次のプロトコルをまとめた図は、図1を参照してください。 安全上の注意：組み立てられたウイルス粒子と接触しているすべての材料はVirkon液または他の適切な消毒剤で消毒する必要がある。 1。プラスミドDNAの株式の準備（〜2日間） <ol><li>以下のプラスミドが1必要です。 <ul><li> pRV1 - AAV2 repおよびcap配列を含有する</li><li> PH21 - AAV1 repおよびcap配列を含有する</li><li> pFdelta6 - アデノウイルスヘルパープラスミド</li><li> AAV2パッケージングシグナル（逆方向末端反復、ITRS）に挟まれた組換え発現カセットを含むプラスミドAAV </li></ul></li><li> pFdelta6が部分欠失を防ぐためにStbl2コンピテントセルで成長させる必要がありますが、pRV1とPH21はDH5alphaコンピテントセルに成長させることができる。部分的な削除がDH5alpha細胞内で発生した場合はAAVプラスミドはStbl2細胞に成長させることができる。 </li><li>プラスミドDNAは高品質とRNAの汚染物質の自由でなければならない。プラスミドは、次のダイジェストを使用して整合性をスクリーニングすることができます。 <ul><li> pRV1 - XbaIで消化7.5キロバイトと3.8 kbのバンドを与えるために</li><li> PH21 - 4.5kbのバンドを与えるためにEcoRIで消化、2.8 kbと0.2キロバイト</li><li> pFdelta6 - 5.5kbのバンドを与えるためにHindIIIでダイジェスト、3 KB、3 KB、2.3 kbと1.5キロバイト</li></ul></li></ol> 2。 （ - 3日間2）トランスフェクションのためのヒト胚性腎臓293（HEK293）細胞の調製<ol><li>プレート2個の80％5 15cmの直径Nunc社製組織培養皿にHEK293細胞のコンフルエント150センチメートル2フラスコ。トランスフェクションの前にコンフルエント80％（めっき後約48時間） - 細胞は70でなければなりません。 10％ウシ胎児血清、100 U / mlのペニシリン/ 100μg/ mlのストレプトマイシンを含む低グルコースと標準ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で培養細胞。 </li><li>トランスフェクションの前に3時間は、DMEMを除去し、イスコフと交換の5％ウシ胎児血清を含む改変ダルベッコ培地（IMDM）。 </li></ol> 3。ウイルス性プラスミドのトランスフェクション（トランスフェクションのための〜1時間、インキュベーションのための3日間） <ol><li>ウイルスの単一のバッチ（5 × 15cmの組織培養プレート）のために、以下を準備します。 <ul><li>プラスミド62.5μgのAAV </li><li> 125μgのpFdelta6 </li><li> 31.25μgのpRV1 </li><li> 31.25μgのPH21 </li><li> 1650μlの2.5 M CaCl 2を </li><li> 12ミリリットルのdH 2 O </li></ul></li><li> 50 mlチューブにクラス2の組織培養フード滅菌フィルタートランスフェクション混合物に。 </li><li>ソリューションをボルテックスながら、素早く液（pH 7.05）緩衝生理食塩水2 × HEPES 13 mlを加える。 50 mlチューブの蓋を交換し、15秒間ボルテックスし続けます。 1分45秒放置する、微細な白色沈殿物が形成すべきである。 </li><li>静かに各15cmの組織培養皿へのトランスフェクション溶液5mlを加える。スワールプレートが混在し、インキュベーターに戻ります。 </li><li>トランスフェクション後16時間は、IMD​​M培地を除去し、DMEMで置き換えてください。 </li></ol> 4。細胞の溶解とrAAVsの収穫（2時間） <ol><li>トランスフェクション後72時間は、細胞培養プレートから培地を除去し捨てる。すべての廃棄物は、Virkon液または他の適切な消毒剤で処理する必要があります。 </li><li>ゆっくりと（; pH7.4のPBS）緩衝生理食塩水暖かい1 ×リン酸で細胞を洗浄。 </li><li>各プレートに25ミリリットル温かいPBSを加え、穏やかにセルスクレーパーで細胞を取り除く。 50mlチューブ中で懸濁液を集める。 </li><li> 10分800 xgで細胞をペレット化する。 </li><li>上清と150mMのNaClでペレットを再懸濁します、20mMのトリスpH8.0を破棄し、組織培養プレートあたり10mlを使用してください。 2つの50 mlチューブに分割。 </li><li>のdH 2 Oで10％のデオキシコール酸ナトリウムの新鮮な溶液を調製します最終濃度0.5％のために各チューブには、この1.25 mlを加え。 ml当たり50単位の最終濃度にベンゾナーゼヌクレアーゼを追加。徹底的にチューブを混ぜる。 </li><l私は37&gt;インキュベーション℃で1時間。 </li><li> 15分間3000 × gで遠心分離によって細胞残屑を取り除きます。新鮮な50 mlチューブに移す、すべての細胞の破片がヘパリンカラム（ステップ5を参照）がブロックされないように削除されていることを確認してください。この段階で、サンプルは、続行する前に-20℃で保存することができます。我々は、感染性を低下させることなく-20℃で数週間サンプルを保存している。 </li></ol> 5。 rAAVsのヘパリンカラム精製（2 - 3時間） <ol><li>そのソリューションが流れそう〜5.4ステップ5.2の毎分1 mlのカラムを通して蠕動ポンプを使用してセットアップハイトラップのヘパリンカラム。に気泡がヘパリンカラムに導入されていないことを確認することが重要です。 </li><li> 10ミリリットル150mMのNaCl、20mMトリス、pH8.0でカラムを平衡化する。 </li><li>カラムを50 mlのウイルス液を適用するとを通して流れるようになります。 </li><li> 20ミリリットル100mMのNaCl、20mMトリス、pH8.0でカラムを洗浄。 </li><li> 5 mlのシリンジを使用すると、列wを洗浄し続けます1ミリリットル300mMのNaCl、20mMトリス、pH8.0のに続いてi番目の1ミリリットル200mMのNaCl、20mMのトリス、pH8.0、。フロースルーを捨てる。 </li><li>適用することにより、カラムから5mlの注射器と穏やかな圧力の溶出ウイルスを使用する： <ul><li> 1.5ミリリットル400mMのNaCl、20mMのトリス、pH8.0の</li><li> 3.0ミリリットル450 mMのNaCl、20mMトリス、pH8.0の</li><li> 1.5ミリリットル500mMのNaCl、20mMトリス、pH8.0の</li><li> 15 ml遠心チューブに、これらを収集する。 </li></ul></li></ol> 6。濃度とrAAVsの無菌濾過（1時間） <ol><li> 10万分子量カットオフを持つアミコンウルトラ-4遠心フィルターユニットを使用してベクトルを集中する。 2分（室温で）2000 xgでコンセントレータと遠心分離機にカラム溶出液4mlをロードする。ろ過液を廃棄し、残りのウイルス液と繰り返し遠心分離でコンセントレータをリロードします。濃縮された量は約250μlのはずです。濃縮されたボリュームがこれよりかなり多い場合は、フローのtを捨てるhroughと体積が約250μlのようになるまで1分のステップで遠心し続けます。 </li><li> 500μlの最終容量のためにウイルスをPBS 250μlを加え、コンセントレータから取り外します。 </li><li> 13mmの直径0.2μmのシリンジフィルターを通してフィルターベクトル。必要になるまでベクトルを分注し、-80℃で保存してください。 </li></ol> 7。ウイルスストックのタイター（3日） これは、レポーター遺伝子または免疫細胞化学的に検出可能な遺伝子産物を駆動するHEK293細胞において活性であるプロモーターが必要です。 HEK293細胞他の細胞株または初代細胞培養と互換性のないベクトルを生成するときに使用することができます。 <ol><li>そう彼らが40であることをHEK293細胞を播種が18ポリ- L -リジンコートしたガラス製カバースリップまたはヌンクチャンバースライドの18の井戸を準備 - コンフルエント50％。 Creリコンビナーゼ依存rAAVsの滴定のためにその安定的に発現するCreリコンビナーゼ2 HEK293細胞を使用してください。 </li><li>シリアルDの各ウェルに感染AAVベクター（図2A）のilutions。希釈当たり3ウェルを使用してください。我々は日常的に各ウェルに直接ウイルスを追加。 </li><li>後72時間は、室温で10分のために培地（2％PFAの最終濃度を与える）に4％パラホルムアルデヒド（PFA）の等量を追加することで、HEK293細胞を修正。 </li><li>細胞をPBSで3回洗浄し、のdH 2 Oおよびカバースリップですすいでください。 </li><li>最高希釈係数を持つ3つの井戸から、形質導入された細胞の数を数えるが、それでも、感染した細胞が含まれ、これらの平均値を見つけ、マイクロリットルあたりの感染ユニット（図2B）の番号を与えるために希釈係数を掛けます。 </li></ol> 8。予想結果 HEK293細胞は、強化された緑色蛍光タンパク質（EGFP）を図2Bに示されているウイルスのエンコーディングで形質導入。我々は一般的にマイクロリットルあたり約6 × 10 6感染性粒子の一貫した力価を実現。我々は日常的に定位麟蹄のため、これらのベクターを使用成人の齧歯類の脳にction。これは、地域固有の遺伝子発現2の強力な技術を提供します。細胞型の選択的な遺伝子発現を持つこの地域の特異性を組み合わせるために、我々は、Cre -トランスジェニックマウス2のターゲット領域にCreリコンビナーゼ依存rAAVsを注入する。図2C - Eは、成人のパルブアルブミンのCreトランスジェニックマウス3の異なる脳領域にEGFPをエンコードするのCre依存rAAVsの定位注射の例を示します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3348/3348fig1.jpg" /> 図1。するrAAVの生産のためのプロトコルの模式図。 1）HEK293細胞を播種し、70までに成長している - 80％コンフルエントに。 2）AAVとヘルパープラスミドを調製し、そしてHEK293細胞にトランスフェクトされています。トランスフェクションおよびHEK293細胞は別の56時間培養した後、3）培地は、DMEM、16時間に変更されます。 4）HEK293細胞を回収し、溶解されています。 rAAVベクターはcによって細胞残渣から分離されていますentrifugation。 5）ウイルス粒子が濃縮し、滅菌前にヘパリンカラムを通して精製されています。 6）HEK293細胞を24ウェルプレート上で増殖し、感染単位の数を決定するAAVベクターの連続希釈液で感染されています。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3348/3348fig2.jpg" /> 図2。タイターとrAAV1 / 2のin vivoアプリケーションで。ウイルス力価を測定するためのHEK293細胞の（A）のセットアップ。 HEK293細胞は、rAAVsの連続希釈液で形質導入されています。 C、感染していないコントロール、N、未希釈のウイルスストックを1μl。 （B）HEK293細胞はEGFPを発現するrAAVsに感染している。 （CE）ウイルスeGFPの発現は、Creを活性化rAAVsの定位注射後のパルブアルブミンのCreトランスジェニックマウスの別のターゲット地域でCreを発現神経細胞に限定されています。例の画像は（C）網様体視床と淡蒼球、（D）歯状回と海馬の（E）CA1領域におけるGFP免疫反応性を示しています。 DG、ドntate回、RT、視床網様核、GP、淡蒼球。スケールバー：B、500μmであり、C、100μm以下、D、100μm以下、E、500μmである。

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利害の衝突は宣言されません。

rAAVベクターは、動物でのin vivo研究にとってますます貴重になってきています。ここで、我々は企業へのウイルスの生産の高価なアウトソーシングを避けることで、この有用なベクトルの広範なアプリケーションを容易にすることができるrAAVsを製造するための簡単​​で安価なプロトコルを記述している。プロトコルは、（参考文献1に基づいて）等しい比4で、両方の親の血清型からキャプシドタンパク質を含むキメラrAAV1 / 2ベクトルの生産を説明します。ヘパリンカラムに結合することによって、rAAVベクターの精製は、AAV2キャプシドタンパク質の発現に依存していますが、ここで概説AAV1以外の血清型と組み合わせることができます。さらに、AAV6は減少親和性を持つものの、ヘパリンに結合することが報告されており、潜在的にこの手順5,6を用いてヘパリンカラムで精製することができます。それは他の血清型は、ヘパリンカラム溶出5,7のためのNaClの異なる濃度を必要とすること、しかし、注意すべきである。包装するrAAVのゲノムは5.2 KB 8までのパッケージング効率の大幅な削減と4.1と4.9キロバイトの間で最適であることが示された。導入遺伝子発現の細胞型特異的規制は通常、小型のAAV粒子内に収容することができる要素に作用する大きなシスによって達成されるので、このパッケージングの制限は、するrAAVのシステムの最大の欠点と見なすことができます。このような我々はむしろ、ステップ6.3に概説PBSを追加するよりも、1つ以上の500μlをバッチに250μlのに集中して、別のウイルスのバッチを組み合わせているAAVパッキンの制限に近い場合、パッケージの遺伝子をしようとするから生じるものなど、低力価のバッチを、克服するために。信頼性の高い細胞型特異形質導入は、パッケージングの限界を伸ばし避けるためのCre -ドライバーのマウスと、条件付きするrAAVカセット（下記参照）を組み合わせることにより達成することができます。 ノートの、このプロトコルは高いtの生産にわかりやすい指示を提供しようとしながらITERするrAAVは、それはヘパリンアフィニティークロマトグラフィーによる精製のためのAAV2キャプシドタンパク質の部分の存在を必要とする。 AAV2以外の血清型は、別の手順9を用いて精製する必要があります。ヘパリンカラム精製の ​​利点の一つは、それが塩化セシウム勾配10を使用して製造したものよりも大きい感染率を持つAAVベクターを生成すると考えられています。しかし、この方法にはいくつかの欠点もあります。例えば、ヘパリンに結合する他のタンパク質も精製されたウイルスストックで存在することができる。ヘパリン精製ベクターの親和性がベクトル力価10、特に興奮20または抑制性ニューロン（図2）のどちらをターゲットにする我々のアプローチの影響を受けることができるが、AAV介在導入遺伝子の発現のCre -誘発活性化を採用し、力価に依存しません。ヘパリンカラム精製に代わるものを使用するよりも高いウイルス力価と純粋な準備を生成するイオジキサノール密度勾配の使用、です。塩化セシウム勾配10。この方法は、純度99％11より大きいベクトルを生成するためにヘパリンカラム精製と組み合わせることができます。したがって、慎重な検討は、ウイルスの精製法は、その特定のダウンストリームアプリケーションに適しているのと、個々のグループによって行われる必要があります。 このプロトコルに関連付けられている最も一般的な問題は、低ウイルス力価である。私たちの経験では、これは通常、低トランスフェクション効率、またはヘパリンカラムからのウイルスの溶出にさかのぼることができます。すべてのトランスフェクションの材料は、トランスフェクション前に室温になっているはず、とテストのトランスフェクションは、各研究室に最適な条件を見つけるために実行する必要があります。トランスフェクションの他の方法は、リポフェクタミンなど、非常に効率的ですが、法外に高価になることができます。さらに、ヘパリンカラム溶出液の濃度とpHはヘパリンカラムwithoからビリオンの完全な溶出のために重要です。UTの損傷。もう一つの重要なポイントは、パッケージング細胞は組織培養皿の表面によく付着する必要があるということです。細胞が手順の実行中にいくつかの段階でデタッチした場合には、実験を終了し、細胞の新しいバイアルを解凍することをお勧めします。 げっ歯類における導入遺伝子発現の時空間制御が容易に正確な解剖学的ターゲティングと動物の発達段階によって達成されます。効率的なAAVによる遺伝子導入は、子宮内12,13で示されている。成人の脳では、定位注射した後するrAAV粒子に感染して領域のみならず、ウイルス力価の変化によってではなく、注入パラメータを変更することにより非常に大きなエリアに、非常に小さな対象地域から調整することができます。これらは、ボリュームとスピード注射のとウイルス懸濁液14とポリオールマンニトールのインクルードが。マンニトールは、全身するrAAVの注入15日以降の様々な組織の感染性を高めるために使用することができます&lt;/&gt;のSup。 するrAAV（約4.7 KB）のパッケージング能力は、おそらくこれらのウイルスベクターから発現することができる遺伝子の点では最も制限要因になります。しかし、最近の研究では、ウイルス粒子が同じセル16に感染するときに遺伝子発現を開始、これは部分的に別々のrAAVベクターに分割する大規模な遺伝子または発現カセットによって克服し、ブリッジング配列を導入することができることを示している。 rAAVベクターによって運ばれる遺伝子の発現レベルも大幅に自己無料のrAAVベクター17を使用することによって高めることができる。 rAAVベクターの定位注入は、地域固有の方法で遺伝子発現を誘導するための、迅速、安価で強力な方法を提供する。組み合わせでは第2世代のRNA干渉戦略の18 rAAVsはまた地域固有のダウン遺伝子ノックアウトのために使用することができます。 rAAVsは、回路や細胞の種類を達成するためのCreトランスジェニックマウスまたは細胞型特異的プロモーターと組み合わせることができます。例：TETシステムとのフィッティングrAAVsがウイルス媒介遺伝子発現22,23上に時間的なコントロールを追加しながら、高空間分解能2,19-21で遺伝子操作を可能にする特異的な遺伝子発現は、これらの例では、これらのベクトルの膨大な組合せの可能性を示し、今後数年間にわたってするrAAVベースの研究の急速な増加を予測。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>アミコンウルトラ遠心フィルター</td><td>ミリポア</td><td> UFC810024 </td><td> 10万MWCO </td></tr><tr><td>ベンゾナーゼヌクレアーゼ</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> E1014 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecoダルベッコ改変イーグル培地（DMEM） </td><td>インビトロジェン</td><td> 10567014 </td><td> 10％FCSおよび10単位/ mlのpenicillin/100μg/ mlのストレプトマイシンを補足</td></tr><tr><td> HEK293細胞</td><td>アメリカンタイプカルチャーコレクション</td><td> CRL - 1573 </td><td>通路に30未満を使用して、 </td></tr><tr><td> HEPES緩衝生理食塩水</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 51558 </td><td></td></tr><tr><td>ハイトラップヘパリンカートリッジ</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 54836 </td><td></td></tr><tr><td>イスコフ改変ダルベッコ培地</td><td>インビトロジェン</td><td> 12440-053 </td><td> 5％FCSを補足</td></tr><tr><td> 、デオキシコール酸ナトリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> D5670 </td><td>バッチごとに新鮮な溶液を作る</td></tr><tr><td> 15cmの組織培養皿</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 157150 </td><td></td></tr><tr><td> Stbl2コンピテントセル</td><td>インビトロジェン</td><td> 10268-019 </td><td></td></tr><tr><td> Virkonソリューション</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> NC9821357 </td><td>廃棄が排出する前に一晩駆除を残す</td></tr></tbody></table> 表1。プロトコルに必要な具体的な試薬

production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors

近年、組換えアデノ随伴ウイルスベクターは、（AAV）動物におけるin vivo試験のためにますます貴重になっており、また現在は、人間の臨床試験で検証されています。野生型AAVは、パルボウイルス科ファミリの非病原性のメンバーと本質的に複製欠損である。幅広い伝達プロファイル、低免疫応答だけでなく、これらのベクトルで達成強いと永続的な導入遺伝子の発現は、それらのin vitroおよび in vivo遺伝子デリバリーのために人気があり、多目的なツールきました。 rAAVsは、簡単かつ安価に実験室で生産し、それらの良好な安全性プロファイルに基づいて行うことができます、一般的に低い安全​​性の分類が与えられます。ここで、我々はAAV1およびAAV2両方のキャプシドタンパク質を含むキメラrAAVsの生産とタイターのための方法を説明します。これらのいわゆるキメラベクターの使用は、親のような高力価の株式などの血清型（AAV1）と精製の両方の利点を兼ね備えアフィニティークロマトグラフィー（AAV2）による。これらのAAV血清型はすべてのAAV血清型の最も研究であり、そして個々に広い感染性のパターンを持っている。ここで説明するキメラベクターは、AAV1およびAAV2の感染特性を持つ必要がありますので、神経細胞、骨格筋、膵臓、特に腎臓を含む組織の広い範囲を、感染すると予想することができます。メソッドはここで説明するヘパリンカラム精製を使用して、方法は、塩化セシウム勾配を通じて遠心分離のような他の精製法、より高いウイルス力価とクリーンなウイルス製剤を得たと信じていた。さらに、我々はこれらのベクトルを迅速かつ容易に製造感染性粒子の数の正確な読みを与えるために滴定することができる方法について説明します。

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Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

組換えアデノ随伴ウイルス（rAAVs）ベクトルはのためにますます貴重になってきています<em&gt; in vivoで</em&gt;動物での試験。我々はrAAVsが実験室で製造することができるとどのようにこれらのベクトルが生成される感染性粒子の数の正確な読みを与えるために滴定することができる方法について説明します。

組換えアデノ随伴ウイルスベクターの産生と力価測定

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

production-and-titering-of-recombinant-adeno-associated-viral-vectors

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

61.3K ビュー.  University of Aberdeen. 組換えアデノ随伴ウイルス（rAAVs）ベクトルはのためにますます貴重になってきています in vivoで動物での試験。我々はrAAVsが実験室で製造することができるとどのようにこれらのベクトルが生成される感染性粒子の数の正確な読みを与えるために滴定することができる方法について説明します。

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Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control of a heterologous expression system to facilitate the analysis of the resulting phenotype. This approach can be used to express a gene that is not normally found in the organism, to express a mutant form of a gene product, or to over-express a dominant-negative form of the gene product. It is particularly useful in the study of the hematopoetic system, where transcriptional regulation is a major control mechanism in the development and differentiation of B cells 1, reviewed in 2-4.
Mouse genetics is a powerful tool for the study of human genes and diseases. A comparative analysis of the mouse and human genome reveals conservation of synteny in over 90% of the genome 5. Also, much of the technology used in mouse models is applicable to the study of human genes, for example, gene disruptions and allelic replacement 6. However, the creation of a transgenic mouse requires a great deal of resources of both a financial and technical nature. Several projects have begun to compile libraries of knock out mouse strains (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) or mutagenesis induced strains (RIKEN), which require large-scale efforts and collaboration 7. Therefore, it is desirable to first study the phenotype of a desired gene in a cell culture model of primary cells before progressing to a mouse model. 
Retroviral DNA integrates into the host DNA, preferably within or near transcription units or CpG islands, resulting in stable and heritable expression of the packaged gene of interest while avoiding transcriptional silencing 8 9. The genes are then transcribed under the control of a high efficiency retroviral promoter, resulting in a high efficiency of transcription and protein production. Therefore, retroviral expression can be used with cells that are difficult to transfect, provided the cells are in an active state during mitosis. Because the structural genes of the virus are contained within the packaging cell line, the expression vectors used to clone the gene of interest contain no structural genes of the virus, which both eliminates the possibility of viral revertants and increases the safety of working with viral supernatants as no infectious virions are produced 10. 
Here we present a protocol for recombinant retroviral production and subsequent infection of splenic B cells. After isolation, the cultured splenic cells are stimulated with Th derived lymphokines and anti-CD40, which induces a burst of B cell proliferation and differentiation 11. This protocol is ideal for the study of events occurring late in B cell development and differentiation, as B cells are isolated from the spleen following initial hematopoetic events but prior to antigenic stimulation to induce plasmacytic differentiation.

An efficient system of structure and function analysis of a gene in an ex vivo culture of splenic B-lymphocytes is described. This method takes advantage of recombinant retroviral production in a helper free, ecotrophic packaging cell line. Stable, heritable expression of a gene of interest within primary lymphocytes is achieved leading to generation of surface antibodies on B cells undergoing class switch recombination.

B細胞の組換えレトロウイルスの生産と感染症

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

免疫・感染学

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the generation of extreme population diversity that facilitates virus adaptation and evolution. Increasing evidence shows that the intrinsic error rates, and the resulting mutation frequencies, of RNA viruses can be modulated by subtle amino acid changes to the viral polymerase. Although biochemical assays exist for some viral RNA polymerases that permit quantitative measure of incorporation fidelity, here we describe a simple method of measuring mutation frequencies of RNA viruses that has proven to be as accurate as biochemical approaches in identifying fidelity altering mutations. The approach uses conventional virological and sequencing techniques that can be performed in most biology laboratories. Based on our experience with a number of different viruses, we have identified the key steps that must be optimized to increase the likelihood of isolating fidelity variants and generating data of statistical significance. The isolation and characterization of fidelity altering mutations can provide new insights into polymerase structure and function1-3. Furthermore, these fidelity variants can be useful tools in characterizing mechanisms of virus adaptation and evolution4-7.

The present article describes the steps required to isolate and characterize RNA polymerase fidelity variants of RNA viruses and how to use mutation frequency data to confirm fidelity changes in tissue culture.

ウイルスの変異頻度のRNAウイルスと特性の忠実性の変異の分離

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. Several downstream applications require large quantities of pure viral DNA, which is provided by this protocol. These applications include viral genome sequencing, where the removal of host DNA is crucial to optimize data output for viral sequences, and the production of new viral recombinant strains, where co-transfection of purified plasmid and linear viral DNA facilitates recombination.1,2,3 
This procedure utilizes a combination of extractions and density-based centrifugation to isolate purified linear herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells.4,5 The initial purification steps aim to isolate purified viral capsids, which contain and protect the viral DNA during the extractions and centrifugation steps that remove cellular proteins and DNA. Lysis of nucleocapsids then releases viral DNA, and two final phenol-chloroform steps remove remaining proteins. The final DNA captured from solution is highly concentrated and pure, with an average OD260/280 of 1.90. Depending on the quantity of infected cells used, yields of viral DNA range from 150-800 &mu;g or more. The purity of this DNA makes it stable during long-term storage at 4C. This DNA is thus ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections. 
Prior to beginning the protocol, it is important to know the average number of cells per dish (e.g. an average of 8 x 106 PK-15 cells in a confluent 15 cm dish), and the titer of the viral stock to be used (e.g. 1 x 108 plaque-forming units per ml). These are necessary to calculate the appropriate multiplicity of infection (MOI) for the protocol.6 For instance, to infect one 15 cm dish of PK-15 cells with the above viral stock, at an MOI of 5, you would use 400 &mu;l of viral stock and dilute it with 3.6 ml of medium (total inoculation volume of 4 ml for one 15 cm plate).
Multiple viral DNA preparations can be prepared at the same time. The number of simultaneous preparations is limited only by the number of tubes held by the ultracentrifuge rotor (one per virus; see step 3.9 below). Here we describe the procedure as though being done for one virus.

We describe the process of isolating high purity herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells. The final DNA captured from solution is of high concentration and purity, making it ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections to produce new viral recombinants.

ヌクレオカプシドからウイルスDNAの調製

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 which regulate the expression of non-structural (NS1 and NS2) and capsid proteins (VP1 and VP2) respectively1. They attract high interest as anticancer agents for their oncolytic and oncosuppressive abilities while being non-pathogenic for humans2. NS1 is the major effector of viral cytotoxicity3. In order to further enhance their natural antineoplastic activities, derivatives from these vectors have been generated by replacing the gene encoding for the capsid proteins with a therapeutic transgene (e.g. a cytotoxic polypeptide, cytokine, chemokine, tumour suppressor gene etc.)4. The recombinant parvoviruses (recPVs) vector retains the NS1/2 coding sequences and the PV genome telomeres which are necessary for viral DNA amplification and packaging. Production of recPVs occurs only in the producer cells (generally HEK293T), by co-transfecting the cells with a second vector (pCMV-VP) expressing the gene encoding for the VP proteins (Fig. 1)4. The recPV vectors generated in this way are replication defective. Although recPVs proved to possess enhanced oncotoxic activities with respect to the parental viruses from which they have been generated, their production remains a major challenge and strongly hampers the use of these agents in anti-cancer clinical applications.
We found that introduction of an Ad-5 derived vector containing the E2a, E4(orf6) and the VA RNA genes (e.g. pXX6 plasmid) into HEK293T improved the production of recPVs by more than 10 fold in comparison to other protocols in use. Based on this finding, we have constructed a novel Ad-VP-helper that contains the genomic adenoviral elements necessary to enhance recPVs production as well as the parvovirus VP gene unit5. The use of Ad-VP-helper, allows production of rec-PVs using a protocol that relies entirely on viral infection steps (as opposed to plasmid transfection), making possible the use of cell lines that are difficult to transfect (e.g. NB324K) (Fig. 2). We present a method that greatly improves the amount of recombinant virus produced, reducing both the production time and costs, without affecting the quality of the final product5. In addition, large scale production of recPV (in suspension cells and bioreactors) is now conceivable.

Here we describe a protocol based only on cell infection, which improves the efficiency of recombinant parvovirus production by more than 100 fold in comparison to other protocols in use. This protocol relies on the use of a novel adenovirus 5-based helper containing the parvovirus VP transcription unit (Ad-VP).

アデノウイルス由来のシステムの助けを借りて効率的な組換えパルボウイルスの生産

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 ...

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus (AAV) Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

Adeno-associated viral (AAV) vectors represent some of the most potent and promising vehicles for therapeutic human gene transfer due to a unique combination of beneficial properties1. These include the apathogenicity of the underlying wildtype viruses and the highly advanced methodologies for production of high-titer, high-purity and clinical-grade recombinant vectors2. A further particular advantage of the AAV system over other viruses is the availability of a wealth of naturally occurring serotypes which differ in essential properties yet can all be easily engineered as vectors using a common protocol1,2. Moreover, a number of groups including our own have recently devised strategies to use these natural viruses as templates for the creation of synthetic vectors which either combine the assets of multiple input serotypes, or which enhance the properties of a single isolate. The respective technologies to achieve these goals are either DNA family shuffling3, i.e. fragmentation of various AAV capsid genes followed by their re-assembly based on partial homologies (typically &gt;80% for most AAV serotypes), or peptide display4,5, i.e. insertion of usually seven amino acids into an exposed loop of the viral capsid where the peptide ideally mediates re-targeting to a desired cell type. For maximum success, both methods are applied in a high-throughput fashion whereby the protocols are up-scaled to yield libraries of around one million distinct capsid variants. Each clone is then comprised of a unique combination of numerous parental viruses (DNA shuffling approach) or contains a distinctive peptide within the same viral backbone (peptide display approach). The subsequent final step is iterative selection of such a library on target cells in order to enrich for individual capsids fulfilling most or ideally all requirements of the selection process. The latter preferably combines positive pressure, such as growth on a certain cell type of interest, with negative selection, for instance elimination of all capsids reacting with anti-AAV antibodies. This combination increases chances that synthetic capsids surviving the selection match the needs of the given application in a manner that would probably not have been found in any naturally occurring AAV isolate. Here, we focus on the DNA family shuffling method as the theoretically and experimentally more challenging of the two technologies. We describe and demonstrate all essential steps for the generation and selection of shuffled AAV libraries (Fig. 1), and then discuss the pitfalls and critical aspects of the protocols that one needs to be aware of in order to succeed with molecular AAV evolution.

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus AAV Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

We demonstrate the basic technique to molecularly engineer and evolve synthetic Adeno-associated viral (AAV) gene therapy vectors via DNA family shuffling. Moreover, we provide general guidelines and representative examples for selection and analysis of individual chimeric capsids with enhanced properties on target cells in culture or in mice.

シャッフルDNAファミリーを経由して合成アデノ随伴ウイルス（AAV）遺伝子治療ベクターのエンジニアリングと進化

Adeno-associated viral (AAV) vectors represent some of the most potent and promising vehicles for therapeutic human gene transfer due to a unique ...

Production and Purification of Non Replicative Canine Adenovirus Type 2 Derived Vectors

Adenovirus (Ad) derived vectors have been widely used for short or long-term gene transfer, both for gene therapy and vaccine applications. Because of the frequent pre-existing immunity against the classically used human adenovirus type 5, canine adenovirus type 2 (CAV2) has been proposed as an alternative vector for human gene transfer. The well-characterized biology of CAV2, together with its ease of genetic manipulation, offer major advantages, notably for gene transfer into the central nervous system, or for inducing a wide range of protective immune responses, from humoral to cellular immunity. Nowadays, CAV2 represents one of the most appealing nonhuman adenovirus for use as a vaccine vector. This protocol describes a simple method to construct, produce and titer recombinant CAV2 vectors. After cloning the expression cassette of the gene of interest into a shuttle plasmid, the recombinant genomic plasmid is obtained by homologous recombination in the E. coli BJ5183 bacterial strain. The resulting genomic plasmid is then transfected into canine kidney cells expressing the complementing CAV2-E1 genes (DK-E1). A viral amplification enables the production of a large viral stock, which is purified by ultracentrifugation through cesium chloride gradients and desalted by dialysis. The resulting viral suspension routinely has a titer of over 1010 infectious particles per ml and can be directly administrated in vivo.

These past 15 years, canine adenovirus type 2 (CAV2)-derived vectors have proven their efficiency to transduce cells in vitro&#160;and in vivo and are widely used for vaccination and gene therapy. Here, we describe a procedure to construct, produce and purify CAV2 vectors, giving rise to high-titer viral suspensions.

Adenovirus (Ad) derived vectors have been widely used for short or long-term gene transfer, both for gene therapy and vaccine applications. Because of the ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. Conversely, viruses have evolved intricate strategies to evade and exploit host immune signaling for survival and propagation. Viral immune evasion, entailing host defense and viral evasion, provides one of the most fascinating and dynamic interfaces to discern the host-virus interaction. These studies advance our understanding in innate immune regulation and pave our way to develop novel antiviral therapies.
Murine &#947;HV68 is a natural pathogen of murine rodents. &#947;HV68 infection of mice provides a tractable small animal model to examine the antiviral response to human KSHV and EBV of which perturbation of in vivo virus-host interactions is not applicable. Here we describe a protocol to determine the antiviral cytokine production. This protocol can be adapted to other viruses and signaling pathways.
Recently, we have discovered that &#947;HV68 hijacks MAVS and IKK&#946;, key innate immune signaling components downstream of the cytosolic RIG-I and MDA5, to abrogate NF&#922;B activation and antiviral cytokine production. Specifically, &#947;HV68 infection activates IKK&#946; and that activated IKK&#946; phosphorylates RelA to accelerate RelA degradation. As such, &#947;HV68 efficiently uncouples NF&#922;B activation from its upstream activated IKK&#946;, negating antiviral cytokine gene expression. This study elucidates an intricate strategy whereby the upstream innate immune activation is intercepted by a viral pathogen to nullify the immediate downstream transcriptional activation and evade antiviral cytokine production.

We describe a protocol to measure the antiviral cytokine production in mice infected with a model herpesvirus, murine gamma herpesvirus 68 (&#947;HV68) that is closely-related to human Kaposi&#8217;s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) and Epstein-Barr virus (EBV). Utilizing genetically modified mouse strains and mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we assessed the antiviral cytokine production both in vivo and ex vivo. &#8220;Reconstituting&#8221; the expression of innate immune components in knockout embryonic fibroblasts by lentiviral transduction, we further pinpoint specific innate immune molecules and dissect the key signaling events that differentially regulate the antiviral cytokine production.

サイトカイン産生のウイルス回避における先天性免疫シグナルを解剖

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

の検出のための凍結乾燥LAMP法試薬の開発<em&gt; Q熱リケッチア</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

酵素結合レクチンアッセイによってインフルエンザノイラミニダーゼ阻害抗体価を測定します

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

表面上のヒトノロウイルスの検出のためのスワブサンプリング方法

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...