我々は、軸方向の光ピンセットのヘルプについては、この原稿に彼のストレッチングデータの一部を寄付するための博士儀·ファンチェンに感謝します。この作品は、NSFの助成金、PHY-0957293とフォーカス助成PHY-0114336によって後援されています。

1。ピンセットセットアップ<ol><li> 1064 nmのレーザーからのビームは、2つの直交偏光ビームに分割される。一つは、他のが（図2参照）、キャリブレーション用に使用されている間生体分子を操作するために使用されています。 </li><li>各ビームの位置と焦点がそれぞれ独立して、ビーム·ステアリングミラーや光学望遠鏡によって制御されながら操作ビームの強度は、音響光学偏向器（AOD）によって制御されます。 </li><li>ビームは、その後、別の偏光ビームスプリッタと再結合し、わずかに顕微鏡対物レンズの背面開口部を入れすぎする伸縮式光学系の最終セットでさらに条件付けられる。操作ビームのためのわずかに小さい因子、約20％が、線形ポテンシャルの大きい実行可能な領域に変換することを浅いフォーカスを与えながら、キャリブレーションビームは50％オーバーフィルは、タイトな光学トラップにつながる。ビームはしっかりPlanApo 60x/1.4油浸顕微鏡objで集中している試料セルにective。 </li><li>このピンセットのセットアップは、凝縮器で試料室に集束ハロゲンランプからの照明を提供しています自宅内蔵明視野顕微鏡と組み合わされています。明視野像は、ダイクロイックミラーにより、レーザ光から分離し、次いで2つのCCDカメラ上に結像される。他のCCDは画像その位置が顕微鏡でドリフトを補償するフィードバック制御システムとして機能する単一立ち往生参照ミクロスするのに使用される一方のCCDデータを取得する私たちの主な手段として作用し、正確なサンプリングレートを生成するためにトリガするソフトウェアです。 </li><li>サンプルは粗くXYステージによる客観に対して位置決めされた後、正確に埋め込まれた3次元のピエゾステージにより位置決めすることができる。 </li><li>前方散乱と透過したレーザ光は、明視野コンデンサーによって収集され、光検出器上に集光される。得られた信号は、100kHzでのアンチエイリアシングフィルタを通して濾過増幅されDAQカードを使用して200kHzでcquired。 </li></ol> 2。軸方向の位置にビーズの見かけの大きさのキャリブレーション<ol><li>緩衝食塩水ミクロスはリン酸で希釈し800nm ​​の直径のポリスチレンの分散溶液を試料室9をロードします 。 10-15分後、過剰微小球を除去するバッファーで軽くフラッシュに座ってみましょう。 </li><li>ランダムにカバーガラスに付着した微小球の位置を確認し、マイクロスフェアは、焦点がぼけた画像を生成するために、フォーカス以下1μm程度になるまで試料室の高さを調整します。 </li><li>画像の見かけの大きさを測定するには、まずLabVIEWのマッチング機能を幾何学的なパターンを使用して微小球の中心を見つける。 </li><li>次に、各断面の中心の周りに360°を平均化することにより、微小球の半径方向の強度プロファイルを生成します。明視野画像のそれぞれに白いリングに対応して放射状のプロフィールは、見つけることが二次関数を取り付けることができます明るさのピーク。このピークと中心間の距離は、ビーズの見かけの大きさの尺度として使用することができます。 </li><li>キャリブレーションpiezostageを使用して、徐々にマイクロスフェアの軸方向の位置を向上させ、CCDカメラを用いて各軸の位置に画像を取得する。 </li><li>その軸の位置（図3参照）と微小球の見かけの大きさを相関させるための連続した​​各画像の画像解析を繰り返します。方法によって得られた軸方向の分解能は1.4 nm付近7です。 </li></ol> 3。操作ビームの光学ポテンシャルのマッピング<ol><li>一直線操作ビームとキャリブレーションビームを整列させることから始めます。操作ビームはかなり弱いはずですが、キャリブレーションビームは、対物レンズの背面開口部には約50 mWである必要があり、10 mWを言う。 </li><li>操作ビームのスイッチを切って、キャリブレーションビームのはるかに硬くトラップ内での自由なミクロスフェアを閉じ込める。 </li><li>さて、マニオンにするpulationビーム。操作ビームは、キャリブレーションビームよりもはるかに弱いですので、微小球の軸方向の位置がわずかに摂動されます。すでに説明したように軸方向の位置の結果の変化がぼけ明視野画像から測定することができる。 </li><li>操作ビームをオフにしても、キャリブレーションビームの中に閉じ込めミクロスと、望遠レンズを調整することにより、キャリブレーションビームの軸方向の焦点を移す。操作ビームをオンにして、マイクロスフェアと繰り返し、その後の変位を測定します。 </li><li>変位のΔXは、キャリブレーションビームの焦点の軸方向の位置に対してプロットすることができます。ミクロスフェアの最大の変位に対応する軸方向位置（図4参照）光学トラップの線形領域の中心を決定する。 </li><li>軸方向の位置の関数としての操作ビームの光力を得るための最後のステップは、剛性の慎重な測定を必要とするキャリブレーションビーム。これを取得するには、操作ビームがオフになっている間、望遠レンズを調整することによって、表面上マイクロメートル程度にキャリブレーションビームによってトラップミクロスフェアを、動かす。 </li><li>光検出器と透過光の強度を測定することにより微小球の熱軸方向の動きを記録します。 </li><li>信号の自己相関は、変動の時定数を与えるために、単一指数減衰関数にフィッティングすることができます。τZ </li><li>微小球の流体力学的摩擦係数ζは、表面5,10へミクロス近接補正することができる。キャリブレーショントラップの剛性はその後（補足資料AおよびBを参照）は、κ のz =ζ/τはzで与えられます。 </li><li>キャリブレーショントラップの剛性を知ることは、一つは力ƒにTHI の z =κzの ΔXの統合を以前に測定された軸方向変位に変換することができますSカーブは、操作ビームの軸方向の光学ポテンシャル（図4参照）の空間マッピングを生成します。 </li></ol> 4。 DNAサンプルを伸ばす<ol><li>チャンバ9含む表面テザーDNA分子（&lt;1 KBP）をマウントし、明視野像を観察しながら、望遠鏡を調整することによって、少し延伸ミクロス上記操作ビームの焦点を置きます。ミクロスフェアの1がトラップされるまで、ステージの位置を調整します。 </li><li>大体光学トラップのXY平面の中央に微小球の位置を合わせます。 LabVIEWで方形波のシリーズを生成し、繰り返しレーザービームをオンおよびオフにしたAODに送信します。慎重にレーザーと試料室の加熱を防ぐために上の状態の持続時間の強度を制御する。一般的に、レーザーパワーの約2 mWを（客観の背面開口部で測定）を使用し、200ミリ（上）と500ミリ（オフ）のパルスを送信します。正方形wの振幅AODに送信aveは0.5前後となるはずV. </li><li>トラップが繰り返しオン·オフとされるマイクロスフェアを見て、レーザーはマイクロスフェアの動きに任意の優先方向を誘導する場合に注意してください。反復して、XとY方向ともに微小球の位置を調整しながら、piezostageを制御することにより、マイクロスフェアのランダムな動きは、レーザーがオンのときに著しく制限されても、XY平面内で等方的になる必要があります。 </li><li>次に、Z方向にビーズを合わせます。 、今回は、リアルタイムで同時にミクロス軸の変位を測定しながら、再びオンにレーザビームをパルスとオフ。 Zの変位が最大となる点である線形領域内のセンターステージ。 </li><li> Z方向に慎重に位置合わせした後、トラップがまだXY平面の中央に配置されていることを確認することが不可欠です。 XYアライメントが変更されている場合は、すべてのマイクロスフェア3に沿って適切にセンタリングされるまで、XYとZアライメント両方を繰り返す必要があります軸。 </li><li> DNAをストレッチについては、各手順で0.025 Vのステップで0 Vから0.5 Vに、AODに電圧信号を送信することにより、レーザー強度を上げ、レコード400フレーム100 fpsで、それらを軸方向の変位を得るために平均。 </li><li>力拡張曲線がプロットされ、今では修正されたWLCモデル11（B補足資料を参照）に適合することができます。 </li></ol> 5。代表的な結果： 我々2つのDNA配列のために存在力の延長曲線：1298 bpおよび247 bpの配列、最短シーケンス後者は、我々は、再現伸ばすことができました。これらの長さスケールで一つは有限サイズ効果と境界の制約から生じるゼロ力の拡張を考慮しなければならないので、DNAの短いストレッチのために、従来のワームのようなチェーン（WLC）のモデルでは、完全に力拡張の関係を説明していません。力拡張の測定は、そのため、effectiを持つ改変WLCモデルを用いて適合しなければならない持続長とフィットパラメータとしてゼロ力の拡張子をVE、補助教材で、より詳しく説明。 dsDNAの大きな輪郭長については、効果的な持続長は、単に名目上の持続長（〜50 nm）であり、ゼロフォースの拡張子は無視することができます。しかし輪郭長が短くなるほど、効果的な持続長は、よく50nmおよびDNAの下に減少してもゼロの力の下で、大幅な拡張を示しています。 力拡張曲線のデータとそれに対応するフィットをFig。二つの配列のための5。修正されたWLCのフィットから、我々は、1298 bpのDNAと247 bpのDNAの25 nmの35 nmであることが効果的な永続性の長さを決定した。例示的な目的のために、我々は、各シーケンスの力の延長曲線の単一の対策を提示している。実際には、測定を複数回繰り返すと標準誤差とともに平均的な結果を得るだろう。これは、股関節にも留意しなければならないトン各曲線を得た後、それがマイクロスフェアは、以前のプロトコルで説明したようにそうしないとミクロスが再編されている必要があり、線形領域内に捕捉され、適切に配置されたままことを保証するために不可欠です。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig1.jpg" /> アキシャル光ピンセットの原理図1（左）焦点の近くに従来の光ピンセットトラップ。ビーズは、その後テンションを発揮するカバースリップに横移動されます。 （右）軸方向の光ピンセットでは、マイクロスフェアは、光学ポテンシャルの線形領域では、焦点から離れて捕集される。この構成では、ポリマーは、拡張子の範囲のための一定の張力の下で開催されています。また、レーザ強度​​を増加させると、軸方向に微小球を移動します。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig2.jpg" /> 図2の模式図軸方向の光ピンセットレーザ光 ​​（波長1064nmのNd：YVO 4）は 、偏光ビームスプリッタ（PBS）を通過させることによって2つのビームに分割されます。操作ビームは、音響光学偏向器（AOD）を通過して、キャリブレーションビームが独立して伸縮自在のレンズを使用して調整できます。 2つのビームは、その後、別のPBSを用いて再結合し、高NA対物レンズによって試料上に集束されています。同時に、マイクロスフェアを追跡するために使用される明視野照明は、赤外線（IR）を濾過し、その後のフィードバック制御系の一部としてその他の行為しながら測定を行いそのうちの1つのCCDカメラによって撮像され、サンプルを通過します。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig3.jpg" /> 図3軸方向位置のキャリブレーション。軸方向の位置を較正するために、私たちはステージの軸方向の位置を変化させてチャンバーカバーグラスに付着したビーズのピンボケ画像を取得する。マイクロのサイズphereは、その中心とミクロスフェアの画像の周りに形成された明るいリングについてのピーク強度の位置との距離によって与えられる。挿入図は、ビーズの大きさを与えるラジアル強度分布を示している。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig4.jpg" /> 光学ポテンシャルのマッピングの背後に4原則を示しています。操作ビームの光力をマッピングするには、それがはるかに強いのキャリブレーションビーム内に捕捉された微小球に誘導することを軸方向の変位を測定する。この変位が最大となる線形領域の中心が位置しています。光力対軸方向位置曲線は光の可能性を見つけるために統合することができます。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig5.jpg" /> 図5フォース伸展曲線。データはランダム1298 bpおよび247 bpの（挿入図）segmenために示されているdsDNAのトンは、軸方向の光ピンセットによって伸張。データポイントは、式の修正されたWLCモデルに適合させた。 3（実線）および34 nmおよびそれぞれ1298bpと247bpのために25nmの効果的な永続性の長さが得られた。

<ol>
	<li>Halford, S. E., Welsh, A. J., Szczelkun, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-mediated+DNA+looping.">Enzyme-mediated DNA looping.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 33, 1-24 (2004).</li><li>Allemand, J. F., Cocco, S., Douarche, N., Lia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loops+in+DNA:+an+overview+of+experimental+and+theoretical+approaches.">Loops in DNA: an overview of experimental and theoretical approaches.</a> Eur. Phys. J. E. Soft. Matter. 19, 293-302 (2006).</li><li>Kaplan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-encoded+nucleosome+organization+of+a+eukaryotic+genome.">The DNA-encoded nucleosome organization of a eukaryotic genome.</a> Nature. 458, 362-366 (2009).</li><li>Garcia, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Consequences+of+Tightly+Bent+DNA:+The+Other+Life+of+a+Macromolecular+Celebrity.">Biological Consequences of Tightly Bent DNA: The Other Life of a Macromolecular Celebrity.</a> Biopolymers. 85, 115-130 (2006).</li><li>Neuman, K. C., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+trapping.">Optical trapping.</a> Rev. Sci. Instrum. 75, 2787-2809 (2004).</li><li>Moffitt, J. R., Chemla, Y. R., Smith, S. B., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+optical+tweezers.">Recent advances in optical tweezers.</a> Annu. Rev. Biochem. 77, 205-228 (2008).</li><li>Chen, Y. F., Blab, G. A., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretching+submicron+biomolecules+with+constant-force+axial+optical+tweezers.">Stretching submicron biomolecules with constant-force axial optical tweezers.</a> Biophys. J. 96, 4701-4708 (2009).</li><li>Chen, Y. F., Wilson, D. P., Raghunathan, K., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entropic+boundary+effects+on+the+elasticity+of+short+DNA+molecules.">Entropic boundary effects on the elasticity of short DNA molecules.</a> Phys. Rev. E. 80, 020903-020903 (2009).</li><li>Chen, Y. F., Chu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethered+Particle+Microscopy+(TPM)+Protocol.">Tethered Particle Microscopy (TPM) Protocol.</a> Meiners Lab. , (2011).</li><li>Brenner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slow+motion+of+a+sphere+through+a+viscous+fluid+towards+a+plane+surface.">The slow motion of a sphere through a viscous fluid towards a plane surface.</a> Chem. Eng. Sci. 16, 242-251 (1961).</li><li>Marko, J. F., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretching+DNA.">Stretching DNA.</a> Macromolecules. 28, 8759-8770 (1995).</li><li>Greenleaf, W. J., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule,+motion-based+DNA+sequencing+using+RNA+polymerase.">Single-molecule, motion-based DNA sequencing using RNA polymerase.</a> Science. 313, 801-801 (2006).</li><li>Chen, Y. F., Milstein, J. N., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-mediated+DNA+loop+formation+and+breakdown+in+a+fluctuating+environment.">Protein-mediated DNA loop formation and breakdown in a fluctuating environment.</a> Phys. Rev. Lett. 104, 258103-258103 (2010).</li><li>Chen, Y. F., Milstein, J. N., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtonewton+entropic+forces+can+control+the+formation+of+protein-mediated+DNA+loops.">Femtonewton entropic forces can control the formation of protein-mediated DNA loops.</a> Phys. Rev. Lett. 104, 048301-048301 (2010).</li><li>Raghunathan, K., Milstein, J. N., Juliar, B., Blaty, J., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+Dependent+Effects+on+the+Elasticity+of+Short+DNA+Molecules.">Sequence Dependent Effects on the Elasticity of Short DNA Molecules.</a> , (2011).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

従来の光ピンセットは、屈折物体に一定の力を適用するために、アナログまたはコンピューター制御のフィードバックに依存しています。これらのアクティブ·フィードバック·システムは、タンパク質の結合に由来するDNAまたはフィラメントに沿って分子モーターの急速なステッピングには、例えば、試料の延長の急激な変化が発生した条件の下で行うことが困難である。一定の力を加える...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬/機器</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>注釈</th></tr><tr><td>のNd：YVO4レーザー</td><td>スペクトラフィジックス</td><td> T40-Z-106C </td><td></td></tr><tr><td>音響光学の そらせ板</td><td> IntraAction </td><td> DTDベース274HA6 </td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡対物</td><td>オリンポス</td><td> PlanApo </td><td> 60X、NAは1.4 </td></tr><tr><td>ピエゾステージ</td><td>マッド·シティ·ラボ</td><td>ナノLP100 </td><td> XYZステージ</td></tr><tr><td> CCDカメラ</td><td> PixeLink </td><td> PL-A741 </td><td></td></tr><tr><td>光検出器</td><td>電気光学 テク</td><td> ET-3020 </td><td></td></tr><tr><td>ポリスチレンビーズ</td><td> Spherotech </td><td> SVP-08-10 </td><td>波長800nm​​、ストレプトアビジン コー​​ティングされた</td></tr><tr><td>抗ジゴキシゲニン</td><td>ロッシュ</TD&gt; <td> 11333089001 </td><td>羊から</td></tr><tr><td>プライマー</td><td> MWGオペロン</td><td>カスタムオリゴ</td><td>一方のプライマー：ビオチン その他：ジゴキシゲニン</td></tr><tr><td> PCR試薬</td><td>ニューイングランド バイオラボズ</td><td> Taqポリメラーゼ、 のdNTP </td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>のための他の化学物質 バッファ</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>補足資料 A.流体摩擦係数表面近傍の微小球の流体力学的摩擦係数を決定するための1は、以下の拡張5,10を使用することができます： <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq1.jpg" alt="式（1）" />どこで次の速記時間として導入されて： <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq2.jpg" alt="式（2）" />摩擦係数は表面上の距離ηを位置の微小球の中心で、流体の粘度ηと微小球の半径で定義されます。 10約条項に展開したとき和はそれなりに収束する。 剛性校正上の軸方向位置のBの影響トラップ剛性のキャリブレーションは、表面からの距離が増加すると共に増加するキャリブレーションの精度、およびトラップを実験的に使用される実際の軸の位置との間でトレードオフが必要となります。一般的には、トラップが実際の実験条件よりも高い表面、800から1000 nm付近で校正されています。 C.は、ワームのようなチェーン（WLC）のモデルを変更力拡張曲線が変更されたWLC mに合うことができるodelその次のようにゼロ光の力で体積排除効果を考慮： <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq3.jpg" alt="式（3）" /> F optは光学力であり、x oはゼロ力拡張のためのフィットパラメータであり、x optは力の下で拡張したもので、lは DNAの輪郭長であり、l * p &quot; は効果的なのための第2嵌合パラメータである&quot;持続長、F WLCは通常のWLCモデル11で与えられます。 <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq4.jpg" alt="式（4）" /> ここで、ε相対DNAの拡張子は。

stretching short sequences of dna with constant force axial optical tweezers

小さいキロより輪郭の長さのDNAを延伸する単一分子技術は実験的困難をはらんでいます。しかし、このようなヒストン結合し、DNAの1,2タンパク質媒介ルーピングなど、多くの興味深い生物学的事象は、この長さスケールで発生します。近年では、DNAの機械的特性は、コンパクトなヌクレオソームとクロマチン繊維3,4へのDNAのパッケージングのような基本的な細胞プロセスにおいて重要な役割を果たすことが示されている。明らかに、それは、DNAの短いストレッチの機械的性質を理解することが次に重要です。本稿では、我々は数百塩基対程度の短い輪郭長を持つDNAの機械的挙動を研究するために開発した単一分子光tweezing技術に実用的なガイドを提供します。 DNAの短いセグメントをストレッチングの主なハードルは、従来の光ピンセットは、一般のdirectioに力を適用するために設計されていることであるnは5,6ステージに横方向（図1参照）。この幾何学では、DNAが繋がれているためビーズとカバーガラス、、の間の角度は、サブミクロンの長さのDNAのための非常に急峻になる。軸方向の位置は、現在拡張子がカバースリップに近い微小球をドラッグしているので、立体効果が強化され、挑戦することができ、これを占めており、されなければならない。さらに、微小球の非対称性の結果として、横方向の拡張は、拡張時の反力の変化の方向が光学トラップ内の微小球の回転によるトルクのさまざまなレベルを生成します。 ストレッチサブミクロンDNAのための代替方法は、独自のユニークなハードルにぶつかる。例えば、デュアルビーム光学トラップが2つのトラップの間に微小球の間の光の散乱点からの干渉の影響が重大な問題を提起するために開始する波長、周りのDNAを引き伸ばしに制限されています。トラップの1つを交換マイクロピペットで最も可能性が高い同様の課題に苦しむだろう。一つは直接DNAを伸ばすために軸方向のポテンシャルを使うこともできますが、アクティブ·フィードバック方式は一定の力を適用し、この帯域幅は、特に低力で、かなり限定されますが必要でしょう。 我々は、直接一定の力軸方向の光ピンセット7,8を使用してカバーグラスから離したDNAを引いて、これらの根本的な問題を回避する。これは、光力がある光学ポテンシャル、定レーザーパワーを調節することによって調整することができるの強さの線形領域でビーズを捕捉することによって達成される。線形領域内トラッピングも軸方向に約350 nmの拡張するDNA上のすべての光力クランプとして機能します。我々は同時に、細かくカバースリップにこだわった基準微小球が同じ位置とフォーカスのままであるように、ステージの位置を調整することにより、熱的、機械的なドリフトを補償実質的に無限の観察期間のためllowing。

Watch this Scientific Journal Video about Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers at JoVE.com

Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

我々は、短いDNA分子の機械的性質を探求する一定の力軸光ピンセットの使用を例証します。軸方向にDNAを延伸することによって、私たちは私たちが約100nm限り短くDNA分子を研究できるように、立体障害と、従来の横方向の操作で生じるアーチファクトを最小限に抑えることができます。

コンスタント·フォース軸光ピンセットを用いたDNAの短い配列を伸ばす

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths  less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many ...

stretching-short-sequences-dna-with-constant-force-axial-optical

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.0K ビュー.  University of Michigan. 我々は、短いDNA分子の機械的性質を探求する一定の力軸光ピンセットの使用を例証します。軸方向にDNAを延伸することによって、私たちは私たちが約100nm限り短くDNA分子を研究できるように、立体障害と、従来の横方向の操作で生じるアーチファクトを最小限に抑えることができます。

ビデオ: Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On the end of the microscope's cantilever is a nano-scale probe, which traverses image areas ranging from nanometers to micrometers, measuring the elevation of macromolecules resting on the substrate surface at any given point. Electrostatic forces cause proteins, lipids, and nucleic acids to loosely attach to the substrate in random orientations and permit imaging. The generated data resemble a topographical map, where the macromolecules resolve as three-dimensional particles of discrete sizes (Figure 1) 1,2. Tapping mode AFM involves the repeated oscillation of the cantilever, which permits imaging of relatively soft biomaterials such as DNA and proteins. One of the notable benefits of AFM over other nanoscale microscopy techniques is its relative adaptability to visualize individual proteins and macromolecular complexes in aqueous buffers, including near-physiologic buffered conditions, in real-time, and without staining or coating the sample to be imaged. 
The method presented here describes the imaging of DNA and an immunoadsorbed transcription factor (i.e. the glucocorticoid receptor, GR) in buffered solution (Figure 2). Immunoadsorbed proteins and protein complexes can be separated from the immunoadsorbing antibody-bead pellet by competition with the antibody epitope and then imaged (Figure 2A). This allows for biochemical manipulation of the biomolecules of interest prior to imaging. Once purified, DNA and proteins can be mixed and the resultant interacting complex can be imaged as well. Binding of DNA to mica requires a divalent cation 3,such as Ni2+ or Mg2+, which can be added to sample buffers yet maintain protein activity. Using a similar approach, AFM has been utilized to visualize individual enzymes, including RNA polymerase 4 and a repair enzyme 5, bound to individual DNA strands. These experiments provide significant insight into the protein-protein and DNA-protein biophysical interactions taking place at the molecular level. Imaging individual macromolecular particles with AFM can be useful for determining particle homogeneity and for identifying the physical arrangement of constituent components of the imaged particles. While the present method was developed for visualization of GR-chaperone protein complexes 1,2 and DNA strands to which the GR can bind, it can be applied broadly to imaging DNA and protein samples from a variety of sources.

A tapping mode atomic force microscope (AFM) method for the visualization of plasmid DNA, cytoplasmic proteins, and DNA-protein complexes is described. The method includes alternate approaches for preparing samples for AFM imaging following biochemical manipulation. DNA containing specific protein interacting regions are observed in near-physiologic buffer conditions.

原子間力顕微鏡を用いて組換えDNAとタンパク質の複合体の可視化

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

生物工学

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

磁気ピンセットを用いた多重化単分子フォースタンパク質分解測定

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

原子間力顕微鏡と内皮グリコカリックスの機械的性質の定量化

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) antibody conjugated latex beads have been utilized to create a biosensor designed for discrimination of methicillin resistant (MRSA) and sensitive (MSSA) S. aureus species 1,2. The lytic phages have been converted into phage spheroids by contact with water-chloroform interface. Phage spheroid monolayers have been moved onto a biosensor surface by Langmuir-Blodgett (LB) technique 3. The created biosensors have been examined by a quartz crystal microbalance with dissipation tracking (QCM-D) to evaluate bacteria-phage interactions. Bacteria-spheroid interactions led to reduced resonance frequency and a rise in dissipation energy for both MRSA and MSSA strains. After the bacterial binding, these sensors have been further exposed to the penicillin-binding protein antibody latex beads. Sensors analyzed with MRSA responded to PBP 2a antibody beads; although sensors inspected with MSSA gave no response. This experimental distinction determines an unambiguous discrimination between methicillin resistant and sensitive S. aureus strains. Equally bound and unbound bacteriophages suppress bacterial growth on surfaces and in water suspensions. Once lytic phages are changed into spheroids, they retain their strong lytic activity and show high bacterial capture capability. The phage and phage spheroids can be utilized for testing and sterilization of antibiotic resistant microorganisms. Other applications may include use in bacteriophage therapy and antimicrobial surfaces.

Lytic phage biosensors and antibody beads are able to discriminate between methicillin resistant (MRSA) and sensitive staphylococcus bacteria. The phages were immobilized by a Langmuir-Blodgett method onto a surface of a quartz crystal microbalance sensor and worked as broad range staphylococcus probes. Antibody beads recognize MRSA.

抗生物質耐性ブドウ球菌の細菌の検出のためのバイオセンサー

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a combination of bright field and differential interference contrast imagery. Two primary approaches are presented: noninterferometric quantitative phase microscopy (NIQPM), to perform measurements of total cell mass and subcellular density distribution, and Hilbert transform differential interference contrast microscopy (HTDIC)&#160;to determine volume. NIQPM is based on a simplified model of wave propagation, termed the paraxial approximation, with three underlying assumptions: low numerical aperture (NA) illumination, weak scattering, and weak absorption of light by the specimen. Fortunately, unstained cellular specimens satisfy these assumptions and low NA illumination is easily achieved on commercial microscopes. HTDIC is used to obtain volumetric information from through-focus DIC imagery under high NA illumination conditions. High NA illumination enables enhanced sectioning of the specimen along the optical axis. Hilbert transform processing on the DIC image stacks greatly enhances edge detection algorithms for localization of the specimen borders in three dimensions by separating the gray values of the specimen intensity from those of the background. The primary advantages of NIQPM and HTDIC lay in their technological accessibility using &#8220;off-the-shelf&#8221; microscopes. There are two basic limitations of these methods: slow z-stack acquisition time on commercial scopes currently abrogates the investigation of phenomena faster than 1 frame/minute, and secondly, diffraction effects restrict the utility of NIQPM and HTDIC to objects from 0.2 up to 10 (NIQPM) and 20 (HTDIC) &#956;m in diameter, respectively. Hence, the specimen and its associated time dynamics of interest must meet certain size and temporal constraints to enable the use of these methods. Excitingly, most fixed cellular specimens are readily investigated with these methods.

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

定量的な光学顕微鏡：細胞生物物理の測定は、標準的な光学顕微鏡で特徴

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch cells plated on a PolyDiMethylSiloxane (PDMS) membrane, compatible with imaging. This technique is reproducible and versatile. The PDMS membrane can be micropatterned in order to confine cells or tissues to a specific geometry. The first step is to print micropatterns onto the PDMS membrane with a deep UV technique. The PDMS membrane is then mounted on a mechanical stretcher. A chamber is bound on top of the membrane with biocompatible grease to allow gliding during the stretch. The cells are seeded and allowed to spread for several hours on the micropatterns. The sample can be stretched and unstretched multiple times with the use of a micrometric screw. It takes less than a minute to apply the stretch to its full extent (around 30%). The technique presented here does not include a motorized device, which is necessary for applying repeated stretch cycles quickly and/or computer controlled stretching, but this can be implemented. Stretching of cells or tissue can be of interest for questions related to cell forces, cell response to mechanical stress or tissue morphogenesis. This video presentation will show how to avoid typical problems that might arise when doing this type of seemingly simple experiment.

This manuscript presents a technique to apply or release forces on adherent cells or tissues using unidirectional stretching.

PDMS膜上のマイクロパターン細胞を伸ばす

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques include so-called force spectroscopy approaches such as atomic force microscopy, optical tweezers, flow stretching, and magnetic tweezers. Amongst these approaches, magnetic tweezers have distinguished themselves by their ability to apply torque while maintaining a constant stretching force. Here, it is illustrated how such a &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers experimental configuration can, through a straightforward modification of its field configuration to minimize the magnitude of the transverse field, be adapted to measure the degree of twist in a biological molecule. The resulting configuration is termed the freely-orbiting magnetic tweezers. Additionally, it is shown how further modification of the field configuration can yield a transverse field with a magnitude intermediate between that of the &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers and the freely-orbiting magnetic tweezers, which makes it possible to directly measure the torque stored in a biological molecule. This configuration is termed the magnetic torque tweezers. The accompanying video explains in detail how the conversion of conventional magnetic tweezers into freely-orbiting magnetic tweezers and magnetic torque tweezers can be accomplished, and demonstrates the use of these techniques. These adaptations maintain all the strengths of conventional magnetic tweezers while greatly expanding the versatility of this powerful instrument.

Magnetic tweezers, a powerful single-molecule manipulation technique, can be adapted for the direct measurements of the twist (using a configuration called freely-orbiting magnetic tweezers) and torque (using a configuration termed magnetic torque tweezers) in biological macromolecules. Guidelines for performing such measurements are given, including applications to the study of DNA and associated nucleo-protein filaments.

ツイストとトルクの計測のための磁気ピンセット

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

光ピンセットによる単一のRNA分子のナノマニピュレーション

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Quantifying Fibrillar Collagen Organization with Curvelet Transform-Based Tools

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression of a wide range of diseases including breast, ovarian, kidney, and pancreatic cancers. Freely available fiber quantification software tools are mainly focused on the calculation of fiber alignment or orientation, and they are subject to limitations such as the requirement of manual steps, inaccuracy in detection of the fiber edge in noisy background, or lack of localized feature characterization. The collagen fiber quantitation tool described in this protocol is characterized by using an optimal multiscale image representation enabled by curvelet transform (CT). This algorithmic approach allows for the removal of noise from fibrillar collagen images and the enhancement of fiber edges to provide location and orientation information directly from a fiber, rather than using the indirect pixel-wise or window-wise information obtained from other tools. This CT-based framework contains two separate, but linked, packages named &#8220;CT-FIRE&#8221; and &#8220;CurveAlign&#8221; that can quantify fiber organization on a global, region of interest (ROI), or individual fiber basis. This quantification framework has been developed for more than ten years and has now evolved into a comprehensive and user-driven collagen quantification platform. Using this platform, one can measure up to about thirty fiber features including individual fiber properties such as length, angle, width, and straightness, as well as bulk measurements such as density and alignment. Additionally, the user can measure fiber angle relative to manually or automatically segmented boundaries. This platform also provides several additional modules including ones for ROI analysis, automatic boundary creation, and post-processing. Using this platform does not require prior experience of programming or image processing, and it can handle large datasets including hundreds or thousands of images, enabling efficient quantification of collagen fiber organization for biological or biomedical applications.

Here, we present a protocol to use a curvelet transform-based, open-source MATLAB software tool for quantifying fibrillar collagen organization in the extracellular matrix of both normal and diseased tissues. This tool can be applied to images with collagen fibers or other types of line-like structures.

カーブレット変換ベースのツールを使用したフィブリラーコラーゲンの定量化

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression ...