長期的なシナプス可塑性、具体的には、長期増強および長期うつ病は、海馬の横方向に沿って広く調査されている。また、縦方向に沿って見てきました。しかし、縦方向に関しては、シナプス可塑性に関して海馬の縦方向CA1軸にはほとんど注意が払われていない。
私たちの研究室からの以前の出版物は、海馬のCA1ピラミッドニューロンがシナプス可塑性をサポートできる関連接続を形成することを示しています。このプロトコルの詳細については、前の資料を参照して、次の参照を参照することをお勧めします。マウスを麻酔するためにウレタンを注入する。
完全に麻酔をしたマウスを摂氏37度に設定した加熱パッドの上に置きます。目を湿らせるには、アイジェルを塗布します。目のクランプを使用して、マウスの頭蓋骨をしっかりと固定します。
目のクランプは外科処置の間に実験者のための移動性の自由を与える。そして、それは聴覚皮質を含む実験にも特に有用であり得る。ただし、正確なステレオタクシック座標を取得するには、多くの注意が必要です。
メスとマウスの頭間骨と後頭骨の端にある皮下組織と筋肉を分離します。綿棒で乾燥したデュラ物質をブロット。その後、脳脊髄液を排出するために水槽マグナを穿刺します。
綿棒を取り付けて脳脊髄液を排出し続けます。頭皮の皮膚を切り取り、取り除き、露出した領域を乾燥させておきます。静脈キャリパーの助けを借りて海馬領域に対応するポイントをマークします。
顕微鏡で観察しながら、メスまたは高速ドリルを使用して、マークされたポイントに沿って海馬の後部領域の上の頭蓋骨に切開を行います。生理食塩水または不活性油を塗布することにより、露出した脳組織を湿らせておいてください。ステレオタックスホルダーに刺激電極と記録電極をしっかりと固定して配置します。
CA1の裏海馬の上の刺激および記録電極を調節する。後ろ方向の縦方向 CA1 海馬領域の座標を見つけるガイドとして、ステレオタックス座標でマウスの脳を使用します。.マルチチャンネル電極を使用した録音の場合は、最初のチャンネルを使用してCA1海馬領域のステレオタックス座標を最初に見つけます。
残りの電極を、刺激および記録電極の角度が、ブレグマ点からの正中線に対して30度から60度の範囲になるように配置する。この角度は、CA1海馬領域の縦方向に対応します。録音システムの電源を入れます。
記録およびデータ収集のためのニューラルソフトウェアを開きます。脳の表面に触れるまで、マイクロマニピュレーターを使用して記録電極と刺激電極をゆっくりと下げます。電極が脳表面に触れたときにインピーダンスの増加を観察します。
これは、画面に表示される赤いチャンネルで観察することができます。CA1海馬に対して選択した立体座標系に対応するおおよその深さまで電極をゆっくりと下げます。安定した興奮性興奮性シナプス後の電位が観察されるまで刺激を与える。
最大刺激強度を検出するために入力出力曲線を実行します。入力出力曲線を使用して、ベースラインの強度を設定し、高周波刺激または低周波刺激を呼び出すための刺激強度を設定します。高周波刺激または低周波刺激後1時間、局所的なフルポテンシャルを記録します。
データをエクスポートし、選択したソフトウェアを使用して分析します。すでに調製したスライス溶液の不良400mlは、約20分間、別のフラスコおよび酸素化物にする。酸素化スライス溶液の貧弱な200 ml。
パラフィルムで覆い、約20分間80度の冷凍庫に移してスラッシュを作ります。貧弱な脳スライス保持室で溶液をスライスの残りの200 mlと連続バブリングで摂氏32度の水ボットに保ちます。冷やしたスライス溶液を引き出し、ビーカーに約50mlの貧弱を引き出します。
麻酔付きマウスの首を切る。マウスの頭蓋骨を覆う皮膚を切り取り、後頭部骨に正中線に沿って頭蓋骨の部分をカットします。鈍い鉗子で頭蓋骨を開きます。
ヘラで脳をそっとすくい取り、ビーカーの冷やしたスライス溶液に入れる。メスの刃で中線に沿って2つの脳半球を分離します。海馬をヘラで皮質からそっと取り外して分離します。
孤立した海馬の中隔および時間的な端を切り取る。スライスプレートに少量の接着剤を塗布します。縦方向CA1海馬スライスの場合は、海馬のCA3領域を接着剤でスライスプレートに取り付けます。
コントロールとして機能する横切りスライスの場合は、海馬の腹側端をビブラートメのスライスプレートに取り付けます。スライスチャンバーに置きます。ビブラートメのパラメータを設定します。
付属の海馬をビブラートメでスライスします。良い縦方向CA1海馬脳スライスは、CA1の1層とデンテート回の2層を有する。また、CA1領域の地層オリエンと地層放射体が存在する。
あるいは、横海馬の脳スライスは、タクトのデンテート回CA3およびCA1領域を有する。水ボットのチャンバーを保持する脳のスライスに脳のスライスを転送します。摂氏32度の温度で20分間インキュベートし、室温にして回復させます。
ACS serfを1分間に2mlの速度で連続的に過熱させます。脳スライスを記録チャンバーに移し、鈍い鉗子で脳スライスの位置を調整し、ハップで所定の位置に保持します。データ取得用のソフトウェアをオンにします。
縦方向脳スライス。縦方向のスライスの場合、刺激と記録電極を地層オリエンに配置します。刺激電極は、同じ層からの記録を持つ脳スライスの中隔または時間側のいずれかに置きます。
あるいは、刺激および記録電極をラジタムに配置し、脳スライスの中隔または時間側のいずれかに刺激電極を配置する。横スライスを制御する場合は、CA3シャファー側副経路領域に刺激電極を配置し、CA1領域に記録電極を配置します。アイソレーター刺激発生器をオンにし、刺激を与えます。
シナプス後の興奮性充填電位が観察されるまでの記録電極深さを調整する。最大刺激強度を検出するために入力出力曲線を実行します。入力出力曲線を使用して、高周波刺激または低周波刺激を呼び起こすベースライン記録の刺激強度を設定します。
孤独な期間の増強または長期うつ病を誘発するパラメーターについては、添付のPDFを参照してください。vivoでの高周波刺激に応答して興奮性シナプス後の電位が増加した。これは、縦方向の海馬CA1が長期的な増強をサポートしていることを示しています。
縦方向海馬CA1脳スライスについては、高周波刺激に対する応答の増加が、オリエンと地層ラジウムの中隔側および時間側の両方で観察された。これは、縦方向海馬CA1領域に沿って誘導されるシナプス可塑性が線形または方向特異的ではないことを示している。長期うつ病に対して既に確立されたプロトコルを使用して、インビボとインビトロの両方で長期的なうつ病は誘発されなかった。
結論として、我々は、インビボとインビトロの両方の縦方向海馬CA1領域における長期的なシナプス可塑性を調査する方法を示した。プロトコルの詳細は、このビデオに付随するPDFで、あなた自身の研究室の縦方向海馬CA1領域に沿った長期的なシナプス可塑性を調査するのに役立つ。
