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1。浸透圧ストレス灌流システムの設定 図1は、カルシウムの概略プロトコルは無傷骨格筋線維における評価を火花である。 <ol><li> 2つのチャネルの最小値を含む灌流システムの出口先端部を位置決めすることができる三軸（XYZ）マイクロマニピュレーターを設定する。これは付属の3使い捨てルアー注射器の筒を作ることができる-ようにルアー - 洛活栓および/ ​​または灌流液の流れのオン·オフを切り替えることができます。これらの灌流チャネルは&gt; 0.2ミリメートルの直径を有する単一チップを介して灌流溶液の&gt; 1 ml /分を送達することができるべきである。 </li><li>灌流システム、低張タイロードソリューションと等張タイロード溶液による1、その他の2つのチャンネルをロードします。 </li></ol> 2。マウスから無傷シングル屈筋屈筋ブレビス（FDB）筋線維の準備<ol><li>マウスEUから足を削除する足首関節以上で脚を切断することで重い解剖ハサミを使用して、NIHおよび動物実験委員会のガイドラインに従ってthanized。 </li><li>足底面を上にして最小のCa 2 +タイロード溶液を満たし解剖室に足を固定。 </li><li>腱を切断し、ゆっくりと周囲の組織から筋肉を分離するために腱を引き上げて、FDBを分析。 </li><li>筋肉の深層内の個々の数字にそれが枝遠位腱を切断することで解剖を完了します。 </li><li>筋線維への追加ダメージを回避し、コラゲナーゼ消化液の融解したアリコートと管内に配置するために、その腱を通して鉗子でピックアップしてFDBの筋肉を移し、37℃に予熱</li><li> 160 rpmの速度で60〜90分間、37℃でオービタルシェーカー上で直立し、FDBを含むチューブをインキュベートします。この筋束解離プロトコルは、実験動物の異なる株について試験される必要がある特に、膜の損傷を受けやすいもの疾患/変異型繊維について。 </li><li>等張タイロード液の700μlのチューブに消化されたFDBを移し、ゆっくりとヒントを除去するクリーンなかみそりの刃で切断を経由して徐々に直径が減少する200ミリリットル、マイクロピペットチップの一連の筋肉を数回描画することにより、繊維を解放するために粉砕する200ミリリットルのマイクロピペットの。病気から特に弱い筋肉の損傷繊維を回避するために、先端が繊維束が付着せずに通過させるのに十分なだけ大きいことを確認してください。あまりにも小さい開口部からバンドルを強制しないでください。 </li><li>優しくタップして再懸濁FDB繊維をチューブにして、等張の1ミリリットルを含む35ミリメートルデルタのTPG皿の中央にカット200ミリリットルマイクロピペットで70ミリリットル（総繊維の1月10日）を引き出すことで、FDB繊維をプレートアウトお皿全体に拡散を低減するためにタイロードソリューション。 </li><li> Dに完全な単繊維の数を決定解剖顕微鏡を用いてっぽい。皿の上の3-4そのまま繊維を得るために、FDB繊維の追加の分量を追加します。 </li><li> 4℃でさらに孤立した筋線維を保存し、6時間以内に使用しています。 </li></ol> 3。フルオ4 AM色素添加およびCa 2 +イメージング（スパークス測定） <ol><li> 、10ミリリットルのFluo-4 AMの株式（1 mM）を有するチューブに播種FDB繊維と皿から等張タイロード溶液500mlを転送混ぜて10 mMの最終のFluo-4 AM濃度に皿に戻って追加します。あるいは、プルロン酸染料積載効率を高めるために使用することができる。 </li><li>暗所で室温で60分間ロードします。 </li><li>丁寧にカットされていない200ミリリットルのプラスチックのマイクロピペットの先端で皿からのFluo-4 AM-含む等張タイロード溶液500mlを描くことによって、繊維を洗浄し、新鮮な等張タイロード液の等容量の交換してください。 </li><li>このプロセスを3回繰り返します。 </li><li>ミトコンドリア機能を可視化するために、Isoto 500mlのを転送する5ミリリットルTMRE株式（1 mM）を持つチューブにFDB繊維と皿からタイロードソリューションNIC、混合し、50 nMの最終濃度皿に戻って追加します。 </li><li> 10分間室温でインキュベートする。 </li><li>丁寧にカットされていない200ミリリットルと皿のプラスチック製マイクロピペットチップからTMRE-含む等張タイロード溶液500mlを描くことによって、繊維を洗浄し、新鮮な等張タイロード液の等容量の交換してください。 </li><li>このプロセスを3回繰り返します。 </li><li>共焦点顕微鏡にお皿を転送し、明確なストライエーションと実験のための円滑な筋細胞膜とそのまま繊維を選択します。 </li><li>マイクロマニピュレータコントロールを使用して、離れてターゲット筋線維から中心から灌流システム400〜500ミクロンの先端を置きます。 </li><li> FDB繊維が所定の位置に留まることを確認するために等張タイロード溶液の流れを開始します。 </li><li> 40X油浸対物レンズとのFluo-4 AMからの蛍光シグナルを記録してのFluo-4 AMを励起アルゴンレーザー（励起波長488 nm）を記録発光信号（波長510から580ナノメートル）。蛍光シグナルの強度は、細胞内Ca 2 +濃度（[Ca 2 +] i）の相対レベルに比例する。 </li><li>ファイバ上に浸透圧ストレスを生成するための細胞外溶液の浸透圧を変化させることによってのCa 2 +過渡電流を誘導する。最初に腫れを誘導するために100秒間低張タイロード液（170ミリオスモル）で、次に等張タイロード液（290ミリオスモル）（60秒のベースライン·コレクション）で繊維を灌流して。等張タイロード溶液でFDB繊維をバック灌流。一般的には、一つだけ浸透圧ショックは1デルタTPGディッシュ内の単一の完全な繊維と火花イベントデータ収集のための最後の10分に適用されます。 </li><li> 166 LPS（毎秒線、Eaはスキャン速度のxyの二次元画像の時系列を使用してのCa 2 +スパークの空間的局在レコード（ 図2）。等張性（1分の条件毎に3.08秒/フレームで得られた512画素）で構成chの線）、低張応力（100秒）後、低張応力（5分）。オフライン分析のためのストア信号は、実験終了後のCa 2 +スパークの分布および頻度を評価した。 </li><li>新しい皿の上に新しい繊維を発見およびCa 2 +過渡を誘導するために同じ浸透圧ショックプロトコールに従ってください。直接筋細胞膜の下に配置共焦点走査線を1分間（ つまり 3万ライン）のCA 2 +トランジェントを記録するために、共焦点ラインスキャン（XT）モード（長さ512ピクセル、2ミリ秒/ラインスキャンのサンプルレートを使用します（ 図3 ）。個々のCa 2 +スパークの大きさと速度論の分析のためのラインスキャンの1分間隔で3つの連続シリーズ（）を記録するために、異なる焦点面にラインスキャンを変更します。 </li></ol> 4。データ解析<ol><li>多数の収集XTラインスキャンは、振幅（F / F 0、F 0は休んでのCa 2 +蛍光である）、 すなわち 、個々のCa 2 +の形態および動態パラメータを火花評価するためにトレース、立ち上がり時間、ピークまでの時間、継続時間（FDHM 、半分の大きさで、全期間）、および記録された火花の空間幅（FWHM、半分の大きさでの全幅）。これらのパラメータは、例えば、Ca 2 +フラックス（振幅）としてRYRのCa 2 +チャネルの基本的なゲーティング特性を表し、RYRs（持続時間）のゲーティング動態。 </li><li>以前に11,16説明したように、画像処理言語IDL（インタラクティブデータ言語）で作成されたカスタム開発、半自動アルゴリズムでデジタル画像データを分析します。のCa 2 +のユニークな動態は浸透圧ストレスによってFDB線維に誘起されたCa 2 +スパークの場合に放出するので、2 +スパークのCaイベントの手動および自動化された機能を組み合わせた方がよいこれらのカスタム·ビルドの画像解析プログラム11で識別して処理。それは手動でいくつかの筋疾患モデルにおいてROI（関心領域）を識別するために必要なとき、このアルゴリズムは非常に有用である。 ROIが定義されると、アルゴリズムが自動的にし、Excelファイルにエクスポートすることができ、上述のスパークパラメータを導出できた。あるいは、公共利用可能な画像処理ソフトウェア、ImageJの中には、例えば SparkMasterのCa 2 +スパークの動力学的特性及び骨格筋17におけるそれらの空間分布を定義するために使用することができる。 </li></ol>

<ol>
	<li>Stutzmann, G. E., Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+Ca2++handling+in+excitable+cells+in+health+and+disease.">Endoplasmic reticulum Ca2+ handling in excitable cells in health and disease.</a> Pharmacol. Rev. 63 (3), 700-727 (2011).</li><li>Cheng, H., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+sparks.">Calcium sparks.</a> Physiol. Rev. 88 (4), 1491-1545 (2008).</li><li>Brochet, D. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elementary+calcium+release+events+from+the+sarcoplasmic+reticulum+in+the+heart.">Elementary calcium release events from the sarcoplasmic reticulum in the heart.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 740, 499-509 (2012).</li><li>Brochet, D. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quarky+calcium+release+in+the+heart.">Quarky calcium release in the heart.</a> Circ. Res. 108 (2), 210-218 (2011).</li><li>Guatimosim, S., Guatimosim, C., Song, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+sparks+in+cardiac+myocytes.">Imaging calcium sparks in cardiac myocytes.</a> Methods Mol. Biol. 689, 205-214 (2011).</li><li>Dulhunty, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitation-contraction+coupling+from+the+1950s+into+the+new+millennium.">Excitation-contraction coupling from the 1950s into the new millennium.</a> Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 33 (9), 763-772 (2006).</li><li>Dulhunty, A. F., Casarotto, M. G., Beard, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ryanodine+receptor:+a+pivotal+Ca2++regulatory+protein+and+potential+therapeutic+drug+target.">The ryanodine receptor: a pivotal Ca2+ regulatory protein and potential therapeutic drug target.</a> Curr. Drug Targets. 12 (5), 709-723 (2011).</li><li>Kirsch, W. G., Uttenweiler, D., Fink, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spark-+and+ember-like+elementary+Ca2++release+events+in+skinned+fibres+of+adult+mammalian+skeletal+muscle.">Spark- and ember-like elementary Ca2+ release events in skinned fibres of adult mammalian skeletal muscle.</a> J. Physiol. 537, 379-389 (2001).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+probable+role+of+dihydropyridine+receptors+in+repression+of+Ca2++sparks+demonstrated+in+cultured+mammalian+muscle.">A probable role of dihydropyridine receptors in repression of Ca2+ sparks demonstrated in cultured mammalian muscle.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 290 (2), 539-553 (2006).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++sparks+and+embers+of+mammalian+muscle.">Ca2+ sparks and embers of mammalian muscle.</a> Properties of the sources. J. Gen. Physiol. 122 (1), 95-114 (2003).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncontrolled+calcium+sparks+act+as+a+dystrophic+signal+for+mammalian+skeletal+muscle.">Uncontrolled calcium sparks act as a dystrophic signal for mammalian skeletal muscle.</a> Nat. Cell. Biol. 7 (5), 525-530 (2005).</li><li>Teichmann, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+control+over+Ca2++sparks+via+mechanosensitive+channels+is+disrupted+in+dystrophin+deficient+muscle+but+restored+by+mini-dystrophin+expression.">Inhibitory control over Ca2+ sparks via mechanosensitive channels is disrupted in dystrophin deficient muscle but restored by mini-dystrophin expression.</a> PLoS One. 3 (11), e3644 (2008).</li><li>Shkryl, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+amplification+of+ROS+and+Ca2++signals+in+stressed+mdx+dystrophic+skeletal+muscle+fibers.">Reciprocal amplification of ROS and Ca2+ signals in stressed mdx dystrophic skeletal muscle fibers.</a> Pflugers. Arch. 458 (5), 915-928 (2009).</li><li>Lovering, R. M., Michaelson, L., Ward, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malformed+mdx+myofibers+have+normal+cytoskeletal+architecture+yet+altered+EC+coupling+and+stress-induced+Ca2++signaling.">Malformed mdx myofibers have normal cytoskeletal architecture yet altered EC coupling and stress-induced Ca2+ signaling.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 297 (3), 571-580 (2009).</li><li>Weisleder, N., Ma, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++sparks+as+a+plastic+signal+for+skeletal+muscle+health,+aging,+and+dystrophy.">Ca2+ sparks as a plastic signal for skeletal muscle health, aging, and dystrophy.</a> Acta. 27 (7), 791-798 (2006).</li><li>Weisleder, N., Zhou, J., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+calcium+sparks+in+intact+and+permeabilized+skeletal+muscle+fibers.">Detection of calcium sparks in intact and permeabilized skeletal muscle fibers.</a> Methods Mol. Biol. 798, 395-410 (2012).</li><li>Picht, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SparkMaster:+automated+calcium+spark+analysis+with+ImageJ.">SparkMaster: automated calcium spark analysis with ImageJ.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 293 (3), 1073-1081 (2007).</li><li>Weisleder, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+aging+is+associated+with+compromised+Ca2++spark+signaling+and+segregated+intracellular+Ca2++release.">Muscle aging is associated with compromised Ca2+ spark signaling and segregated intracellular Ca2+ release.</a> J. Cell. Biol. 174 (5), 639-645 (2006).</li><li>Weisleder, N., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Ca2++sparks+in+aging+skeletal+and+cardiac+muscle.">Altered Ca2+ sparks in aging skeletal and cardiac muscle.</a> Ageing Res. Rev. 7 (3), 177-188 (2008).</li><li>Yi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+calcium+uptake+regulates+rapid+calcium+transients+in+skeletal+muscle+during+excitation-contraction+(E-C)+coupling.">Mitochondrial calcium uptake regulates rapid calcium transients in skeletal muscle during excitation-contraction (E-C) coupling.</a> J. Biol. Chem. 286 (37), 32436-32443 (2011).</li><li>Tjondrokoesoemo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+inositol+(1,4,5)-trisphosphate+receptor+activates+ryanodine+receptor+1+to+mediate+calcium+spark+signaling+in+adult+Mammalian+skeletal+muscle.">Type 1 inositol (1,4,5)-trisphosphate receptor activates ryanodine receptor 1 to mediate calcium spark signaling in adult Mammalian skeletal muscle.</a> J. Biol. Chem. 288, 2103-2109 (2013).</li><li>Martins, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+contribute+to+Ca2++signals+produced+by+osmotic+stress+in+mouse+skeletal+muscle+fibres.">Reactive oxygen species contribute to Ca2+ signals produced by osmotic stress in mouse skeletal muscle fibres.</a> J. Physiol. 586 (1), 197-210 (2008).</li><li>Apostol, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+calcium+signals+induced+by+hyper-osmotic+stress+in+mammalian+skeletal+muscle+cells.">Local calcium signals induced by hyper-osmotic stress in mammalian skeletal muscle cells.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 30 (3-4), 97-109 (2009).</li><li>Jiang, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinic+acid+adenine+dinucleotide+phosphate+(NAADP)+Activates+Global+and+Heterogeneous+Local+Ca2++Signals+from+NAADP-+and+Ryanodine+Receptor-gated+Ca2++Stores+in+Pulmonary+Arterial+myocytes.">Nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate (NAADP) Activates Global and Heterogeneous Local Ca2+ Signals from NAADP- and Ryanodine Receptor-gated Ca2+ Stores in Pulmonary Arterial myocytes.</a> J. Biol. Chem. 288 (15), 10381-10394 (2013).</li></ol>

利害の対立が宣言されていません。

完全な骨格筋中のCa 2 +スパークを評価するこの方法は、筋肉の生理学および病気の研究のための便利なツールです。我々は、Ca 2 +スパーク応答は18、19、ならびに筋萎縮性側索硬化症20に老化、筋ジストロフィー11を含む、異なる条件で変更されたことを示した。我々の最近の研究はまた、骨格筋線維の活性化を21で火花のCa 2 +?...

細胞内遊離Ca 2 +（の[Ca 2 +] i）の （レビューのためにステュッツマンとマットソン1を参照）などの神経細胞、心臓、骨格筋及び平滑筋などの興奮性細胞における複数の細胞機能を調節汎用性と重要な二次メッセンジャーである。筋小胞体（SR）とT-細管の間のCa 2 +動員およびクロストークを調節（TT）膜は、筋生理学の基本的な調節因子である。さらに、のCa 2 +シグナル伝達における変化は、様々な筋疾患における収縮機能不全の根本的なメカニズムであることが示された。 Ca 2 +の火花が筋小胞体（SR）膜2上のリアノジン受容体（のRyR）チャネルの開口に起因する小学校のCa 2 +放出イベントをローカライズされています。心筋では、火花は、Ca 2 +によって誘発されるCa 2 +のRELEによるのRyR2チャネルの開口部を通って自然発生的に起こるASE（CICR）メカニズム3-5。骨格筋では、TTのRyR1は厳密膜6,7の電圧センサによって制御される。完全な骨格筋線維で休ん条件でこのようにCa 2 +の火花が抑制されることはほとんど検出されません。最近まで、のRyR1上の電圧センサーの抑制を切り離すために様々な化学的または機械的な「スキニング」の方法によって破壊およびCa 2に対して許可する必要が筋細胞膜は、+、骨格筋8,9で検出されるイベントの口火を切る。一つの方法は、以前に、サポニン界面活性剤10による筋線維の膜の透過化を必要とする。 2003年には、一過性の低浸透ストレスや高浸透圧ストレスのどちらかが2 +は完全な筋線維11内の筋細胞膜に隣接火花周辺カルシウムを誘導できることを発見しました。この方法は、日時のCa 2 +の分子機構および変調を研究するために改変されている</suP&gt;リリースとダイナミクス12月16日 。ここでは、完全な骨格筋におけるCa 2 +スパークの誘導、検出および分析のための我々の実験的アプローチの詳細を概説しています。また、骨格筋、 例えば、スパーク周波数及び振幅のRyRチャネルの開口確率を反映する（ΔF/F0、中の個々のCa 2 +スパークの元素の特性を定量化するために使用することができる私達の特注のスパーク解析プログラムを提示し、 SRの内側のCa 2 +負荷）;ピークまでの時間（立ち上がり時間）と期間（FDHM、火花の半最大振幅で全期間）だけでなく、Ca 2 +の火花の空間分布。また、我々はそのような筋ジストロフィーや筋萎縮性側索硬化症などの骨格筋における様々な病態生理学的状態に変更されたCa 2 +の火花を結ぶ証拠を提示します。 この技術の利点は、比較的せきを切る中のCa 2 +を測定する能力を含む生理学的に近い条件でのCa 2 +スパークの記録を可能にする代わりに、筋線維剥離の老化細胞は、。さらに、当社のカスタム設計されたプログラムは、筋線維に関連して、スパークの特性をより正確に計算しています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="790">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Dissecting microscope</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:367px;">Dissect out fibers and check muscle integrity</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Dissection tools -scissors, and fine tip forceps</td>
			<td style="width:111px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:195px;">Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>DOW CORNING</td>
			<td style="width:119px;">184 SIL ELAST KIT</td>
			<td style="width:367px;">&#160;Make ahead of time for fiber dissection. Mix 5 ml liquid Sylgard components and pour into a 60-mm glass Petri dish and waiting 48 hr to let the Sylgard compound become clear, colorless solid substrate.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60-mm glass petri dish&#160;</td>
			<td style="width:111px;">Pyrex</td>
			<td style="width:119px;">3160</td>
			<td>Fiber dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isotonic Tyrode Solution&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Minimal Ca2+ Tyrode Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hypotonic Tyrode Solution&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">collagenase type I&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-5138</td>
			<td>Fiber digestion&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Fluo-4 AM&#160;</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td>F14201</td>
			<td>Fluorescent Ca2+ imaging dyes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TMRE</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td>T669</td>
			<td>mitochondrial membrane potential fluorescent dyes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Delta TPG dishes&#160;</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td style="width:119px;">0420041500C</td>
			<td>35 mm glass bottom dish for imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Spark Fit software</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>data analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:195px;">Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope</td>
			<td style="width:111px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">3 axis micromanipulator</td>
			<td style="width:111px;">Narishige International</td>
			<td style="width:119px;">MHW-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">temperature controllable orbital shaker</td>
			<td style="width:111px;">New Brunswick scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Fiber dissociation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of calcium sparks in intact skeletal muscle fibers

恒常性のCa 2 +シグナル伝達を維持することは、生細胞における根本的な生理学的プロセスである。 Ca 2 +の火花は、非常に筋小胞体（SR）膜上のチャネルを解放する+（のRyR）CAリアノジン受容体を介したCa 2 +放出事象2をローカライズされた表示される横紋筋線維内Ca 2 +シグナル伝達の基本単位である。適切な評価筋のCa 2 +の火花が健康で病気にかかった横紋筋の細胞内Ca 2 +ハンドリング性に関する情報を提供することができる。のCa 2 +のイベントは、一般に静止心筋細胞に見られる火花が、それらはほとんど骨格筋線維休止に観察されない、したがって、骨格筋線維における火花を生成し、分析する方法が必要である。 ここで詳述Fを使用して孤立した屈筋digitormブレビス（FDB）筋線維中のCa 2 +スパークを測定するための実験的なプロトコルですluorescentのCa 2 +ウインカ及びレーザー走査共焦点顕微鏡。このアプローチでは、単離されたFDB繊維は等張生理溶液への復帰に続いて、過渡低浸透圧ストレスにさらされている。これらの条件下で、ロバスト性Ca 2 +応答は、若い健康なFDB筋線維の筋細胞膜に隣接して検出される火花。改変されたCa 2 +応答をジストロフィーまたはエージング骨格筋線維が検出された火花。このアプローチは、最近、膜脱制限シグナリングイノシトールの間のクロストーク（1,4,5） -三リン酸を受容体（IP 3 R）が関与することを示したとのRyRは、Ca骨格筋における2 +スパークの活性化に貢献しています。要約すると、浸透圧ストレスを用いた我々の研究は、2 +スパークがこの細胞内応答は、生理学における筋肉のシグナル伝達機構を反映していることを示し、筋ジストロフィー（mdxマウス）または筋萎縮性側索硬化症のマウスモデルを含む老化/疾患状態のCaを誘導した（ALSモデル）。

以前の研究では、末梢のCa 2 +誘起過渡低浸透圧ストレスが無傷筋線維11内の筋細胞膜に隣接火花ことを示した。1は滑らか筋細胞膜および特性明確な条線との完全なシングル筋繊維のイメージを示します。 図2は、典型的なCa 2 +のを示しています（XY画像など）火花が若く、健康なマウスからのFDB筋線維を膨潤低浸透?...

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Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

直接カルシウム火花を測定する方法は、ここにある説明のCa 2 +の基本単位は、無傷の骨格筋線維の筋小胞体からの放出。この方法では、孤立した筋線維におけるリアノジン受容体からのCa 2 +放出の浸透圧ストレス媒介トリガを利用しています。ダイナミクスおよび細胞内Ca 2 +シグナル伝達の恒常性能力は、健康および疾患における筋肉機能を評価するために使用することができる。

無傷骨格筋線維内のカルシウムスパークスの評価

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

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Research

JoVE Journal

Biology

15.1K ビュー.  The Ohio State University Wexner Medical Center. 直接カルシウム火花を測定する方法は、ここにある説明のCa 2 +の基本単位は、無傷の骨格筋線維の筋小胞体からの放出。この方法では、孤立した筋線維におけるリアノジン受容体からのCa 2 +放出の浸透圧ストレス媒介トリガを利用しています。ダイナミクスおよび細胞内Ca 2 +シグナル伝達の恒常性能力は、健康および疾患におけ?...

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Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

大人と胚骨格筋のMicroexplantの文化と骨格筋幹細胞の単離

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

生物学

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

生細胞におけるストア作動性カルシウムエントリの蛍光ベースの測定：培養癌細胞から骨格筋線維に

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

隔離された骨格筋の収縮、倦怠感や交互の ex vivo での評価

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.

Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

高解像度の呼吸計測測定のための差動遠心分離することにより骨格筋から無傷ミトコンドリアの単離

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

High-Throughput Contractile Measurements of Hydrogel-Embedded Intact Mouse Muscle Fibers Using an Optics-Based System

In vitro cell culture is a powerful tool to assess cellular processes and test therapeutic strategies. For skeletal muscle, the most common approaches involve either differentiating myogenic progenitor cells into immature myotubes or the short-term ex vivo culture of isolated individual muscle fibers. A key benefit of ex vivo culture over in vitro is the retention of the complex cellular architecture and contractile characteristics. Here, we detail an experimental protocol for the isolation of intact flexor digitorum brevis muscle fibers from mice and their subsequent ex vivo culture. In this protocol, muscle fibers are embedded in a fibrin-based and basement membrane matrix hydrogel to immobilize the fibers and maintain their contractile function. We then describe methods to assess the muscle fiber contractile function using an optics-based, high-throughput contractility system. The embedded muscle fibers are electrically stimulated to induce contractions, after which their functional properties, such as sarcomere shortening and contractile velocity, are assessed using optics-based quantification. Coupling muscle fiber culture with this&#160;system allows for high-throughput testing of the effects of pharmacological agents on contractile function and ex vivo studies of genetic muscle disorders. Finally, this protocol can also be adapted to study dynamic cellular processes in muscle fibers using live-cell microscopy.

Skeletal muscle function can be assessed by quantifying the contractility of isolated muscle fibers, traditionally using laborious, low-throughput approaches. Here, we describe an optics-based, high-throughput method to quantify the contractility of hydrogel-embedded muscle fibers. This approach has applications for drug screening and therapeutic development.

光学系を用いたヒドロゲル包埋無傷マウス筋線維のハイスループット収縮測定(英語)

In vitro cell culture is a powerful tool to assess cellular processes and test therapeutic strategies. For skeletal muscle, the most common approaches ...

天然骨格筋細胞における機能的部位特異的蛍光測定法

Functional Site-Directed Fluorometry in Native Cells to Study Skeletal Muscle Excitability

Functional site-directed fluorometry has been the technique of choice to investigate the structure-function relationship of numerous membrane proteins, including voltage-gated ion channels. This approach has been used primarily in heterologous expression systems to simultaneously measure membrane currents, the electrical manifestation of the channels&#39; activity, and fluorescence measurements, reporting local domain rearrangements. Functional site-directed fluorometry combines electrophysiology, molecular biology, chemistry, and fluorescence into a single wide-ranging technique that permits the study of real-time structural rearrangements and function through fluorescence and electrophysiology, respectively. Typically, this approach requires an engineered voltage-gated membrane channel that contains a cysteine that can be tested by a thiol-reactive fluorescent dye. Until recently, the thiol-reactive chemistry used for the site-directed fluorescent labeling of proteins was carried out exclusively in Xenopus oocytes and cell lines, restricting the scope of the approach to primary non-excitable cells. This report describes the applicability of functional site-directed fluorometry in adult skeletal muscle cells to study the early steps of excitation-contraction coupling, the process by which muscle fiber electrical depolarization is linked to the activation of muscle contraction. The present protocol describes the methodologies to design and transfect cysteine-engineered voltage-gated Ca2+ channels (CaV1.1) into muscle fibers of the flexor digitorum brevis of adult mice using in vivo electroporation and the subsequent steps required for functional site-directed fluorometry measurements. This approach can be adapted to study other ion channels and proteins. The use of functional site-directed fluorometry of mammalian muscle is particularly relevant to studying basic mechanisms of excitability.

著者スポットライト:骨格筋の興奮性を研究するためのネイティブ細胞における機能的部位指向蛍光測定  

Functional site-directed fluorometry is a method to study protein domain motions in real time. Modification of this technique for its application in native cells now allows the detection and tracking of single voltage-sensor motions from voltage-gated Ca2+ channels in murine isolated skeletal muscle fibers.

骨格筋興奮性を研究するための天然細胞における機能部位特異的蛍光測定

Functional site-directed fluorometry has been the technique of choice to investigate the structure-function relationship of numerous membrane proteins, ...

脱細胞化による骨格筋脂肪浸潤の定量化

Decellularization-Based Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration

Fatty infiltration is the accumulation of adipocytes between myofibers in skeletal muscle and is a prominent feature of many myopathies, metabolic disorders, and dystrophies. Clinically in human populations, fatty infiltration is assessed using noninvasive methods, including computed tomography (CT), magnetic resonance imaging (MRI), and ultrasound (US). Although some studies have used CT or MRI to quantify fatty infiltration in mouse muscle, costs and insufficient spatial resolution remain challenging. Other small animal methods utilize histology to visualize individual adipocytes; however, this methodology suffers from sampling bias in heterogeneous pathology. This protocol describes the methodology to qualitatively view and quantitatively measure fatty infiltration comprehensively throughout intact mouse muscle and at the level of individual adipocytes using decellularization. The protocol is not limited to specific muscles or specific species and can be extended to human biopsy. Additionally, gross qualitative and quantitative assessments can be made with standard laboratory equipment for little cost, making this procedure more accessible across research laboratories.

著者スポットライト:骨格筋脂肪浸潤の脱細胞化に基づく定量化  

The present study describes decellularization-based methodologies for visualizing and quantifying intramuscular adipose tissue (IMAT) deposition through intact muscle volume, as well as quantifying metrics of individual adipocytes that comprise IMAT.