートルの波長の短時間の強い光フラッシュを与えます。次に、M電位応答のM1相のピーク振幅を測定し、これは光平衡におけるこの特定の波長でのメタロドプシン吸収を反映する。PDA応答は、異なる変異ハエについて評価された。
野生型ハエは、強い青色光刺激に続いて、長期の角膜陰性ERGとして現れる暗闇で飽和脱分極を示しました。次の青色のライトは、PDAに重ね合わされた小さな応答を生成し、オンとオフのトランジェントを欠いていました。ninaEなどの異常な光色素生合成を有する変異ハエでは、強い青色光刺激後に電圧応答がベースラインに戻り、追加の青色光に対する応答は抑制されず、正常なオン/オフ過渡を示した。
ハエの野生型ERPは同じプロトコルによって得られますが、PDA中に強い緑色のフラッシュが適用されます。この緑色の点滅はERPを誘発し、PDAを抑制しました。M電位は青色照射後の緑色閃光によって得られたが、野生型ハエの青色照射後の青色閃光では得られなかった。
このプロトコルは、野生型、光色素低モルフ変異体ninaE、および光色素レベルが正常な光色素欠乏変異体norpAで繰り返されました。フライロドプシンおよびメタロドプシンの相対吸収スペクトルは、異なるスペクトルおよび光平衡スペクトルの測光測定から計算した。ハエの生存のためには、過熱を控えることによってワックスの粘度に注意を払うことが重要です。
この手順は、欠陥のある視覚変異体の遺伝的およびスクリーニングに適しています。視覚変異をランダムに分離して同定する方法は、ショウジョウバエの光伝達に関与する新しいタンパク質とメカニズムの発見を促進する可能性があります。PDAプロトコルは、重要で斬新な視覚メカニズムの分離を可能にしました。
そうでなければ、参加はおそらく発見されなかったか、予想さえされなかったでしょう。
