ここで詳述する手順の全体的な目標は、新皮質発生中の一次繊毛の関与を解剖することです。原発性繊毛は、前駆細胞の増殖、運命の決定、ならびにニューロンの移動および成熟を含む、新皮質発達の多くのステップにとって重要であることが示されている。新皮質発生中の細胞関与をさらに解剖するために、我々は新皮質発生の新興2Dおよび3D iPS細胞ベースのモデルを利用して、関連するツールを設定した。
すなわち、神経ロゼットおよび背側前脳オルガノイドである。3D iPS細胞ベースのモデルは、胚様体の形成から始まります。前記胚様体の接着は、2D神経ロゼット構造の生成を可能にし、一方、そのようなEBsの自由浮遊培養は、背側前脳オルガノイドの生成を可能にする。
脳オルガノイドを生成するために我々が設定したプロトコルは、アクチビン結節およびBMP経路の阻害剤(二重SMAD阻害としても知られる)を使用して背部前脳オルガノイドを特異的に生成するためのプレパターニング因子を添加することによって、ギャグ法を使用して以前に公開されたプロトコルに基づいている。オルガノイドの3D組織を活用するために、我々は、オルガノイド全体の全免疫標識、透明化、および照明取得を高解像度で可能にする、簡単かつ迅速な方法を設定した。そして、一次繊毛の生合成と機能に焦点を当てるために、我々はビブラートームで切断された自由浮遊切片に免疫組織化学を適応させた。
切片の免疫染色および透明化後、共鳴走査共焦点顕微鏡を用いて画像を取得しました。iPS細胞培養は、大きな規則的なコロニーを保有し、分化が10%未満で、準拠率が80%以下であることから始めます。各iPS細胞コロニーを針を用いて手動で解剖し、各コロニーを水平方向と垂直方向に正確に捕捉してチェッカーボードパターンを作成し、各コロニーを等しいクラスターに分割する。
細胞スクラッパーを用いてコロニーを剥離し、超低付着培養プレート上に移す。彼らが胚様の体を形成できるように、それらをインキュベーターに一晩浮かばせてください。翌日、胚様体を吸引しないように注意しながら培地を回し、神経ロゼットの形成までPoly-L-オルニチンラミニンコーティングされた皿に移す。
これには約 12 ~ 14 日かかります。毎日のリフレッシュ誘導、培地、および神経ロゼット構造の形成について顕微鏡下でチェックする。このステップから、神経ロゼットを拡張、分化、および免疫染色分析のために処理するか、または分離して単離された神経幹および前駆細胞培養物を得ることができる。
まず、分化率が10%未満の大きな規則的なコロニーを抱え、単層上にほぼ1回継代されたiPS培養物から始めます。0日目に、低濃度のfJ2とhiiPS細胞の生存に必要な高濃度のROCK阻害剤を含むEB培地中でiPS細胞が胚様体を形成できるようにし、培地交換なしで3日間EB形成インキュベータープレートを乱さないようにする。3日目に、EBは約400マイクロメートルを測定し、規則的な境界線を示す必要があります。
過去の基準がほとんどのEBに富む場合、二重SMAD阻害剤を含む誘導培地1で培地を変更し、コントラDBを最高の6〜7で明るくし、神経トマトの譲歩を示す。また、他のDBをグロスファクター削減された地下室膜メトリックに変換します。このステップから、オルガノイドの損傷を避けるために、ペプチドの開口部を得るために常に滅菌はさみを使用してください。
まず、約15個のオルガノイドを臨床チューブに移す。EBを50マイクロリットルの誘導培地2で沈降させて除去し、オルガノイドを100マイクロリットルのマトリックスを含むマイクロセンシティブチューブに移し、上下にピペッティングすることによって均質化する。混合物をニュートラルアタッチメントプレートのウェルの中央に広げます。
そして最後に、EBが融合するのを避けるために互いに触れないようにEBをスペースします。物質をインキュベーター内で45分間固化させ、誘導培地を各ウェルに2つ加え、インキュベーター内でインキュベートする。誘導培地2種を1日おきにリフレッシュする。
17日目に、5mlのピペットで上下に10回ピペッティングすることによって、基底膜マトリックスを手動で切断する。オルガノイドプレートを翻訳媒体1枚中、攪拌下でインキュベートし、栄養吸収を改善する。重要なことに、固定培養とオービタルシェーカーでの培養には別のインキュベーターを使用して、付着性iPS細胞増殖に有害な振動を避けることです。
固定後、透過処理、ブロッキング、一次抗体および二次抗体とのインキュベーションには、洗浄ステップを含めて10日間かかります。私たちが好んだクリアリング方法は、グリコール誘導体であるTDEに依存しています。最適な透明化のために、オルガノイドをTDE溶液中に徐々に増加した濃度でそれぞれ24時間挿管する。
オルガノイド包埋には、メスを使用して先端を切り取る1mlシリンジから作られたカスタムメイン成形システムを使用してください。融点の低いアガロースは、その融解温度が摂氏約60度しかないため、推奨されます。60%TDE溶液中に4%の低融点アガロースを調製し、予めオルガノイド包埋された水性ベースで摂氏約37度に冷却させる。
プランジャーを用いて600マイクロリットルのゲル溶液をシリンジに入れ、次いでサンプルを配置し、400マイクロリットルのゲル溶液をシリンジに充填する。ゲルを重合させ、最後に、サンプルを理想的にゲル内に取り込み、照明付きのチャンバー内で容易に押し出してオルガノイドを対物レンズの前に配置することができる。照明付き蛍光顕微鏡は、このような透明なオルガノイドの最初のイメージングに理想的です。
写真のイメージングを減らし、細胞内解像度を比較検討しました。ここでは、サンプルチャンバーに添加した80%TDE溶液に20倍の対物レンズを注入して、当社のクリアリング法の屈折率を正確に調整できるようにしました。最大のサンプルオーダーは、サンプルオーダーが取り付けられたら操作できるプランジャーで上から挿入できる1ミリリットルのシリンジを収容するように設計されています。
オルガノイド全体の取得には約5〜10分かかります。自由浮遊部での免疫染色のために、オルガノイドを集めて4人用部分に4°Cで一晩固定します。オルガノイドを4%低融点アガロースに埋め込み、ビブラトームを用いて断面をPBS溶液に移し、それらを傷つけないようにペイントブラシを用いて150マイクロメートルの6つの切片を得た。
透過処理およびブロッキング後、自由浮遊切片を一次抗体と共に摂氏4度および攪拌下で一晩インキュベートする。インキュベーション前に切片を慎重に洗浄し、二次抗体と共に室温および攪拌下で2時間培養する。最後に、最適な透明化のために、徐々に濃度を上げてTDE溶液中で、60%TDEで30時間、次いで室温で一晩80%TDE中で、徐々に濃度を増加させてセクションをインキュベートする。
セクションを摂氏 4 度の 80%TDE および TLAC ソリューションに格納します。セルチャンバにフリーフローティングセクションを取り付け、サンプルを80%TDE溶液に維持するよう努め、臨床顕微鏡の電動ステージに適応するように設計されています。まず、チャンバー内に丸いカバースリップを1枚入れ、ペイントブラシを使用してクリア保護を慎重に転写します。
チャンバーに80%TDE溶液を満たし、2つの標準カバースリップと1つのセカンドラウンドカバースリップとシリコンシールを追加します。最後に、チャンバーのねじ込みリングをねじ込み、システムを完全に密閉します。ナイトシートと共鳴取得は、3D利用と免疫染色サンプル全体の分析を可能にするソフトウェアのおかげで処理されます。
このようなソフトウェアを使用すると、生成した膨大なデータを迅速に開き、スナップショットやアニメーションを簡単に作成できます。サンプルを異なる向きで移動することができ、X、Y、Y、Zedなどの異なる向きの2Dスライサーツールのおかげで、画像の2Dビューを生成できます。さらに、このようなソフトウェアは、セントロソームおよび原発性繊毛の両方の自動検出を可能にし、病理学的対対照状態における数を定量化することを可能にする。
また、部位を正確に測定するための原発性繊毛の3D再構成も可能です。新しい皮質発達の2D iPS細胞ベースのモデリングのために説明したプロトコルは、発達中の新皮質に見られるものと同様の新しい皮質前駆細胞およびニューロンを含む神経ロゼット構造の生成を可能にする。詳細なバリデーションは、通常の免疫染色分析により行うことができる。
適用可能な前駆細胞は、衝撃感受性のために私たちと一緒に二重染色されるべきであり、中間前駆細胞はTBI2染色によって、早期骨新皮質ニューロンはCTIP2陽性染色によって明らかにされるべきである。このような神経ロゼット様構造は、有糸分裂紡錘体を維持する運動核やTBX2を染色するホスホビメンチンに対して惹起された抗体による免疫染色により可視化できるラジカル前駆細胞の動態間核移動をモデル化する。最後に、繊毛発生は、周心に対して惹起された抗体による免疫染色によって分析することができ、それは原発性繊毛の背部を染色し、公理を染色する特定の手段のものである。
このようなロゼット構造上で、根尖ポリファブリカル前駆細胞から抽出された原発性繊毛は、CTIP2陽性ニューロンからも突出している間に、各心室領域の中心内腔より密集して上方にある。腺神経ロゼットの解離は、初代繊毛の生合成および機能を分析するのに非常に有用な単離された神経幹および前駆細胞培養物を生成することを可能にする。特に、我々は、推奨される音波薬または浸透圧アゴニストによる治療後の音波薬物経路の誘導を試験する手順を詳述する。
その後のRTPCR SAは、GLI1やPTCH1などのソニカ薬物標的遺伝子の誘導をテストし、免疫蛍光分析は、オープンソースツール、ilastik、CiliaQのおかげで、定量化される一次繊毛に沿った主要な音波薬物成分のダイナミクスをテストします。長さおよび配向を含む異なる毛様体パラメータが調査されるが、推奨されるソニッカ薬物治療に応答してそれぞれ一次繊毛に蓄積または脱離するGLI2およびGPR161について、一次繊毛成分の強度もここに示されている。新皮質発生のアウト3D iPS細胞ベースのモデリングのために我々が詳述するプロトコルは、従来の免疫染色分析または女性染色のいずれかによって特徴付けることができる背側前脳同一性を有する均質な大脳オルガノイドの生成を可能にし、ここで示すように、神経カドヘリンをそれぞれ染色するN−カドヘリン、PAX6、およびCTIP2を惹起した抗体の最適な浸透を伴う、 ピンク色で、心室帯様領域の頂端前駆細胞、緑色で、および皮質板様領域に位置するすべての新生児新皮質ニューロンである。
ここには、再び提起された抗体を有する免疫染色オルガノイド全体の第2のフィルムがあり、CTIP2は、赤色で、おそらくピンク色に維持され、TPX2は緑色で、Fabri-Kal前駆細胞の動態間核移動など、新皮質前駆細胞のいくつかの特性を試験することを可能にする。興味深いことに、ホスホビメンチン陽性前駆細胞は、上室帯様領域においても観察され、正表面まで延びる独特の正の過程を抱き、外側の放射状グリア前駆細胞を連想させ、この方法の高分解能を示す。ここでは、体の後ろを緑色に染色したペリセントリン抗体と、公理をピンク色で染色するARLT3B抗体で検出された原発繊毛を示す共鳴走査顕微鏡のおかげで取得された免疫染色、自由浮遊部のビデオです。
原発性繊毛は、すべてのニューロン幹および前駆細胞から、特に、エピカル前駆細胞のエピカル表面だけでなく、プレプレート様領域の新皮質ニューロンにも広がっている。最後に、2Dニューロンロゼットおよび単離された幹および前駆細胞は、脳皮質発達のいくつかの側面を反復し、毛様体生合成および機能をテストするための相補的で有用なツールを表す。ここで検出したプロトコルにより、この異なるiPS細胞株から背部前脳オルガノイドを首尾よく生成し、均質な結果を生み出すことができ、この手順の堅牢性が保証されました。
オルガノイド全体または自由に浮遊する切片の免疫染色、透明化、およびイメージングのために当社が設定したプロトコルは、シンプルで高速で費用対効果が高いです。このような細胞ベースのモデルと、毛様体摂動細胞のリプログラミングまたはCRISPR 9技術を使用して毛様体遺伝子を特異的に編集することによって生成されたiPS細胞の3Dイメージング解析を組み合わせることで、大脳皮質の正常および病理学的発達における一次繊毛の寄与の理解において著しい進歩が可能になるはずである。
