Name: high fat diet feeding and high throughput triacylglyceride assay in drosophila melanogaster
Uploaded: 2017-09-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
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我々 はこの原稿を編集のエリカ ・ テイラーを感謝したいです。この作品は、国立衛生研究所 (P01 HL098053、P01 AG033561 および R01 HL054732) r. b. に、博士課程終了後の研究サプリメント (R01 HL085481) と親睦 (AAUW) から S.B.D.、助成金、S.B.D. に米国心臓協会からの助成金によって賄われていた・ R.T.B.

1。 栄養 HFD <img alt="Table 1"src="/files/ftp_upload/56029/56029table1.jpg"/> テーブル 1。フライ食品のレシピ 。
この表は、当社のコントロールの食品を準備するための異なる材料をまとめます。食品の 10 mL バイアルに注がれ、冷却、長期的な保存のための 4 ° C で保存に行ったら、.
<ol><li>HFD 準備 <ol><li>高脂肪食品の 1 キロをするためには、既製の通常はえの食糧の 700 グラムの重量を量る (表 1 参照) および分析用天秤を使用して 2 つの独立したコンテナーにココナッツ オイルの 300 g.</li>
		<li>は、内容が完全に溶けるまで電子レンジで個別に各コンテナーを熱します。はえの食糧コンテナーにココナッツ オイルを注ぐ。油はよくはえの食糧に混合するまで泡立て器を使ってかき混ぜる 。
		注: 食品や油の塊も見えるはずです。はえの食糧が電子レンジで溶けて、食べ物をミックスして沸騰を防ぐため 1 分の間隔で停止します</li>。
		<li>再高脂肪食品の重量を量る。総重量が 1 kg 未満のもの (食品の + 300 g ココナッツ オイルの 700 g)、水 (約 10 mL) 加熱蒸発を補うために、1 キロに体重を取り戻すことを追加</li>
		<li>注ぐ十分に混合された約 10 mL バイアル (バイアル量の約 25%) あたり高脂肪食品。次に、ハエを防ぐために寒冷紗をかぶせて &#39; 汚染。室温で 1 時間冷却し、4 週間をストレージのための 4 ° C にバイアルを転送します 。
		注: 通常の食品 (NF) は、コントロール食品として使用されます。またバイアルあたり NF の 10 mL バイアル ボリューム (約 25%) を注ぐ。HFD 食糧のため、NF 食品の 30% をココナッツ オイルに置き換えます。コントロールと実験条件は、ハエは NF と HFD (バイアルあたりの食品の 10 mL) の同じ量を与えられた</li>。
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 1"class="xfigimg"src="/files/ftp_upload/56029/56029fig1.jpg"/> 図 1 。ショウジョウバエ の餌 HFD 。
スキームは、(ココナッツ オイル添加) と制御料理 (ココナッツ油 NF の添加せず通常国会) または HFD のハエの異なる餌手順を示します。全体のプロセスは、成虫の初期コレクションの後 10 日間かかります。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56029/56029fig1large.jpg"target="_blank"> この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<ol start="2"> キイロショウジョウバエ の給餌 HFD <li> 注: このプロトコルには制御料理と HFD のフライラインと互換性のある手順を餌が含まれています。制御と実験のハエは、同じ量の食べ物 (NF または HFD) を含むバイアルに配置されます。
	<ol><li>使用 CO 2 ハエを麻酔する 。
		注: 初心者、読み取りを参照してください発生と キイロショウジョウバエ の処理の概要について 21</li>。
		<li>収集 0 5 バイアル (反転) による移転から日古いハエ NF (以前は室温で暖められた) を含む新しい瓶にハエ。21 日の 5 その他のハエの年齢を聞かせて ° C</li>
		<li>5 日間の終わりに、4 から HFD と NF を含むバイアルを取る ° C 
		注: 低温が生きているハエを強調することさせて使用する前にウォーム アップするために室温で 30 分間座ってバイアル</li>。
		<li>ワイプを使用して、きれいにし、瓶の側面から余分な水分を削除します</li>。
		<li>についてフィルター紙の小片を挿入 1 cm × 3 cm、あらゆる余分な液体を吸収する高脂肪食品にします 。
		注: この手順は HFD 食品へのこだわりからハエを防止するため重要です</li>。
		次に、<li>は (反転) によって高脂肪食品にハエを転送します。5 日間の水平方向に彼らの側に (立っていない) 21-22 ° C でバイアルをレイアウトします 。
		注: これは部分的に高脂肪食品の原因、食品と死ぬに固執するハエを溶かすことができるよう高温を避けてください</li>。
		<li>後 5 日転送 (反転) で 30 分間空を彼らの勇気を許可するように食べ物がなくても新しい瓶に NF と HFD から飛ぶ。次に、ハエを計量に進みます 。
		注: プロトコルを供給この HFD で重要な手順の 1 つは十分に混合された HFD、はえの食糧または凝縮油の任意のチャンクの無料の準備です。均質な混合と HFD 45-30 ° c の冷却をお勧め、バイアルに注ぐと 4 ° c. の適切な年齢で、食べ物を保存する前にコントロールと実験ハエのマッチングです事前の栄養と環境条件の制御だけでなく、重要ですHFD の餌。供給フェーズでは、制御と実験ハエ与えられなければならない NF と HFD の同量。決して過密バイアルまたは (次世代影響を避けるため) にボトルからハエを収集します。NF と HFD 食餌療法の制限やその他の混雑の効果を避けるために給餌中にバイアルあたり最大 25 ハエを常に置きます。HFD は 30% ココナッツ オイルから成る、こうして 22 の ° C の上の温度は部分的に油性食品と死ぬに固執するハエを引き起こして、HFD を溶かす可能性があります。HFD のハエを置く前に、残油を削除し、食品の任意の余分な水分を吸収するフィルター紙を挿入するバイアルをクリーンアップします。、HFD のハエのインキュベーション中にバイアルはハエの無脂肪水平表面を提供するためにその両側に配置されます。</li>
	</ol></li> <li>ハエを計量 <ol><li>遺伝子型およびテストする性別ごとに事前にラベルが付いた、空の 1.7 mL の管の重量を記録する超高感度スケールを使用します</li>。
		<li>1.7 mL チューブの重量を量った 1 つにブラシでステータスを供給事前麻酔フライ麻酔薬または CO 2 を使用して同じ品種、性別、36 のハエを収集し、</li>。
		<li>同じ超高感度スケールでハエを含むチューブの重量を量ます</li>。
		<li>は、この数式を次平均飛行重量を決定する: 
		<img alt="Equation 1"src="/files/ftp_upload/56029/56029eq1.jpg"/> 注: このプロトコルでハエの数は 36 です</li>。
		<li>フラッシュは 2 分収集の液体窒素に急落して、ハエを含む 1.7 mL の管を凍結し、チューブをボックスに入れています。-80 ° C (望ましい温度) にタグの試金で使用されるまでストレージ ボックスを次に、転送します 。
		注意: 液体窒素は非常に低温です。適切な個人用保護具を使用してください</li>。
	</ol></li></ol> 2。タグ アッセイ <ol><li>タグの標準濃度の準備 <ol><li>PBT の 500 mL を準備 (PBS 1 X 0.05% トリトン).</li>
		<li>使用 0.5 mL チューブとタグ ソリューション (材料表) の準備空白 (PBT のみ) の 100 μ L、100 μ L (2 μ g/μ L 1 μ g/μ L 0.5 μ g/μ L; 0.25 μ g/μ L; 六つの標準的なタグの濃度の0.125 μ g/μ l。0.0625 μ g/μ L)、PBT と</li>。
		<li>氷のチューブを設置し、ハエを研削進みます</li>。
	</ol></li> <li>ハエを研削 <ol><li>-80 ° C (手順 1.3) から冷凍のハエを取る。氷に乗って飛ぶを含むチューブを転送</li>
		<li>まず、96 ウェル ボール ディスペンサーにボールを粉砕 2 mm 金属を置き、余分なボールを削除する小さなブラシを使用します</li>。
		金属製のボールを研削板に直接転送するボール ディスペンサーとフリップの上に逆さま <li>96 ウェル研削場所プレート。ウェルあたり 1 つのボールがあります</li>。
		<li>96 ウェル研磨プレートの各行に PBT 600 μ L を追加マルチ チャンネル ピペットを使用します</li>。
		<li>鉗子、ウェルあたり 3 ハエを追加。96 ウェル研磨プレートの各の行/ウェル中のハエの遺伝子型、性別、食品の状態を示します</li>。
		<li>はしっかりと 96 ウェル研削プレート キャップを置きます。テープは、漏れがないことを確認する上に配置可能性があります</li>。
		<li>は、研削盤に 96 ウェルプレート研削を正しく配置します。最高速度およびプレスにマシンを設定 &#34; を実行 &#34; 3 分のハエを挽く</li>
		<li>後 3 分、研削を停止し、プレート遠心分離に進む: 画4,000 x g、4 ° C で 15 分間 ge遠心分離の後研削プレート上澄みをペレットと混合を避けるために慎重に管理します</li>。
	</ol></li> <li>サンプル読み込みとタグ定量 <ol><li>新しい分光光度計 96 ウェル プレートを取る。タグ試薬を 200 μ l 添加のプレートの各行を読み込むマルチ チャンネル ピペットを使用します</li>。
		<li>空を作成する最初の行の最初のウェルに PBT の負荷 20 μ L。上下にピペッティングで混ぜます。気泡の形成を避けるためします</li>。
		最初の行の上下にピペッティングによるミックスの <li>ロード 20 μ L に残り (ステップ 2.1.2) から各標準希釈の井戸。気泡の形成を避けるためします</li>。
		<li>分光光度計 96 ウェル プレート内の対応する行に研削板の各行から上澄みの 20 μ L マルチ チャンネル ピペットを使用して転送します。上下のピペットをよく混ぜます。気泡の形成を避けるためします</li>。
		<li>次に、96 ウェルのプレートの上にガス透過性の箔を配置します</li>。
		<li>インキュベート 37 ° C で 10 分間でプレート 
		注: 井戸の中に泡がある場合すべてのバブルを削除する 2,000 x g で 2 分間プレートを遠心分離機します。気泡の存在は吸読書を妨げます</li>。
		<li>550 でプレートの各ウェルの吸光度を読み取り海里に互換性のあるマイクロ プレート リーダーを使用してあります。次に、標準曲線をトレースし、未知試料の濃度 [μ g/μ L] を決定します</li>。
		<li>あたり平均日本フライ級、タグのコンテンツの量を決定する次の数式を使用して、: 
		<img alt="Equation 2"src="/files/ftp_upload/56029/56029eq2.jpg"/> 注: このプロトコルで 3 ハエが PBT 600 μ L でみじん切り; その結果、フライあたりの平均容積は 200 μ L.</li>
	</ol></li> <li>ブラッドフォードの試金とタンパク質含量、タグのコンテンツを正規化 <ol><li>7 つの準備のウシ血清アルブミン (BSA) 標準希釈液 100 μ L (200 μ G/ml; 150 μ g/mL 100 μ g/mL 75 μ g/mL 250μ g/ミリリットルです。500 μ g/ミリリットルです。1,000 μ g/mL)、PBT と</li>。
		<li>新しい 96 ウェル プレートし、プレートのそれぞれの行に 1 X ブラッドフォード試薬 200 μ L を読み込む</li>。
		<li>最初の行の最初のよく、空白を作成する PBT の 10 μ L を追加。上下にピペッティングで混ぜます。気泡の形成を避けるためします</li>。
		最初の行の上下にピペッティングによるミックスの <li>追加 10 μ L に残りの各標準希釈の井戸。気泡の形成を避けるためします</li>。
		<li>96 ウェル プレートに対応する行に研削板の各行から培養上清中のハエの 10 μ L を転送マルチ チャンネル ピペットを使用しています。上下のピペットをよく混ぜます。気泡の形成を避けるためします</li>。
		<li>96 ウェルのプレートの上にガス透過性の箔を配置します</li>。
		<li>では、5 分間室温でプレートを孵化させなさい。井戸の中に泡がある場合はそれらを削除する 2,000 x g で 2 分間プレートを遠心分離機します 。
		注: 気泡の存在は吸読書を妨げます</li>。
		<li>使用ブランクの吸光度を読み取り、標準と 595 で不明なサンプル分光光度計海里にあります。標準曲線を使用し、各行にサンプルの濃度 [μ g/μ L].</li>
		<li>正規化次の数式を使用して蛋白質のレベルとコンテンツのタグ: 
		<img alt="Equation 3"src="/files/ftp_upload/56029/56029eq3.jpg"/></li></ol></li></ol>

<ol>
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著者が明らかに何もありません。

マウスの肥満誘導は、ヶ月19,20を取ることができます。ハエ、プロトコルを供給この HFD は日以内の 18 h (図 2を参照) 後にのみ脂肪蓄積の増加を引き起こしている問題で過剰の脂肪蓄積の誘導のことができます。HFD 説明プロトコルと餌はグルコース コンテンツ12を増加し、 Bmmリパーゼと PGC 1 式<sup class=...

我々 は、肥満とその関連の経済負担が世界的な問題1時間です。すべての 3 つのアメリカ人のうち 2 つは太りすぎまたは肥満関連の心臓病理学、成人2以内の死亡の主な原因であります。モデル生物を用いたメタボリック シンドロームの調節に関与する遺伝的および分子コンポーネントを適切に調査する新しい効率的な方法が必要です。この理由から、ヒトとマウス3,4,5,6を含む哺乳類で最も基本的な生物的プロセスを共有するのでミバエショウジョウバエモデルを選択します。ショウジョウバエのゲノムの進化の過程で非常に節約されたが、全体的にはるかに少ない遺伝子重複と代謝複雑さで、多くの人間の病気4に関与する基本的なメカニズムを理解するために理想的な小さい,7,8しますまた、脂肪組織、消化管によって特徴的なプロセスが実施と膵臓がフライで表され、人間9,に類似している糖・脂質代謝、たとえば、規制機能を仲介する。10,11。また、肥満、インスリン抵抗性や人間の糖尿病のコントロールに関与する基本的な分子経路はキイロショウジョウバエ12,13,14保存機能,15,16. 高等生物のようなショウジョウバエが哺乳類心臓3,17のそれに類似したプロセスによって開発中に形成される心臓の鼓動。したがって、プロトコルと高スループット タグ分析、ショウジョウバエの遺伝学的ツール ボックスを使用して有効なスクリーニング目的のために適応を供給信頼性の高い HFD の開発研究し、遺伝的基礎を理解するための重要な手段を提供します。複雑な代謝性疾患の基になります。
HFD 食品自体はほとんど18メタボリック シンドロームと関連付けられる知られている飽和脂肪酸で構成されているココナッツ オイルを添加した標準研究所はえの食糧から作られます。齧歯動物などの哺乳類モデルで肥満を誘発するヶ月19,20を取ることができる、私たちの最適化された HFD 効果的かつ再現性をもって、ショウジョウバエのプロトコルを供給増加の問題で個体の脂肪分日12,14。このプロトコルでは、タグの高スループット試金と組み合わせて効率的な検診遺伝的要因、環境の影響および脂肪質の新陳代謝の新しい変調器を発見する新薬候補の効果をことができます。その結果、これらのプロトコルは、理解や戦闘肥満および肥満関連人間の病理学に関連します。
餌のプロトコルは多目的、単一の飽和または不飽和の脂肪酸の代謝と機能の効果を研究に適用可能性があります。タグにあるこの高スループットの分析の使用、キイロショウジョウバエに限定されないが、キューティクルやタフな細胞外マトリックス (例えば、他のショウジョウバエの種、線虫と小さいモデル有機体の様々 な適応があります。およびその他の新興の無脊椎動物モデル) 代謝病期や成人期開発のあらゆる段階で異なる環境、遺伝的または生理学的な条件の下で脂肪の量を測定します。タグ アッセイは遊離脂肪酸、グリセロール、グリセロール 3-リン酸、最終的に 4-アミノアンチピリン (4-AAP) と 3, 5 - と反応して H2O2にタグが低下する酵素反応の一連の比色測定に基づいてジクロロ-2-ヒドロキシ ベンゼン スルホン酸 (3, 5 DHBS) 96 ウェルの分光光度計を用いて測定した赤い色の製品を生産します。

<table><tbody><tr><td>Talboys Ball dropper/bead Dispenser</td><td>Talboys</td><td>#: 930150</td><td></td></tr><tr><td>Talboys High Throughput Homogenizer</td><td>Talboys</td><td>#: 930145</td><td></td></tr><tr><td>Grinding Balls, Stainless Steel&amp;nbsp;</td><td>OPS Diagnostics, LLC</td><td># GBSS 156-5000-01</td><td>5000 balls</td></tr><tr><td>Masterblock 96 Well deep Microplates</td><td>Greiner Bio-One</td><td># T-3058-1</td><td>case of 80 plates</td></tr><tr><td>Greiner&amp;nbsp; 96 well microplate flat bottom</td><td>Sigma Aldrich</td><td># M4436</td><td>40 plates</td></tr><tr><td>Greiner CapMat for sealing multiwell plates</td><td>Sigma Aldrich</td><td># C3606</td><td>50 sealing plates</td></tr><tr><td>Reagent Reservoirs&amp;nbsp;</td><td>Thomas Scientific</td><td># 1192T71</td><td>12/PK</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Finnpipette 4661040</td><td>Thermo Scientific</td><td># 4661040</td><td>1-10 ul multipipette</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Finnpipette 4661070</td><td>Thermo Scientific</td><td># 4661070</td><td>30-300ul multipipette</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Finnpipette 4661020</td><td>Thermo Scientific</td><td>#4661020</td><td>10-100ul multipipette</td></tr><tr><td>Multichannel tips</td><td>Denville Scientific Inc</td><td># P3131-S</td><td>for 10 uL pipette</td></tr><tr><td>Multichannel tips</td><td>Denville Scientific Inc</td><td># P3133-S</td><td>for 200 uL pipette</td></tr><tr><td>Multichannel tips</td><td>Denville Scientific Inc</td><td>#P1125</td><td>for 100 uL pipette</td></tr><tr><td>Forceps&amp;nbsp;</td><td>Roboz Surgical</td><td># 5 Dumonts</td><td>Super fine forceps</td></tr><tr><td>Mettler Toledo Excellence XS Analytical Balance Mfr# XS64</td><td>Cole-Parmer scientific experts</td><td># EW-11333-00</td><td></td></tr><tr><td>Metler Toledo Excellence XS Toploading Balance</td><td>Cole-Parmer scientific experts</td><td># EW-11333-49</td><td></td></tr><tr><td>96-Well microplate Centrifuge</td><td>Hettich Zentrifugen</td><td># Rotina 420R</td><td></td></tr><tr><td>Microplate Reader</td><td>Molecular devices</td><td># SpectraMax 190</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Line Bench Top Orbit Environ Shaker Incubator</td><td>Biostad</td><td># 3527</td><td></td></tr><tr><td>Infinity Triglycerides reagent</td><td>Thermo Scientific</td><td># TR22421</td><td></td></tr><tr><td>Triglyceride Standard</td><td>Stanbio</td><td>#2103 - 030</td><td></td></tr><tr><td>Quick Start Bradford Protein Assay</td><td>Bio-RAD</td><td># 500-0205</td><td>1x dye Reagent</td></tr><tr><td>Coconut oil</td><td>Nutiva</td><td># 692752200014</td><td>15 0z jar</td></tr><tr><td>PBS 10X</td><td>Thermo Scientific</td><td># AM9625</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td># 9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Gas-permeable Foil</td><td>Macherey-Nagel</td><td># 740675</td><td>50 pieces</td></tr><tr><td>filter Paper</td><td>VWR</td><td># 28317-241</td><td>Pack of 100</td></tr><tr><td>Drosophila vials</td><td>Genesee Scientific</td><td>Cat #: 32-116SB</td><td></td></tr><tr><td>Quick Start Bovine Serum Albumin Standard</td><td>Bio-Rad</td><td># 5000206</td><td></td></tr><tr><td>FlyNap Anesthetic</td><td>Carolina</td><td># 173025</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Kimwipes Low-Lint</td><td>Uline</td><td># S-8115</td><td>1-Ply, 4.4 x 8.4&quot;</td></tr></tbody></table>

high fat diet feeding and high throughput triacylglyceride assay in drosophila melanogaster

心臓病は、世界中の人間の死の第 1 原因です。数多くの研究は、人間の肥満と心疾患との間の強力な接続を示しているより多くのツールと研究努力は良い関与の解明に必要な。世紀以上ショウジョウバエの遺伝的非常に解き得るモデルは、キー遺伝子と種を渡って節約される非常に証明した分子経路の発見に尽力されています。多くの生物的プロセスと疾患メカニズム機能開発 (例えば、ボディー プラン、心)、がん、神経変性疾患など、その場で保存されます。最近では、肥満やモデル生物で心臓病などの二次疾患の研究は人間のメタボリック症候群に関与する主調整装置の識別に非常に重要な役割を果たしています。
ここでは、効率的なツールとして、肥満、すなわち、過剰な脂肪の蓄積を誘導し、タグの蓄積の形で脂肪のコンテンツを監視する効率的なプロトコルを開発このモデル生物を使用する提案します。非常に節約されただけでなく、以下の複雑なゲノム、フライは急速な実験、費用対効果と組み合わせての短い寿命もあります。このペーパーは、高脂肪の食事療法 (HFD) 肥満と脂肪、再現性の高いことを目的に関連する増加を測定するための高スループット triacylglyceride (タグ) アッセイを誘発するショウジョウバエの餌の詳しいプロトコルを提供しますと大規模な遺伝的または化学スクリーニングのため効率的です。これらのプロトコルは、効率的に、肥満に関係する規制メカニズムの調査し同様、創薬研究開発に及ぼす薬剤の候補者の試験のための標準化されたプラットフォームを提供する新しい機会を提供または肥満、糖尿病関連代謝疾患の予防。

キイロショウジョウバエ、という場合に、他の種の間にある性の二形性男女22。男性22より、腹部の脂肪質に、女性が多いことが知られています。提案プロトコルの有効性をテストするには、タグ規格研究所野生型 (w1118) の男女の違いをタグの内容にハエを決定するアッセイを行った。データは、女性がある男?...

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High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

高脂肪食給餌とキイロショウジョウバエの高スループット Triacylglyceride 試金

これは、栄養のショウジョウバエ毒性に関与している基本的な分子メカニズムの理解のためのモデルの肥満を誘発する高脂肪食です。ショウジョウバエと様々 な食物、環境、遺伝的または生理学的な条件の下で可能性があります他の (昆虫) モデルの脂肪蓄積を測定高スループット triacylglyceride 分析を提供します。

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

high-fat-diet-feeding-high-throughput-triacylglyceride-assay

Research

JoVE Journal

Genetics

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

11.2K ビュー.  Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute. これは、栄養のショウジョウバエ毒性に関与している基本的な分子メカニズムの理解のためのモデルの肥満を誘発する高脂肪食です。ショウジョウバエと様々 な食物、環境、遺伝的または生理学的な条件の下で可能性があります他の (昆虫) モデルの脂肪蓄積を測定高スループット triacylglyceride 分析を提供します。

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The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

The incidence of complex metabolic diseases has increased as a result of a widespread transition towards lifestyles of increased caloric intake and lowered activity levels. These multifactorial diseases arise from a combination of genetic, environmental, and behavioral factors. One such complex disease is Metabolic Syndrome (MetS), which is a cluster of metabolic disorders, including hypertension, hyperglycemia, and abdominal obesity. Exercise and dietary intervention are the primary treatments recommended by doctors to mitigate obesity and its subsequent metabolic diseases. Exercise intervention, in particular aerobic interval training, stimulates favorable changes in the common risk factors for Type 2 Diabetes Mellitus (T2DM), Cardiovascular Disease (CVD), and other conditions. With the influx of evidence describing the therapeutic effect exercise has on metabolic health, establishing a system that models exercise in a controlled setting provides a valuable tool for assessing the effects of exercise in an experimental context. Drosophila melanogaster is a great tool for investigating the physiological and molecular changes that result from exercise intervention. The flies have short lifespans and similar mechanisms of metabolizing nutrients when compared to humans. To induce exercise in Drosophila, we developed a machine called the TreadWheel, which utilizes the fly&#39;s innate, negative geotaxis tendency to gently induce climbing. This enables researchers to perform experiments on large cohorts of genetically diverse flies to better understand the genotype-by-environment interactions underlying the effects of exercise on metabolic health.

The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

The TreadWheel uses rotational motion to gently induce exercise in adult Drosophila melanogaster by exploiting flies&#39; innate, negative geotaxis. It allows for analysis of the interactions between exercise and factors, such as genotype, sex, and diet, and their effect on physiological and molecular assays to assess metabolic health.

キイロショウジョウバエで優しく誘導運動されて: インターバル トレーニングのプロトコル

The incidence of complex metabolic diseases has increased as a result of a widespread transition towards lifestyles of increased caloric intake and ...

遺伝学

Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila

Food consumption is under the tight control of the brain, which integrates the physiological status, palatability, and nutritional contents of the food, and issues commands to start or stop feeding. Deciphering the processes underlying the decision-making of timely and moderate feeding carries major implications in our understanding of physiological and psychological disorders related to feeding control. Simple, quantitative, and robust methods are required to measure the food ingestion of animals after experimental manipulation, such as forcibly increasing the activities of certain target neurons. Here, we introduced dye-labeling-based feeding assays to facilitate the neurogenetic study of feeding control in adult fruit flies. We review available feeding assays, and then describe our methods step-by-step from setup to analysis, which combine thermogenetic and optogenetic manipulation of neurons controlling feeding motivation with dye-labeled food intake assay. We also discuss the advantages and limitations of our methods, compared with other feeding assays, to help readers choose an appropriate assay.

Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila

Quantitative food-intake assays with dyed food provide a robust and high-throughput means to evaluate feeding motivation. Combining the food consumption assay with thermogenetic and optogenetic screens is a powerful approach to investigate the neural circuits underlying appetite in adult Drosophila melanogaster.

定量的食物摂取の試金を組み合わせると強制的にショウジョウバエの食欲を勉強するニューロンを活性化

Food consumption is under the tight control of the brain, which integrates the physiological status, palatability, and nutritional contents of the food, ...

行動学

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

Quantifying food intake in Drosophila is used to study the genetic and physiological underpinnings of consumption-associated traits, their environmental factors, and the toxicological and pharmacological effects of numerous substances. Few methods currently implemented are amenable to high throughput measurement. The Microplate Feeder Assay (MFA) was developed for quantifying the consumption of liquid food for individual flies using absorbance. In this assay, flies consume liquid food medium from select wells of a 1536-well microplate. By incorporating a dilute tracer dye into the liquid food medium and loading a known volume into each well, absorbance measurements of the well acquired before and after consumption reflect the resulting change in volume (i.e., volume consumed). To enable high throughput analysis with this method, a 3D-printed coupler was designed that allows flies to be sorted individually into 96-well microplates. This device precisely orients 96- and 1536-well microplates to give each fly access to up to 4 wells for consumption, thus enabling food preference quantification in addition to regular consumption. Furthermore, the device has barrier strips that toggle between open and closed positions to allow for controlled containment and release of a column of samples at a time. This method enables high throughput measurements of consumption of aqueous solutions by many flies simultaneously. It also has the potential to be adapted to other insects and to screen consumption of nutrients, toxins, or pharmaceuticals.

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

The microplate feeder assay offers an economical, high throughput method for quantifying liquid food consumption in Drosophila. A 3D-printed device connects a 96-well microplate in which flies are housed to a 1536-well microplate from which flies consume a feeding solution with a tracer dye. The solution volume decline is measured spectrophotometrically.

ショウジョウバエの消費定量化のための高スループットマイクロプレートフィーダアッセイ

Quantifying food intake in Drosophila is used to study the genetic and physiological underpinnings of consumption-associated traits, their environmental ...

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. When selecting sites to deposit their eggs, female flies are capable of ranking the relative attractiveness of their options and choosing the &#34;greater of two goods.&#34; However, most egg-laying preference assays are not practical if one wants to take a systematic genetic screening approach to search for the circuit basis underlying this simple decision-making process, as they are population-based and laborious to set up. To increase the throughput of studying of egg-laying preferences of single females, we developed custom chambers that each can simultaneously assay egg-laying preferences of up to thirty individual flies as well as a protocol that ensures each female has a high egg-laying rate (so that their preference is readily discernable and more convincing). Our approach is simple to execute and produces very consistent results. Additionally, these chambers can be equipped with different attachments to allow video recording the egg-laying animals and to deliver light for optogenetics studies. This article provides the blueprints for fabricating these chambers and the procedure for preparing the flies to be assayed in these chambers.

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

This protocol describes a high throughput assay for testing egg-laying preferences of Drosophila melanogaster at single-animal resolution. This assay provides a simple, efficient, and scalable platform to identify genes and circuit components that control a simple decision-making process.

個々の産卵環境を調べるために、ハイスループットアッセイ<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. ...

神経科学

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We demonstrate a simple way to tap into the fly reward system, modify experiences related to natural reward, and use voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states. The approach serves as a relevant tool to study the neurons and genes that play a role in experience-mediated changes of internal state. The protocol is composed of two discrete parts: exposing the flies to rewarding and nonrewarding experiences, and assaying voluntary ethanol consumption as a measure of the motivation to obtain a drug reward. The two parts can be used independently to induce the modulation of experience as an initial step for further downstream assays or as an independent two-choice feeding assay, respectively. The protocol does not require a complicated setup and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for inducing rewarding and nonrewarding experiences in fruit flies (Drosophila melanogaster) using voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states.

使用して報酬を求める行動の変化を測定するための簡単な方法<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of the right type and quantity of food therefore has a major influence on quality of life. Research on feeding behavior focuses on the underlying processes that ensure actual feeding and unravels the role of factors regulating internal energy homeostasis and the neuronal bases of decision-making. The model organism Drosophila melanogaster, with its great variety of genetically traceable tools for labeling and manipulating single neurons, allows mapping of neuronal networks and identification of molecular signaling cascades involved in the regulation of food intake. This report demonstrates the CApillary FEeder assay (CAFE) and shows how to measure food intake in a group of flies for time spans ranging from hours to days. This easy-to-use assay consists of glass capillaries filled with liquid food that flies can freely access and feed on. Food consumption in the assay is accurately determined using simple measurement tools. Herein we describe step-by-step the method from setup to successful execution of the CAFE assay, and provide practical examples to analyze the food intake of a group of flies under controlled conditions. The reader is guided through possible limitations of the assay, and advantages and disadvantages of the method compared to other feeding assays in D. melanogaster are evaluated.

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

The CApillary FEeder (CAFE) assay is a simple, budget-friendly, highly reliable method for investigating mechanisms underlying food intake. Used with the highly versatile genetic model organism Drosophila melanogaster, it provides a powerful means of gaining new insights into regulatory mechanisms of food intake.

キャピラリーフィーダーアッセイにおいて食物摂取を測定します<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

キイロショウジョウバエ幼虫と大人の脳の代謝解析

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

内脂肪量の生化学的および高スループット微視的評価<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

生物学

Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Foraging and feeding behaviors allow animals to access sources of energy and nutrients essential for their development, health, and fitness. Investigating the neuronal regulation of these behaviors is essential for the understanding of the physiological and molecular mechanisms underlying nutritional homeostasis. The use of genetically tractable animal models such as worms, flies, and fish greatly facilitates these types of studies. In the last decade, the fruit fly Drosophila melanogaster has been used as a powerful animal model by neurobiologists investigating the neuronal control of feeding and foraging behaviors. While undoubtedly valuable, most studies examine adult flies. Here, we describe a protocol that takes advantage of the simpler larval nervous system to investigate neuronal substrates controlling feeding behaviors when larvae are exposed to diets differing in their protein and carbohydrates content. Our methods are based on a quantitative colorimetric no-choice feeding assay, performed in the context of a neuronal thermogenetic-activation screen. As a read-out, the amount of food eaten by larvae over a 1 h interval was used when exposed to one of the three dye-labeled diets that differ in their protein to carbohydrates (P:C) ratios. The efficacy of this protocol is demonstrated in the context of a neurogenetic screen in larval Drosophila, by identifying candidate neuronal populations regulating the amount of food eaten in diets of different macronutrient quality. We were also able to classify and group the genotypes tested into phenotypic classes. Besides a brief review of the currently available methods in the literature, the advantages and limitations of these methods are discussed and, also, some suggestions are provided about how this protocol might be adapted to other specific experiments.

Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Described here is a protocol that enables the colorimetric quantification of the amount of food eaten within a defined interval of time by Drosophila melanogaster larvae exposed to diets of different macronutrient quality. These assays are conducted in the context of a neuronal thermogenetic screen.

ショウジョウバエ幼虫を用いた熱遺伝学的神経細胞スクリーンにおけるマクロ栄養素摂取量の定量化

Foraging and feeding behaviors allow animals to access sources of energy and nutrients essential for their development, health, and fitness. Investigating ...

A Rapid Food-Preference Assay in Drosophila

To select food with nutritional value while avoiding the consumption of harmful agents, animals need a sophisticated and robust taste system to evaluate their food environment. The fruit fly, Drosophila melanogaster, is a genetically tractable model organism that is widely used to decipher the molecular, cellular, and neural underpinnings of food preference. To analyze fly food preference, a robust feeding method is needed. Described here is a two-choice feeding assay, which is rigorous, cost-saving, and fast. The assay is Petri-dish-based and involves the addition of two different foods supplemented with blue or red dye to the two halves of the dish. Then, ~70 prestarved, 2-4-day-old flies are placed in the dish and&#160;allowed to choose between blue and red foods in the dark for about 90 min. Examination of the abdomen of each fly is followed by the calculation of the preference index. In contrast to multiwell plates, each Petri dish takes only ~20 s to fill and saves time and effort. This feeding assay can be employed to quickly determine whether flies like or dislike a particular food.

A Rapid Food-Preference Assay in Drosophila

We present a protocol for a two-choice feeding assay for flies. This feeding assay is fast and easy to run and is suitable not only for small-scale laboratory research, but also for high-throughput behavioral screens in flies.

ショウジョウバエにおける急速な食品嗜好アッセイ

To select food with nutritional value while avoiding the consumption of harmful agents, animals need a sophisticated and robust taste system to evaluate ...

高脂肪食給餌とキイロショウジョウバエの高スループット Triacylglyceride 試金

要約

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この動画の章

キイロショウジョウバエで優しく誘導運動されて: インターバルトレーニングのプロトコル

定量的食物摂取の試金を組み合わせると強制的にショウジョウバエの食欲を勉強するニューロンを活性化

ショウジョウバエの消費定量化のための高スループットマイクロプレートフィーダアッセイ

個々の産卵環境を調べるために、ハイスループットアッセイ

使用して報酬を求める行動の変化を測定するための簡単な方法

キャピラリーフィーダーアッセイにおいて食物摂取を測定します

キイロショウジョウバエ幼虫と大人の脳の代謝解析

内脂肪量の生化学的および高スループット微視的評価

ショウジョウバエ幼虫を用いた熱遺伝学的神経細胞スクリーンにおけるマクロ栄養素摂取量の定量化

ショウジョウバエにおける急速な食品嗜好アッセイ

高脂肪食給餌とキイロショウジョウバエの高スループット Triacylglyceride 試金

要約

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キイロショウジョウバエで優しく誘導運動されて: インターバル トレーニングのプロトコル

定量的食物摂取の試金を組み合わせると強制的にショウジョウバエの食欲を勉強するニューロンを活性化

ショウジョウバエの消費定量化のための高スループットマイクロプレートフィーダアッセイ

個々の産卵環境を調べるために、ハイスループットアッセイ

使用して報酬を求める行動の変化を測定するための簡単な方法

キャピラリーフィーダーアッセイにおいて食物摂取を測定します

キイロショウジョウバエ幼虫と大人の脳の代謝解析

内脂肪量の生化学的および高スループット微視的評価

ショウジョウバエ幼虫を用いた熱遺伝学的神経細胞スクリーンにおけるマクロ栄養素摂取量の定量化

ショウジョウバエにおける急速な食品嗜好アッセイ

キイロショウジョウバエで優しく誘導運動されて: インターバルトレーニングのプロトコル