Name: high fat diet feeding and high throughput triacylglyceride assay in drosophila melanogaster
Uploaded: 2017-09-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
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Gostaríamos de agradecer a Erika Taylor para edição deste manuscrito. Este trabalho foi financiado por subvenções provenientes do National Institutes of Health (P01 HL098053, P01 AG033561 e HL054732 R01) de R.B., um suplemento de investigação pós-doutoramento (R01 HL085481) e companheirismo (AAUW) para S.B.D., concessões e da associação americana do coração para S.B.D. e RGB

1. HFD alimentação protocolo <img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/56029/56029table1.jpg" /> tabela 1. Receita de comida de mosca. 
Esta tabela resume os diferentes ingredientes usados para preparar nosso controle alimentar. Uma vez feita, 10 mL do alimento é vertido em frascos, refrigerado e estocado a 4 ° C para armazenamento a longo prazo.
<ol><li>Preparação HFD <ol><li>para fazer 1 kg de alimento gordo alto, pesa 700 g de comida de mosca normal pre-feita (ver tabela 1) e 300 g de óleo de coco em dois recipientes separados usando uma balança analítica.</li>
		<li>Calor cada recipiente individualmente no microondas, até que o conteúdo derrete completamente. Despeje o óleo de coco o recipiente de alimento de voar. Mexa com um batedor até que o óleo é bem misturado a comida da mosca. 
		Nota: Não há pedaços de comida ou óleo devem ser visíveis. Quando a comida de mosca está derretendo no microondas, parar em intervalos de 1 minuto para misturar os alimentos e evitar ferver.</li>
		<li>Re-pesar o alimento de gordura alto. Se o peso total é inferior a 1 kg (700 g de comida + 300 g de óleo de coco), adicionar água (cerca de 10 mL) para compensar a evaporação durante o aquecimento e para trazer de volta o peso de 1 kg...</li>
		<li>Pour cerca de 10 mL bem misturado alta gordura comida por frasco (cerca de 25% do volume do frasco). Em seguida, cubra com gaze para evitar moscas &#39; contaminação. Deixe esfriar por 1h à temperatura ambiente, em seguida, transferir os frascos a 4 ° C para armazenamento acima de 4 semanas. 
		Nota: A comida Normal (NF) é usada como um alimento de controle. Também despeje 10 mL (cerca de 25% do volume do frasco) de NF por frasco. Para a comida HFD, substitua 30% da comida NF com óleo de coco. Para controle e condições experimentais, as moscas receberam a mesma quantidade de NF e HFD (10ml de comida por frasco).</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56029/56029fig1.jpg" /> Figura 1 . HFD alimentação em Drosophila. 
O esquema mostra as diferentes etapas de alimentação para as moscas em um alimento de controle (dieta normal sem adição de óleo de coco-NF) ou HFD (com a adição de óleo de coco). O processo todo leva 10 dias após a coleta inicial de moscas adultas. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56029/56029fig1large.jpg" target="_blank"> clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol start="2"> <li>HFD alimentação de d. melanogaster Nota: Este protocolo inclui controle alimentar e HFD alimentando os procedimentos que são compatíveis com qualquer linha de voar. Controle e experimentais moscas são colocadas em frascos contendo a mesma comida de quantidade (NF ou HFD).
	<ol><li>Uso de CO 2 para anestesiar moscas. 
		Nota: Para os neófitos, por favor leia referência 21 para uma visão geral sobre criação e manipulação de d. melanogaster.</li>
		<li>Recolher 0-5 moscas dia velho de frascos e transferência (lançando) as moscas em novos frascos contendo NF (previamente aquecido à temperatura ambiente). Deixe a idade de moscas por 5 dias adicionais no 21 ° C.</li>
		<li>No final dos 5 dias, retire os frascos que contêm HFD e NF de 4 ° C. 
		Nota: como temperaturas frias podem salientar vivos moscas, deixe os frascos descansar por 30 min à temperatura ambiente para se aquecer antes de usar.</li>
		<li>Usando lenços, limpar e remover o excesso de líquido dos lados dos frascos.</li>
		<li>Inserir um pequeno pedaço de papel de filtro, sobre 1 cm x 3 cm, a comida da alta gorda para absorver todo o líquido excedente. 
		Nota: Este passo é essencial para prevenir as moscas de degola para a comida HFD.</li>
		<li>Em seguida, transferir as moscas sobre os alimentos de alta gordura (lançando). Colocar os frascos horizontalmente do lado deles, (não permanente) em 21-22 ° C durante 5 dias. 
		Nota: Evite temperaturas mais altas, como isto pode parcialmente derreter a comida gorda alta, fazendo com que as moscas manter os alimentos e morrer.</li>
		<li>Depois de 5 dias, transferir (lançando) as moscas de NF e HFD dentro dos frascos de novos sem comida para permitir que a sua coragem de vazio durante 30 min. Em seguida, proceder à pesagem moscas. 
		Nota: Uma das etapas críticas neste HFD protocolo de alimentação é preparar um HFD bem misturado, livre de quaisquer pedaços de comida de mosca ou óleo condensado. Mistura homogênea e refrigerar o HFD 45-30 ° c é aconselhável, antes de derramar dentro dos frascos e armazenar os alimentos na idade adequada de 4 ° C. correspondência de controle e experimentais moscas é importante, assim como prior de condições nutricionais e ambientais controladas para a alimentação de HFD. Durante a fase de alimentação, controle e experimentais moscas devem ser dada a mesma quantidade de NF e HFD. Nunca colete moscas de superlotadas frascos ou garrafas (para evitar efeitos de transgeracional). Sempre coloque um máximo de 25 moscas por frasco durante NF e HFD alimentação para evitar restrição dietética ou outros efeitos crowding. O HFD é composto de 30% de óleo de coco, assim, temperaturas acima de 22 ° C parcialmente podem derreter o HFD, fazendo com que as moscas enfiar a comida oleosa e morrer. Antes de colocar as moscas o HFD, limpe os frascos para remover qualquer resíduo de óleo e inserir um filtro de papel para absorver qualquer excesso de líquido no alimento. Durante a incubação das moscas em HFD, os frascos são colocados em seus lados para fornecer uma superfície horizontal sem gordura para as moscas.</li>
	</ol></li> <li>Pesando as moscas <ol><li>para cada genótipo e gênero a ser testado, usar uma escala ultra sensível para registrar os pesos de tubos de vazio, previamente rotulado 1,7 mL.</li>
		<li>Usando anestésico voar ou CO 2, anestesiar e recolher 36 moscas com o mesmo genótipo, sexo, e alimentar o status com um pincel em um pre-pesava 1.7 tubo mL.</li>
		<li>Pesa o tubo contendo moscas com a mesma escala ultra-sensíveis.</li>
		<li>Determinar o peso médio de voar esta fórmula a seguir: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56029/56029eq1.jpg" /> Nota: O número de moscas neste protocolo é 36.</li>
		<li>Flash congela os tubos de 1,7 mL contendo moscas por mergulhar no nitrogênio líquido por 2 min. coletar e colocar os tubos em caixas. Em seguida, transferir as caixas a-80 ° C (temperatura preferível) para o armazenamento até o uso com o ensaio de TAG. 
		Atenção: O nitrogênio líquido é a temperatura extremamente baixa. Por favor, use equipamento de proteção pessoal apropriado.</li>
	</ol></li></ol> 2. TAG ensaio <ol><li>preparação das concentrações padrão TAG <ol><li>preparar 500 mL de PBT (PBS 1x, 0.05% Triton).</li>
		<li>Usando tubos de 0,5 mL e a solução de TAG (Tabela de materiais), preparam-se 100 µ l de espaço em branco (apenas PBT) e 100 µ l de seis concentrações de TAG padrão (2 µ g / µ l; 1 µ g / µ l; 0,5 µ g / µ l; 0,25 µ g / µ l; 0,125 µ g / µ l; 0.0625 µ g / µ l) com o PBT.</li>
		<li>Coloque os tubos no gelo e prosseguir com as moscas de moedura.</li>
	</ol></li> <li>Moagem as moscas <ol><li>tirar as moscas congeladas de-80 ° C (etapa 1.3). Transferir os tubos contendo as moscas no gelo</li>
		<li>Primeiro, coloque o metal de 2 milímetros, bolas de moagem em um dispensador de bola 96 poços, use um pincel pequeno para remover bolas extras.</li>
		Placa de <li>lugar da moagem de 96 poços de cabeça para baixo em cima do dispensador de bola e flip transferir as bolas de metal directamente para a placa de moedura. Deve haver uma bola por alvéolo.</li>
		<li>Usando uma pipeta multicanal, adicionar 600 µ l de PBT em cada linha da placa de 96 poços moedura.</li>
		<li>Com fórceps, adicionar 3 voa por bem. Indicar a condição de genótipo, sexo e comida das moscas em cada linha/poço da placa de 96 poços moedura.</li>
		<li>Firmemente Coloque as tampas para a placa de moedura de 96 poços. Fita pode ser colocada na parte superior para assegurar que não há nenhum escapamento.</li>
		<li>, Corretamente, colocar as placas de 96 poços moagem para a máquina de moer. Ajuste a máquina para a velocidade mais alta e pressione &#34; executar &#34; para moer as moscas por 3 min.</li>
		<li>Após 3 min, parar a moagem e proceder com centrifugação de placa: centrifuGE para 15 min a 4.000 x g, 4 ° C. Após a centrifugação, gerenciar a placa de moedura cuidadosamente para evitar misturar o sobrenadante com a pelota.</li>
	</ol></li> <li>Carregamento de amostra e determinação de conteúdo de TAG <ol><li>tomar uma nova placa de 96 poços Espectrofotômetro. Usando uma pipeta multicanal, carregar 200 µ l de reagente a TAG em cada linha da placa.</li>
		<li>Carga 20 µ l de PBT dentro do primeiro poço da primeira linha, para criar um espaço em branco. Misture pipetando para cima e para baixo. Evitar a formação de bolhas.</li>
		Poços de <li>carga 20 µ l de cada diluição padrão (da etapa 2.1.2) para o restante da primeira linha e mistura pipetando para cima e para baixo. Evitar a formação de bolhas.</li>
		<li>Usando uma pipeta multicanal, transferência de 20 µ l do sobrenadante de cada linha da placa de moagem para a linha correspondente da placa de 96 poços Espectrofotômetro. Pipete para cima e para baixo para misturar bem. Evitar a formação de bolhas.</li>
		<li>Em seguida, coloque uma folha de gás-permeável sobre a parte superior da placa de 96 poços.</li>
		<li>Incubar a placa a 37 ° C durante 10 min. 
		Nota: Se houver bolhas nos poços, centrifugar a placa por 2 min a 2.000 x g para remover todas as bolhas. A presença de bolhas irá interferir com a leitura de absorvância.</li>
		<li>Leia a absorvância de cada poço da placa em 550 nm, utilizando um leitor de microplacas compatível. Em seguida, traçar a curva-padrão e determinar a concentração [µ g / µ l] das amostras desconhecidas.</li>
		<li>Para determinar a quantidade de conteúdo da marca por médio peso mosca, use a seguinte fórmula: 
		<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56029/56029eq2.jpg" /> Nota: neste protocolo, 3 moscas foram picadas em 600 µ l de PBT; em consequência, o volume médio por mosca é 200 µ l.</li>
	</ol></li> <li>Ensaio de Bradford e normalização de conteúdo da marca com conteúdo de proteína <ol><li>preparar sete 100 µ l de albumina de soro bovino (BSA) padrão diluições (75 µ g/mL; 100 µ g/mL; 150 µ g/mL, 200 µ g/mL; 250 µ g/mL; 500 µ g/mL; 1.000 µ g/mL) com o PBT.</li>
		<li>Tomar uma nova placa de 96 poços e carregar 200 µ l de reagente de Bradford X 1 em cada linha da placa.</li>
		<li>No primeiro bem de primeira linha, adicionar 10 µ l de PBT para criar um espaço em branco. Misture pipetando para cima e para baixo. Evitar a formação de bolhas.</li>
		Poços de <li>Adicionar 10 µ l de cada diluição padrão para o restante da primeira linha e mistura pipetando para cima e para baixo. Evitar a formação de bolhas.</li>
		<li>Usando uma pipeta multicanal, transferir 10 µ l do sobrenadante a mosca de cada linha da placa de moagem para a linha correspondente da placa de 96 poços. Pipete para cima e para baixo para misturar bem. Evitar a formação de bolhas.</li>
		<li>Colocar uma película permeável ao gás por cima da placa de 96 poços.</li>
		<li>Incube a placa na temperatura de quarto por 5 min. Se houver bolhas nos poços, centrifugar a placa por 2 min a 2.000 x g para removê-los. 
		Nota: A presença de bolhas irá interferir com a leitura de absorvância.</li>
		<li>Uso de um espectrofotômetro para ler a absorbância do branco, padrões e amostras desconhecidas em 595 nm. Use a curva padrão para determinar as concentrações [µ g / µ l] das amostras em cada linha.</li>
		<li>Normalizar a TAG conteúda com nível de proteína usando a seguinte fórmula: 
		<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56029/56029eq3.jpg" /></li></ol></li></ol>

<ol>
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Os autores não têm nada para divulgar.

Indução de obesidade em ratos pode levar meses19,20. Nas moscas, este HFD alimentando o protocolo permite a indução de acúmulo de gordura em excesso em questão de dias ou menos, causando aumentos no acúmulo de gordura somente após 18 h (ver Figura 2). HFD alimentando com o protocolo descrito aumenta o conteúdo de glicose 12 e Bmm lipase e PGC-1 expressão24. Isto está...

Estamos em um tempo onde a obesidade e seus associados encargos económicos, é um problema mundial1. Dois em cada três americanos estão com sobrepeso ou obesos com patologias do coração relacionadas, a principal causa de morte dentro da população adulta2. Novos métodos eficientes são necessários para investigar adequadamente os componentes genéticos e moleculares implicados na regulação da síndrome metabólica, usando organismos modelo. Por esta razão, nós escolhemos o mosca de fruta Drosophila modelo porque ele compartilha os processos biológicos mais básicos com mamíferos, incluindo ratos e seres humanos3,4,5,6. Genoma de drosophilaé altamente conservadas durante a evolução, mas no geral é muito menor com menos duplicação de genes e complexidade metabólica, tornando-a ideal para compreender os mecanismos fundamentais implicados em muitas doenças humanas4 , 7 , 8. Além disso, característico de processos realizados pelo tecido adiposo, intestino e pâncreas são representados na mosca e mediar funções reguladoras no metabolismo glicose e lipídios, por exemplo, que são semelhantes aos seres humanos9, 10,11. Além disso, as vias moleculares básicas envolvidos no controle da obesidade, resistência à insulina e diabetes em seres humanos são funcionalmente conservadas em Drosophila melanogaster12,13,14 , 15 , 16. como organismos superiores, Drosophila tem um coração que é formado durante o desenvolvimento de processos semelhantes do coração dos mamíferos3,17. Assim, o desenvolvimento de um confiável HFD alimentação protocolo e ensaio de TAG alto throughput, adaptado para fins de triagem eficiente usando a caixa de ferramenta genética da Drosophila, fornecem um meio importante para estudar e entender a base genética fundamental doenças metabólicas complexas subjacentes.
O próprio alimento HFD é feito a partir de um alimento mosca de laboratório padrão suplementado com óleo de coco, que é composto principalmente de ácidos graxos saturados, conhecidos por ser associado com a síndrome metabólica18. Enquanto induzir obesidade em modelos de mamíferos, como roedores, pode levar meses19,20, nosso HFD otimizado protocolo de alimentação em Drosophila eficazmente e reproducibly aumenta a gordura em questão de dias12,14. Este protocolo, em conjunto com um ensaio de alto throughput TAG, permite eficiente triagem em massa para os efeitos de fatores genéticos, influências ambientais e candidatos a fármacos para descobrir novos moduladores do metabolismo das gorduras. Em consequência, estes protocolos são prováveis relevantes para entender e/ou combater a obesidade e patologias humanas associadas a obesidade.
O protocolo de alimentação é versátil e pode ser aplicado para estudar os efeitos metabólicos e funcionais do único de ácidos gordos saturados ou insaturados. O uso deste teste de TAG de alta taxa de transferência não está limitado a d. melanogaster, mas pode ser adaptado a uma variedade de organismos modelo pequeno com cutícula ou matrizes extracelulares duros (por exemplo, outras espécies de Drosophila , c. elegans e outros emergentes organismos invertebrados modelo) para medir o teor de gordura em diferentes condições ambientais, genéticas ou fisiológicas, em qualquer fase de desenvolvimento, maturidade ou fase da doença metabólica. O ensaio de TAG é baseado em uma medição colorimétrica de uma série de reações enzimáticas que degradam as TAGs em ácidos graxos livres, glicerol, o glicerol-3-fosfato e finalmente H2O2 , que reage com 4-aminoantipyrine (4-AAP) e 3,5- dicloro-2-hidroxibenzeno sulfonato (3,5 DHBS) para produzir um produto de cor vermelho que é medido utilizando um Espectrofotômetro de 96 poços.

<table><tbody><tr><td>Talboys Ball dropper/bead Dispenser</td><td>Talboys</td><td>#: 930150</td><td></td></tr><tr><td>Talboys High Throughput Homogenizer</td><td>Talboys</td><td>#: 930145</td><td></td></tr><tr><td>Grinding Balls, Stainless Steel&amp;nbsp;</td><td>OPS Diagnostics, LLC</td><td># GBSS 156-5000-01</td><td>5000 balls</td></tr><tr><td>Masterblock 96 Well deep Microplates</td><td>Greiner Bio-One</td><td># T-3058-1</td><td>case of 80 plates</td></tr><tr><td>Greiner&amp;nbsp; 96 well microplate flat bottom</td><td>Sigma Aldrich</td><td># M4436</td><td>40 plates</td></tr><tr><td>Greiner CapMat for sealing multiwell plates</td><td>Sigma Aldrich</td><td># C3606</td><td>50 sealing plates</td></tr><tr><td>Reagent Reservoirs&amp;nbsp;</td><td>Thomas Scientific</td><td># 1192T71</td><td>12/PK</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Finnpipette 4661040</td><td>Thermo Scientific</td><td># 4661040</td><td>1-10 ul multipipette</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Finnpipette 4661070</td><td>Thermo Scientific</td><td># 4661070</td><td>30-300ul multipipette</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Finnpipette 4661020</td><td>Thermo Scientific</td><td>#4661020</td><td>10-100ul multipipette</td></tr><tr><td>Multichannel tips</td><td>Denville Scientific Inc</td><td># P3131-S</td><td>for 10 uL pipette</td></tr><tr><td>Multichannel tips</td><td>Denville Scientific Inc</td><td># P3133-S</td><td>for 200 uL pipette</td></tr><tr><td>Multichannel tips</td><td>Denville Scientific Inc</td><td>#P1125</td><td>for 100 uL pipette</td></tr><tr><td>Forceps&amp;nbsp;</td><td>Roboz Surgical</td><td># 5 Dumonts</td><td>Super fine forceps</td></tr><tr><td>Mettler Toledo Excellence XS Analytical Balance Mfr# XS64</td><td>Cole-Parmer scientific experts</td><td># EW-11333-00</td><td></td></tr><tr><td>Metler Toledo Excellence XS Toploading Balance</td><td>Cole-Parmer scientific experts</td><td># EW-11333-49</td><td></td></tr><tr><td>96-Well microplate Centrifuge</td><td>Hettich Zentrifugen</td><td># Rotina 420R</td><td></td></tr><tr><td>Microplate Reader</td><td>Molecular devices</td><td># SpectraMax 190</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Line Bench Top Orbit Environ Shaker Incubator</td><td>Biostad</td><td># 3527</td><td></td></tr><tr><td>Infinity Triglycerides reagent</td><td>Thermo Scientific</td><td># TR22421</td><td></td></tr><tr><td>Triglyceride Standard</td><td>Stanbio</td><td>#2103 - 030</td><td></td></tr><tr><td>Quick Start Bradford Protein Assay</td><td>Bio-RAD</td><td># 500-0205</td><td>1x dye Reagent</td></tr><tr><td>Coconut oil</td><td>Nutiva</td><td># 692752200014</td><td>15 0z jar</td></tr><tr><td>PBS 10X</td><td>Thermo Scientific</td><td># AM9625</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td># 9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Gas-permeable Foil</td><td>Macherey-Nagel</td><td># 740675</td><td>50 pieces</td></tr><tr><td>filter Paper</td><td>VWR</td><td># 28317-241</td><td>Pack of 100</td></tr><tr><td>Drosophila vials</td><td>Genesee Scientific</td><td>Cat #: 32-116SB</td><td></td></tr><tr><td>Quick Start Bovine Serum Albumin Standard</td><td>Bio-Rad</td><td># 5000206</td><td></td></tr><tr><td>FlyNap Anesthetic</td><td>Carolina</td><td># 173025</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Kimwipes Low-Lint</td><td>Uline</td><td># S-8115</td><td>1-Ply, 4.4 x 8.4&quot;</td></tr></tbody></table>

high fat diet feeding and high throughput triacylglyceride assay in drosophila melanogaster

Doença cardíaca é a principal causa de morte humana no mundo. Numerosos estudos têm demonstrado forte ligação entre obesidade e mau funcionamento cardíaco em humanos, mas mais ferramentas e esforços de pesquisa são necessários para melhor elucidar os mecanismos envolvidos. Para mais de um século, o modelo geneticamente altamente tratável de Drosophila tem sido fundamental na descoberta de genes-chave e vias moleculares que provou ser altamente conservadas em toda a espécie. Muitos processos biológicos e mecanismos de doença são funcionalmente conservados na mosca, como desenvolvimento (por exemplo, plano de corpo, coração), câncer e doenças neurodegenerativas. Recentemente, o estudo da obesidade e patologias secundárias, tais como doença em organismos-modelo, tem desempenhado um papel altamente crítico na identificação dos principais reguladores envolvidos na síndrome metabólica em seres humanos.
Aqui, propomos usar esse organismo modelo como uma ferramenta eficiente para induzir a obesidade, ou seja, acumulação excessiva de gordura e desenvolver um protocolo eficiente para monitorar o teor de gordura sob a forma de acumulação de TAGs. Além de altamente conservadas, mas menos complexo genoma, a mosca também tem uma vida curta para a experimentação rápida, combinada com a relação custo-eficácia. Este artigo fornece um protocolo detalhado para a alimentação de alta gordura dieta (HFD) em Drosophila para induzir a obesidade e um ensaio de triacilglicerol (TAG) de alto rendimento para medir o associado aumento no teor de gordura, com o objectivo de ser altamente reprodutível e eficiente para rastreio genético ou químico em larga escala. Estes protocolos oferecem novas oportunidades para eficientemente investigar mecanismos reguladores envolvidos na obesidade, bem como fornecer uma plataforma padronizada para a pesquisa de descoberta de drogas para testes rápidos do efeito de candidatos da droga sobre o desenvolvimento ou prevenção da obesidade, diabetes e doenças metabólicas associadas.

No d. melanogaster, como é o caso com outras espécies, existe dimorfismo sexual entre machos e fêmeas,22. É sabido que as fêmeas são maiores, com mais gordura em seus abdomens, do que os machos22. Para testar a eficácia do nosso protocolo, realizamos ensaios de TAG para determinar as diferenças de conteúdo da marca entre machos e fêmeas de sua padrão de laboratório (w1118) voa. Os dados mostram que as...

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High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Dieta de alta gordura alimentar e ensaio de triacilglicerol alto Throughput em Drosophila Melanogaster.

Esta é uma dieta de alta gordura protocolo para induzir obesidade em Drosophila, um modelo para a compreensão fundamental molecular os mecanismos implicados na lipotoxicity de alimentação. Ele também fornece um ensaio de triacilglicerol alto throughput para medir o acúmulo de gordura em Drosophila e potencialmente outros modelos (insetos) sob diferentes condições de dieta, ambientais, genéticas ou fisiológicas.

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

high-fat-diet-feeding-high-throughput-triacylglyceride-assay

Research

JoVE Journal

Genetics

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

11.2K visualizações.  Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute. Esta é uma dieta de alta gordura protocolo para induzir obesidade em Drosophila, um modelo para a compreensão fundamental molecular os mecanismos implicados na lipotoxicity de alimentação. Ele também fornece um ensaio de triacilglicerol alto throughput para medir o acúmulo de gordura em Drosophila e potencialmente outros modelos (insetos) sob diferentes condições de dieta, ambientais, genéticas ou fisiológicas.

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The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

The incidence of complex metabolic diseases has increased as a result of a widespread transition towards lifestyles of increased caloric intake and lowered activity levels. These multifactorial diseases arise from a combination of genetic, environmental, and behavioral factors. One such complex disease is Metabolic Syndrome (MetS), which is a cluster of metabolic disorders, including hypertension, hyperglycemia, and abdominal obesity. Exercise and dietary intervention are the primary treatments recommended by doctors to mitigate obesity and its subsequent metabolic diseases. Exercise intervention, in particular aerobic interval training, stimulates favorable changes in the common risk factors for Type 2 Diabetes Mellitus (T2DM), Cardiovascular Disease (CVD), and other conditions. With the influx of evidence describing the therapeutic effect exercise has on metabolic health, establishing a system that models exercise in a controlled setting provides a valuable tool for assessing the effects of exercise in an experimental context. Drosophila melanogaster is a great tool for investigating the physiological and molecular changes that result from exercise intervention. The flies have short lifespans and similar mechanisms of metabolizing nutrients when compared to humans. To induce exercise in Drosophila, we developed a machine called the TreadWheel, which utilizes the fly&#39;s innate, negative geotaxis tendency to gently induce climbing. This enables researchers to perform experiments on large cohorts of genetically diverse flies to better understand the genotype-by-environment interactions underlying the effects of exercise on metabolic health.

The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

The TreadWheel uses rotational motion to gently induce exercise in adult Drosophila melanogaster by exploiting flies&#39; innate, negative geotaxis. It allows for analysis of the interactions between exercise and factors, such as genotype, sex, and diet, and their effect on physiological and molecular assays to assess metabolic health.

A TreadWheel: Protocolo de treinamento de intervalo para suavemente induzido por exercício em Drosophila melanogaster.

The incidence of complex metabolic diseases has increased as a result of a widespread transition towards lifestyles of increased caloric intake and ...

Genética

Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila

Food consumption is under the tight control of the brain, which integrates the physiological status, palatability, and nutritional contents of the food, and issues commands to start or stop feeding. Deciphering the processes underlying the decision-making of timely and moderate feeding carries major implications in our understanding of physiological and psychological disorders related to feeding control. Simple, quantitative, and robust methods are required to measure the food ingestion of animals after experimental manipulation, such as forcibly increasing the activities of certain target neurons. Here, we introduced dye-labeling-based feeding assays to facilitate the neurogenetic study of feeding control in adult fruit flies. We review available feeding assays, and then describe our methods step-by-step from setup to analysis, which combine thermogenetic and optogenetic manipulation of neurons controlling feeding motivation with dye-labeled food intake assay. We also discuss the advantages and limitations of our methods, compared with other feeding assays, to help readers choose an appropriate assay.

Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila

Quantitative food-intake assays with dyed food provide a robust and high-throughput means to evaluate feeding motivation. Combining the food consumption assay with thermogenetic and optogenetic screens is a powerful approach to investigate the neural circuits underlying appetite in adult Drosophila melanogaster.

Combinando os ensaios quantitativos de ingestão de alimentos e forçosamente, ativando os neurônios para estudar o apetite em Drosophila

Food consumption is under the tight control of the brain, which integrates the physiological status, palatability, and nutritional contents of the food, ...

Comportamento

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

Quantifying food intake in Drosophila is used to study the genetic and physiological underpinnings of consumption-associated traits, their environmental factors, and the toxicological and pharmacological effects of numerous substances. Few methods currently implemented are amenable to high throughput measurement. The Microplate Feeder Assay (MFA) was developed for quantifying the consumption of liquid food for individual flies using absorbance. In this assay, flies consume liquid food medium from select wells of a 1536-well microplate. By incorporating a dilute tracer dye into the liquid food medium and loading a known volume into each well, absorbance measurements of the well acquired before and after consumption reflect the resulting change in volume (i.e., volume consumed). To enable high throughput analysis with this method, a 3D-printed coupler was designed that allows flies to be sorted individually into 96-well microplates. This device precisely orients 96- and 1536-well microplates to give each fly access to up to 4 wells for consumption, thus enabling food preference quantification in addition to regular consumption. Furthermore, the device has barrier strips that toggle between open and closed positions to allow for controlled containment and release of a column of samples at a time. This method enables high throughput measurements of consumption of aqueous solutions by many flies simultaneously. It also has the potential to be adapted to other insects and to screen consumption of nutrients, toxins, or pharmaceuticals.

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

The microplate feeder assay offers an economical, high throughput method for quantifying liquid food consumption in Drosophila. A 3D-printed device connects a 96-well microplate in which flies are housed to a 1536-well microplate from which flies consume a feeding solution with a tracer dye. The solution volume decline is measured spectrophotometrically.

Um ensaio alimentador de microplaco de alta produtividade para quantificação do consumo em Drosophila

Quantifying food intake in Drosophila is used to study the genetic and physiological underpinnings of consumption-associated traits, their environmental ...

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. When selecting sites to deposit their eggs, female flies are capable of ranking the relative attractiveness of their options and choosing the &#34;greater of two goods.&#34; However, most egg-laying preference assays are not practical if one wants to take a systematic genetic screening approach to search for the circuit basis underlying this simple decision-making process, as they are population-based and laborious to set up. To increase the throughput of studying of egg-laying preferences of single females, we developed custom chambers that each can simultaneously assay egg-laying preferences of up to thirty individual flies as well as a protocol that ensures each female has a high egg-laying rate (so that their preference is readily discernable and more convincing). Our approach is simple to execute and produces very consistent results. Additionally, these chambers can be equipped with different attachments to allow video recording the egg-laying animals and to deliver light for optogenetics studies. This article provides the blueprints for fabricating these chambers and the procedure for preparing the flies to be assayed in these chambers.

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

This protocol describes a high throughput assay for testing egg-laying preferences of Drosophila melanogaster at single-animal resolution. This assay provides a simple, efficient, and scalable platform to identify genes and circuit components that control a simple decision-making process.

High Throughput Ensaio para examinar Preferências de postura de Pessoa<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. ...

Neurociência

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We demonstrate a simple way to tap into the fly reward system, modify experiences related to natural reward, and use voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states. The approach serves as a relevant tool to study the neurons and genes that play a role in experience-mediated changes of internal state. The protocol is composed of two discrete parts: exposing the flies to rewarding and nonrewarding experiences, and assaying voluntary ethanol consumption as a measure of the motivation to obtain a drug reward. The two parts can be used independently to induce the modulation of experience as an initial step for further downstream assays or as an independent two-choice feeding assay, respectively. The protocol does not require a complicated setup and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for inducing rewarding and nonrewarding experiences in fruit flies (Drosophila melanogaster) using voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states.

Uma maneira simples para medir alterações na Recompensa comportamento de busca Usando<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of the right type and quantity of food therefore has a major influence on quality of life. Research on feeding behavior focuses on the underlying processes that ensure actual feeding and unravels the role of factors regulating internal energy homeostasis and the neuronal bases of decision-making. The model organism Drosophila melanogaster, with its great variety of genetically traceable tools for labeling and manipulating single neurons, allows mapping of neuronal networks and identification of molecular signaling cascades involved in the regulation of food intake. This report demonstrates the CApillary FEeder assay (CAFE) and shows how to measure food intake in a group of flies for time spans ranging from hours to days. This easy-to-use assay consists of glass capillaries filled with liquid food that flies can freely access and feed on. Food consumption in the assay is accurately determined using simple measurement tools. Herein we describe step-by-step the method from setup to successful execution of the CAFE assay, and provide practical examples to analyze the food intake of a group of flies under controlled conditions. The reader is guided through possible limitations of the assay, and advantages and disadvantages of the method compared to other feeding assays in D. melanogaster are evaluated.

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

The CApillary FEeder (CAFE) assay is a simple, budget-friendly, highly reliable method for investigating mechanisms underlying food intake. Used with the highly versatile genetic model organism Drosophila melanogaster, it provides a powerful means of gaining new insights into regulatory mechanisms of food intake.

O capilar alimentador ensaio mede ingestão alimentar em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

Análise metabólica do melanogaster da drosófila Larval e adulto cérebros

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

Bioquímica e Alto Rendimento Avaliação microscópica de massa gorda em<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

Biologia

Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Foraging and feeding behaviors allow animals to access sources of energy and nutrients essential for their development, health, and fitness. Investigating the neuronal regulation of these behaviors is essential for the understanding of the physiological and molecular mechanisms underlying nutritional homeostasis. The use of genetically tractable animal models such as worms, flies, and fish greatly facilitates these types of studies. In the last decade, the fruit fly Drosophila melanogaster has been used as a powerful animal model by neurobiologists investigating the neuronal control of feeding and foraging behaviors. While undoubtedly valuable, most studies examine adult flies. Here, we describe a protocol that takes advantage of the simpler larval nervous system to investigate neuronal substrates controlling feeding behaviors when larvae are exposed to diets differing in their protein and carbohydrates content. Our methods are based on a quantitative colorimetric no-choice feeding assay, performed in the context of a neuronal thermogenetic-activation screen. As a read-out, the amount of food eaten by larvae over a 1 h interval was used when exposed to one of the three dye-labeled diets that differ in their protein to carbohydrates (P:C) ratios. The efficacy of this protocol is demonstrated in the context of a neurogenetic screen in larval Drosophila, by identifying candidate neuronal populations regulating the amount of food eaten in diets of different macronutrient quality. We were also able to classify and group the genotypes tested into phenotypic classes. Besides a brief review of the currently available methods in the literature, the advantages and limitations of these methods are discussed and, also, some suggestions are provided about how this protocol might be adapted to other specific experiments.

Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Described here is a protocol that enables the colorimetric quantification of the amount of food eaten within a defined interval of time by Drosophila melanogaster larvae exposed to diets of different macronutrient quality. These assays are conducted in the context of a neuronal thermogenetic screen.

Quantificação da ingestão de Macronutrientes em uma Tela Neuronal Termogenética usando Larvas de Drosophila

Foraging and feeding behaviors allow animals to access sources of energy and nutrients essential for their development, health, and fitness. Investigating ...

A Rapid Food-Preference Assay in Drosophila

To select food with nutritional value while avoiding the consumption of harmful agents, animals need a sophisticated and robust taste system to evaluate their food environment. The fruit fly, Drosophila melanogaster, is a genetically tractable model organism that is widely used to decipher the molecular, cellular, and neural underpinnings of food preference. To analyze fly food preference, a robust feeding method is needed. Described here is a two-choice feeding assay, which is rigorous, cost-saving, and fast. The assay is Petri-dish-based and involves the addition of two different foods supplemented with blue or red dye to the two halves of the dish. Then, ~70 prestarved, 2-4-day-old flies are placed in the dish and&#160;allowed to choose between blue and red foods in the dark for about 90 min. Examination of the abdomen of each fly is followed by the calculation of the preference index. In contrast to multiwell plates, each Petri dish takes only ~20 s to fill and saves time and effort. This feeding assay can be employed to quickly determine whether flies like or dislike a particular food.

A Rapid Food-Preference Assay in Drosophila

We present a protocol for a two-choice feeding assay for flies. This feeding assay is fast and easy to run and is suitable not only for small-scale laboratory research, but also for high-throughput behavioral screens in flies.

Um ensaio rápido de preferência alimentar em Drosophila

To select food with nutritional value while avoiding the consumption of harmful agents, animals need a sophisticated and robust taste system to evaluate ...

Dieta de alta gordura alimentar e ensaio de triacilglicerol alto Throughput em Drosophila Melanogaster.

Resumo

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A TreadWheel: Protocolo de treinamento de intervalo para suavemente induzido por exercício em Drosophila melanogaster.

Combinando os ensaios quantitativos de ingestão de alimentos e forçosamente, ativando os neurônios para estudar o apetite em Drosophila

Um ensaio alimentador de microplaco de alta produtividade para quantificação do consumo em Drosophila

High Throughput Ensaio para examinar Preferências de postura de Pessoa

Uma maneira simples para medir alterações na Recompensa comportamento de busca Usando

O capilar alimentador ensaio mede ingestão alimentar em

Análise metabólica do melanogaster da drosófila Larval e adulto cérebros

Bioquímica e Alto Rendimento Avaliação microscópica de massa gorda em

Quantificação da ingestão de Macronutrientes em uma Tela Neuronal Termogenética usando Larvas de Drosophila

Um ensaio rápido de preferência alimentar em Drosophila