Name: assessment of sarcoplasmic reticulum calcium reserve and intracellular diastolic calcium removal in isolated ventricular cardiomyocytes
Uploaded: 2017-09-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
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この作品は中国の国家自然科学基金からの助成金によって支えられた (号 81100159、修習ライ; 81401147、区張)、医療と健康科学プログラムの浙江省 (号 201646246、修習 Lai)、健康科学、杭州市 (第 2013A28 号、丁林) の技術計画。

機関動物のケアと使用実験研究センター、中国医学科学の中国アカデミー、浙江大学委員会によって承認されたプロトコルに従ってすべての動物実験を行なった。
 1 ソリューション準備 <ol><li>表 1 で説明したようにすべてのソリューションを準備します。</li></ol>。
 2 分離の左心室 (LV) 心筋 注: 左心室心筋細胞は酵素によって前述 7 Langendroff 灌流システムを使用して分離、、。 8 , 9 , , 10 11.
<ol><li>Langendroff 灌流システムのセットアップ。通常 Tyrode (NT) ソリューションで灌流システムを埋める、36.5 ° C の温度設定、チューブに空気の泡を排除します</li>。
	<li>は、重さし、抱水クロラール (400 mg/kg) の腹腔内注入 (ip) による Sprague-dawley ラットの麻酔。5 分後尻尾や足指のピンチの応答を評価することで麻酔状態を確認</li>
	<li>手術用ハサミで剣状突起下腹腔内を開く、剣状突起を持ち上げ、シザーと胸を開きます。心膜を削除、わずかに持ち上げ心カーブタイプ鉗子で、大動脈弓を識別、心臓から大動脈のルートから鋏による切断します</li>。
	<li>は、60 mm ディッシュに心を転送し、NT ソリューションで洗っています。大動脈を持つ 2 つの微細解剖鉗子と蛍光灌流カニューレにマウントし、しっかりと縛る手術用縫合糸を使用してカニューレに大動脈 。
	注: 熟練したオペレーターが 15 内でこのプロセスを終えることができる s.</li>
	<li>は、冠状動脈の循環を回復する 30 mL NT ソリューションと心臓を灌流します。その後、液を 30 mL Ca 2 + に切り替える-無料の枝 (10 mM タウリン、1 mg/mL BSA) ハートビートを停止します。次に、コラゲナーゼ、分離ソリューション (0.6 mg/mL) 酵素の消化力のために、出納を切り替えます 。
	注: 使用コラゲナーゼは糖尿病ラットやコラゲナーゼ II での実験のための実験の糖尿病ラットなし</li>。
	<li>20-25 分の消化力の後すぐに Ca 2 + を灌流液を変更-無料の消化をさらに停止する枝。中心部を鉗子で保持、カニューレから切って、KB ソリューションを含む 35 mm ディッシュの中心の場所 (テーブル 1 を参照).</li>
	<li>解剖はさみ鉗子と左心室壁です。心房、右心室、房室接合部を切った。残りの組織は LV です。KB ソリューションと新しい 35 mm ディッシュにそれを転送します。LV の組織を細かくミンチします</li>。
	<li>ゆっくりピペットのフィルター処理されたプラスチック スポイト入りと 10 mL KB ソリューションで再停止します</li>。
	<li>は、150 μ m 絞りステンレス フィルター、および 15 mL 遠心管への転送の細胞をフィルター処理します。30 s と破棄上清の 150 x g で遠心分離機します。再 10 mL KB ソリューション、無料で細胞が 6 分のために解決を中断、上澄みを廃棄し、再 10 mL KB ソリューション内のペレットを中断します 。
	注: すべての手順を 100% O 2 毒ガス ソリューションで 36 ° C で行った</li>。
</ol> 3。カルシウム再導入 <ol><li>KB ソリューションで 20 分間定住した後、上澄みを廃棄し、カルシウムの再導入溶液を細胞を再停止 (0.3 mM Ca 2 +、4.5 mL Ca 2 +-無料枝、1.5 mL NT ソリューション)10 分</li>
	<li>カルシウム再導入液と B で上記の手順を繰り返します (0.3 mM Ca 2 +、3 mL Ca 2 +-無料枝、3 mL NT ソリューション).</li>
	<li>は、NT ソリューション (1.2 mM Ca 2 +) で利用可能な細胞を浄化するために上記の手順を繰り返します。このソリューションで孤立した左心室心筋細胞を保存し、研究それらを 4-6,</li>
</ol> 4。設定上の灌流システム <ol><li>NT ソリューション室灌流 ( 図 1 a) の流入管を接続します</li>。
	<li>ターゲット細胞針灌流、多バレルのマニホールド ヒント (例えば、灌流鉛筆、今後鉛筆と呼ばれます) に接続、マニピュレーターで修正、バルブに灌流システムを制御します。NT ソリューションと 10 mM カフェイン ソリューションを鉛筆 ( 図 1 a) の各列に追加します</li>。
	<li>をはずして空気管に空気の泡を避難</li>。
	<li>10 鉛筆数ミクロンの先端から点滴をカウント s、3 ドリップ/10 s のおおよその速度で流れの速度を保つために流量制御を手動で調整</li>
</ol> 5。細胞内 Ca 2 + 過渡的筋節の短縮 7 , 8 , 9 測定 <ol><li>スライドで、ピペット 10 μ L 細胞懸濁液顕微鏡で細胞カウンターで細胞数をカウントし、密度を計算します。おおよそ 50,000 セル/ml 濃度に細胞を希釈します</li>。
	<li>2 μ M に最終濃度をもたらす細胞の懸濁液 1 mL に追加 Fura 2 アセトキシメチルセファロスポリン (午前) 株式 (カルシウム敏感な染料) を室温で 20 分間暗闇の中で保持します</li>。
	<li>150 g で 30 s、および再中断 2 時間を NT ソリューションと心筋細胞間遠心します</li>。
	<li>ターン、光と暗闇の中で細胞を維持します。15 分用灌流チェンバに筋紡錘を配置します。その後 NT ソリューション室灌流 (1.5 mL/分) を開始します。5 分刺激 (波期間 4.0 ms パルス振幅 8.0 V) を使用して 1 Hz 刺激と筋紡錘のペース</li>
	<li>形のよい細胞を選択 (棒状、鋭いエッジ、およびクロス縞をオフに)、顕微鏡の対物レンズ × 10 の下で安定した刺激収縮 (自発収縮なし)。次に、顕微鏡の倍率を 40 倍に変更し、水平方向の位置で、細胞を保つために CCD カメラの向きを回転します</li>。
	<li>フレーム単一心筋細胞フレーミング アダプターを調整することによって。バック グラウンドが明確であることを確認します</li>。
	<li>340 または 380 nm 波長励起フィルターとキセノン ランプが発する光を細胞を公開し、40 × 対物を介して細胞をイメージします。510 で蛍光シグナルを検出 nm。一方で、心筋の筋節長変化に注意してくださいし、同時に柔らかい端モジュールを使用して記録します</li>。
	光電子増倍管の二重励起蛍光測定システムによる <li>レコード蛍光。カルシウム イメージング システムの録音プログラムを実行をクリックして &#34; ファイル/新しいファイル &#34; 新しい記録ファイルを作成し、クリックする、&#34; 開始 &#34; 蛍光および筋節の長さを同期的に記録します</li>。
</ol> 6。SR Ca 2 + リザーブと拡張期の Ca 2 + 除去機能 7 , 8 , 9 評価 <ol><li>Interlink、&#34; Aux アウト &#34; ポート刺激、&#34; アナログの &#34; バルブ制御システムのポート (例えば バルブの司令官、材料表 を参照) (TTL 信号を同期) に BNC ケーブルで</li>。
	<li>プリセット前述 8 , 9; として自動的に灌流バルブの切り替えのためのプログラム操作の詳細な手順については、次として表示されます。
	<ol><li>プリセット 表 2 に従って、ソフトウェアを制御し、バルブ内のパラメーター、&#34; ダウンロード &#34; プログラムにロード シーケンスをダウンロード] ボタンをクリックします。クリックして、&#34; ・ トリッグ小胞体 &#34; トリガー関数を有効にする] ボタンをクリックします 。
		注: バルブ制御システム TTL 信号を受信した後のシーケンスを実行することができます</li>。
		<li>シーケンス モードに刺激をプリセットし、表 3 に従ってパラメーターを設定します</li>。
	</ol></li> <li>で刺激を設定 &#34; S1 ステップ &#34; LV のペースを細胞 1 Hz では NT ソリューションを 1.5 mL/min の速度で針灌流を開始。 。
	注意: 針ストリームの速度は灌流チャンバーよりも速く、針のストリームの光の屈折が灌流チャンバーの光の屈折とは異なる。光の屈折の違いは、ターゲット細胞をとりまく効果的な針灌流の範囲を示します</li>。
	<li>選択 (上流に下流のシーケンス) の低消費電力ミクロな視点の下でターゲット細胞と確認されるによって到達できる鉛筆のマイクロ チップ。顕微鏡の倍率を 400 倍に変更します。水平方向の位置で、細胞を保つために CCD カメラの向きを回転させます。筋紡錘を格納する適切なウィンドウにセル フレーミング アダプターの下の長方形の開口部を調整します。最小限の背景があることを確認します。他の細胞またはこのウィンドウで死んだ細胞の残骸を認めていない</li>。
	<li>鉛筆、マイクロマニピュレーターの固定の位置を調整し、顕微鏡倍率 x 400 未満ターゲット細胞に視界の半径の距離でマイクロ チップを慎重に配置します</li>。
	<li>主ターゲット細胞をカバーし、心筋が針流れによって一掃できないことを確認してください針ストリームの範囲を調整します</li>。
	<li>後 60 s の基本的なペーシング、カーソルを刺激する、&#34; D2 ステップ &#34;. 
	注: プロトコルの残りの部分は、刺激とバルブ コントロール システムによって自動的に実行されます。上記の設定に基づき、プロトコルが自動的に実行される 図 2 a、1 Hz 基本 60 NT ソリューションとペーシングのように s。ペーシングと 2 の遅延、一時停止 s、15 の 10 mM カフェイン灌流に急速に切り替える (機能的、SR 内の Ca 2 + ストレージをリリース) を s、NT ソリューションに切り替えてと</li>。
	<li>記録の最後に、個々 の細胞のバック グラウンド蛍光を検出します。クリックして、&#34; 一時停止 &#34; ミクロな視点を近く空白エリアに移動記録、ファイルを一時停止するボタンです。クリックして、&#34; レコード &#34; 秒の記録を再開するボタンをクリックし、バック グラウンド補正の数値 340 と 380 nm の強度値を記録します</li>。
	<li>オープン、&#34; 操作/定数 &#34; ダイアログ ボックスでに値を入力し、&#34; 背景 &#34;、それぞれを形成; ソフトウェアは、バック グラウンドを引いて Fura 2 比率値を修正できます</li>。
</ol> 7。データ分析 9 <ol><li>カルシウム トランジェントおよび基本的なペーシングの段階で短縮筋の測定、収縮パルスの平均値、カルシウム濃度、時定数などの動的パラメーターを分析します。カルシウム一時的な崩壊 (タウ 1 Hz)、自動的にソフトウェアを使用しています 。
	注: ソフトウェアの decay セグメントがうまく適合しない場合は、手動のモノラル指数曲線のあてはめの減少トレースをエクスポートします</li>。
	<li>カフェイン誘発性カルシウム パルス カルシウム除去機能の解析のための急な波とパルスのみを選択します。信号障害、異常パルスまたはそれらの距離の中間を流れていたセルを除外します</li>。
	<li>カフェイン誘発性カルシウム パルス (Ca-カフェイン、方式 2 + 予備のインデックス) の振幅を測定します</li>。
	<li>モノラル指数曲線あてはめ (10 時間) 手動でソフトウェア ( 図 2) からカフェイン誘発性カルシウム パルス (タウ カフェイン) の減衰時定数を取得します</li>。
</ol>

<ol>
	<li>Capel, R. A., Terrar, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+Ca+(2+)-dependent+mechanisms+for+the+initiation+of+the+heartbeat.">The importance of Ca (2+)-dependent mechanisms for the initiation of the heartbeat.</a> Front Physiol. 6, 80 (2015).</li><li>Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+cycling+and+signaling+in+cardiac+myocytes.">Calcium cycling and signaling in cardiac myocytes.</a> Annu Rev Physiol. 70, 23-49 (2008).</li><li>Zhao, S. M., Wang, Y. L., Guo, C. Y., Chen, J. L., Wu, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+decay+of+Ca2++homeostasis+in+the+development+of+diabetic+cardiomyopathy.">Progressive decay of Ca2+ homeostasis in the development of diabetic cardiomyopathy.</a> Cardiovasc Diabetol. 13, 75 (2014).</li><li>Pereira, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+in+diabetic+cardiomyocytes.">Calcium signaling in diabetic cardiomyocytes.</a> Cell calcium. 56 (5), 372-380 (2014).</li><li>Coppini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late+sodium+current+inhibition+reverses+electromechanical+dysfunction+in+human+hypertrophic+cardiomyopathy.">Late sodium current inhibition reverses electromechanical dysfunction in human hypertrophic cardiomyopathy.</a> Circulation. 127 (5), 575-584 (2013).</li><li>Ferrantini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R4496C+RyR2+mutation+impairs+atrial+and+ventricular+contractility.">R4496C RyR2 mutation impairs atrial and ventricular contractility.</a> J Gen Physiol. 147 (1), 39-52 (2016).</li><li>Li, L., Chu, G., Kranias, E. G., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+myocyte+calcium+transport+in+phospholamban+knockout+mouse+relaxation+and+endogenous+CaMKII+effects.">Cardiac myocyte calcium transport in phospholamban knockout mouse relaxation and endogenous CaMKII effects.</a> Am J Physiol. 274, H1335-H1347 (1998).</li><li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMKII+inhibition+in+heart+failure,+beneficial,+harmful,+or+both.">CaMKII inhibition in heart failure, beneficial, harmful, or both.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302, H1454-H1465 (2012).</li><li>Lai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rho+kinase+inhibitor,+fasudil,+ameliorates+diabetes-induced+cardiac+dysfunction+by+improving+calcium+clearance+and+actin+remodeling.">The Rho kinase inhibitor, fasudil, ameliorates diabetes-induced cardiac dysfunction by improving calcium clearance and actin remodeling.</a> J Mol Med (Berl). 95 (2), 155-165 (2017).</li><li>Lai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch+Current-Induced+Abnormal+Impulses+in+CaMKII&#948;+Knockout+Mouse+Ventricular+Myocytes.">Stretch Current-Induced Abnormal Impulses in CaMKII&#948; Knockout Mouse Ventricular Myocytes.</a> J Cardiovasc Electrophysiol. 24 (4), 457-463 (2013).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+of+L-type+calcium+current+and+cardiac+function+in+CaMKII{delta}+knockout+mice.">Alterations of L-type calcium current and cardiac function in CaMKII{delta} knockout mice.</a> Circ Res. 107 (3), 398-407 (2010).</li><li>Roussel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoyl-carnitine+increases+RyR2+oxidation+and+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++leak+in+cardiomyocytes:+Role+of+adenine+nucleotide+translocase.">Palmitoyl-carnitine increases RyR2 oxidation and sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak in cardiomyocytes: Role of adenine nucleotide translocase.</a> Biochim Biophys Acta. 1852 (5), 749-758 (2015).</li><li>Yaras, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+diabetes+on+ryanodine+receptor+Ca2++release+channel+(RyR2)+and+Ca2++homeostasis+in+rat+heart.">Effects of diabetes on ryanodine receptor Ca2+ release channel (RyR2) and Ca2+ homeostasis in rat heart.</a> Diabetes. 54 (11), 3082-3088 (2005).</li><li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Mediated+Overexpression+of+O-GlcNAcase+Improves+Contractile+Function+in+the+Diabetic+Heart.">Adenovirus-Mediated Overexpression of O-GlcNAcase Improves Contractile Function in the Diabetic Heart.</a> Circ Res. 96 (9), 1006-1013 (2005).</li></ol>

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SR からリリースされたカルシウム変化は心臓の収縮の Ca2 +の主要な源です。程度、SR Ca2 +コンテンツの振幅および小数部の Ca2 + SR からリリース心筋収縮のため利用できる SR Ca2 +予備を反映します。その一方で、SR の Ca2 +予備は拡張期12,13,14の間に SR で SR Ca2 +再取り込み、Ca<...

細胞内カルシウム ([Ca2 +]私) リサイクル1心筋細胞の収縮および拡張機能の調節に重要な役割を果たしています。ご存知のように、カルシウム誘発性 Ca2 +放出は収縮する電気信号に変換するカップリング、興奮収縮を開始します。膜の脱分極は、細胞膜の L 型 Ca2 +チャネル、Ca2 +を引き起こすはリアノジン受容体 2 (RyR2) を介した細胞質に SR からの解放をアクティブにします。一時的な上昇細胞質 Ca2 +筋原線維の収縮を開始します。期には, 細胞質 Ca2 +は SR Ca2 +による SR に reuptaken-atp アーゼ 2 (SERCA2) と、Na+-Ca2 +交換 (NCX)2を介して心筋のポンプ。このプロセスはリサイクル、心筋収縮緩和に します。
心臓の SR は収縮機械を囲む細胞内膜ネットワークです。それは収縮の Ca2 +貯水池として機能、それがリラクゼーションの中に細胞内 Ca2 + reabsorbs。ビートを利用できる SR Ca2 +予備は心収縮力の確定です。一方、心臓の拡張期の細胞内 Ca2 +の除去が欠かせません。いくつかの病態生理学的条件下で糖尿病、心不全、障害 Ca2 +クリアランス、落ち込んで SR Ca2 +など心筋に店が関与している心機能低下2,3 ,4。
SR Ca2 +放出と拡張期心筋細胞 Ca2 +除去を測定するために、広く使用されている方法の 2 種類があります: パッチ ・ クランプ5,6、およびカフェイン誘発性 Ca に基づいて NCX 電流の整合性2 + Ca2 +蛍光イメージング7,8,9に基づくパルス。前者のアプローチは、Ca2 + SR から解放主ポンプでくまれるセルから NCX によって事実に依存します。ただし、このアプローチは、高度な設備・熟練作業の条件によって制限されます。本研究では Ca2 +パルスのカフェイン誘発性の Ca2 +蛍光イメージング システムに基づく測定による SR Ca2 +リザーブと心筋細胞の Ca2 +除去を評価するための便利な方法をについて説明します。簡単に言えば、細胞内 Ca2 +蛍光はフラ 2 で示されます。連動した刺激システムと灌流システム、によって灌流の切り替えとシステムを自動的にペーシングのためのプログラムを提案します。10 mM カフェインを用いて急速に SR で総 Ca2 +放出を誘発します。カルシウム濃度のカフェイン誘発性カルシウム パルス指数関数的減衰時定数 (タウ) は、それに応じて拡張期の Ca2 +除去 SERCA と NCX の貢献を反映するモノ指数曲線の当てはめから得られました。

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Alfa Aesar</td><td>012314</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Alfa Aesar</td><td>012315</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Alfa Aesar</td><td>11595</td><td></td></tr><tr><td>HEPEs</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16828</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Alfa Aesar</td><td>A18395</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Alfa Aesar</td><td>A18854</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Alfa Aesar</td><td>011594</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Alfa Aesar</td><td>3337</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamic</td><td>Alfa Aesar</td><td>A15031</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12403</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase A</td><td>Roche</td><td>10103586001</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type II</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Roche</td><td>735094</td><td></td></tr><tr><td>caffeine</td><td>Sigma</td><td>C0750</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F1201</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>Olympus IX 71</td><td></td></tr><tr><td>Langendorff system</td><td>Beijing Syutime Technology Co</td><td>PlexiThermo-S-LANGC</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Marchauser</td><td>MM33 links</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion chamber</td><td>IonOptix</td><td>FHD</td><td></td></tr><tr><td>Valve Controlled Gravity Perfusion System</td><td>ALA</td><td>VC 3-8</td><td></td></tr><tr><td>valve commander software</td><td>ALA</td><td>VC 3 1.0.1.2</td><td></td></tr><tr><td>Precision flow regulator</td><td>Delta Med</td><td>3204315</td><td></td></tr><tr><td>Multi-Barrel Manifold Perfusion Pencil</td><td>AutoMate Scientific</td><td>04-08-[360]</td><td></td></tr><tr><td>Micron Removable Tip</td><td>AutoMate Scientific</td><td>360um i.d.</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Measurement and Cell Dimensioning Systems</td><td>IonOptix</td><td>Hyperswitch</td><td></td></tr><tr><td>Recording software</td><td>IonOptix</td><td>IonWizard 6.2.59</td><td></td></tr><tr><td>Stimulator</td><td>IonOptix</td><td>MyoPacer EP</td><td></td></tr><tr><td>Sprague-dawley rats</td><td>Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.</td><td>SCXK 2016-01-007436</td><td></td></tr></tbody></table>

assessment of sarcoplasmic reticulum calcium reserve and intracellular diastolic calcium removal in isolated ventricular cardiomyocytes

細胞内カルシウム リサイクル心筋収縮および拡張機能の調節に重要な役割を果たしています。心筋の筋小胞体 (SR) は、reuptakes 細胞内 Ca2 +安静時の収縮の Ca2 +貯水池として機能します。ビートを利用できる SR Ca2 +予備は心筋収縮性の予測、細胞内 Ca2 +の除去は、心臓の拡張機能のために重大。糖尿病、心不全など、いくつかの病態生理学的条件下で障害カルシウム クリアランスと心筋細胞の Ca2 +ストアは、心機能低下の進行状況に関与する可能性があります。ここでは、方式2 +リザーブと拡張期の Ca2 +除去を評価するプロトコルについて述べる。簡単に言えば、単一心筋細胞が酵素によって分離され、フラ 2 で示された細胞内の Ca2 +蛍光カルシウム イメージング システムによって記録されました。合計 SR Ca2 +放出を誘発するためにカフェインを採用するには、連動した刺激システムと灌流システムによって自動灌流スイッチ プログラムをプリセットします。その後、モノラル指数曲線のあてはめカルシウム濃度のカフェイン誘発性カルシウム パルス減衰時定数を分析に用いる。したがって、SR の Ca2 +の貢献-ATPase (SERCA) と Na+-Ca2 +交換 (NCX) 拡張期のカルシウムの除去を行った。

ストレプトゾトシン (STZ) - 誘発糖尿病ラット (DM) と年齢をマッチさせたスプレイグ - を示すここで、ドーリー (SD) ラットの例。8 週齢雄 SD ラット (200 ± 20 g) は、管理グループのための DM グループまたはクエン酸バッファーの STZ (70 mg/kg, ip) の単一腹腔内注射を受けた。STZ 投与後 1 週間ラット血糖値と &#62; 16.7 ミリ モル/L が糖尿病と考えられていた。8 週間後左心室心...

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Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes

細胞内カルシウム リサイクル心筋収縮および拡張機能の調節に重要な役割を果たしています。ここでは、カルシウム イメージング システムにより筋小胞体 Ca2 +リザーブと心筋拡張期のカルシウム除去機能を評価するためのプロトコルについて述べる。

分離の心室心筋の筋小胞体カルシウム拡張予備能と細胞内のカルシウム除去の評価

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum ...

assessment-sarcoplasmic-reticulum-calcium-reserve-intracellular

Research

JoVE Journal

Medicine

10.1K ビュー.  Zhejiang University School of Medicine. 細胞内カルシウム リサイクル心筋収縮および拡張機能の調節に重要な役割を果たしています。ここでは、カルシウム イメージング システムにより筋小胞体 Ca2 +リザーブと心筋拡張期のカルシウム除去機能を評価するためのプロトコルについて述べる。

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Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

The study of electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ handling abnormalities requires isolated cardiomyocytes. In addition, the possibility to investigate myocytes from patients using these techniques is an invaluable requirement to elucidate the molecular basis of cardiac diseases such as atrial fibrillation (AF).1 Here we describe a method for isolation of human atrial myocytes which are suitable for both patch-clamp studies and simultaneous measurements of intracellular Ca2+ concentrations. First, right atrial appendages obtained from patients undergoing open heart surgery are chopped into small tissue chunks ("chunk method") and washed in Ca2+-free solution. Then the tissue chunks are digested in collagenase and protease containing solutions with 20 &mu;M Ca2+. Thereafter, the isolated myocytes are harvested by filtration and centrifugation of the tissue suspension. Finally, the Ca2+ concentration in the cell storage solution is adjusted stepwise to 0.2 mM. We briefly discuss the meaning of Ca2+ and Ca2+ buffering during the isolation process and also provide representative recordings of action potentials and membrane currents, both together with simultaneous Ca2+ transient measurements, performed in these isolated myocytes.

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

We describe the isolation of human atrial myocytes which can be used for intracellular Ca2+ measurements in combination with electrophysiological patch-clamp studies.

カルシウムの同時測定のための人間の心房筋細胞の分離<sup&gt; 2 +</sup&gt;過渡と膜電流

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

生物学

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

無傷骨格筋線維内のカルシウムスパークスの評価

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force used to pump blood. Individual cardiomyocytes were first isolated over 40 years ago in order to better study the physiology and structure of heart muscle. Techniques have rapidly improved to include enzymatic digestion via coronary perfusion. More recently, analyzing the contractility and calcium flux of isolated myocytes has provided a vital tool in the cellular and sub-cellular analysis of heart failure. Echocardiography and EKGs provide information about the heart at an organ level only. Cardiomyocyte cell culture systems exist, but cells lack physiologically essential structures such as organized sarcomeres and t-tubules required for myocyte function within the heart. In the protocol presented here, cardiomyocytes are isolated via Langendorff perfusion. The heart is removed from the mouse, mounted via the aorta to a cannula, perfused with digestion enzymes, and cells are introduced to increasing calcium concentrations. Edge and sarcomere detection software is used to analyze contractility, and a calcium binding fluorescent dye is used to visualize calcium transients of electrically paced cardiomyocytes; increasing understanding of the role cellular changes play in heart dysfunction. Traditionally used to test drug effects on cardiomyocytes, we employ this system to compare myocytes from WT mice and mice with a mutation that causes dilated cardiomyopathy. This protocol is unique in its comparison of live cells from mice with known heart function and known genetics. Many experimental conditions are reliably compared, including genetic or environmental manipulation, infection, drug treatment, and more. Beyond physiologic data, isolated cardiomyocytes are easily fixed and stained for cytoskeletal elements. Isolating cardiomyocytes via perfusion is an extremely versatile method, useful in studying cellular changes that accompany or lead to heart failure in a variety of experimental conditions.

Individual cardiomyocytes from wild type and mutant mice can be isolated from the heart in order to study their contractility and calcium transients. This allows characterization of the contribution of cellular dysfunction to heart dysfunction from any cause.

マウス心筋細胞の単離と生理解析

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring apparatus and a motor to perform functional studies. These studies will allow measurement of cardiomyocyte stiffness (passive force) and its activation with different calcium (Ca2+)-containing solutions to determine, amongst others: maximum force development, myofilament Ca2+-sensitivity (pCa50), cooperativity (nHill) and the rate of force redevelopment (ktr). This method also enables determination of the effects of drugs acting directly on myofilaments and of the expression of exogenous recombinant proteins on both active and passive properties of cardiomyocytes. Clinically, skinned cardiomyocyte studies highlight the pathophysiology of many myocardial diseases and allow in vitro assessment of the impact of therapeutic interventions targeting the myofilaments. Altogether, this technique enables the clarification of cardiac pathophysiology by investigating correlations between in vitro and in vivo parameters in animal models and human tissue obtained during open heart or transplant surgery.

This protocol aims to describe step-by-step the technique of extraction and assessment of cardiac function using skinned cardiomyocytes. This methodology allows measurement and acutemodulation of myofilament function using small frozen biopsies that can be collected from different cardiac locations, from mice to men.

皮膚心筋細胞を用いた心機能のインビトロ評価

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...

医学

単離リンパ管におけるカルシウムと収縮性のリアルタイム解析

Real-time Evaluation of Absolute, Cytosolic, Free Ca2+ and Corresponding Contractility in Isolated, Pressurized Lymph Vessels

The lymphatic vasculature, now often referred to as &#34;the third circulation,&#34; is located in many vital organ systems. A principal mechanical function of the lymphatic vasculature is to return fluid from extracellular spaces back to the central venous ducts. Lymph transport is mediated by spontaneous rhythmic contractions of lymph vessels (LVs). LV contractions are largely regulated by the cyclic rise and fall of cytosolic, free calcium ([Ca2+]i).
This paper presents a method to concurrently calculate changes in absolute concentrations of [Ca2+]i and vessel contractility/rhythmicity in real time in isolated, pressurized LVs. Using isolated rat mesenteric LVs, we studied changes in [Ca2+]i and contractility/rhythmicity in response to drug addition. Isolated LVs were loaded with the ratiometric Ca2+-sensing indicator Fura-2AM, and video microscopy coupled with edge-detection software was used to capture [Ca2+]i&#160;and diameter measurements continuously in real time.
The Fura-2AM signal from each LV was calibrated to the minimum and maximum signal for each vessel and used to calculate absolute [Ca2+]i. Diameter measurements were used to calculate contractile parameters (amplitude, end diastolic diameter, end systolic diameter, calculated flow) and rhythmicity (frequency, contraction time, relaxation time) and correlated with absolute [Ca2+]i measurements.

著者スポットライト:リンパ浮腫および高血圧研究における革新的な方法

This protocol describes a method to simultaneously measure cytosolic, free calcium [Ca2+]i and vessel diameter in contracting lymph vessels in real time and then calculate absolute Ca2+ concentrations as well as contractility/rhythmicity parameters. This protocol can be used to study Ca2+ and contractile dynamics across a variety of experimental conditions.

単離加圧リンパ管における絶対、細胞質、遊離Ca2+ 、および対応する収縮性のリアルタイム評価

The lymphatic vasculature, now often referred to as &#34;the third circulation,&#34; is located in many vital organ systems. A principal mechanical ...

免疫・感染学

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

This article describes the detailed protocol and equipment necessary for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ in the Langendorff-perfused rabbit heart. This method allows for direct observation and quantification of Vm and SR Ca2+ dynamics in the intact heart.

イントラ小胞体のCaの光学マッピング<sup&gt; 2+</sup&gt;とランゲンドルフ灌流ウサギの心臓における膜電位

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca2+ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca2+ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca2+-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca2+ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca2+ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca2+. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca2+ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca2+ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca2+ indicator, D1SR, is used to detect Ca2+ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca2+ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca2+ movement.

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

FRETベースの共焦点イメージングを使用した培養平滑筋細胞の小胞体内カルシウム変動の測定

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Assessment of Myofilament Ca2+ Sensitivity Underlying Cardiac Excitation-contraction Coupling

Heart failure and cardiac arrhythmias are the leading causes of mortality and morbidity worldwide. However, the mechanism of pathogenesis and myocardial malfunction in the diseased heart remains to be fully clarified. Recent compelling evidence demonstrates that changes in the myofilament Ca2+ sensitivity affect intracellular Ca2+ homeostasis and ion channel activities in cardiac myocytes, the essential mechanisms responsible for the cardiac action potential and contraction in healthy and diseased hearts. Indeed, activities of ion channels and transporters underlying cardiac action potentials (e.g., Na+, Ca2+ and K+ channels and the Na+-Ca2+ exchanger) and intracellular Ca2+ handling proteins (e.g., ryanodine receptors and Ca2+-ATPase in sarcoplasmic reticulum (SERCA2a) or phospholamban and its phosphorylation) are conventionally measured to evaluate the fundamental mechanisms of cardiac excitation-contraction (E-C) coupling. Both electrical activities in the membrane and intracellular Ca2+ changes are the trigger signals of E-C coupling, whereas myofilament is the functional unit of contraction and relaxation, and myofilament Ca2+ sensitivity is imperative in the implementation of myofibril performance. Nevertheless, few studies incorporate myofilament Ca2+ sensitivity into the functional analysis of the myocardium unless it is the focus of the study. Here, we describe a protocol that measures sarcomere shortening/re-lengthening and the intracellular Ca2+ level using Fura-2 AM (ratiometric detection) and evaluate the changes of myofilament Ca2+ sensitivity in cardiac myocytes from rat hearts. The main aim is to emphasize that myofilament Ca2+ sensitivity should be taken into consideration in E-C coupling for mechanistic analysis. Comprehensive investigation of ion channels, ion transporters, intracellular Ca2+ handling, and myofilament Ca2+ sensitivity that underlie myocyte contractility in healthy and diseased hearts will provide valuable information for designing more effective strategies of translational and therapeutic value.

Assessment of Myofilament Ca2+ Sensitivity Underlying Cardiac Excitation-contraction Coupling

This paper describes a protocol that assesses the changes of myofilament Ca2+ sensitivity during contraction in isolated cardiac myocytes from rat heart. Together with cardiac electrophysiology, systolic/diastolic cytosol Ca2+ levels and contraction/relaxation, this measurement is imperative in underpinning the mechanisms mediating cardiac excitation-contraction coupling in healthy and diseased hearts.

筋フィラメントのCaの評価<sup&gt; 2+</sup&gt;感度基礎心臓興奮収縮連関

Heart failure and cardiac arrhythmias are the leading causes of mortality and morbidity worldwide. However, the mechanism of pathogenesis and myocardial ...

分離の心室心筋の筋小胞体カルシウム拡張予備能と細胞内のカルシウム除去の評価

要約

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カルシウムの同時測定のための人間の心房筋細胞の分離

無傷骨格筋線維内のカルシウムスパークスの評価

マウス心筋細胞の単離と生理解析

皮膚心筋細胞を用いた心機能のインビトロ評価

単離加圧リンパ管における絶対、細胞質、遊離Ca²⁺ 、および対応する収縮性のリアルタイム評価

単離加圧リンパ管における絶対、細胞質、遊離Ca²⁺ 、および対応する収縮性のリアルタイム評価

単離加圧リンパ管における絶対、細胞質、遊離Ca²⁺ 、および対応する収縮性のリアルタイム評価

イントラ小胞体のCaの光学マッピング

FRETベースの共焦点イメージングを使用した培養平滑筋細胞の小胞体内カルシウム変動の測定

筋フィラメントのCaの評価