We would like to thank the members of the Montgomery and Madison labs for helpful discussion. We acknowledge the funding received from the following sources in this research: NFNZ, AMRF, Marsden Fund, HRC, and NIH.

動物倫理に関する声明： この原稿に記載されているプロトコルは、オークランドとスタンフォード大学の大学によって確立された動物のケアのガイドラインに従ってください。 P7の仔ラットは、迅速な断頭により安楽死させた。海馬切開をその後直ちに以下に記載のように行われる。 1器官海馬スライス培養<ol><li>準備<ol><li> （脳を解剖するためにのみ使用）解剖培地を作製。 、5ミリリットルHEPES緩衝液、2ミリリットル1Mトリスストック液（pH7.2）（0.85％NaCl中各10,000単位）200ミリリットル最小必須培地、2ミリリットルのペニシリン - ストレプトマイシン溶液を組み合わせ、およびフィルターは、0.22μmのフィルターを用いて滅菌する。氷のように冷たい解剖培地中で海馬解剖を行ってください。 </li><li>解剖媒体を冷却する。冷凍庫に液体が非常に寒いになるまで解剖を開始する前に約1時間を解剖メディアを配置します。大きな氷​​CRを許可しない形成するystals。必要になるまで氷上で保管してください。 </li><li> （海馬の解剖を除いてすべてのために使用される）培養液を準備します。 100ミリリットルの最小必須培地を組み合わせて、（1×濃度、液体）ハンクス塩/ W、L-グルタミン/ W、2ミリリットルのペニシリン - ストレプトマイシン溶液（0.85％NaCl中の液体、それぞれ1万台）、2.5ミリリットルのHEPES、1Mバッファソリューション、50ミリリットルハンクス液を50mlウマ血清（定義された、熱不活性化）、フィルター、0.22μmのフィルターで滅菌する。 </li><li>培養皿を準備します。 35mm培養皿あたりの培地の1ミリリットルを置き、それぞれの皿にメンブレンインサートを追加します。 1 150ミリメートルペトリ皿にこれらの料理の7まで使用すること（「プレート」と呼ぶ）。皿中の培地は、適切な温度およびpHを達成するように、解剖が始まる前に、少なくとも1時間、CO 2インキュベーターでプレートを置きます。 </li></ol></li><li>生後7日目のラット仔から海馬の解剖（P7） <ol><li>手順の前に、UV光の下ですべての解剖ツールを事前に滅菌する。 </li><li>迅速な断頭後、一皿に冷やした培地中に脳と場所を削除し、解剖用の湿らせた濾紙片にそれを削除します。海馬を露出させ、鈍い滑らかなプラスチックでコーティングされたミニチュアスパチュラを使用して離れて脳からの皮質をいじめる。円蓋をカットした後、静かに（ 図1A）、それを反転する海馬の下にへらを働く。 注：正常スライス培養は、P10まで動物を用いて調製することができる。 </li><li>離れて脳の残りの部分から分離された海馬をトリミング。湿らせた柔らかい絵筆を使用して冷却された解剖メディアを含む新しい皿に海馬の転送（ 例えば 、白クロテン＃4）。 </li><li>解剖時の脈絡叢の海馬の下側（ すなわち 、より平坦側）を清掃して、これらのスポンジ状、meninge様組織は、それが困難な海馬を分離するために作るように後で互いにスライス。 注：彼らは静かにからかわできない場合には所定の位置にこれらの組織のままにしておきます。 </li><li>海馬を損傷することなく、可能な限り迅速に全体解剖を行ってください。 注：慎重な解剖限り実験条件が冷えているように、高速で1よりも重要である。同時に3匹のラットからの海馬をスライス。スライスの健康は限り最初からメッキスライスはインキュベーターに行くときに合計時間が30分の下にあるように影響を受けません。 </li></ol></li><li>スライシング<ol><li>手動の組織スライサーを使用して、400μmの横断面に横方向に海馬をスライス。スライスが実施される方法は、それが組織に過度に有害ではないと（ つまり、アモンのホーンを容易に組織内に保存されるように見られている）は、容易に目に見える層状アーキテクチャと整合厚さのスライスを生成するように、重要ではありません。 </li><li>組織のステージに海馬うそ＃2ろ紙のトリプル厚さの上にチョッパー。海馬は（むしろこの時点でスライスされたパンのパンのように、 図1B全てのカットが行われたまで、 すなわち全体の海馬がチョッパーのステージ上に残っている）は、個別のスライスを削除せずに完全にスライスされている。 </li><li>次の各海馬（白クロテン＃2）に敷設ソフト絵筆を使って解剖培地に海馬を転送します。静かに海馬とその下のろ紙の間の接着を破壊する側にそれぞれ海馬を押してください。段階からそれを拾うために、各海馬の下にブラシをロールバックします。チルド解剖媒体の同じ35ミリメートルペトリ皿にすべての海馬を置きます。手動で右回りと左回りの運動を交互に料理を攪拌することにより、個別スライスに海馬を分離します。 </li><li>解剖顕微鏡下でスライスを点検し、損傷している任意のものを捨て、小さな、またははっきりと目に見える細胞を有しないものボディ層。 注：それは多くの場合、すべてのスライスが正常に、このように自分の兄弟から分離されるわけではない場合になります。この場合、それらはエッジに回し、微細鉗子の先端とそれらをつついて分離することができる。 「良い」のスライスは、その後、カットオフとファイアーポリッシュパスツールピペット（ 図1C-E）を使用して冷却された解剖培地を含む別のきれいなペトリ皿に移している。 </li></ol></li><li>ストレージ<ol><li>メンブレンフィルターインサート上に個別のスライスを配置します。パスツールピペットを使用すると、個別に培養インサートにスライスを転送し、遮断し、火が大きなボアを与えるために研磨。 注：切断·ピペットを火研磨する際に作成した穴の大きさが重要です。小さすぎるとスライスを簡単膜用ピペットを残すことはありません。大きすぎると過剰な流体は、スライスとともに、膜の表面上に配置されている。最高のボア径は、典型的には約半分DIAMですピペットのバレルのETER。切断時に、この直径は、ピペットのテーパーに適切な場所で切断することにより選択することができる。 </li><li>スライス転送<ol><li>第1の媒体とのピペットを記入してから、小さな吸引力で、単一のスライスを吸い上げる。これはピペットの開口部付近のスライスを保持し、スライスを配置し、挿入にあまりにも多くのメディアの追放を防ぐことができます。 </li><li>小さな吊り滴を形成するために、電球にわずかな圧力をかけ、スライスがその液滴に落ち着くし、その後膜にその滴をタッチし、膜上にスライス」の秋 &quot;をできるようにすることができます。一般的に3つのスライスは、各膜インサート上に配置されます。 注：流体液滴が大きすぎると、3つのスライスからの液滴が膜表面上にマージする傾向があり、スライスは、したがって、すべてのことをより困難後で電気生理学的記録のためにそれらを分離すること、膜の中心に集まる。 </li></ol></li><li>流体Removアル<ol><li>スライスに浸漬または解剖媒体のプールに囲まれないように、そのプレートの全てのスライス（1つのインサートあたり3つのスライス=プレート当たり21スライス）のための培養プレートインサートの上部から余分なメディアを吸引除去する。 </li><li>実行これはノーカットますが、ファイアーポリッシュパスツールピペットを使用することです。スライスが落ち着くし、ピペッティングの前に分間膜に付着することを許可する。アップピペットにスライスを吸うしないように注意してください。スライスが落ち着くのに十分な時間を可能にするために、最初にメッキされ挿入するための流体の除去を行う。 </li></ol></li><li>スライスストレージ<ol><li> 37℃、5.0％CO 2インキュベーターに保管してスライス培養。 図1Eにおける文化の最終配置を観察します。個別のスライスは、底部のための多孔質膜を有する培養プレートインサートに載る、このインサートは、少​​量の培地で満たされたペトリ皿内に収まる。これにより、スライスは私の中に浸漬されていませんdiumが、培養プレートインサートの下部にのみ膜を介してそれにアクセスすることができます。 </li><li>必要に応じて、培養プレートインサートを削除するか、またはスライスを含有する挿入膜の一部を切り出してもよい研究のためのいずれかのスライスを削除します。 </li></ol></li></ol></li><li>メンテナンス<ol><li>文化を作った翌日ペトリ皿に培地を交換します。移す前に少なくとも1時間インキュベーター内で平衡化される新鮮な培養培地1mlを含む新しいペトリ皿に培養プレートインサートを転送します。 </li><li>文化を行った後、三日目に同じ方法で再び培養液を交換する。 3日目に、34℃に設定したインキュベーターに文化を移す。 （3〜4日ごとに）各1週間に2回培養液を交換する。 </li><li>健全な文化を特定します。対になった全細胞記録のための健全な文化を選択します。 NOTE：健康な培養物は、明確に定義されたエッジと明確に定義された錐体細胞層を有している。文化ウィット現在または平坦化された境界線と空胞化外観時間暗（おそらく壊死性）の領域が拒否されます。これらの基準を採用し、スライス培養の通常の三分の二は、記録のために十分に健康である。 </li><li>時間のかなり小さなウィンドウ内でこれらの培養物を利用する。ニューロンはゆっくりと時間とともに悪化し、わずかにてんかん様の挙動を表示し始めるので、2週間以上培養して組織を使用しないでください。ニューロンの生存の正確な上限は知られていないが、それは培養中の錐体細胞のような後半の16週間を機能し記録することができる。 </li></ol></li></ol> 2ペア全細胞記録<ol><li> ACSFおよび細胞内ソリューション<ol><li> （単位：mm）120グルコン酸カリウム、40 HEPES、5のMgCl 2、2 NaATP、および0.3 NaGTP（;：290 mOsmで浸透圧KOHで7.2）を混合することにより、シナプス前電極液を調製します。同じ電極溶液はシナプス後ニューロンのために使用される一方、セシウム、グルコン酸（120mMの）は、典型的には、主要なシナプス後の電極中の塩に加え、5 mMのQX314として使用されます。 注：これは、シナプス後NMDAR媒介電流8-10,13を記録するために、正の電位で安定した電圧クランプを可能にします。また、ギガオームシールが行われる前に、シナプス後記録電極から流れる内部液によってシナプス前ニューロンのカリウム誘発性の過剰興奮を防ぐことができます。 </li><li> （単位：mm）を構成するシナプス後電極液120セシウムグルコン酸を準備し、40のHEPES、5のMgCl 2、5 QX314、2 NaATP、および0.3 NaGTP（CsOHを用いてpH 7.2;浸透圧：290ミリオスモル）。 5-10MΩの抵抗でガラス微小電極を引いて、濾過した内部液で満たされる。 </li><li>人工脳脊髄液（ACSF）119のNaCl、2.4のKCl、（mM単位）構成を準備し、MgSO 4 1.3、2.4のCaCl 2、1mMのNa 2 HPO 4、26.2のNaHCO 3、95％O 2、5で飽和した11グルコース、pH7.4で、 ％のCO 2。注：もしAMPAR媒介ResponsesはACSFで10μMのCNQXまたはNBQXを含む、NMDAR EPSCsの検査のためにブロックする必要がある。 </li></ol></li><li>ペア全体の細胞記録を入手<ol><li>二つの個別のニューロン間のシナプス伝達を調べるために、シナプス前ニューロンのような1つのニューロンを指定し、活動電位を誘導し、シナプス伝達を開始するために電流クランプに保持します。 </li><li>シナプス後ニューロンのように、第二のニューロンを指定して、研究者が必要とする情報に応じた電流または電圧クランプでそれを保持。 -65 mVの電圧クランプにシナプス後ニューロンを保持することにより、30 mVの6-16で調べNMDAR媒介EPSCsで調べAMPAR媒介EPSCsで、グルタミン酸作動電流の詳細な検査を取得</li><li>対になった記録を確立します。対になった記録を確立するには、シナプス前細胞全体の記録が常にシナプスconnecteあるものまで得ようとする複数の連続シナプス後ニューロンを可能にする、最初に得られ、dが得られる。シナプス可塑性の実験を行う場合には、シナプス後ニューロンにおけるLTPの誘導として最初のシナプス前ニューロンを得るために特に重要であるLTP 8,19に必要な細胞質要因の洗い出しを防止するために、全細胞の記録を得るための10分以内に開始しなければなりません。 </li><li>運動誘発性細胞損失を避けてください。対になった全細胞の記録を実行する主要な課題は、第二の記録を取得しながら、最初の全細胞記録の振動や動きによって誘発される混乱を避けている。 <ol><li>最初の全細胞記録を入手した後、確立された記録は、モニタ（ 図2A）に見えている領域の端に位置するように、x軸に顕微鏡レンズは10〜200μmを移動します。 </li><li> ACSFはまだレンズとの接触を維持することを保証しながら、顕微鏡〜5〜10ミリメートルのレンズを上げる。第二の電極をマウントし、流体メニスカス（ 図2Bに導く</s·チョン&gt;）。 </li><li>それがレンズを通る光の経路の直下にあるが、それでもかなり確立され、記録電極の上までxy平面に電極を移動します。電極は、顕微鏡下で表示されていると、先端が離れて第一の電極からのモニタの遠端にあることを確認してください。 </li><li>両方の電極が同じ焦点面になるまで、顕微鏡を中心とした順番に第二の電極を下に移動します。これは、最初の全細胞記録を破壊するように、正圧のレベルが強すぎる先端の閉塞を回避するのに十分な強さではないことが重要である。これは、最初のスライスに入る電極から2-3神経細胞の移動を誘導する正圧に変換される。 </li><li>最初のシナプス前の記録（ 図2C）と同様、焦点面におけるシナプス後パートナーを見つけます。録音は、一般に、第1、rの0〜200 mmのニューロンからCA3錐体ニューロン間のペアの録音第二全細胞を入手しているecording（ 図2C、D）。 注：これらの標準的な全細胞記録技術を使用した場合、ニューロンの対の間のシナプス伝達は、最大3〜4時間の期間にわたって安定である。 </li></ol></li></ol></li><li>シナプス可塑性：一度成功したシナプス接続された錐体細胞ペア（ 図3A、B）を取得すると、シナプス伝達と可塑性の特性を調べる。 <ol><li> LTP誘導。 <ol><li> 1分間0 mVの（ 図3C）7-9,12-14 -10にシナプス後脱分極とシナプス前活動電位（1 Hz）を組み合わせることで、LTPを誘導する。シナプス後ニューロンへの侵入の10分以内にペアリングを開始します。 注：シナプス後活動電位がシナプス前ニューロン8への電流の10ミリ秒以下の注入を誘発してLTPはまた、1分間1Hzでシナプス前とシナプス後活動電位を組み合わせることで電流クランプで開催され、両方のニューロンと誘導することができる</s&gt;アップ。 </li></ol></li><li>さらに5〜10分間（ 図3C）9 -55 mVのにシナプス後ニューロンのわずかな脱分極と組み合わせる1Hzで低頻度刺激（LFS）でLTDを誘導する。 </li></ol></li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+pharmacology+of+unitary+synaptic+connections+between+pairs+of+cells+in+areas+CA3+and+CA1+of+rat+hippocampal+slice+cultures.">Physiology and pharmacology of unitary synaptic connections between pairs of cells in areas CA3 and CA1 of rat hippocampal slice cultures.</a> Journal of Neurophysiology. 73 (3), 1282-1294 (1995).</li><li>Mitra, A., Blank, M., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmentally+altered+inhibition+in+Ts65Dn,+a+mouse+model+of+Down+syndrome.">Developmentally altered inhibition in Ts65Dn, a mouse model of Down syndrome.</a> Brain Research. 1440, 1-8 (2012).</li><li>Hanson, J. E., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+FMR1+genotype+influences+the+degree+of+synaptic+connectivity+in+a+mosaic+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome.</a> Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).</li><li>Hanson, J. E., Blank, M., Valenzuela, R. A., Garner, C. C., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+nature+of+synaptic+circuitry+is+altered+in+area+CA3+of+the+hippocampus+in+a+mouse+model+of+Down's+syndrome.">The functional nature of synaptic circuitry is altered in area CA3 of the hippocampus in a mouse model of Down's syndrome.</a> Journal of Physiology. 579, 53-67 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

ここでは、器官型海馬スライス培養物において成功対の全細胞記録を確立するための要件を記載している。対になった記録はまた、急性スライスおよび解離培養系26,27を含む複数の調製物中で行うことができる。ここでの焦点は、シナプス可塑性（すなわちLTP及びLTD）の長い形の誘導になって、それが器官全体細胞記録をペアにことを強調することが重要であり、急性スライスと細胞...

グルタミン酸受容体は、中枢神経系のシナプスにおける興奮性シナプス伝達の大部分を媒介する。シナプス後膜のスパインヘッドであるN-メチル-D-アスパラギン酸（NMDA）に局在するイオンチャネル型グルタミン酸受容体の二つの主要なサブタイプおよびα-アミノ-3 - ヒドロキシ-5 - メチルイソオキサゾール-4 - プロピオン酸（AMPA）受容体。静止膜電位では、AMPA受容体がシナプス伝達の間にシナプス後電流の大部分を運ぶ。海馬では、NMDA受容体はシナプス後膜におけるAMPA受容体の数の変化を誘発するのに重要な役割を果たしている：「一致検出器」として作用することにより1は 、シナプス強度1の変更を開始するために、NMDA受容体はシナプスのメカニズムに関与してそれは細胞下レベルで学習と記憶を下支えすると考えられている。シナプス前伝達物質放出と平行してシナプス後ニューロンの脱分極に応答して、カルシウムは、NMDAを経由して入る受容体はAMPA受容体の挿入または取り外し2を開始する。これらの受容体の動態は、シナプス可塑性の基礎となる：シナプス強度の低下が長期抑圧4（LTD）である、シナプス強度の増大が、長期増強の2,3（LTP）である。 NMDA受容体は、その誘導を制御すると考えられているつつAMPA受容体の移動は、シナプス可塑性の発現に関与すると考えられている。 シナプス伝達と可塑性の基礎となる正確なメカニズムを決定することは、シナプスの小集団、理想的には単一のシナプスを研究する必要があります。いくつかのシナプスが、このレベルでの研究のために非常に適しているが、 例えば 、5開催の萼は、ほとんどのシナプス集団についてこれは、シナプス結合の小と拡散自然に非常に困難である。二つの主要な電気生理学的技術は、単一のシナプス結合を調べるために開発されている：最初は最小限の刺激であり、機種では電子1シナプス前繊維は細胞外刺激さと推定される。第2の技術は、シナプス接続ニューロンからの2同時ホールセル記録が行われ録音を、ペアになっています。最小限の刺激の主な利点は、それが同時にシナプス後ニューロンから記録しながら軸索管への細胞外刺激電極の配置を含む、実行するために迅速で比較的簡単であることである。この技術を用いて第一の関心事は、単セルの信頼性のある刺激はめったに裁判後に裁判を保証しないことができるということである。 過去15年間で私たちは、日常的に2シナプス接続錐体ニューロン6-17からペアリングホールセル記録を使用している。この技術の主な利点は、1つのシナプス前ニューロンが一貫して確実に刺激されることである。また、電気生理学的特性評価だけでなく、シナプス前ニューロン6,18の薬理学的操作だけではないことができます&lt;/ SUP&gt;。しかし、ニューロン間のシナプス接続の確率は、19を得るために接続されたペアが困難に低い。シナプス接続は、インビトロ、得られた接続性、さらに自然に再確立できるように、器官型脳切片培養物の使用は、この障害を回避するネイティブ脳組織20と同様である。さらに、器官培養物は可塑性にメカニズムを有効にする、対になったパルスの円滑化（PPF）とうつ病（PPD）6,22,23を含む短期シナプス可塑性のLTP、LTD 7-10,12-15,21と追加のフォームを表現ニューロンのペアで研究される。ここでは、正常にこのin vitro系でのペアの録音を達成に関わる詳細な方法論について説明します。この情報は、容易に急性スライスおよび他の脳領域を含む他の実験系に適合させることができる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="686">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">Organotypic cultures</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:64px;">Paired recordings</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Minimum Essential Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stable motorized micromanipulators&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Shallow tissue bath</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES buffer solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>DIC camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1M Tris stock solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Computer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horse Serum&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Vibration isolation table</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">plastic-coated miniature spatulas&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Upright microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">soft paintbrush&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Data acquistion and analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">manual tissue chopper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Electrode puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">#2 filter paper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Faraday cage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">#5&#160; forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Membrane inserts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CO2 incubator&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Class II hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

paired whole cell recordings in organotypic hippocampal slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

シナプス接続は記録電極を経由して脱分極電流パルス（20ミリ用、一般に20〜50 PA）を渡すことによって、活動電位を発射するために、シナプス前ニューロンを刺激することによって明らかである。シナプス後現在のトレースは、次にシナプス前活動電位（ 図3A）のピークの後に短い（&lt;5ミリ秒）で一貫性の潜時で誘発単シナプスEPSCの有無を調べる。シナプス接続されたペアを?...

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Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

器官型海馬スライスにおけるペア全細胞記録

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.6K ビュー.  University of Auckland. Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

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Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle. This is a direct consequence of the accessibility to both cell types and ability to visually distinguish the single segmental CaP motor-neuron on the basis of morphology and location. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type. Identification of the CaP motor-neuron type is confirmed by either dye filling or by the biophysical features such as action potential waveform and cell input resistance. Motor-neuron recordings routinely last for one hour permitting long-term recordings from multiple different target muscle cells. Control over the motor-neuron firing pattern enables measurements of the frequency-dependence of synaptic transmission at the neuromuscular junction. Owing to a large quantal size and the low noise provided by whole cell voltage clamp, all of the unitary events can be resolved in muscle. This feature permits study of basic synaptic properties such as release properties, vesicle recycling, as well as synaptic depression and facilitation. The advantages offered by this in vivo preparation eclipse previous neuromuscular model systems studied wherein the motor-neurons are usually stimulated by extracellular electrodes and the muscles are too large for whole cell patch clamp. The zebrafish preparation is amenable to combining electrophysiological analysis with a wide range of approaches including transgenic lines, morpholino knockdown, pharmacological intervention and in vivo imaging. These approaches, coupled with the growing number of neuromuscular disease models provided by mutant lines of zebrafish, open the door for new understanding of human neuromuscular disorders.

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target skeletal muscle. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a segmental CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type.

モーターニューロンとターゲットゼブラフィッシュの骨格筋からの対のパッチクランプ記録

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

神経科学

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

器官型海馬切片培養

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex. Because of the lack of specific pharmacological agents for these channels, we have taken a genetic approach to manipulating channel expression. We use an organotypic culture preparation (16) in order to maintain cell morphology and the laminar pattern of cortex. We typically isolate acute neocortical slices at postnatal days 8-10 and maintain the slices in culture for 3-7 days. This allows us to study neurons at a similar age to those in our work with acute slices and minimizes the development of exuberant excitatory connections in the slice. We record from visually-identified pyramidal neurons in layers II/III or V using infrared illumination (IR-) and differential interference contrast microscopy (DIC) with whole cell patch clamp in current- or voltage-clamp. We use biolistic (Gene gun) transfection of wild type or mutant potassium channel DNA to manipulate expression of the channels to study their function. The transfected cells are easily identified by epifluorescence microscopy after co-transfection with cDNA for green fluorescent protein (GFP). We compare recordings of transfected cells to adjacent, untransfected neurons in the same layer from the same slice.

This is a protocol to prepare and maintain a neocortical slice preparation in organotypic culture for the purpose of making electrical recordings from pyramidal neurons.

新皮質の器官型スライス標本からの全細胞記録

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

器官培養における神経雪崩のマルチ電極アレイの録音

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

急性海馬スライスにおけるシナプス誘発アストログリアとニューロン活動の二重の電気生理学的記録

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Morphologically-と神経化学的に特定し海馬介在ニューロンからホールセルパッチクランプ記録

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

急性脳スライスにおけるニューロンマイクロ回路の電気生理学的および形態学的特徴は、ペアパッチクランプ記録を使用して、

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

脳スライスにおける全細胞パッチクランプ記録

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. This model is suitable for addressing different research questions that involve studies on neuroprotection, electrophysiological experiments on neurons, neuronal networks or tumor invasion. The hippocampal architecture and neuronal activity in multisynaptic circuits are well conserved in OHSC, even though the slicing procedure itself initially lesions and leads to formation of a glial scar. The scar formation alters presumably the mechanical properties and diffusive behavior of small molecules, etc. Slices allow the monitoring of time dependent processes after brain injury without animal surgery, and studies on interactions between various brain-derived cell types, namely astrocytes, microglia and neurons under both physiological and pathological conditions. An ambivalent aspect of this model is the absence of blood flow and immune blood cells. During the progression of the neuronal injury, migrating immune cells from the blood play an important role. As those cells are missing in slices, the intrinsic processes in the culture may be observed without external interference. Moreover, in OHSC the composition of the medium-external environment is precisely controlled. A further advantage of this method is the lower number of sacrificed animals compared to standard preparations. Several OHSC can be obtained from one animal making simultaneous studies with multiple treatments in one animal possible. For these reasons, OHSC are well suited to analyze the effects of new protective therapeutics after tissue damage or during tumor invasion. 
The protocol presented here describes a preparation method of OHSC that allows generating highly reproducible, well preserved slices that can be used for a variety of experimental research, like neuroprotection or tumor invasion studies.

Organotypic hippocampal slice cultures (OHSC) represent an in vitro model that simulates the in vivo situation very well. Here we describe a vibratome-based improved slicing protocol to obtain high quality slices for use in assessing the neuroprotective potential of novel substances or the biological behavior of tumor cells.

研究保護および腫瘍細胞の侵襲性をモデルとして脊髄海馬スライス培養

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.