このプロトコルは、心臓スフェロイドの生成、維持、および光学分析のためのワークフローを記述します。これらの心臓スフェロイドは、現在のin vitro疾患モデルのギャップを埋めるために不可欠です。この技術により、研究者は心臓スフェロイドの次世代のハイスループットスクリーニングと機能的ストレージを作成することができます。
まず、コンフルエントなヒト誘導多能性幹細胞由来心筋細胞を含む培養プレートの各ウェルに、1ミリリットルの1ミリリットル四方の滅菌心臓剥離液を加えます。プレートを摂氏37度で15分間インキュベートします。白・丸型の細胞を明視野顕微鏡の倍率4倍で観察し、細胞の剥離を確認します。
5ミリリットルのピペットを使用して、2ミリリットルの温かい基礎培地で細胞を洗い流すことによって細胞を機械的に解離させ、単一細胞懸濁液を調製する。細胞懸濁液を15ミリリットルのコニカルチューブに移し、300gで3分間遠心分離する。その後、上清を吸引し、細胞を1ミリリットルのhiPSC-CM再めっき培地に再懸濁した。
1, 000マイクロリットルのピペットチップを使用して、細胞ペレットを解離します。3〜4回混合した後、溶液が均一に見えるので、カセットにロードして細胞をカウントし、100マイクロリットルの再メッキ培地中の適切な量の細胞を超低接着、丸底、96ウェルプレートの各ウェルに移します。心臓スフェロイドプレートをインキュベーター内のオービタルシェーカーに70rpm、温度37°C、二酸化炭素5%、酸素21%、湿度90%で24時間置きます。
スフェロイドの破裂を避けるために、各ウェルから50マイクロリットルの培地のみを吸引し、最初の48時間はウェルあたり100マイクロリットルのRPMIとB27培地を追加します。次に、各ウェルから100マイクロリットルの培地を吸引し、1ウェルあたり100マイクロリットルの成熟培地を添加する。成熟培地で細胞を維持し、2〜3日ごとに培地をリフレッシュします。
スフェロイドプレートを氷上に10分間置き、予冷してから、プレートを70gで3分間遠心分離します。50マイクロリットルがウェルに残るまで培地を取り除きます。次に、ウェルあたり200マイクロリットルの氷冷hiPSC凍結培地を追加します。
プレートシールフィルムでプレートをシールします。シリコンモールドを準備するには、シリコンエラストマーキットのコンポーネントを10対1の比率で混合し、ウェルプレートの下部内に溶液を追加します。真空ポンプを使用して15〜20分間溶液を脱泡します。
金型をオーブンに入れ、摂氏60度で8時間硬化させて、プレートから剥がした半可撓性エラストマーを得ます。密封されたプレートをシリコン型に注意深く入れ、ウェルプレートと冷凍庫の間の均一な熱交換を確保します。プレートを液体窒素タンクまたは摂氏150度の冷凍庫に移して長期保管する前に、準備したシリコーン型でプレートを摂氏80度で最低4時間凍結します。
心臓スフェロイドの迅速な解凍を確実にするために、液体窒素から心臓スフェロイドを含む細胞プレートを一度に1枚集め、摂氏37度、二酸化炭素5%、酸素21%、湿度90%のインキュベーターに15分間入れます。シーリングフィルムをプレートから取り除き、各ウェルの150マイクロリットルを吸引してから、200マイクロリットルの温かい基礎培地を各ウェルに加えます。プレートを70gで3分間遠心分離し、温かい基礎培地洗浄を繰り返します。
完了したら、150マイクロリットルの培地を除去し、各ウェルに200マイクロリットルの心筋細胞融解培地を追加します。次いで、心臓スフェロイド生成中に述べたようにRPMI洗浄を繰り返し、次いで成熟培地中の細胞を維持する。培養の1週間後、融解した心臓スフェロイドはカルシウム取り扱い光学イメージングに最適です。
各ウェルの150マイクロリットルを吸引する。融解した心臓スフェロイドを暗所条件下でウェルあたり100マイクロリットルのCal-520 AMカルシウム色素培地で処理し、プレートを60分間インキュベートします。顕微鏡に電力を供給し、環境制御オプションがオンになっていることを確認して、カルシウム取得および分析システムを準備します。
カメラとフレーミングの絞り寸法を調整して、背景領域を最小限に抑えます。カルシウム信号を測定するには、488ナノメートルのレーザーを使用して、カルシウム放出中の明るい緑色の信号でコントラストを黒い背景に設定します。2秒以内に10〜10ピークの一貫したストリームでビデオを録画します。
10秒のビデオを録画し、96ウェルプレートをスキャンし、最初は左に移動し、次にジグザグに下に移動してプレート全体を覆います。カルシウム過渡現象を取得した後、蛍光トレース解析ソフトウェアを使用してデータを解析します。心臓スフェロイドは播種後1日目までに3D構造を獲得し、最大6週間培養することができました。
3週齢の心臓スフェロイドの大部分は、アルファアクチニンとトロポニンTで規則的なサルコメア組織を発現し、0日目と3週齢の心臓スフェロイドの高レベルのアルファアクチニンは、培養中に一定で高純度の細胞組成を示しました。心臓遺伝子、デスモソーム、およびミトコンドリアの発現の増加は、2Dで90日間培養したhiPSC-CMよりもスフェロイドで観察されました。心臓スフェロイドの拍動率は、世代後最初の3週間で同様であり、心臓スフェロイドの劣化により6週目に大幅に低下しました。
殴動率は3週目と比較して大幅に低下し、悪化の結果として6週目に低下しました。カルシウム過渡パラメータは2週目に高いピーク値を示し、上昇時間、減衰時間、および崩壊90%でのカルシウム過渡持続時間は3週目に有意に増加し、hiPSC-CM由来のスフェロイドが生成後2週目と3週目に機能的に最適であることを示しています。スフェロイドサイズは、播種に使用される細胞の数とともに増加しました。
より大きなサイズの古い回転楕円体では、鼓動は有意に高かった。5k、10k、および20kのスフェロイドは、2.5kのスフェロイドと比較して、同様の有意に高い鼓動率を示しました。凍結保存は、心臓スフェロイド内の細胞生存率に影響を与えませんでした。
融解および新鮮な年齢を合わせたスフェロイドにおけるサルコメアタンパク質の同様の発現は、凍結保存効率を示した。融解または新鮮な心臓スフェロイドの拍動速度に有意な変化はなかった。立ち上がり時間、減衰時間、および解凍または新鮮なCSのCTD90に大きな変化は見られませんでした。疾患モデリングやハイスループット薬物スクリーニングの他に、これらのスフェロイドは細胞外小胞産生のバイオリアクターや細胞外小胞関連療法にも使用できます。
また、これらのスフェロイドのバイオバンキングは、再生戦略のための新しい心筋細胞供給として使用することができます。嚢胞性線維症、がん、心臓スフェロイドの患者由来幹細胞モデルのバイオバンクは、薬物スクリーニングや個別化医療の分子メカニズムを解明する大きな可能性を秘めていることが示唆されています。
