記事を校正してくれたElizabeth Benevidesに感謝します。私たちはDrsに感謝します。ジョン・ハスマンとジーン・ブラットが彼らの有益な議論とコメントのために語った。

1.神経前駆細胞の作製<ol><li> 小分子を補充したヒトiPSC培地（材料表参照）中のγ-照射マウス胚性フィーダー（MEF）細胞層上の6ウェルプレート中の線維芽細胞およびPBMC由来のhiPSCを維持する。 注：毎日のメンテナンスは、以前に報告された手順1、16の修正版です。 <ol><li> 6ウェル組織培養グレードプレートの各ウェルに300μL/ウェルの推奨培地（製造業者のプロトコールに従って）に6×10 5個の MEFをプレートする。 </li><li> 48時間後、hiPSCを添加する前に、MEF培地を300μL/ウェルのhiPSC培地で1時間交換する。 </li><li> 37℃の水浴でhiPSCをすばやく解凍し、1mLのhiPSC培地をゆっくりと滴下します。 hiPSCと培地を15 mLコニカルチューブに移す。培地を加えて総容量を5 mLにする。 129xgで4分間遠心分離し、上清を吸引する1：1000濃度のROCK阻害剤を含む1mLのhiPSC培地中でペレットを静かに再懸濁する。 </li><li> MEF細胞層上に（典型的には30万細胞/ウェルで播種した）細胞懸濁液をプレートし、37℃、5％CO 2、湿度95％でインキュベートします。 </li><li> iPSC培養を光学顕微鏡を用いて密接にモニターする。 48時間後に、不均一な縁を有する培養物を除去し、嚢胞様になるまで増殖させるか、または光学顕微鏡下で黄褐色に見えるようにして自発的分化を最小化する。 注：7〜10日後、hiPSCコロニーが形成されるはずです。コロニーは、境界が明確に定められ、細胞密度が均一であり、緩やかに充填された不均一な細胞がない丸いものでなければなりません。 </li><li>自発的に分化した細胞の培養をクリアするために、丸いhiPSCコロニーを手動で選択する。コロニーを新鮮なMEF層に置くことによってコロニーを広げる。とき文化コンフルエントとフリーズ1、16近くに7日ごとに3：1を展開します。 </li></ol></li><li>増殖および凍結細胞（バックアップ用）の後、それらが50〜75％コンフルエントに達するまでプレート上でhiPSCコロニーを増殖させる。 </li><li> 7日間のプレーティング後、軽度の酵素処理（300μLの酵素溶液で5〜10分）および穏やかな粉砕（1000μLピペットで2〜4回）を行い、神経前駆細胞分化のためのhiPSCを採取および調製する。 </li><li> 129xgで4分間細胞懸濁液を遠心分離し、上清を吸引し、ペレットを5mLのヒトiPSC培地に再懸濁する。 37℃で1時間、細胞懸濁液を0.1％ゼラチンコート5cm細胞培養皿に移し、MEFを除去し、hiPSC収率を最大にする。他の5cmゼラチンコートディッシュに培地（非付着細胞を含む）を移す。 </li><li>トランスファーピペットを使用して、非接着細胞を15mL遠心管に移す。 3 mL培地でプレートを静かにすすぎ、15 mLチューブに加えます。 </li><li> 129xgで4分間細胞懸濁液を遠心分離し、超遠心分離機を吸引する培地にペレットを静かに再懸濁する。自動細胞計数器を用いて細胞数を決定する。 96ウェルの低接着性のV底プレートに9,000細胞/ウェルのプレート。 </li><li>プレートを163×gで3分間遠心分離する。 37℃、湿度95％、CO 2 5％でプレートをインキュベートする。ピペットを使用して、1日おきに培地の半分を取り出し、新鮮な化学的に定義された分化培地1（DM1; 図1 ; Table of Materials）で14日間交換することにより、50％培地を交換する。 </li></ol> 2.無血清胚様体（SFEB）誘導（ 図2 ） <ol><li> 6ウェルプレートに40μmの細胞培養インサートを置き、凝集物の添加の少なくとも1時間前に1mLのDM1培地を加える。 </li><li> 14日目に、40μlの細胞培養インサート上に200μLの幅のある先端チップを用いて20μlの培地で凝集物を移し、培地をDM2に変更する。 <br/&gt;注：細胞培養インサートは、ウェルの底面から少し離れて位置する特殊なインサートで、ポリテトラフルオロエチレン膜がプラスチックフレームに吊されています。この膜は生体適合性があり、上に置かれるSFEBへの栄養素および酸素輸送を効率的に維持することができる。それらは一般にマウスまたはラット7、17、18から採取した器官型海馬スライス培養で使用されています。 <ol><li>一つの細胞培養インサートに4-6個の凝集体を移し、凝集体の間に十分な空間を確保する。微細なピペットチップ（ 例えば、 200μLチップ）を使用して、可能な限り過剰な溶液を除去する。 注：SFEBの周りから取り除かれた溶液として、細胞培養インサート上を移動するので、SFEBを短時間妨げることは許容される。 </li><li> 37℃、湿度95％、5％CO 2で1mLのDM2で培養物を維持する。ピペットを使用して、75％媒体の3/4を取り除き、3/4の新鮮な媒体に交換することによって、1日おきに培地を交換する。例えば、750μLの培地を除去し、750μLの新鮮な培地を加える。 </li></ol></li><li>培養の14日後、1日おきに、そしてさらに16日間、75％培地交換でDM3培地に切り替える。 </li><li> 30日を超えて細胞培養挿入物上のSFEBを維持するために、培地を60,90および120日間毎日交換する。 注：SFEBは直径約1,000μmまで成長し、通常100-150μmの厚さになります1 。 </li></ol> 3. SFEB組成の決定<ol><li> 200μLの広口ピペットチップを使用して、培地をゆっくりピペッティングすることにより、インサートからSFEBを分離する。 SFEBを移送するには、広い口のピペットチップを使用してピペットの先端に軽く体を吸引します。 SFEBをピペットチップにロードした後、12ウェルプレートに静かに移し、300μLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）/ウェル。 注：SFEBは12ウェルプレート中の溶液中に懸濁する。これは、固定剤、ブロッキング溶液、および抗体の完全な浸透を可能にするために重要である。染色に複数のSFEBを使用する場合、12ウェルプレートの1ウェルあたり最大10のSFEBを添加することができる。これは溶液と抗体を保存します。 </li><li> 1ウェルあたり300μLの4％パラホルムアルデヒドを含むSFEBを室温で30〜45分間固定する。固定したSFEBを300μLのPBSで2回、各洗浄で3〜5分間洗浄する。 注意：パラホルムアルデヒドを取り扱う際は、適切な個人用保護具を着用してください。 注：この研究のニワトリのTuj1でニューロンをマークする成熟、細胞タイプ等を決定するためのマーカーに対する免疫反応のためのプローブが1で使用した：追加のマーカーについて、500、表2及び参考文献1、16を参照してください。 </li><li> 0.1％Triton-X100をPBSおよび10％正常ロバ血清（ブロッキング溶液;300μl; 1ウェルあたりL）で室温で1時間インキュベートした。 </li><li>ブロッキング溶液を除去し、ブロッキング溶液中の一次抗体300μLでSFEBを処理する。 4℃で一晩インキュベートする。 0.1％トリトン-Xを含む300μLのPBS中でSFEBを3回洗浄する（1回の洗浄につき3〜5分）。 </li><li>二次抗体をブロッキング溶液で1：1000に調製する。二次抗体を用いてSFEBを室温で1時間インキュベートする。 300μLのPBSでSFEBを洗浄し、それぞれ3〜5分間3回洗浄する。 注：この段階でSFEBはイメージングの準備ができます。 </li><li>画像を得るには、ワイドボアピペットを用いてガラススライド上にSFEBをピペットで入れる。静かな吸引を使用して、SFEB周囲の余分な溶液を除去する。 注：同様の染色条件では、複数のSFEBを同じスライドガラスに置くことができます。 </li><li> SFEB上に1滴の封入剤を加え、ガラスカバースリップを置き、軽く押して気泡がないことを確認します。マウントメディアを固めて、イメージングと定量に進みます（ステップ3.8）。 <br/&gt;注：マウント媒体が硬化した後、SFEBはイメージングの準備ができています。 </li><li> SFEB横切って関心領域（ROI）の複数の領域を取り、参考文献1、16に記載されているように、標準的な共焦点顕微鏡で各ROIを介して最大の投影画像と合成Zスタックを用いて、細胞の定量を行います。 注：全体SFEBsは画像ベースのタイルを（詳細は参考文献1、16を参照）を用いて定量することができます。 SFEBは約100μmまで薄いので、組織内での光の散乱が最小であり、したがって、2光子顕微鏡検査の必要性はない。線維芽細胞由来のiPS細胞でこのプロトコルの以前の用途はCGEおよび前前脳運命1、16に類似していた転写アイデンティティと介在ニューロンの亜集団で複雑かつ多様な構造を明らかにしたSFEB運命マップを生成しました。 </sup&gt; </li></ol> 4. MEAを用いたSFEBにおける神経活動の記録<ol><li>製造元の指示に従って12ウェルMEAプレートを調製する。 </li><li> MEAプレートを無菌条件下で滅菌H 2 Oで5分間3回洗浄して洗浄する。 75％エタノールで5分間洗浄し、次に100％エタノールで洗浄してプレートを滅菌する。 </li><li>プレートをオーブンで50°Cで4〜5時間反転させて滅菌処理を完了させます。 </li><li>各ウェルに500μLの0.2％ポリエチレンイミン溶液（PEI）を添加し、室温で1時間インキュベートする。 PEIを吸引し、滅菌蒸留H 2 Oでウェルを4回洗浄する。フード内で一晩空気を乾燥させる。 </li><li> L15培地中のラミニンの20μL/ mL溶液を調製し、各ウェルの中央に10μLのラミニンを添加する。 注記：周囲の参照電極と接地電極を被覆しないでください。 </li><li>培地またはラミニンの蒸発を防ぐために、周囲のリザーバに滅菌dH 2 Oを添加する。プレートを37℃で1時間インキュベートする。 </li><li> SFEB（セクション1および2を参照）を、ラミニンコーティングされたMEAプレートに、それらを静かに広口ピペットチップに吸引し、それらを移すことによって添加する。各ウェルにDM2培地200μLを添加し、37℃、湿度95％および5％CO 2で一晩インキュベートする。 </li><li> 24時間後に200μLの培地を追加し、プレートを読み取る前に37℃、湿度95％、5％CO 2で30分間回復させる。 </li><li> MEAプレートをプレートリーダー（37℃に予熱）に入れ、神経活動を記録する。関連するMEAレコーディングソフトウェアで10分間活動を記録する。詳細は、参考文献19を参照してください。 </li><li>統計分析ソフトウェアを使用して、未処理のデータ連続ストリームおよびニューロン活動のラスタプロットを生成します19 。 注：MEA記録は、SFEBメッキの7日後に撮影されます。この研究のために、記録を10分間行い、ネットワークバースト活性を検出した漸進的なトレース、およびラスタプロットが含まれます。 SFEBはMEAプレート上で長期間維持することができ、環境的に制御された条件を用いて長期間にわたって記録することができます（ 図6 ）。 </li></ol>

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著者には競合する金銭的利益はない。

本明細書に記載のプロトコルは、hiPSC供給源を、前頭皮質の初期発達段階を再現する3-D構造に区別するための条件を提供する。この手順は、電気生理学のために調べることができ、顕微鏡検査も受け入れやすい構造をもたらす。 SFEBの最終形態は、器官型脳スライス培養のものに似ており、高品質の詳細な共焦点イメージングを可能にする。このプロトコルは、線維芽細胞および末梢血単核細...

私たちはこれまで、ヒト由来の多能性幹細胞（hiPSCs）由来の患者由来の3次元モデルシステムを報告しましたが、これは早期皮質ネットワーク開発のいくつかの側面を再現しています1 。この3-Dモデル、無血清胚様体（SFEB）は、以前の単純な集約hiPSCモデル2,3に向上します。仕事の成長体は、5 /単層hiPSCモデル4私達のSFEBsような3-D構造が、神経発生のおおよその態様は、一般的にインビボおよび2次元（2-D）で観察されるより前の時点で観察されたことが明らかにされています。初期の研究は、生理学的複雑性2を示さずに3次元物体の自己組織化の複雑さに焦点を当てている2 。 本明細書に記載のプロトコルは、線維芽細胞由来の未分化hiPSCおよび<html>末梢血単核細胞（PBMC）である。これらの細胞はγ線照射マウス胚性フィーダー（MEFs）上で維持される。これらのhiPSCコロニーを、自然に分化した細胞を手動で洗浄し、酵素的に採取し、Rhoキナーゼ阻害剤Y-27632（ROCKi）を含有する培地中に再懸濁する。未分化hiPSCを解離および遠心分離に供してから、96ウェルの低接着V底プレートに移す。プレーティング後、前頭前野前脳ニューロン運命系統6を駆動するために、二重SMAD阻害（SB431542およびdNK193189とDickkopf1（DKK-1））を用いて神経誘導を開始する。 14日後、SFEBを6ウェルプレートの細胞培養インサートに移す。一旦移されると、丸いSFEBは、同様の細胞培養インサート1を用いて海馬の器官型スライス培養物調製物でしばしば観察されるように、局所ネットワーク接続を維持しながら、広がり始め、ss = &quot;xref&quot;&gt; 7。 この形式のSFEBに基づく3Dプラットフォームの使用は、カルシウムイメージングまたは電気生理学的アッセイ（例えば、単細胞記録または多電極アレイ（MEA）などの細胞ベースの生理学的アッセイを用いて調べることができる皮質ネットワークの効率的な産生に適している。 ） 1 。 3-Dシステムは早期皮質発達のマーカーを担っているが、他の研究では、これらの3-D体は本質的に遅いヒト組織発生のペースを可能にするためにより長いインキュベーション時間を必要とすることが示されている8 。このSFEBプロトコルは、皮質の初期発生の局面を捕捉する未分化hiPSCからの3-D SFEBを首尾よく生成する。 神経学的障害におけるネットワーク異常をモデル化するためのSFEBの可能性は、このシステムの強みである。患者の組織由来のhiPSCsは、お尻になる神経系の細胞に成長することができます細胞生物学および付随する遺伝子発現に関するものである。ヒトiPS細胞は、自閉症スペクトラム障害（ASD）、統合失調症9、レット症候群10、およびアルツハイマー病11、12のような複雑な病因を有する神経障害を変化させ、個人の大きなグループの遺伝子プロファイルを確認するために使用されています。最近まで、iPSCモデルは、典型的には、分子相互作用の評価に堪能ではあるが、インビボで見られる複雑な細胞相互作用を解読するには不十分な単層調製物であった。動物モデルは、全臓器プラットフォームを再現するためのデフォルトの代替物である。これらの動物モデルは、所見の翻訳の貧弱さに悩まされ、大規模な遺伝子スクリーニング研究によって同定されたヒト遺伝子プロファイルを複製する能力が限られている。従って、iPSCからの3-Dシステムの開発は、人間に必要な複雑さの層を加える疾患モデル13、14。 3D hiPSCプラットフォームの次のステップは、細胞ベースのアッセイを用いたハイスループットスクリーニングの大規模要件に対応することです15 。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;SFEB Neuronal Differentiation Cell culture Media. Reagents. Components&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff Neural Induction Medium (hiPSC Media)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>0-5835</td><td>250 mL</td></tr><tr><td>PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media)</td><td>GlobalStem</td><td>GSM-2001</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;DM1 Media Components&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1</td><td>Invitrogen</td><td>10565018</td><td>385 mL</td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td>20% 100 mL</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>Glutamax 200 mM</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution 10 mM (100x), liquid</td><td>Invitrogen</td><td>11140050</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol (1,000x), liquid</td><td>Invitrogen</td><td>21985023</td><td>900 &amp;mu;L</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;DM2 Media Components&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1</td><td>Invitrogen</td><td>10565018</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Glutamax 200 mM</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100x), liquid</td><td>Invitrogen</td><td>17502048</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;DM3 Media Components&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEUROBASAL Medium (1x), liquid</td><td>Invitrogen</td><td>21103049</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>B-27 Supplement Minus Vitamin A (50x), liquid</td><td>Invitrogen</td><td>12587010</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Glutamax 200 mM</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Small Molecules&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thiazovivin</td><td>Stemgent</td><td>04-0017</td><td>2 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Stemgent</td><td>04-0010-10</td><td>1:1,000 (10 &amp;mu;M)</td></tr><tr><td>Dorsomorphin</td><td>Stemgent</td><td>04-0024</td><td>1 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>LDN-193189</td><td>Stemgent</td><td>04-0074-10</td><td>250 nM</td></tr><tr><td>Y27632 (ROCKi)</td><td>Stemgent</td><td>04-0012-10</td><td>10 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Recombinant Protiens&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DKK-1</td><td>Peprotech</td><td>120-30</td><td>200 ng/mL</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Components/Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture inserts 0.4 &amp;mu;M, 30mm Diameter</td><td>Millicell</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Embryonic Fibroblasts</td><td>GlobalStem</td><td>GSC-6301G</td><td></td></tr><tr><td>96 well V bottom w/Lids</td><td>Evergreen</td><td>222-8031-01V</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td><td>ThermoFisher</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>ThermoFisher</td><td>85111</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum</td><td>Jackson Labs</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz&#039;s L-15 Medium</td><td>ThermoFisher</td><td>11415114</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>DRAQ5 (Nuclear Marker)</td><td>ThermoFisher</td><td>65-0880-96</td><td></td></tr><tr><td>MEA Plates</td><td>Axion Biosystems</td><td>M768-GL1-30Pt200</td><td></td></tr><tr><td>6 well flat bottom</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibody&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Millipore</td><td>MAB5326</td><td></td></tr><tr><td>Brn-2</td><td>Protein tech</td><td>14596-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>VGLUT1</td><td>Synaptic Systems</td><td>135 303</td><td></td></tr><tr><td>Pax6</td><td>abcam</td><td>ab5790</td><td></td></tr><tr><td>Calretinin</td><td>abcam</td><td>ab702</td><td></td></tr><tr><td>Calbindin</td><td>abcam</td><td>ab11426</td><td></td></tr><tr><td>CoupTFII</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>PPH714700</td><td></td></tr><tr><td>Nkx 2.1</td><td>abcam</td><td>ab12650</td><td></td></tr><tr><td>Tuj1</td><td>abcam</td><td>ab41489</td><td></td></tr><tr><td>Reelin</td><td>Millipore</td><td>MAB5364</td><td></td></tr><tr><td>Tbr1</td><td>Millipore</td><td>MAB2261</td><td></td></tr><tr><td>NFH</td><td>Dako</td><td>M0762</td><td></td></tr></tbody></table>

developing hipsc derived serum free embryoid bodies for the interrogation of 3-d stem cell cultures using physiologically relevant assays

hiPSCsを使用して多数のin vitro疾患モデルが開発されているが、これらの2次元（2D）システムは、疑わしい疾患の変異を有する罹患者の基礎的な細胞構造および機能の複雑さを表さない可能性がある。従来の2次元モデルは、インビボのような構造の不完全な表現であり、脳の複雑さを適切に捕捉しない。したがって、 in vivo系で見られる細胞相互作用および機能をよりよく再現できる、より多くの3-D hiPSCベースのモデルが必要となっている。 ここでは、無血清胚様体（SFEB）に基づく未分化hiPSCからの3-D系を開発するためのプロトコールを報告する。この3-Dモデルは、発達中の腹側新皮質の局面を反映しており、泳動、接続性、通信およびマットのような生きた神経細胞およびインタクトな組織に不可欠な機能への研究を可能にする期間。具体的には、本発明者らのプロトコールを用いたSFEBは、カルシウムイメージング、および凍結切除なしの多電極アレイ（MEA）記録のような生理学的に関連した高含量細胞ベースのアッセイを用いて調べることができることを示す。 MEA記録の場合、我々はSFEBが長期間の培養中にスパイク活性およびネットワークレベル破裂活性の両方を増加させることを示す。このSFEBプロトコルは、早期皮質発達の局面を捕捉する3-Dモデルにおけるネットワーク形成の発展の研究のための堅牢でスケーラブルなシステムを提供する。

本発明者らの技術を用いて増殖させたSFEBは、初期の発達中の皮質下脳室ゾーンに類似した形態学的特徴を有する組織をもたらし、広範囲のTuj1陽性ニューロンならびに神経前駆細胞（ 図3A ）が充満した。 SFEBの外層および内層には、数多くの発育中の皮質のロゼットが観察された（ 図3B ）。 SFEBの外縁は、分裂終了ニュー?...

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Developing HiPSC Derived Serum Free Embryoid Bodies for the Interrogation of 3-D Stem Cell Cultures Using Physiologically Relevant Assays

ここでは、無血清胚様体（SFEB）と呼ばれるヒト誘導多能性幹細胞（hiPSC）から3次元（3-D）システムを開発するためのプロトコールを報告する。この3-Dモデルは、器質型のスライス培養のように、ヒトの皮質の発達をモデル化するため、および神経回路を発達させる生理学的な質問のために使用することができる。

生理学的に関連性のあるアッセイを用いた3-D幹細胞培養物の調査のためのHiPSC由来の無血清胚様体の開発

Although a number of in vitro disease models have been developed using hiPSCs, one limitation is that these two-dimensional (2-D) systems may not ...

developing-hipsc-derived-serum-free-embryoid-bodies-for-interrogation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.8K ビュー.  The Hussman Institute for Autism. ここでは、無血清胚様体（SFEB）と呼ばれるヒト誘導多能性幹細胞（hiPSC）から3次元（3-D）システムを開発するためのプロトコールを報告する。この3-Dモデルは、器質型のスライス培養のように、ヒトの皮質の発達をモデル化するため、および神経回路を発達させる生理学的な質問のために使用することができる。 

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Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells inside of 3D biomaterial scaffolds provides a way to accurately mimic these microenvironments, providing an advantage over traditional 2D culture methods using polystyrene as well as a method for engineering replacement tissues 2. While 2D tissue culture polystrene has been used for the majority of cell culture experiments, 3D biomaterial scaffolds can more closely replicate the microenvironments found in vivo by enabling more accurate establishment of cell polarity in the environment and possessing biochemical and mechanical properties similar to soft tissue.3 A variety of naturally derived and synthetic biomaterial scaffolds have been investigated as 3D environments for supporting stem cell growth. While synthetic scaffolds can be synthesized to have a greater range of mechanical and chemical properties and often have greater reproducibility, natural biomaterials are often composed of proteins and polysaccharides found in the extracelluar matrix and as a result contain binding sites for cell adhesion and readily support cell culture. Fibrin scaffolds, produced by polymerizing the protein fibrinogen obtained from plasma, have been widely investigated for a variety of tissue engineering applications both in vitro and in vivo 4. Such scaffolds can be modified using a variety of methods to incorporate controlled release systems for delivering therapeutic factors 5. Previous work has shown that such scaffolds can be used to successfully culture embryonic stem cells and this scaffold-based culture system can be used to screen the effects of various growth factors on the differentiation of the stem cells seeded inside 6,7.
 This protocol details the process of polymerizing fibrin scaffolds from fibrinogen solutions using the enzymatic activity of thrombin. The process takes 2 days to complete, including an overnight dialysis step for the fibrinogen solution to remove citrates that inhibit polymerization. These detailed methods rely on fibrinogen concentrations determined to be optimal for embryonic and induced pluripotent stem cell culture. Other groups have further investigated fibrin scaffolds for a wide range of cell types and applications - demonstrating the versatility of this approach 8-12.

This work details the preparation of 3D fibrin scaffolds for culturing and differentiating plutipotent stem cells. Such scaffolds can be used to screen the effects of various biological compounds on stem cell behavior as well as modified to contain drug delivery systems.

幹細胞培養アプリケーションのための3Dフィブリン足場の調製

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

生物工学

Serum Free Production of Three-dimensional Human Hepatospheres from Pluripotent Stem Cells

The development of renewable sources of liver tissue is required to improve cell-based modelling, and develop human tissue&#160;for transplantation. Human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) represent promising sources of human liver spheres. We have developed a serum free and defined method of cellular differentiation to generate three-dimensional human liver spheres formed from human pluripotent stem cells. A potential limitation of the technology is the production of dense spheres with dead material inside. In order to circumvent this, we have employed agarose microwell technology at defined cell densities to control the size of the 3D spheres, preventing the generation of apoptotic and/or necrotic cores.&#160; Notably, the spheres generated by our approach display liver function and stable phenotype, representing a valuable resource for basic and applied scientific research. We believe that our approach could be used as a platform technology to develop further tissues to model and treat human disease and in the future may permit the generation of human tissue with complex tissue architecture.

This protocol describes an approach to produce hepatospheres from human pluripotent stem cells using a defined culture system and cell self-assembly. This protocol is reproducible in a number of cell lines, cost effective and allows the production of stable human hepatospheres for biomedical application.

多能性幹細胞からの3次元ヒト肝球の血清自由産生

The development of renewable sources of liver tissue is required to improve cell-based modelling, and develop human tissue&#160;for transplantation. Human ...

発生生物学

2D and 3D Human Induced Pluripotent Stem Cell-Based Models to Dissect Primary Cilium Involvement during Neocortical Development

Primary cilia (PC) are non-motile dynamic microtubule-based organelles that protrude from the surface of most mammalian cells. They emerge from the older centriole during the G1/G0 phase of the cell cycle, while they disassemble as the cells re-enter the cell cycle at the G2/M phase boundary. They function as signal hubs, by detecting and transducing extracellular signals crucial for many cell processes. Similar to most cell types, all neocortical neural stem and progenitor cells (NSPCs) have been shown harboring a PC allowing them to sense and transduce specific signals required for the normal cerebral cortical development. Here, we provide detailed protocols to generate and characterize two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cell-based models from human induced pluripotent stem cells (hIPSCs) to further dissect the involvement of PC during neocortical development. In particular, we present protocols to study the PC biogenesis and function in 2D neural rosette-derived NSPCs including the transduction of the Sonic Hedgehog (SHH) pathway. To take advantage of the three-dimensional (3D) organization of cerebral organoids, we describe a simple method for 3D imaging of in toto immunostained cerebral organoids. After optical clearing, rapid acquisition of entire organoids allows detection of both centrosomes and PC on neocortical progenitors and neurons of the whole organoid. Finally, we detail the procedure for immunostaining and clearing of thick free-floating organoid sections preserving a significant degree of 3D spatial information and allowing for the high-resolution acquisition required for the detailed qualitative and quantitative analysis of PC biogenesis and function.

We present detailed protocols for the generation and characterization of 2D and 3D human induced pluripotent stem cell (hIPSC)-based models of neocortical development as well as complementary methodologies enabling qualitative and quantitative analysis of primary cilium (PC) biogenesis and function.

2Dおよび3Dヒト人工多能性幹細胞ベースのモデルにより、新皮質発生中の原発性繊毛の関与を解剖

Primary cilia (PC) are non-motile dynamic microtubule-based organelles that protrude from the surface of most mammalian cells. They emerge from the older ...

Semi-Automated Phenotypic Analysis of Functional 3D Spheroid Cell Cultures

We present a protocol that describes the properties and advantages of using a standalone clinostat incubator for growing, treating, and monitoring 3D cell cultures. The clinostat mimics an environment where cells can assemble as highly reproducible spheroids with low shear forces and active nutrient diffusion. We demonstrate that both cancer and non-cancer hepatocytes (HepG2/C3A and THLE-3 cell lines) require 3 weeks of growth prior to achieving functionalities comparable to liver cells. This protocol highlights the convenience of utilizing incubators for 3D cells with cameras monitoring the cell growth, as snapshots can be taken to count and measure spheroids upon treatment. We describe the comparison of THLE-3 and HepG2/C3A cell lines, showing how non-cancerous cell lines can be grown as well as immortalized cancer cells. We demonstrate and illustrate how proteomics experiments can be conducted from a few spheroids, which can be collected without perturbing cell signaling, i.e., no trypsinization required. We show that proteomics analysis can be used to monitor the typical liver phenotype of respiratory chain metabolism and the production of proteins involved in metal detoxification and describe a semi-automated system to count and measure the spheroid's area. Altogether, the protocol presents a toolbox that comprises a phenotypic characterization via image capture and a proteomics pipeline to experiment on 3D cell culture models.

We present a protocol for growing high-reproducible spheroids and their phenotypic characterization using image capture and proteomics.

機能的3Dスフェロイド細胞培養の半自動表現型解析(英語)

We present a protocol that describes the properties and advantages of using a standalone clinostat incubator for growing, treating, and monitoring 3D cell ...

生化学

Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by several researchers. However, most of these investigators have used polyacrylamide hydrogels for stem cell culture in their studies. Therefore, their results are controversial because those results might originate from the specific characteristics of the polyacrylamide and not from the physical cue (stiffness) of the biomaterials. Here, we describe a protocol for preparing hydrogels, which are not based on polyacrylamide, where various stem, cells including human embryonic stem (ES) cells and human induced pluripotent stem (iPS) cells, can be cultured. Hydrogels with varying stiffness were prepared from bioinert polyvinyl alcohol-co-itaconic acid (P-IA), with stiffness controlled by crosslinking degree by changing crosslinking time. The P-IA hydrogels grafted with and without oligopeptides derived from extracellular matrix were investigated as a future platform for stem cell culture and differentiation. The culture and passage of amniotic fluid stem cells, adipose-derived stem cells, human ES cells, and human iPS cells is described in detail here. The oligopeptide P-IA hydrogels showed superior performances, which were induced by their stiffness properties. This protocol reports the synthesis of the biomaterial, their surface manipulation, along with controlling the stiffness properties and finally, their impact on stem cell fate using xeno-free culture conditions. Based on recent studies, such modified substrates can act as future platforms to support and direct the fate of various stem cells line to different linkages; and further, regenerate and restore the functions of the lost organ or tissue.

A protocol is presented to prepare polyvinyl alcohol-co-itaconic acid hydrogels with varying stiffness, which were grafted with and without oligopeptides, to investigate the effect of the stiffness of biomaterials on the differentiation and proliferation of stem cells. The stiffness of the hydrogels was controlled by the crosslinking time.

Xeno 無料条件下におけるさまざまな剛性とポリビニル アルコール Co イタコン酸ゲルのひと多能性幹細胞文化

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by ...

Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that correspond to primary germ layer formation during embryogenesis. Thus, these cells represent a powerful tool with which to examine the mechanisms that drive early human development. We have developed a method to culture human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates that provides control over both the geometry of the colonies and their mechanical environment in order to recapitulate the physical parameters that underlie embryogenesis. The key feature of this method is the ability to generate polyacrylamide hydrogels with defined patterns of extracellular matrix ligand at the surface to promote cell attachment. This is achieved by fabricating stencils with the desired geometric patterns, using these stencils to create patterns of extracellular matrix ligand on glass coverslips, and transferring these patterns to polyacrylamide hydrogels during polymerization. This method is also compatible with traction force microscopy, allowing the user to measure and map the distribution of cell-generated forces within the confined colonies. In combination with standard biochemical assays, these measurements can be used to examine the role mechanical cues play in fate specification and morphogenesis during early human development.

Extracellular matrix ligands can be patterned onto polyacrylamide hydrogels to enable the culture of human embryonic stem cells in confined colonies on compliant substrates. This method can be combined with traction force microscopy and biochemical assays to examine the interplay between tissue geometry, cell-generated forces, and fate specification.

組織レベルの力学を制御するための準拠基板上のヒト胚性幹細胞コロニーの幾何学的パターン化

Human embryonic stem cells demonstrate a unique ability to respond to morphogens in vitro by self-organizing patterns of cell fate specification that ...

Generation, High-Throughput Screening, and Biobanking of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are of paramount importance for human cardiac disease modeling and therapeutics. We recently published a cost-effective strategy for the massive expansion of hiPSC-CMs in two dimensions (2D). Two major limitations are cell immaturity and a lack of three-dimensional (3D) arrangement and scalability in high-throughput screening (HTS) platforms. To overcome these limitations, the expanded cardiomyocytes form an ideal cell source for the generation of 3D cardiac cell culture and tissue engineering techniques. The latter holds great potential in the cardiovascular field, providing more advanced and physiologically relevant HTS. Here, we describe an HTS-compatible workflow with easy scalability for the generation, maintenance, and optical analysis of cardiac spheroids (CSs) in a 96-well-format. These small CSs are essential to fill the gap present in current in vitro disease models and/or generation for 3D tissue engineering platforms. The CSs present a highly structured morphology, size, and cellular composition. Furthermore, hiPSC-CMs cultured as CSs display increased maturation and several functional features of the human heart, such as spontaneous calcium handling and contractile activity. By automatization of the complete workflow, from the generation of CSs to functional analysis, we increase intra- and inter-batch reproducibility as demonstrated by high-throughput (HT) imaging and calcium handling analysis. The described protocol allows modeling of cardiac diseases and assessing drug/therapeutic effects at the single-cell level within a complex 3D cell environment in a fully automated HTS workflow. In addition, the study describes a straightforward procedure for long-term preservation and biobanking of whole-spheroids, thereby providing researchers the opportunity to create next-generation functional tissue storage. HTS combined with long-term storage will substantially contribute to translational research in a wide range of areas, including drug discovery and testing, regenerative medicine, and the development of personalized therapies.

Presented here is a set of protocols for the generation and cryopreservation of cardiac spheroids (CSs) from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes cultured in a high-throughput, multidimensional format. This three-dimensional model functions as a robust platform for disease modeling, high-throughput screenings, and maintains its functionality after cryopreservation.

ヒト誘起多能性幹細胞由来心臓スフェロイドの作製、ハイスループットスクリーニング、バイオバンキング

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are of paramount importance for human cardiac disease modeling and therapeutics. We ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

無血清全胚培養系で、マウス胚発生

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

生物学

iPS細胞からの効率的なヒト腸オルガノイド生成のためのマトリックス比較

Comparative Study of Basement-Membrane Matrices for Human Stem Cell Maintenance and Intestinal Organoid Generation

Extracellular matrix (ECM) plays a critical role in cell behavior and development. Organoids generated from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) are in the spotlight of many research areas. However, the lack of physiological cues in classical cell culture materials hinders efficient iPSC differentiation. Incorporating commercially available ECM into stem cell culture provides physical and chemical cues beneficial for cell maintenance. Animal-derived commercially available basement membrane products are composed of ECM proteins and growth factors that support cell maintenance. Since the ECM holds tissue-specific properties that can modulate cell fate, xeno-free matrices are used to stream up translation to clinical studies. While commercially available matrices are widely used in hiPSC and organoid work, the equivalency of these matrices has not been evaluated yet. Here, a comparative study of hiPSC maintenance and human intestinal organoids (hIO) generation in four different matrices: Matrigel (Matrix 1-AB), Geltrex (Matrix 2-AB), Cultrex (Matrix 3-AB), and VitroGel (Matrix 4-XF) was conducted. Although the colonies lacked a perfectly round shape, there was minimal spontaneous differentiation, with over 85% of the cells expressing the stem cell marker SSEA-4. Matrix 4-XF led to the formation of 3D round clumps. Also, increasing the concentration of supplement and growth factors in the media used to make the Matrix 4-XF hydrogel solution improved hiPSC expression of SSEA-4 by 1.3-fold. Differentiation of Matrix 2-AB -maintained hiPSC led to fewer spheroid releases during the mid-/hindgut stage compared to the other animal-derived basement membranes. Compared to others, the xeno-free organoid matrix (Matrix 4-O3) leads to larger and more mature hIO, suggesting that the physical properties of xeno-free hydrogels can be harnessed to optimize organoid generation. Altogether, the results suggest that variations in the composition of different matrices affect stages of IO differentiation. This study raises awareness about the differences in commercially available matrices and provides a guide for matrix optimization during iPSC and IO work.

著者スポットライト:iPS細胞を用いた創薬のためのオルガノイド生成の促進

Organoids have become valuable tools for disease modeling. The extracellular matrix (ECM)&#160;guides cell fate during organoid generation, and using a system that resembles the native tissue can improve model accuracy. This study compares the generation of induced pluripotent stem cells-derived human intestinal organoids in animal-derived ECM and xeno-free hydrogels.

ヒト幹細胞維持と腸管オルガノイド生成のための基底膜マトリックスの比較研究

Extracellular matrix (ECM) plays a critical role in cell behavior and development. Organoids generated from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) ...

生理学的に関連性のあるアッセイを用いた3-D幹細胞培養物の調査のためのHiPSC由来の無血清胚様体の開発

要約

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幹細胞培養アプリケーションのための3Dフィブリン足場の調製

多能性幹細胞からの3次元ヒト肝球の血清自由産生

2Dおよび3Dヒト人工多能性幹細胞ベースのモデルにより、新皮質発生中の原発性繊毛の関与を解剖

機能的3Dスフェロイド細胞培養の半自動表現型解析(英語)

Xeno 無料条件下におけるさまざまな剛性とポリビニルアルコール Co イタコン酸ゲルのひと多能性幹細胞文化

組織レベルの力学を制御するための準拠基板上のヒト胚性幹細胞コロニーの幾何学的パターン化

ヒト誘起多能性幹細胞由来心臓スフェロイドの作製、ハイスループットスクリーニング、バイオバンキング

無血清全胚培養系で、マウス胚発生

ヒト幹細胞維持と腸管オルガノイド生成のための基底膜マトリックスの比較研究

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生理学的に関連性のあるアッセイを用いた3-D幹細胞培養物の調査のためのHiPSC由来の無血清胚様体の開発

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多能性幹細胞からの3次元ヒト肝球の血清自由産生

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機能的3Dスフェロイド細胞培養の半自動表現型解析(英語)

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組織レベルの力学を制御するための準拠基板上のヒト胚性幹細胞コロニーの幾何学的パターン化

ヒト誘起多能性幹細胞由来心臓スフェロイドの作製、ハイスループットスクリーニング、バイオバンキング

無血清全胚培養系で、マウス胚発生

ヒト幹細胞維持と腸管オルガノイド生成のための基底膜マトリックスの比較研究

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Xeno 無料条件下におけるさまざまな剛性とポリビニルアルコール Co イタコン酸ゲルのひと多能性幹細胞文化