我々 はこの原稿を編集のエリカ ・ テイラーを感謝したいです。この作品は、国立衛生研究所 (P01 HL098053、P01 AG033561 および R01 HL054732) r. b. に、博士課程終了後の研究サプリメント (R01 HL085481) と親睦 (AAUW) から S.B.D.、助成金、S.B.D. に米国心臓協会からの助成金によって賄われていた・ R.T.B.

1。 栄養 HFD <img alt="Table 1"src="/files/ftp_upload/56029/56029table1.jpg"/> テーブル 1。フライ食品のレシピ 。
この表は、当社のコントロールの食品を準備するための異なる材料をまとめます。食品の 10 mL バイアルに注がれ、冷却、長期的な保存のための 4 ° C で保存に行ったら、.
<ol><li>HFD 準備 <ol><li>高脂肪食品の 1 キロをするためには、既製の通常はえの食糧の 700 グラムの重量を量る (表 1 参照) および分析用天秤を使用して 2 つの独立したコンテナーにココナッツ オイルの 300 g.</li>
		<li>は、内容が完全に溶けるまで電子レンジで個別に各コンテナーを熱します。はえの食糧コンテナーにココナッツ オイルを注ぐ。油はよくはえの食糧に混合するまで泡立て器を使ってかき混ぜる 。
		注: 食品や油の塊も見えるはずです。はえの食糧が電子レンジで溶けて、食べ物をミックスして沸騰を防ぐため 1 分の間隔で停止します</li>。
		<li>再高脂肪食品の重量を量る。総重量が 1 kg 未満のもの (食品の + 300 g ココナッツ オイルの 700 g)、水 (約 10 mL) 加熱蒸発を補うために、1 キロに体重を取り戻すことを追加</li>
		<li>注ぐ十分に混合された約 10 mL バイアル (バイアル量の約 25%) あたり高脂肪食品。次に、ハエを防ぐために寒冷紗をかぶせて &#39; 汚染。室温で 1 時間冷却し、4 週間をストレージのための 4 ° C にバイアルを転送します 。
		注: 通常の食品 (NF) は、コントロール食品として使用されます。またバイアルあたり NF の 10 mL バイアル ボリューム (約 25%) を注ぐ。HFD 食糧のため、NF 食品の 30% をココナッツ オイルに置き換えます。コントロールと実験条件は、ハエは NF と HFD (バイアルあたりの食品の 10 mL) の同じ量を与えられた</li>。
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 1"class="xfigimg"src="/files/ftp_upload/56029/56029fig1.jpg"/> 図 1 。ショウジョウバエ の餌 HFD 。
スキームは、(ココナッツ オイル添加) と制御料理 (ココナッツ油 NF の添加せず通常国会) または HFD のハエの異なる餌手順を示します。全体のプロセスは、成虫の初期コレクションの後 10 日間かかります。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56029/56029fig1large.jpg"target="_blank"> この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<ol start="2"> キイロショウジョウバエ の給餌 HFD <li> 注: このプロトコルには制御料理と HFD のフライラインと互換性のある手順を餌が含まれています。制御と実験のハエは、同じ量の食べ物 (NF または HFD) を含むバイアルに配置されます。
	<ol><li>使用 CO 2 ハエを麻酔する 。
		注: 初心者、読み取りを参照してください発生と キイロショウジョウバエ の処理の概要について 21</li>。
		<li>収集 0 5 バイアル (反転) による移転から日古いハエ NF (以前は室温で暖められた) を含む新しい瓶にハエ。21 日の 5 その他のハエの年齢を聞かせて ° C</li>
		<li>5 日間の終わりに、4 から HFD と NF を含むバイアルを取る ° C 
		注: 低温が生きているハエを強調することさせて使用する前にウォーム アップするために室温で 30 分間座ってバイアル</li>。
		<li>ワイプを使用して、きれいにし、瓶の側面から余分な水分を削除します</li>。
		<li>についてフィルター紙の小片を挿入 1 cm × 3 cm、あらゆる余分な液体を吸収する高脂肪食品にします 。
		注: この手順は HFD 食品へのこだわりからハエを防止するため重要です</li>。
		次に、<li>は (反転) によって高脂肪食品にハエを転送します。5 日間の水平方向に彼らの側に (立っていない) 21-22 ° C でバイアルをレイアウトします 。
		注: これは部分的に高脂肪食品の原因、食品と死ぬに固執するハエを溶かすことができるよう高温を避けてください</li>。
		<li>後 5 日転送 (反転) で 30 分間空を彼らの勇気を許可するように食べ物がなくても新しい瓶に NF と HFD から飛ぶ。次に、ハエを計量に進みます 。
		注: プロトコルを供給この HFD で重要な手順の 1 つは十分に混合された HFD、はえの食糧または凝縮油の任意のチャンクの無料の準備です。均質な混合と HFD 45-30 ° c の冷却をお勧め、バイアルに注ぐと 4 ° c. の適切な年齢で、食べ物を保存する前にコントロールと実験ハエのマッチングです事前の栄養と環境条件の制御だけでなく、重要ですHFD の餌。供給フェーズでは、制御と実験ハエ与えられなければならない NF と HFD の同量。決して過密バイアルまたは (次世代影響を避けるため) にボトルからハエを収集します。NF と HFD 食餌療法の制限やその他の混雑の効果を避けるために給餌中にバイアルあたり最大 25 ハエを常に置きます。HFD は 30% ココナッツ オイルから成る、こうして 22 の ° C の上の温度は部分的に油性食品と死ぬに固執するハエを引き起こして、HFD を溶かす可能性があります。HFD のハエを置く前に、残油を削除し、食品の任意の余分な水分を吸収するフィルター紙を挿入するバイアルをクリーンアップします。、HFD のハエのインキュベーション中にバイアルはハエの無脂肪水平表面を提供するためにその両側に配置されます。</li>
	</ol></li> <li>ハエを計量 <ol><li>遺伝子型およびテストする性別ごとに事前にラベルが付いた、空の 1.7 mL の管の重量を記録する超高感度スケールを使用します</li>。
		<li>1.7 mL チューブの重量を量った 1 つにブラシでステータスを供給事前麻酔フライ麻酔薬または CO 2 を使用して同じ品種、性別、36 のハエを収集し、</li>。
		<li>同じ超高感度スケールでハエを含むチューブの重量を量ます</li>。
		<li>は、この数式を次平均飛行重量を決定する: 
		<img alt="Equation 1"src="/files/ftp_upload/56029/56029eq1.jpg"/> 注: このプロトコルでハエの数は 36 です</li>。
		<li>フラッシュは 2 分収集の液体窒素に急落して、ハエを含む 1.7 mL の管を凍結し、チューブをボックスに入れています。-80 ° C (望ましい温度) にタグの試金で使用されるまでストレージ ボックスを次に、転送します 。
		注意: 液体窒素は非常に低温です。適切な個人用保護具を使用してください</li>。
	</ol></li></ol> 2。タグ アッセイ <ol><li>タグの標準濃度の準備 <ol><li>PBT の 500 mL を準備 (PBS 1 X 0.05% トリトン).</li>
		<li>使用 0.5 mL チューブとタグ ソリューション (材料表) の準備空白 (PBT のみ) の 100 μ L、100 μ L (2 μ g/μ L 1 μ g/μ L 0.5 μ g/μ L; 0.25 μ g/μ L; 六つの標準的なタグの濃度の0.125 μ g/μ l。0.0625 μ g/μ L)、PBT と</li>。
		<li>氷のチューブを設置し、ハエを研削進みます</li>。
	</ol></li> <li>ハエを研削 <ol><li>-80 ° C (手順 1.3) から冷凍のハエを取る。氷に乗って飛ぶを含むチューブを転送</li>
		<li>まず、96 ウェル ボール ディスペンサーにボールを粉砕 2 mm 金属を置き、余分なボールを削除する小さなブラシを使用します</li>。
		金属製のボールを研削板に直接転送するボール ディスペンサーとフリップの上に逆さま <li>96 ウェル研削場所プレート。ウェルあたり 1 つのボールがあります</li>。
		<li>96 ウェル研磨プレートの各行に PBT 600 μ L を追加マルチ チャンネル ピペットを使用します</li>。
		<li>鉗子、ウェルあたり 3 ハエを追加。96 ウェル研磨プレートの各の行/ウェル中のハエの遺伝子型、性別、食品の状態を示します</li>。
		<li>はしっかりと 96 ウェル研削プレート キャップを置きます。テープは、漏れがないことを確認する上に配置可能性があります</li>。
		<li>は、研削盤に 96 ウェルプレート研削を正しく配置します。最高速度およびプレスにマシンを設定 &#34; を実行 &#34; 3 分のハエを挽く</li>
		<li>後 3 分、研削を停止し、プレート遠心分離に進む: 画4,000 x g、4 ° C で 15 分間 ge遠心分離の後研削プレート上澄みをペレットと混合を避けるために慎重に管理します</li>。
	</ol></li> <li>サンプル読み込みとタグ定量 <ol><li>新しい分光光度計 96 ウェル プレートを取る。タグ試薬を 200 μ l 添加のプレートの各行を読み込むマルチ チャンネル ピペットを使用します</li>。
		<li>空を作成する最初の行の最初のウェルに PBT の負荷 20 μ L。上下にピペッティングで混ぜます。気泡の形成を避けるためします</li>。
		最初の行の上下にピペッティングによるミックスの <li>ロード 20 μ L に残り (ステップ 2.1.2) から各標準希釈の井戸。気泡の形成を避けるためします</li>。
		<li>分光光度計 96 ウェル プレート内の対応する行に研削板の各行から上澄みの 20 μ L マルチ チャンネル ピペットを使用して転送します。上下のピペットをよく混ぜます。気泡の形成を避けるためします</li>。
		<li>次に、96 ウェルのプレートの上にガス透過性の箔を配置します</li>。
		<li>インキュベート 37 ° C で 10 分間でプレート 
		注: 井戸の中に泡がある場合すべてのバブルを削除する 2,000 x g で 2 分間プレートを遠心分離機します。気泡の存在は吸読書を妨げます</li>。
		<li>550 でプレートの各ウェルの吸光度を読み取り海里に互換性のあるマイクロ プレート リーダーを使用してあります。次に、標準曲線をトレースし、未知試料の濃度 [μ g/μ L] を決定します</li>。
		<li>あたり平均日本フライ級、タグのコンテンツの量を決定する次の数式を使用して、: 
		<img alt="Equation 2"src="/files/ftp_upload/56029/56029eq2.jpg"/> 注: このプロトコルで 3 ハエが PBT 600 μ L でみじん切り; その結果、フライあたりの平均容積は 200 μ L.</li>
	</ol></li> <li>ブラッドフォードの試金とタンパク質含量、タグのコンテンツを正規化 <ol><li>7 つの準備のウシ血清アルブミン (BSA) 標準希釈液 100 μ L (200 μ G/ml; 150 μ g/mL 100 μ g/mL 75 μ g/mL 250μ g/ミリリットルです。500 μ g/ミリリットルです。1,000 μ g/mL)、PBT と</li>。
		<li>新しい 96 ウェル プレートし、プレートのそれぞれの行に 1 X ブラッドフォード試薬 200 μ L を読み込む</li>。
		<li>最初の行の最初のよく、空白を作成する PBT の 10 μ L を追加。上下にピペッティングで混ぜます。気泡の形成を避けるためします</li>。
		最初の行の上下にピペッティングによるミックスの <li>追加 10 μ L に残りの各標準希釈の井戸。気泡の形成を避けるためします</li>。
		<li>96 ウェル プレートに対応する行に研削板の各行から培養上清中のハエの 10 μ L を転送マルチ チャンネル ピペットを使用しています。上下のピペットをよく混ぜます。気泡の形成を避けるためします</li>。
		<li>96 ウェルのプレートの上にガス透過性の箔を配置します</li>。
		<li>では、5 分間室温でプレートを孵化させなさい。井戸の中に泡がある場合はそれらを削除する 2,000 x g で 2 分間プレートを遠心分離機します 。
		注: 気泡の存在は吸読書を妨げます</li>。
		<li>使用ブランクの吸光度を読み取り、標準と 595 で不明なサンプル分光光度計海里にあります。標準曲線を使用し、各行にサンプルの濃度 [μ g/μ L].</li>
		<li>正規化次の数式を使用して蛋白質のレベルとコンテンツのタグ: 
		<img alt="Equation 3"src="/files/ftp_upload/56029/56029eq3.jpg"/></li></ol></li></ol>

<ol>
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著者が明らかに何もありません。

マウスの肥満誘導は、ヶ月19,20を取ることができます。ハエ、プロトコルを供給この HFD は日以内の 18 h (図 2を参照) 後にのみ脂肪蓄積の増加を引き起こしている問題で過剰の脂肪蓄積の誘導のことができます。HFD 説明プロトコルと餌はグルコース コンテンツ12を増加し、 Bmmリパーゼと PGC 1 式<sup class=...

我々 は、肥満とその関連の経済負担が世界的な問題1時間です。すべての 3 つのアメリカ人のうち 2 つは太りすぎまたは肥満関連の心臓病理学、成人2以内の死亡の主な原因であります。モデル生物を用いたメタボリック シンドロームの調節に関与する遺伝的および分子コンポーネントを適切に調査する新しい効率的な方法が必要です。この理由から、ヒトとマウス3,4,5,6を含む哺乳類で最も基本的な生物的プロセスを共有するのでミバエショウジョウバエモデルを選択します。ショウジョウバエのゲノムの進化の過程で非常に節約されたが、全体的にはるかに少ない遺伝子重複と代謝複雑さで、多くの人間の病気4に関与する基本的なメカニズムを理解するために理想的な小さい,7,8しますまた、脂肪組織、消化管によって特徴的なプロセスが実施と膵臓がフライで表され、人間9,に類似している糖・脂質代謝、たとえば、規制機能を仲介する。10,11。また、肥満、インスリン抵抗性や人間の糖尿病のコントロールに関与する基本的な分子経路はキイロショウジョウバエ12,13,14保存機能,15,16. 高等生物のようなショウジョウバエが哺乳類心臓3,17のそれに類似したプロセスによって開発中に形成される心臓の鼓動。したがって、プロトコルと高スループット タグ分析、ショウジョウバエの遺伝学的ツール ボックスを使用して有効なスクリーニング目的のために適応を供給信頼性の高い HFD の開発研究し、遺伝的基礎を理解するための重要な手段を提供します。複雑な代謝性疾患の基になります。
HFD 食品自体はほとんど18メタボリック シンドロームと関連付けられる知られている飽和脂肪酸で構成されているココナッツ オイルを添加した標準研究所はえの食糧から作られます。齧歯動物などの哺乳類モデルで肥満を誘発するヶ月19,20を取ることができる、私たちの最適化された HFD 効果的かつ再現性をもって、ショウジョウバエのプロトコルを供給増加の問題で個体の脂肪分日12,14。このプロトコルでは、タグの高スループット試金と組み合わせて効率的な検診遺伝的要因、環境の影響および脂肪質の新陳代謝の新しい変調器を発見する新薬候補の効果をことができます。その結果、これらのプロトコルは、理解や戦闘肥満および肥満関連人間の病理学に関連します。
餌のプロトコルは多目的、単一の飽和または不飽和の脂肪酸の代謝と機能の効果を研究に適用可能性があります。タグにあるこの高スループットの分析の使用、キイロショウジョウバエに限定されないが、キューティクルやタフな細胞外マトリックス (例えば、他のショウジョウバエの種、線虫と小さいモデル有機体の様々 な適応があります。およびその他の新興の無脊椎動物モデル) 代謝病期や成人期開発のあらゆる段階で異なる環境、遺伝的または生理学的な条件の下で脂肪の量を測定します。タグ アッセイは遊離脂肪酸、グリセロール、グリセロール 3-リン酸、最終的に 4-アミノアンチピリン (4-AAP) と 3, 5 - と反応して H2O2にタグが低下する酵素反応の一連の比色測定に基づいてジクロロ-2-ヒドロキシ ベンゼン スルホン酸 (3, 5 DHBS) 96 ウェルの分光光度計を用いて測定した赤い色の製品を生産します。

<table width="924">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Talboys Ball dropper/bead Dispenser</td>
			<td style="width:209px;">Talboys</td>
			<td style="width:148px;">#: 930150</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Talboys High Throughput Homogenizer</td>
			<td style="width:209px;">Talboys</td>
			<td style="width:148px;">#: 930145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="width:400px;height:17px;">Grinding Balls, Stainless Steel&#160;</td>
			<td style="width:209px;">OPS Diagnostics, LLC</td>
			<td style="width:148px;"># GBSS 156-5000-01</td>
			<td>5000 balls</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Masterblock 96 Well deep Microplates</td>
			<td style="width:209px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:148px;"># T-3058-1</td>
			<td>case of 80 plates</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="width:400px;height:22px;">Greiner&#160; 96 well microplate flat bottom</td>
			<td style="width:209px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:148px;"># M4436</td>
			<td>40 plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Greiner CapMat for sealing multiwell plates</td>
			<td style="width:209px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:148px;"># C3606</td>
			<td>50 sealing plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Reagent Reservoirs&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:148px;"># 1192T71</td>
			<td>12/PK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Scientific Finnpipette 4661040</td>
			<td style="width:209px;">Thermo Scientific</td>
			<td># 4661040</td>
			<td>1-10 ul multipipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Scientific Finnpipette 4661070</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td># 4661070</td>
			<td>30-300ul multipipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Scientific Finnpipette 4661020</td>
			<td style="width:209px;">Thermo Scientific</td>
			<td>#4661020</td>
			<td>10-100ul multipipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multichannel tips</td>
			<td style="width:209px;">Denville Scientific Inc</td>
			<td># P3131-S</td>
			<td>for 10 uL pipette</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Multichannel tips</td>
			<td style="width:209px;">Denville Scientific Inc</td>
			<td># P3133-S</td>
			<td>for 200 uL pipette</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Multichannel tips</td>
			<td style="width:209px;">Denville Scientific Inc</td>
			<td>#P1125</td>
			<td>for 100 uL pipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Roboz Surgical</td>
			<td># 5 Dumonts</td>
			<td>Super fine forceps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mettler Toledo Excellence XS Analytical Balance Mfr# XS64</td>
			<td style="width:209px;">Cole-Parmer scientific experts</td>
			<td># EW-11333-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Metler Toledo Excellence XS Toploading Balance</td>
			<td style="width:209px;">Cole-Parmer scientific experts</td>
			<td># EW-11333-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">96-Well microplate Centrifuge</td>
			<td style="width:209px;">Hettich Zentrifugen</td>
			<td style="width:148px;"># Rotina 420R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Microplate Reader</td>
			<td style="width:209px;">Molecular devices</td>
			<td style="width:148px;"># SpectraMax 190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Lab-Line Bench Top Orbit Environ Shaker Incubator</td>
			<td style="width:209px;">Biostad</td>
			<td style="width:148px;"># 3527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Infinity Triglycerides reagent</td>
			<td style="width:209px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:148px;"># TR22421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Triglyceride Standard</td>
			<td style="width:209px;">Stanbio</td>
			<td style="width:148px;">#2103 - 030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Quick Start Bradford Protein Assay</td>
			<td style="width:209px;">Bio-RAD</td>
			<td style="width:148px;"># 500-0205</td>
			<td>1x dye Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Coconut oil</td>
			<td style="width:209px;">Nutiva</td>
			<td># 692752200014</td>
			<td>15 0z jar</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">PBS 10X</td>
			<td style="width:209px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:148px;"># AM9625</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:209px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:148px;"># 9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Gas-permeable Foil</td>
			<td style="width:209px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:148px;"># 740675</td>
			<td>50 pieces</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">filter Paper</td>
			<td style="width:209px;">VWR</td>
			<td style="width:148px;"># 28317-241</td>
			<td>Pack of 100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Drosophila vials</td>
			<td style="width:209px;">Genesee Scientific</td>
			<td>Cat #: 32-116SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quick Start Bovine Serum Albumin Standard</td>
			<td style="width:209px;">Bio-Rad</td>
			<td># 5000206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">FlyNap Anesthetic</td>
			<td style="width:209px;">Carolina</td>
			<td style="width:148px;"># 173025</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kimwipes Low-Lint</td>
			<td style="width:209px;">Uline</td>
			<td style="width:148px;"># S-8115</td>
			<td>1-Ply, 4.4 x 8.4&#34;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high fat diet feeding and high throughput triacylglyceride assay in drosophila melanogaster

心臓病は、世界中の人間の死の第 1 原因です。数多くの研究は、人間の肥満と心疾患との間の強力な接続を示しているより多くのツールと研究努力は良い関与の解明に必要な。世紀以上ショウジョウバエの遺伝的非常に解き得るモデルは、キー遺伝子と種を渡って節約される非常に証明した分子経路の発見に尽力されています。多くの生物的プロセスと疾患メカニズム機能開発 (例えば、ボディー プラン、心)、がん、神経変性疾患など、その場で保存されます。最近では、肥満やモデル生物で心臓病などの二次疾患の研究は人間のメタボリック症候群に関与する主調整装置の識別に非常に重要な役割を果たしています。
ここでは、効率的なツールとして、肥満、すなわち、過剰な脂肪の蓄積を誘導し、タグの蓄積の形で脂肪のコンテンツを監視する効率的なプロトコルを開発このモデル生物を使用する提案します。非常に節約されただけでなく、以下の複雑なゲノム、フライは急速な実験、費用対効果と組み合わせての短い寿命もあります。このペーパーは、高脂肪の食事療法 (HFD) 肥満と脂肪、再現性の高いことを目的に関連する増加を測定するための高スループット triacylglyceride (タグ) アッセイを誘発するショウジョウバエの餌の詳しいプロトコルを提供しますと大規模な遺伝的または化学スクリーニングのため効率的です。これらのプロトコルは、効率的に、肥満に関係する規制メカニズムの調査し同様、創薬研究開発に及ぼす薬剤の候補者の試験のための標準化されたプラットフォームを提供する新しい機会を提供または肥満、糖尿病関連代謝疾患の予防。

キイロショウジョウバエ、という場合に、他の種の間にある性の二形性男女22。男性22より、腹部の脂肪質に、女性が多いことが知られています。提案プロトコルの有効性をテストするには、タグ規格研究所野生型 (w1118) の男女の違いをタグの内容にハエを決定するアッセイを行った。データは、女性がある男?...

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High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

高脂肪食給餌とキイロショウジョウバエの高スループット Triacylglyceride 試金

これは、栄養のショウジョウバエ毒性に関与している基本的な分子メカニズムの理解のためのモデルの肥満を誘発する高脂肪食です。ショウジョウバエと様々 な食物、環境、遺伝的または生理学的な条件の下で可能性があります他の (昆虫) モデルの脂肪蓄積を測定高スループット triacylglyceride 分析を提供します。

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

high-fat-diet-feeding-high-throughput-triacylglyceride-assay

Research

JoVE Journal

Genetics

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

11.1K ビュー.  Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute. これは、栄養のショウジョウバエ毒性に関与している基本的な分子メカニズムの理解のためのモデルの肥満を誘発する高脂肪食です。ショウジョウバエと様々 な食物、環境、遺伝的または生理学的な条件の下で可能性があります他の (昆虫) モデルの脂肪蓄積を測定高スループット triacylglyceride 分析を提供します。

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A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal transduction pathways, transcriptional regulatory networks, gene expression, genome-editing, and gene-silencing. Furthermore, significant progress has been made in the regeneration of plants from protoplasts, which has generated even more interest in the use of these systems for plant genomics. In this work, a protocol has been developed for automation of protoplast isolation and transformation from a &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) tobacco suspension culture using a robotic platform. The transformation procedures were validated using an orange fluorescent protein (OFP) reporter gene (pporRFP) under the control of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter (35S). OFP expression in protoplasts was confirmed by epifluorescence microscopy. Analyses also included protoplast production efficiency methods using propidium iodide. Finally, low-cost food-grade enzymes were used for the protoplast isolation procedure, circumventing the need for lab-grade enzymes that are cost-prohibitive in high-throughput automated protoplast isolation and analysis. Based on the protocol developed in this work, the complete procedure from protoplast isolation to transformation can be conducted in under 4 hr, without any input from the operator. While the protocol developed in this work was validated with the BY-2 cell culture, the procedures and methods should be translatable to any plant suspension culture/protoplast system, which should enable acceleration of crop genomics research.

A high-throughput, automated, tobacco protoplast production and transformation methodology is described. The robotic system enables massively parallel gene expression and discovery in the model BY-2 system that should be translatable to non-model crops.

ハイスループットプロトプラスト単離と変革のためのロボットプラットフォーム

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

遺伝学

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the conventional approaches of permanent gene deletion cannot be applied to essential genes. We have pioneered a unique collection of ~70 temperature-sensitive (ts) lethal mutants for studying cell cycle regulation in the unicellular green algae Chlamydomonas reinhardtii1. These mutations identify essential genes, and the ts alleles can be conditionally inactivated by temperature shift, providing valuable tools to identify and analyze essential functions. Mutant collections are much more valuable if they are close to comprehensive, since scattershot collections can miss important components. However, this requires the efficient collection of a large number of mutants, especially in a wide-target screen. Here, we describe a robotics-based pipeline for generating ts lethal mutants and analyzing their phenotype in Chlamydomonas. This technique can be applied to any microorganism that grows on agar. We have collected over 3000 ts mutants, probably including mutations in most or all cell-essential pathways, including about 200 new candidate cell cycle mutations. Subsequent molecular and cellular characterization of these mutants should provide new insights in plant cell biology; a comprehensive mutant collection is an essential prerequisite to ensure coverage of a broad range of biological pathways. These methods are integrated with downstream genetics and bioinformatics procedures for efficient mapping and identification of the causative mutations that are beyond the scope of this manuscript.

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Temperature-sensitive (ts) lethal mutants are valuable tools to identify and analyze essential functions. Here we describe methods to generate and classify ts lethal mutants in high throughput.

ハイスループットは、ロボットに温度に敏感な致死変異体の単離を支援します<em&gt;クラミドモナス</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for understanding the development and evolution of morphological phenotypes. Abdominal pigmentation in Drosophila melanogaster has been particularly useful, allowing researchers to identify the loci that underlie inter- and intraspecific variations in morphology. Hitherto, however, D. melanogaster abdominal pigmentation has been largely assayed qualitatively, through scoring, rather than quantitatively, which limits the forms of statistical analysis that can be applied to pigmentation data. This work describes a new methodology that allows for the quantification of various aspects of the abdominal pigmentation pattern of adult D. melanogaster. The protocol includes specimen mounting, image capture, data extraction, and analysis. All the software used for image capture and analysis feature macros written for open-source image analysis. The advantage of this approach is the ability to precisely measure pigmentation traits using a methodology that is highly reproducible across different imaging systems. While the technique has been used to measure variation in the tergal pigmentation patterns of adult D. melanogaster, the methodology is flexible and broadly applicable to pigmentation patterns in myriad different organisms.

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

This work presents a method to quickly and precisely quantify the abdominal pigmentation of Drosophila melanogaster using digital image analysis. This method streamlines the procedures between phenotype acquisition and data analysis and includes specimen mounting, image acquisition, pixel value extraction, and trait measurement.

腹部色素沈着の定量化<em&gt;ショウジョウバエmelanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution based analysis methodology (nucleosome density ChIP-seq; ndChIP-seq) that enables the generation of combined measurements of micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification genome-wide. Nucleosome position and local density, and the posttranslational modification of their histone subunits, act in concert to regulate local transcription states. Combinatorial measurements of nucleosome accessibility with histone modification generated by ndChIP-seq allows for the simultaneous interrogation of these features. The ndChIP-seq methodology is applicable to small numbers of primary cells inaccessible to cross-linking based ChIP-seq protocols. Taken together, ndChIP-seq enables the measurement of histone modification in combination with local nucleosome density to obtain new insights into shared mechanisms that regulate RNA transcription within rare primary cell populations.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) methodology for the generation of sequence datasets suitable for a nucleosome density ChIP-seq analytical framework integrating micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification measurements.

ネイティブのクロマチン免疫沈降のヌクレオソーム密度解析ライブラリをシーケンスの生成

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of tissues, we have developed numerous modifications and improvements to our original fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol. To facilitate throughput and cost effectiveness, all steps, from probe generation to signal detection, are performed using exon 96-well microtiter plates. Digoxygenin (DIG)-labelled antisense RNA probes are produced using either cDNA clones or genomic DNA as templates. After tissue fixation and permeabilization, probes are hybridized to transcripts of interest and then detected using a succession of anti-DIG antibody conjugated to biotin, streptavidin conjugated to horseradish peroxidase (HRP) and fluorescently conjugated tyramide, which in the presence of HRP, produces a highly reactive intermediate that binds to electron dense regions of immediately adjacent proteins. These amplification and localization steps produce a robust and highly localized signal that facilitates both cellular and subcellular transcript localization. The protocols provided have been optimized to produce highly specific signals in a variety of tissues and developmental stages. References are also provided for additional variations that allow the simultaneous detection of multiple transcripts, or transcripts and proteins, at the same time.

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

The described RNA in situ hybridization protocol allows the detection of RNA in whole Drosophila embryos or dissected tissues. Using 96-well microtiter plates and tyramide signal amplification, transcripts can be detected at high resolution, sensitivity, and throughput, and at a relatively low cost.

ショウジョウバエの胚とパスチラミドシグナル信号増幅を利用した生体表面の高解像度蛍光In Situハイブリダイゼーション

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with a number of challenges including sample preservation quality, degraded DNA, and destructive sampling of rare specimens. In order to more effectively use herbarium material in large sequencing projects, a dependable and scalable method of DNA isolation and library preparation is needed. This paper demonstrates a robust, beginning-to-end protocol for DNA isolation and high-throughput library construction from herbarium specimens that does not require modification for individual samples. This protocol is tailored for low quality dried plant material and takes advantage of existing methods by optimizing tissue grinding, modifying library size selection, and introducing an optional reamplification step for low yield libraries. Reamplification of low yield DNA libraries can rescue samples derived from irreplaceable and potentially valuable herbarium specimens, negating the need for additional destructive sampling and without introducing discernible sequencing bias for common phylogenetic applications. The protocol has been tested on hundreds of grass species, but is expected to be adaptable for use in other plant lineages after verification. This protocol can be limited by extremely degraded DNA, where fragments do not exist in the desired size range, and by secondary metabolites present in some plant material that inhibit clean DNA isolation. Overall, this protocol introduces a fast and comprehensive method that allows for DNA isolation and library preparation of 24 samples in less than 13 h, with only 8 h of active hands-on time with minimal modifications.

This article demonstrates a detailed protocol for DNA isolation and high-throughput sequencing library construction from herbarium material including rescue of exceptionally poor-quality DNA.

堅牢な DNA の隔離および標本の高スループット シーケンス ライブラリーの構築

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our entire society's ability to treat systemic infections. In the United States alone, antibiotic-resistant infections kill approximately 23,000 people a year and cost around 20 billion USD in additional healthcare. One approach to combat antimicrobial resistance is combination therapy, which is particularly useful in the critical early stage of infection, before the infecting organism and its drug resistance profile have been identified. Many antimicrobial treatments use combination therapies. However, most of these combinations are additive, meaning that the combined efficacy is the same as the sum of the individual antibiotic efficacy. Some combination therapies are synergistic: the combined efficacy is much greater than additive. Synergistic combinations are particularly useful because they can inhibit the growth of antimicrobial drug resistant strains. However, these combinations are rare and difficult to identify. This is due to the sheer number of molecules needed to be tested in a pairwise manner: a library of 1,000 molecules has 1 million potential combinations. Thus, efforts have been made to predict molecules for synergy. This article describes our high-throughput method for predicting synergistic small molecule pairs known as the Overlap2 Method (O2M). O2M uses patterns from chemical-genetic datasets to identify mutants that are hypersensitive to each molecule in a synergistic pair but not to other molecules. The Brown lab exploits this growth difference by performing a high-throughput screen for molecules that inhibit the growth of mutant but not wild-type cells. The lab's work previously identified molecules that synergize with the antibiotic trimethoprim and the antifungal drug fluconazole using this strategy. Here, the authors present a method to screen for novel synergistic combinations, which can be altered for multiple microorganisms.

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Synergistic drug combinations are difficult and time-consuming to identify empirically. Here, we describe a method for identifying and validating synergistic small molecules.

重複2法による相乗効果の薬剤の組合せの高スループット識別

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short generation time, are easy to handle, display a high reproductive rate, low cost, and are easily amenable to genetic manipulations by microinjection of DNA in embryos. Recent advances in gene editing tools are enabling precise introduction of mutations and transgenes in zebrafish. Disease modeling in zebrafish often leads to larval phenotypes and early death which can be challenging to interpret if genotypes are unknown. This early identification of genotypes is also needed in experiments requiring sample pooling, such as in gene expression or mass spectrometry studies. However, extensive genotypic screening is limited by traditional methods, which in most labs are performed only on adult zebrafish or in postmortem larvae. We addressed this problem by adapting a method for the isolation of PCR-ready genomic DNA from live zebrafish larvae that can be achieved as early as 72 h post-fertilization (hpf). This time and cost-effective technique, improved from a previously published genotyping protocol, allows the identification of genotypes from microscopic fin biopsies. The fins quickly regenerate as the larvae develop. Researchers are then able to select and raise the desired genotypes to adulthood by utilizing this high-throughput PCR-based genotyping procedure.

Zebrafish have been used as reliable genetic model organisms in biomedical research, especially with the advent of gene-editing technologies. When larval phenotypes are expected, DNA extraction and genotype identification can be challenging. Here, we describe an efficient genotyping procedure for zebrafish larvae, by tail clipping, as early as 72-h post-fertilization.

ハイスループット DNA の抽出およびフィン クリッピングが 3dpf ゼブラフィッシュ仔のジェノタイピング

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often performed at low throughput, it is moreover time-consuming and error-prone, even more so when multiplexing several plasmids. We developed an easy, fast, and accurate method to perform cell transfection in a 384-well plate layout using acoustic droplet ejection (ADE) technology. The nanodispenser device used in this study&#160;is based on this technology and allows precise nanovolume delivery at high speed from a source well plate to a destination one. It can dispense and multiplex DNA and transfection reagent according to a predesigned spreadsheet. Here we present an optimal protocol to perform ADE-based high-throughput plasmid transfection which makes it possible to reach an efficiency of up to 90% and a nearly 100% cotransfection in cotransfection experiments. We extend initial work by proposing a user-friendly spreadsheet-based macro, able to manage up to four plasmids/wells from a library containing up to 1,536 different plasmids, and a tablet-based pipetting guide application. The macro designs the necessary template(s) of the source plate(s) and generates the ready-to-use files for the nanodispenser and tablet-based application. The four-steps transfection protocol involves i) a diluent dispense with a classical liquid handler, ii) plasmid distribution and multiplexing, iii) a transfection reagent dispense by the nanodispenser, and iv) cell plating on the prefilled wells. The described software-based control of ADE plasmid multiplexing and transfection allows even nonspecialists in the field to perform a reliable cell transfection in a fast and safe way. This method enables rapid identification of optimal settings for a given cell type and can be transposed to higher-scale and manual approaches. The protocol eases applications, such as human ORFeome protein (set of open reading frames [ORFs] in a genome) expression or CRISPR-Cas9-based gene function validation, in nonpooled screening strategies.

This protocol describes high-throughput plasmid transfection of mammalian cells in a 384-well plate using acoustic droplet ejection technology. The time-consuming, error-prone DNA dispensing and multiplexing, but also the transfection reagent dispensing, are software-driven and performed by a nanodispenser device. The cells are then seeded in these prefilled wells.

音響ナノディスペンス技術を用いたハイスループットDNAプラスミド多重化とトランスフェクション

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to perform and its ability to standardize the fitness of many strains to a wild-type organism. The technique is limited, however, by available phenotypic markers and the number of strains that can be assessed simultaneously, creating the need for a great number of replicate experiments. Concurrent with large numbers of experiments, the labor and material costs for quantifying bacteria based on phenotypic markers are not insignificant. To overcome these negative aspects while retaining the positive aspects, we have developed a molecular-based approach to directly quantify microorganisms after engineering genetic markers onto bacterial chromosomes. Unique, 25 base pair DNA barcodes were inserted at an innocuous locus on the chromosome of wild-type and mutant strains of Salmonella. In vitro competition experiments were performed using inocula consisting of pooled strains. Following the competition, the absolute numbers of each strain were quantified using digital PCR and the competitive indices for each strain were calculated from those values. Our data indicate that this approach to quantifying Salmonella is extremely sensitive, accurate, and precise for detecting both highly abundant (high fitness) and rare (low fitness) microorganisms. Additionally, this technique is easily adaptable to nearly any organism with chromosomes capable of modification, as well as to various experimental designs that require absolute quantification of microorganisms.

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

This molecular-based approach for determining bacterial fitness facilitates precise and accurate detection of microorganisms using unique genomic DNA barcodes that are quantified via digital PCR. The protocol describes calculating the competitive index for Salmonella strains; however, the technology is readily adaptable to protocols requiring absolute quantification of any genetically-malleable organism.

サルモネラ菌におけるフィットネスのハイスループット分析に関するデジタルPCRベースの競争指数

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

高脂肪食給餌とキイロショウジョウバエの高スループット Triacylglyceride 試金

要約

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ハイスループットプロトプラスト単離と変革のためのロボットプラットフォーム

ハイスループットは、ロボットに温度に敏感な致死変異体の単離を支援します

腹部色素沈着の定量化

ネイティブのクロマチン免疫沈降のヌクレオソーム密度解析ライブラリをシーケンスの生成

ショウジョウバエの胚とパスチラミドシグナル信号増幅を利用した生体表面の高解像度蛍光In Situハイブリダイゼーション

堅牢な DNA の隔離および標本の高スループットシーケンスライブラリーの構築

重複²法による相乗効果の薬剤の組合せの高スループット識別

ハイスループット DNA の抽出およびフィンクリッピングが 3dpf ゼブラフィッシュ仔のジェノタイピング

音響ナノディスペンス技術を用いたハイスループットDNAプラスミド多重化とトランスフェクション

サルモネラ菌におけるフィットネスのハイスループット分析に関するデジタルPCRベースの競争指数

高脂肪食給餌とキイロショウジョウバエの高スループット Triacylglyceride 試金

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ハイスループットプロトプラスト単離と変革のためのロボットプラットフォーム

ハイスループットは、ロボットに温度に敏感な致死変異体の単離を支援します

腹部色素沈着の定量化

ネイティブのクロマチン免疫沈降のヌクレオソーム密度解析ライブラリをシーケンスの生成

ショウジョウバエの胚とパスチラミドシグナル信号増幅を利用した生体表面の高解像度蛍光In Situハイブリダイゼーション

堅牢な DNA の隔離および標本の高スループット シーケンス ライブラリーの構築

重複2法による相乗効果の薬剤の組合せの高スループット識別

ハイスループット DNA の抽出およびフィン クリッピングが 3dpf ゼブラフィッシュ仔のジェノタイピング

音響ナノディスペンス技術を用いたハイスループットDNAプラスミド多重化とトランスフェクション

サルモネラ菌におけるフィットネスのハイスループット分析に関するデジタルPCRベースの競争指数

堅牢な DNA の隔離および標本の高スループットシーケンスライブラリーの構築

重複²法による相乗効果の薬剤の組合せの高スループット識別

ハイスループット DNA の抽出およびフィンクリッピングが 3dpf ゼブラフィッシュ仔のジェノタイピング