我々は技術支援のためにバーナードFoucartに感謝します。この作品は、科学研究のためにベルギーの基金（FRS-FNRS）で医療研究のためのエリザベート王妃基金によってサポートされていました。アニエスヴィレは、科学研究のためにベルギーの基金で研究員です。

全ての動物の手順は、研究における動物のケアと使用のための衛生規制の国立研究所に合わせて、地元の倫理委員会の契約に行った。 1。人工脳脊髄液の調製同メディアは、解剖カットし、休息期間と電気生理学的記録中にスライス（1ml /分）灌流するために使用されます。このメディアは124のNaCl、4.4 mMのKClを、26 mMの炭酸水素ナトリウム、1mMののNaH 2 PO 4、2.5mMのCaCl 2を、1.3のMgSO 4、10mMのD-グルコースから構成されている。 <ol><li>溶液（1 M）に既にあるMgSO 4を除くACSF 2Lのための異なるコンポーネントを重量を量る。標準溶液を使用すると、 硫酸マグネシウム、粉末で吸湿性が高いための Mg 2 +の正確な濃度を確実にすることができます。のCa 2 +：の Mg 2 +比が大幅にLTP誘導とメンテナンスに影響を及ぼす14ので、それらの割合は常に尊重されなければならない。 </li><li>ガラス中のCaCl 2を除いてすべてのコンポーネントを置くには、メスシリンダー、蒸留H 2 Oで2 Lにもたらす</li><li>精力的にかき混ぜる。すべてが溶解するときに、タンク（95％O 2、5％CO 2）に取り付けられた水槽のバブラー、チューブを介してカーボゲンを追加する。数分待ってから、pHは重炭酸塩緩衝液の作用によって7.4に固定されて塩化カルシウムを追加します。 </li><li>冷蔵長方形のガラス皿で600ミリリットルを維持し、°C皿の周りに氷を4にクールダウン。このメディアは、海馬の解剖のために使用されます。 </li><li>残り1400ミリリットルをフィルタリングし、三角フラスコに保つ。 </li></ol> 2。電気生理学的リグと脳スライス記録商工会議所の調製灌流回路は、2蠕動ポンプ、リザーブタンク及びtから他のポンピング使用される流体からの新鮮な流体をポンピングするいずれかの形成されている彼はビンにチャンバーを記録。新鮮な流体は、それが重力（ 図1A）によってインターフェース記録チャンバに到達する前に再酸素化と温め、自家製灌流システムに追加される。インタフェース記録室はFST（ファイン科学ツール、バンクーバー、カナダ、 図1B）によって設計されました。組織切片は、リムーバブルウェル環に結合して不織布​​ネットフィルタ上に配置され、連続的に吸引ウェル針の高さを調整することにより、インターフェイス条件下で維持することができる。自家製プラスチックその端部でブロックチューブと横方向穿孔（0.5 mm）をチャンバ内のレベルの安定性を高めるために、吸引針に固定されている。記録ヘッドは、記録ヘッド（水滴の形成を減少させるため）に偏向口から湿った空気を通過させることによって湿潤環境を維持するのに役立ちガス分散石を含む水浴上に取り付けられている。浴および媒体温度を連続的にDC電流番目のレベルを変えることによって制御される水浴中で荒いシリコーンゴム埋ヒーター素子。水浴と記録ウェルのサーミスタは、チャンバ温度はこれらのサイトに設定し、正確に監視できるようにする。 チャンバの加熱システムは、全体のリグの温度を制御するグローバル加熱システムにより完成される。ソフトウェアは、エジンバラ（大学の研究者によって開発された<a href="http://www.etcsystem.com" target="_blank">www.etcsystem.com</a> ）モニターと酸素空気の温度、脳切片、電極および長期的録音（ 図1C）のための安定した環境を提供し、残りのリグをイコライズ。マウス海馬スライスに使用温度は28℃です。 <ol><li> 20分の最小用蒸留H 2 Oとのすべての灌流回路をすすぎ、暖房システムを起動します。 </li><li>回路内カーボゲンバブリングを開始します。カーボゲンをfを通して自家製灌流チューブに到着ILTERキャンドルと記録室下水浴した。水浴中の流量は、流量計により制御される。流速が遅すぎる場合、組織が低酸素となる可能性がある。流量が高すぎると逆に、ガスが十分に温められ、そして組織の乾燥につながる加湿ないかもしれない。高いガス流量はまた、浸透圧ショックに至る下水浴から組織の上に噴霧水の可能性を高めることができる。これは、偏向口の出口にナイロンメッシュのビット（100μm）を添加することによって防止することができる。 </li><li>回路を排出し、濾過ACSFでいっぱい。 </li><li>保持チャンバー内のスライスをサポートするリングを置く。 500から750ミクロンの範囲のメッシュ開口部を有する不織布ネットフィルタは、2つの部分から成る樹脂、エポキシ接着剤で引き伸ばされ、リングに取り付けられている。不織布ネットフィルタは87％のポリアミドおよび13％エラスタン（パンティ15デン）で構成されている。接着剤はリンの表面にレリーフの形成を避けるために慎重に適用しなければならないgであった。 </li><li>慎重に回路からすべての気泡を除去。 </li><li>吸引針のネジで記録チャンバー内ACSFのレベルを調整します。蠕動ポンプの速度は、入口ポンプの1ml /分および出口ポンプ用5ml /分に調節される。 </li></ol>灌流システムは、硬質耐振動テーブル上に配置され、ファラデーケージに囲まれている。 3。解剖エリアの調製手術器具：＃11ブレードとメス、小さな標準解剖はさみ、春のはさみ、湾曲したピンセット、2ハイデマンspatulaeとスプーン。 補足資料：ギロチン、underpad、カミソリの刃でマッキルウェーン組織チョッパー、ろ紙、ゴム乳首付ガラスパスツールピペット、2プラスチック製パスツールは広口、ペトリ皿、金属製のシリンダーとのいずれかをピペット直径7mm（ 図2A）。 <ol><l私は&gt;冷たいACSF（ステップ1で調製したもの）でいっぱい解剖皿に、ろ紙に包まれた染色皿から冷蔵ガラス蓋を浸す。慎重に水槽バブラー（ 図2A）を介し気泡や含酸ACSFを削除します。 </li><li>使用のために楽器をレイアウトします。組織チョッパープレートと蒸留水とエーテル（ 図2B）で洗浄し、新しいカミソリの刃でろ紙の三層を追加します。それが紙に触れたときにカミソリの刃を水平にする必要があります。ブレード力が極大値の約3分の1に極大値および速度の半分に調整される。 </li><li>あなたはその後、時間を持っていないので、すべてが（楽器、温度...）準備ができているか注意深く確認してください。 </li><li>冷たいACSFでいっぱいパスツールピペットで解剖を噴霧する誰かを尋ねる。 </li><li>断頭前ネンブタールIP（100 mg / kg）を、マウスを麻酔。ハロタン麻酔を使用することもできる。我々は両方の方法とobtaを比較した同じ結果をINED。断頭を麻酔下で実施する必要がなく、頸椎脱臼を用いることもできる。しかし頸椎脱臼は、動物の苦痛を避けるために、非常に良い練習が必要です。 </li><li>冷たいACSF連続シャワーの下で可能な限り迅速にunderpadに解剖。 </li></ol> 4。脳の取り外し<ol><li>銃口上の1つの手の人差し指と親指で、まだ頭を押さえながら、ギロチンカットのエッジで開始し、前頭骨に吻方ランニング頭の上の真ん中に沿って解剖ハサミで切開をする。 </li><li>完全に頭蓋骨プレートを露出させ、頭の尾側の筋肉を除去するために、ヘッドの各側面に皮膚の筋肉を切って。 </li><li>解剖ハサミで、両側に側頭筋をカットし、側頭プレートに沿って、その後横方向に、途中で正面のプレートをカット。次に、2つのPL間、後頭骨に少しカットをするATES。 </li><li>それぞれの側では、後頭部プレートの尾ベースでカット。 </li><li>春のはさみと矢状縫合に沿ってカットします。 </li><li>鉗子で、お互いからそれらを離れて広めることで頭蓋骨の半分を削除します。 </li><li>メスで、単に嗅球後に横方向にカットし、小脳はその後風邪ACSFと解剖皿に抽出された脳を突入直前。 </li></ol> 5。海馬の解剖<ol><li>脳は解剖皿に漬された後、真ん中に挿入メスで互いに二つの半球を断つ。 </li><li>海馬の解剖は、双眼手術用顕微鏡（X25、 図2A）を通して、視覚的制御下spatulaeを用いて行われる。 1半球では、慎重に側脳室を見て構造を広げた。脳幹と間脳を取り外します。これは、一方の側の前頭皮質でspatulaeを適用することによって、オン間脳で行われます反対側。 spatulaeと海馬に手を触れないようにし、組織切片の間にそれをストレッチしないように注意してください。 </li><li>心室にへらを挿入することによって、優しく皮質（アウェイロール）の海馬を押し出すその後円蓋を断つ。 </li><li>海馬が抽出されると、過剰な皮質組織と残りの血管を取り除く。 </li></ol> 6。スライスの切断<ol><li>広口プラスチック製パスツールピペットを用いて、そのアルベア表面上（凸側）をスプーンで海馬を転送します。 </li><li>標準のプラスチック製パスツールピペットを用いて余分な水分を取り除きます。 </li><li>垂直方向にほぼチョッパーのろ紙（ 図2B）に触れスプーンを先端とその後スプーンを戻す急速にろ紙に触れることによって、スプーンから海馬をオフにドロップします。 </li><li>海馬を配向し、チョッパーと400μmの横断それをスライス（海馬の向きについては、図2C参照カミソリの刃に比べて膿）。できるだけ早く行動する。 </li><li>スライスされた海馬とろ紙を取り出し、スライスを少し広げるために金属製のシリンダーのまわりでそれを包む。その後、ACSFのスプレーとの自由スライスが標準的なプラスチックパスツールピペットを使用しており冷たいACSFでいっぱいペトリ皿にそれらを収集。 </li></ol> 7。インターフェイスにおけるスライスのインキュベーション<ol><li>標準のプラスチック製パスツールピペットでスライスを選択し、迅速に記録室に配置します。スライスは、28でインターフェイスで、直接レコーディング室で解剖のトラウマから回復℃まで</li><li>スライスは、最も可能性の高いシンクします。スライスレベルに達し、それが浮くようにそれを高めるために液面を下げる。 </li><li>レベルを下げながら、正しい位置にスライスを入れます。スライスは常にCA1領域における電極のポジショニング（2刺激と一つの記録電極）を容易にするために、同じように配向されている。 </li><li>時停止流体がインタフェースである。スライスの周りの媒体の &quot;メニスカス&quot;は、メディアの十分なレベルを示す。ネットフィルタは、メディアで飽和したが、完全に水没しないようにする必要があります。 </li><li>穴のあいた蓋の上に置かろ紙で覆わ室に保管してください。 </li><li> 28少なくとも1.5時間スライス休ませ℃に</li></ol> 8。シナプス応答の記録<ol><li>電極を記録：ACSFで満たされたときガラスキャピラリーはMΩ2-5の先端抵抗を得るために引っ張られる。濾紙の小片は、電極の先端の周囲に配置され、骨ワックスを凝縮を低減するために先端に印加される。刺激電極：12.5ミクロン径の白金イリジウムバイポーラクラスタ電極はFHC（USA）から購入する。適切なケアで、各電極（ 図1B）は、少なくとも30回使用することができます。 </li><li> CA1領域の角質放線に電極を置き、すべての電極が並んでアップ（ 図3A）。電極は、ナリシゲのマイクロマニピュレーターとスライスの表面の下で75から150程度に低下する。 2刺激電極はシェーファー側枝2つの別個の束を刺激するために配置されます。電極はスライス上に降下している場合、濾紙は慎重室を閉じ、すべての周りに配置されています。 </li><li>二相性刺激（半波あたり0.08ミリ秒のパルス持続時間）はSIU-V分離ユニットに接続された芝生刺激に一定の電圧で行われる。最大応答は2 Vから最大12 VのフィールドEPSPのに刺激強度を増加することによってチェックさWPI ISO-80アンプで1000倍に増幅し、10 Hzから10 kHzでフィルタリングされます。信号は、次に、ナショナルインスツルメンツ/ D変換器を介してPCに送信される。刺激、データ収集と分析がWinLTPプログラム（使用して実行され<a href="http://www.winltp.com">www.winltp.comを</a> ）。フィールドEPSPを、入力アウトで得られた最大振幅の40％で計上されている曲線を置く。スライスごとに、fEPSP斜面はLTP誘導に先立つ30分かけて平均勾配に対して正規化されています。 </li><li> LTPは、第二の経路は対照として機能し、一方の経路上でのテスト刺激の強度で単一列（100ヘルツ）を適用することによってトリガされる。 </li></ol> 9。セットアップの清掃<ol><li>少なくとも10分間、過酸化水素（H 2 O 2）の3％溶液で全ての回路をすすぎ、その後ドレイン。回路は、注意深く実験を開始する前に、蒸留水でリンスする。他のラボではクリーニングのためにのみ蒸留水を使用しますが、水のみを使用しているとき、我々は配管システム内の暗い残留物の堆積を気づいているように、H 2 O 2を使用することは絶対に必要ではありません。 </li><li>記録室の下に水浴の水を交換してください。 </li><li> 5分間アルコール風呂は刺激電極のヒント。 </li></ol>

利害の衝突は宣言されていない。

我々は我々の研究室で開発され、LTP録音11,17に大きな専門知識を有する他の研究室で使用される方法の組み合わせに起因するプロトコルを開発した。このプロトコルは、成体マウスの海馬に適合され、どの年齢やバックグラウンド遺伝子型の動物において使用することができる。また、アルツハイマー病18,19のような神経変性疾患を開発するトランスジェニックマウスにおけ?...

今日では、メモリは神経回路レベルで保存し、リコールされている方法の複合体の限られた理解があります。ただし、メモリ記憶の統一仮説が利用可能であり、広く受け入れられている。メモリは、中枢神経系のニューロン間のシナプス結合の強さの変化として記憶される。自分自身で、シナプス可塑性の研究は、主に2画期的な発見の恩恵を受けています。 （1）精実験、ブリスとロモ1では、そのまま麻酔ウサギを使用して、海馬のperforantパスを簡単に高周波数（1秒、100 Hz）での配信は刺激が長続きを引き起こしたことを（いくつかの発見時間）関連のシナプス結合の増加。この魅惑的な現象は、1975年2ダグラスとゴダードによって&quot;長期増強&quot;やLTPと呼ばれていました。 （2）その後、それは人為的にin vitroで生き維持同様の現象が、脳切片（0.6 mm）の中でトリガできることがわかった</eM&gt;。最も広く研究さLTPは、いわゆるCA1領域の錐体ニューロンにおいて誘発生じる電界興奮性シナプス電位を記録しながら、軸索の束（いわゆるシェーファー側枝）に1つまたは複数の破傷風菌を提供することにより、 インビトロで観察された。 LTP誘導のメカニズムは、主に明らかにされている。 AMPA受容体のリン酸化（その効率を増加させる）と、シナプス後膜3に余分なAMPA受容体の組み込み：基本的には、NMDA受容体を介してCa 2 +の流入は、2つの結果を有する酵素を活性化する。対照的に、LTPの維持期のメカニズムは、30〜60分間、より多くの時間スライスのための健康を維持するために、実験的にはるかに困難であるため、特に、不明な点が多い。 研究の多くは、LTPのメカニズムの理解に専念してきており、興味深い理論が年間4-11にわたって詳述されている。しかし、国連ゴマ今、シナプス強度の安定した増加を根底に正確な分子メカニズムは解明されていない。これは、準備のためにさまざまなテクニックを使用して、異なる研究室で以前の結果を再現することが困難と海馬スライスの維持が一因である可能性があります。彼らの方法論の論文では、Sajikumar ら 12は、実験ラット海馬スライスの準備のための条件、安定したLTPの記録の重要性を強調した。このビデオでは、マウス海馬スライスでは非常に安定したLTPを記録することができるように長年にわたって我々の研究室で開発されたすべての最適化手順を提示します。 この最適化は、マウス13、ラット11 LTPのメカニズムを研究する他の研究室が開発し、正常に使用プロトコルから行われている。これは、経験豊富な研究者が成功率が高いと成体マウスでは非常に長期的なLTPを誘導し、記録することができます。 P誘発性LTPのhysiological基礎は慎重にチェックし、14を実証した。この方法論の論文では、解剖の手順が深くスライス興奮性を修正することができますが、温度や酸素のような実験条件のいずれかの変更は、LTPメンテナンスに多大な影響を及ぼす可能性があることを示している。また、すべてのこれらのパラメータの正確な制御が初心者の学生のために数ヶ月の訓練を必要とすることを強調しなければなりません。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent/Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S8875</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 1M</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>63126</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbogen</td>
			<td>Air Liquide (Belgium)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillaries</td>
			<td>WPI, Inc. (UK)</td>
			<td>TW150-4</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulating Electrodes</td>
			<td>FHC (USA)</td>
			<td>CE2B30</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tools</td>
			<td>FST (Germany)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper 84 g/m2</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>FT-3-105-110</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh</td>
			<td>Lycra</td>
			<td>15 den</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue</td>
			<td>UHU</td>
			<td>plus endfest300</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>WPI, Inc. (UK)</td>
			<td>ISO-80</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interface recording chamber</td>
			<td>FST (Germany)</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pumps</td>
			<td>Gilson (USA)</td>
			<td>Minipuls 3</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>University of Edinburgh</td>
			<td><a href="http://www.etcsystem.com" target="_blank">www.etcsystem.com</a></td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Chopper</td>
			<td>Mcllwain</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulators</td>
			<td>Grass (USA)</td>
			<td>S88X + SIU-V</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Program analysis</td>
			<td>WinLTP</td>
			<td><a href="http://www.winltp.com" target="_blank">www.winltp.com</a></td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulators</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MM-3 and MMO-220A</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical microscope</td>
			<td>Leica Microsystem</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A/D converter</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NIPCI-6229 M-series</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved preparation and preservation of hippocampal mouse slices for a very stable and reproducible recording of long-term potentiation

長期増強（LTP）は、シナプスの強さの増加によって特徴付けられるシナプス可塑性の一種であり、メモリ符号化に関与すると考え。 LTPは広く研究されている急性海馬スライスのCA1領域において誘発。しかしこの現象の維持段階の基礎となる分子メカニズムはまだよく理解されていない。これは、異なる研究室で使用されるさまざまな実験条件が一因である可能性があります。確かに、LTPの維持期は酸素、温度や湿度などの外部パラメータに強く依存する。また、解剖後にスライス平面、スライスの生存の向きなどの内部パラメータに依存しています。 すべてのこれらのパラメータの最適化は非常に再現性が非常に安定した長期増強の誘導を可能にします。この方法論は、さらに安定した増加に関与する分子メカニズムを探索するための可能性を提供しています海馬スライスにおけるシナプスの強さである。また、神経生理学的現象のin vitroでの調査での実験条件の重要性を強調しています。

この方法は、成体C57BL/6Jマウス（JANVIER SAS、フランス）14からの急性海馬スライスに誘起長期的な長期増強の特性を分析するために使用されている。驚くべきことに、実験条件の改善がLTPを見るための新しい方法につながっている。我々は、シナプス強度の長期的な増加は、新しいタンパク質の合成を必要としなかったことを示した。 ここでは、LTP誘導がスライス...

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Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

本論文では、準備し、維持するために、完全な方法論を提示<em&gt; in vitroで</em成体マウスから&gt;急性海馬スライス。このプロトコルは95％の成功率を8時間より長く非常に安定した長期的な長期増強（LTP）の記録を可能にする。

長期増強の非常に安定しており、再現性録音のための改良された準備と海馬マウススライスの保全

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory ...

improved-preparation-preservation-hippocampal-mouse-slices-for-very

Research

JoVE Journal

Neuroscience

26.6K ビュー.  University of Mons. 本論文では、準備し、維持するために、完全な方法論を提示 in vitroで急性海馬スライス。このプロトコルは95％の成功率を8時間より長く非常に安定した長期的な長期増強（LTP）の記録を可能にする。

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Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). &beta;-amyloid (A&beta;), a peptide produced in high amounts in AD, is known to reduce Long-Term Potentiation (LTP), a cellular correlate of learning and memory. Indeed, LTP impairment caused by A&beta; is a useful experimental paradigm for studying synaptic dysfunctions in AD models and for screening drugs capable of mitigating or reverting such synaptic impairments. Studies have shown that A&beta; produces the LTP disruption preferentially via its oligomeric form. Here we provide a detailed protocol for impairing LTP by perfusion of oligomerized synthetic A&beta;1-42 peptide onto acute hippocampal slices. In this video, we outline a step-by-step procedure for the preparation of oligomeric A&beta;1-42. Then, we follow an individual experiment in which LTP is reduced in hippocampal slices exposed to oligomerized A&beta;1-42 compared to slices in a control experiment where no A&beta;1-42 exposure had occurred.

Preparation of Oligomeric &amp;#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

One feature of Alzheimer's Disease is the elevation of A&beta;1-42 peptide. Here we provide a protocol for preparing synthetic A&beta;1-42 oligomers, which impairs hippocampal Long-Term Potentiation, a cellular correlate of memory. This procedure is useful for investigating mechanisms of A&beta;-induced pathology and drug screening.

β-アミロイドオリゴマーの調製 1から42まで</sub海馬スライスでのシナプス可塑性の減損の>と誘導

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

神経科学

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The hippocampus can be extracted quickly and easily from rats and mice and slices remain viable for hours in oxygenated artificial cerebrospinal fluid. Moreover, basic electrophysisologic techniques are easily applied to the investigation of synaptic function in hippocampal slices and have provided some of the best biomarkers for cognitive impairments. The hippocampal slice is especially popular for the study of synaptic plasticity mechanisms involved in learning and memory. Changes in the induction of long-term potentiation and depression (LTP and LTD) of synaptic efficacy in hippocampal slices (or lack thereof) are frequently used to describe the neurologic phenotype of cognitively-impaired animals and/or to evaluate the mechanism of action of nootropic compounds. This article outlines the procedures we use for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and Alzheimer's disease (AD)1-3. Use of aged rats and AD model mice can present a unique set of challenges to researchers accustomed to using younger rats and/or mice in their research. Aged rats have thicker skulls and tougher connective tissue than younger rats and mice, which can delay brain extraction and/or dissection and consequently negate or exaggerate real age-differences in synaptic function and plasticity. Aging and amyloid pathology may also exacerbate hippocampal damage sustained during the dissection procedure, again complicating any inferences drawn from physiologic assessment. Here, we discuss the steps taken during the dissection procedure to minimize these problems. Examples of synaptic responses acquired in "healthy" and "unhealthy" slices from rats and mice are provided, as well as representative synaptic plasticity experiments. The possible impact of other methodological factors on synaptic function in these animal models (e.g. recording solution components, stimulation parameters) are also discussed. While the focus of this article is on the use of aged rats and transgenic mice, novices to slice physiology should find enough detail here to get started on their own studies, using a variety of rodent models.

This article outlines procedures for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and age-related neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease.

老化とアミロイド病理の間にシナプス変化の研究のためのラットおよびトランスジェニックマウスからの急性海馬スライスの準備

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

ホールマウントマッスル分析による再現性のあるマウスの坐骨神経クラッシュと再生のその後の評価

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

マウス脳の長期イメージングのためのポリッシュと強化間引き頭蓋骨ウィンドウ

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Preparation of an Awake Mouse for Recording Neural Responses and Injecting Tracers

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13. In the auditory system, fundamental response properties of brainstem neurons including threshold, frequency specificity, and inhibitory sidebands are altered in significant ways under anesthesia1-2. These observations prompted physiologists to seek ways to record from single neurons without the contaminating effects of anesthesia. One result was a decerebrate preparation, where the brainstem was completely transected at the level of the midbrain4. The drawbacks of this preparation are a formidable surgery, the elimination of descending projections from the forebrain, and an inability to use sensory stimulation to examine structures above the midbrain. A different strategy has been to implant electrode arrays chronically to record from single neurons and multiunit clusters while the animal is awake and/or behaving5,6. These techniques however are not compatible with injecting tracer dyes after first electrophysiologically characterizing a brain structure. To avoid altering neural response properties with anesthetics while recording electrophysiological response properties from single neurons, we have adapted a head restraint technique long used in bats7-9 to mouse10-12. Using this method, we are able to conduct electrophysiological recordings over several days in the unanesthetized mouse. At the end of the recording sessions, we can then inject a dye to reconstruct electrode positions and recording sites or inject a tracer so that pathways to and from the recording loci can be determined. This method allows for well isolated single neuron recordings over multiple days without the use anesthetics.

Electrophysiological characterization of neuronal responses is important for understanding brain function and for guiding the placement of dyes for pathway tracing. However, many studies are performed in anesthetized animals. To understand brain function without anesthetics, we developed a method to record neuronal response properties and inject dyes in awake mouse.

神経応答を記録し、トレーサーを注入するための覚醒マウスの作製

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13.  In the auditory system, fundamental response ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

の長期嗅覚順応の分子読み出し<em&gt; Cエレガンス</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

器官型海馬スライスにおけるペア全細胞記録

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

マウス蝸牛外植片の長期的タイムラプスイメージング

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic hippocampal neurons can often grow successfully on glass coverslips at high density under serum-free conditions, but low density cultures typically require a supply of trophic factors by co-culturing them with a glia feeder layer, preparation of which can be time-consuming and laborious. In addition, the presence of glia may confound interpretation of results and preclude studies on neuron-specific mechanisms. Here, a simplified method is presented for ultra-low density (~2,000 neurons/cm2), long-term (&#62;3 months) primary hippocampal neuron culture that is under serum free conditions and without glia cell support. Low density neurons are grown on poly-D-lysine coated coverslips, and flipped on high density neurons grown in a 24-well plate. Instead of using paraffin dots to create a space between the two neuronal layers, the experimenters can simply etch the plastic bottom of the well, on which the high density neurons reside, to create a microspace conducive to low density neuron growth. The co-culture can be easily maintained for &#62;3 months without significant loss of low density neurons, thus facilitating the morphological and physiological study of these neurons. To illustrate this successful culture condition, data are provided to show profuse synapse formation in low density cells after prolonged culture. This co-culture system also facilitates the survival of sparse individual neurons grown in islands of poly-D-lysine substrates and thus the formation of autaptic connections.

Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms.

超低密度のために簡略化された方法、長期初代海馬ニューロンの文化

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

少量循環、血流 - と水没型チャンバー システムで管理急性海馬スライスにおけるシナプス可塑性を記録

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...