Wir möchte Erika Taylor für die Bearbeitung dieser Handschrift. Diese Arbeit wurde finanziert durch Zuschüsse aus der National Institutes of Health (P01 HL098053, P01 AG033561 und R01 HL054732), r.b., doctoral Research Ergänzung (R01 HL085481) und ein Stipendium (AAUW), S.B.D. und Zuschüsse aus der American Heart Association, S.B.D. und R.T.B.

1. HFD Fütterung Protokoll <img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/56029/56029table1.jpg" /> Tabelle 1. Fliege Nahrungsmittelrezept. 
Diese Tabelle fasst die verschiedenen Zutaten zur Zubereitung unserer Kontrolle. Sobald gebildet, 10 mL des Essens ist in Fläschchen gegossen, gekühlt und bei 4 ° C für langfristige Lagerung gelagert.
<ol><li>HFD Vorbereitung <ol><li>um 1 kg des hohen Fett essen machen, wiegt 700 g vorgefertigte normale fliegen Nahrung (siehe Tabelle 1) und 300 g Kokosöl in zwei getrennten Behältern mit einer Analysenwaage.</li>
		<li>Erhitzen jeder Behälter einzeln in der Mikrowelle, bis der Inhalt vollständig schmelzen. Gießen Sie das Kokosöl in die Fliege Lunchbox. Rühren mit einem Schneebesen, bis das Öl gut in die Fliege Nahrung vermischt ist. 
		Hinweis: Keine Klumpen von Lebensmitteln oder Öl sollte sichtbar sein. Wenn das fliegende Essen in der Mikrowelle schmelzen, zu stoppen, in Abständen von 1 min auf das Essen zu mischen und zu verhindern, überkochen.</li>
		<li>Re wiegen die hohen Fette essen. Wenn das Gesamtgewicht beträgt weniger als 1 kg (700 g Lebensmittel + 300 g Kokosöl), fügen Sie Wasser (ca. 10 mL) zum Ausgleich von Verdunstung während des Erhitzens und bringen wieder das Gewicht auf 1 kg.</li>
		<li>Pour gut durchmischten ca. 10 mL hohe fettreiche Nahrung pro Vial (rund 25 % des Volumens der Durchstechflasche). Als nächstes decken mit Gaze, fliegen zu verhindern &#39; Kontamination. Für 1 h bei Raumtemperatur abkühlen lassen dann die Fläschchen auf 4 ° C für die Lagerung bis zu 4 Wochen übertragen. 
		Hinweis: Die normale Nahrung (NF) wird als Kontrolle Lebensmittel verwendet. Auch Gießen Sie 10 mL (ca. 25 % des Volumens der Vial) NF pro Fläschchen. Ersetzen Sie für die HFD Lebensmittel 30 % der NF-Lebensmittel mit Kokosnuss-Öl. Zur Steuerung und experimentellen Bedingungen, die fliegen erhielten die gleiche Menge an NF und HFD (10 mL Futter pro Fläschchen).</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56029/56029fig1.jpg" /> Abbildung 1 . HFD Fütterung in Drosophila. 
Das Schema zeigt die verschiedenen Fütterung Schritte für fliegen auf einem Steuerelement Essen (normale Ernährung ohne Zusatz von Kokosöl-NF) oder HFD (mit dem Zusatz von Kokosöl). Der gesamte Prozess dauert 10 Tage nach der ersten Sammlung von Erwachsenen fliegen. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56029/56029fig1large.jpg" target="_blank"> Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<ol start="2"> <li>HFD Fütterung von D. Melanogaster Hinweis: dieses Protokoll beinhaltet Kontrolle Essen und HFD Fütterung Verfahren, die mit einer Fliege Linie kompatibel sind. Kontrolle und experimentelle fliegen werden in Ampullen mit der gleichen Menge Essen (NF oder HFD) gelegt.
	<ol><li>Einsatz CO 2 um die fliegen zu betäuben. 
		: Für Neulinge, bitte lesen Hinweis 21 für einen Überblick über Erziehung und Umgang mit D. Melanogaster.</li>
		<li>Sammeln 0-5 Tag alt fliegen von Vials und Transfer (mit Spiegeln) die fliegen in neue Ampullen mit NF (vorher bei Raumtemperatur erwärmt). Lassen Sie das Fliegen Alter für 5 zusätzliche Tage bei 21 ° c</li>
		<li>Am Ende der 5 Tage, nehmen Sie das Fläschchen mit HFD und NF von 4 ° c 
		Hinweis: wie Kälte Leben fliegen, stress können lassen Sie die Fläschchen für 30 min bei Raumtemperatur zum Aufwärmen vor dem Einsatz sitzen.</li>
		<li>Mit Feuchttücher, reinigen und entfernen Sie überschüssigen Flüssigkeit von den Seiten der Durchstechflaschen.</li>
		<li>Legen Sie ein kleines Stück Filterpapier, über 1 cm x 3 cm, in den hohen Fett essen, überschüssige Flüssigkeit zu absorbieren. 
		Hinweis: Dieser Schritt ist wichtig, zu verhindern, dass die fliegen kleben auf HFD Nahrung.</li>
		<li>Transfer als nächstes die fliegen auf den hohen Fett essen (mit Spiegeln). Legen Sie die Flaschen horizontal auf ihrer Seite (nicht stehend) bei 21-22 ° C für 5 Tage. 
		Hinweis: Vermeiden Sie höhere Temperaturen, da dies teilweise hohe fettreiche Nahrung, wodurch die fliegen zu essen und sterben Stick schmelzen kann.</li>
		<li>Nach 5 Tagen, transfer (mit Spiegeln) die fliegen von NF und HFD in neue Fläschchen ohne Nahrung für ihren Mut, für 30 min leer lassen. Als nächstes gehen Sie zum Wiegen der Flies. 
		Hinweis: Die entscheidenden Schritte in dieser HFD Fütterung Protokoll gehört zu einer gut durchmischten HFD, frei von jeder Brocken fliegen Essen oder kondensierten Öl vorzubereiten. Homogen mischen und Kühlung der HFD auf 45-30 ° C ist ratsam, vor dem Gießen in Fläschchen und Lagerung der Lebensmittel im richtigen Alter von 4 ° c Anpassung der Steuerung und experimentellen fliegen ist ebenso wichtig wie kontrollierte Ernährung und ökologischen Bedingungen vor die HFD Fütterung. Während der Einlaufphase Kontrolle und experimentelle fliegt die gleiche Menge an NF und HFD anzugeben. Sammeln Sie nie fliegen aus überfüllten Fläschchen oder Flaschen (zur Vermeidung von generationenübergreifenden Effekte). Setzen Sie immer maximal 25 fliegen pro Fläschchen während NF und HFD Fütterung um diätetische Einschränkung oder andere crowding Effekte zu vermeiden. Die HFD besteht aus 30 % Kokosöl, somit Temperaturen über 22 ° C könnte teilweise schmelzen HFD, wodurch die fliegen zum Aufkleben auf die fettige Lebensmittel und sterben. Reinigen Sie bevor die fliegen auf der HFD die Fläschchen, entfernen das restliche Öl und legen ein Filterpapier überschüssigen Flüssigkeit in der Nahrung zu absorbieren. Während der Inkubation der fliegen auf HFD, regelt die Fläschchen auf ihren Seiten um eine fettfreie horizontale Oberfläche für die fliegen.</li>
	</ol></li> <li>Wiegen die fliegen <ol><li>für jeden Genotyp und Geschlecht getestet werden, eine hochempfindliches Skala verwenden, um die Gewichte bereits beschriftete, leere 1,7 mL Röhrchen aufnehmen.</li>
		<li>Mit Fliege Betäubung oder CO 2, zu betäuben und 36 fliegen von den gleichen Genotyp, Geschlecht, zu sammeln und Einspeisung Status mit einem Pinsel in einer Pre-1,7 mL-Tube wog.</li>
		<li>Wiegen die Röhrchen mit fliegen mit der gleichen hochempfindliches Skala.</li>
		<li>Bestimmen das Durchschnittsgewicht fliegende nach dieser Formel: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56029/56029eq1.jpg" /> Hinweis: die Anzahl der fliegen in diesem Protokoll ist 36.</li>
		<li>Blitz Einfrieren der 1,7 mL-Röhrchen mit fliegen durch Eintauchen in flüssigem Stickstoff für 2 min. sammeln und die Rohre in Boxen. Als nächstes übertragen die Boxen bis-80 ° C (bevorzugte Temperatur) für die Lagerung bis zur Verwendung mit dem TAG-Assay. 
		Achtung: Flüssiger Stickstoff ist bei einer sehr niedrigen Temperatur. Bitte geeignete persönliche Schutzausrüstung benutzen.</li>
	</ol></li></ol> 2. TAG-Assay <ol><li>Vorbereitung der TAG standard Konzentrationen <ol><li>500 mL PBT vorbereiten (PBS 1 X 0,05 % Triton).</li>
		<li>Mit 0,5 mL Röhrchen und die TAG-Lösung (Table of Materials), bereiten Sie 100 µL des Rohlings (nur PBT) und 100 µL der sechs standard-TAG-Konzentrationen (2 µg/µL 1 µg/µL 0,5 µg/µL; 0,25 µg/µL; 0,125 µg/µL; 0,0625 µg/µL) mit der PBT.</li>
		<li>Die Rohre auf Eis legen und fahren Sie mit Schleifen fliegen.</li>
	</ol></li> <li>Schleifen die fliegen <ol><li>nehmen Sie die gefrorenen fliegen von-80 ° C (Schritt 1.3). Übertragen Sie die Röhrchen mit der fliegen auf Ice</li>
		<li>Zuerst legen Sie 2 mm Metall Mahlkugeln in eine 96-Well-Kugel-Spender, verwenden Sie einen kleinen Pinsel Extrakugeln entfernen.</li>
		<li>Ort der 96-Well-Schleifen Platte auf dem Kopf stehend auf dem Ball Dispenser und Flip die Metallkugeln direkt in die reibende Platte übertragen. Es sollte ein Ball pro Bohrloch.</li>
		<li>Mit einer Multi-Kanal-Pipette 600 µL PBT in jeder Zeile der Schleifscheibe 96-Well-Platte hinzufügen.</li>
		<li>Mit der Pinzette, fügen Sie 3 fliegt pro Bohrloch. Der Genotyp, Geschlecht und Ernährung Zustand der fliegen in jeder Zeile/gut von den Schleifen 96-Well-Platte.</li>
		<li>Legen Sie fest die Kappen auf die Schleifscheibe 96-Well-Platte. Band darf Sie nach oben, um sicherzustellen, dass es kein Durchsickern.</li>
		<li>Setzen Sie richtig die Schleifen 96-Well-Platten der Schleifmaschine. Die Maschine setzen, um die höchste Geschwindigkeit und Presse &#34; laufen &#34; die fliegen für 3 min. mahlen</li>
		<li>Nach 3 min, stoppen die Schleifen und fahren Sie mit Platte Zentrifugation: bewiesenge für 15 min bei 4.000 x g, 4 ° C. Nach Zentrifugation, verwalten die reibende Platte sorgfältig, um zu vermeiden, Mischen des Überstands mit dem Pellet.</li>
	</ol></li> <li>Probenbeladung und Bestimmung des TAG <ol><li>eine neue Spektralphotometer 96-Well-Platte zu nehmen. Mit einer Multi-Kanal-Pipette 200 µL des Reagenz TAG in jeder Zeile der Platte laden.</li>
		<li>Last 20 µL PBT in den ersten Brunnen der ersten Zeile ein Leerzeichen erstellen. Mischen von Pipettieren rauf und runter. Vermeiden Sie Luftblasen.</li>
		<li>Last 20 µL jeder standard Verdünnung (aus Schritt 2.1.2) in den übrigen Brunnen von der ersten Zeile und der Mix von Pipettieren rauf und runter. Vermeiden Sie Luftblasen.</li>
		<li>Mit einer Multi-Kanal-Pipette 20 µL des Überstandes aus jeder Zeile der reibende Platte auf die entsprechende Zeile in der 96-Well-Photometer-Platte übertragen. Pipette rauf und runter, gut mischen. Vermeiden Sie Luftblasen.</li>
		<li>Setzen Sie eine gasdurchlässige Folie oberhalb des 96-Well-Platte.</li>
		<li>Brüten die Platte bei 37 ° C für 10 min. 
		Hinweis: In den Brunnen gibt es Bläschen, Zentrifugieren der Platte für 2 min bei 2.000 x g um alle Luftblasen zu entfernen. Bläschen beeinträchtigt auch die Extinktion lesen.</li>
		<li>Lesen Sie die Absorption von jedem Bohrloch der Platte bei 550 nm mit einem kompatiblen Mikrotestplatte Reader. Als nächstes verfolgen die Standardkurve und bestimmen die Konzentration [µg/µL] unbekannter Proben.</li>
		<li>Um den Betrag des TAG-Inhalt pro mittlere fliegen Gewicht ermitteln verwenden Sie die folgende Formel: 
		<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56029/56029eq2.jpg" /> Hinweis: In diesem Protokoll wurden 3 fliegen in 600 µL PBT gehackt; in der Folge ist das mittlere Volumen pro Fliege 200 µL.</li>
	</ol></li> <li>Bradford-Test und Normalisierung des TAG-Inhalt mit Protein-Inhalt <ol><li>bereiten sieben 100 µL Rinderserumalbumin (BSA) standard Verdünnungen (75 µg/mL; 100 µg/mL; 150 µg/mL; 200 µg/mL; 250 µg/mL; 500 µg/mL; 1.000 µg/mL) mit der PBT.</li>
		<li>Nehmen eine neue 96-Well-Platte und 200 µL 1 X Bradford-Reagenz in jeder Zeile der Platte laden.</li>
		<li>In die erste Vertiefung der ersten Zeile fügen Sie 10 µL PBT erstelle ich eine leere. Mischen von Pipettieren rauf und runter. Vermeiden Sie Luftblasen.</li>
		<li>Fügen Sie 10 µL jeder standard Verdünnung in den verbleibenden Brunnen von der ersten Zeile und der Mix von Pipettieren rauf und runter. Vermeiden Sie Luftblasen.</li>
		<li>Mit einer Multi-Kanal-Pipette 10 µL Überstand der Fliege aus jeder Zeile der reibende Platte in die entsprechende Zeile in der 96-Well-Platte übertragen. Pipette rauf und runter, gut mischen. Vermeiden Sie Luftblasen.</li>
		<li>Legen Sie eine gasdurchlässige Folie oberhalb des 96-Well-Platte.</li>
		<li>Die Platte bei 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. In den Vertiefungen gibt es Bläschen, Zentrifugieren die Platte für 2 min bei 2.000 x g um sie zu entfernen. 
		Hinweis: Bläschen wird das Ablesen der Absorption stören.</li>
		<li>Einsatz einem Spektrophotometer zu lesen die Extinktion des Rohlings, Normen und unbekannte Proben bei 595 nm. Die Standardkurve verwenden, um die Konzentrationen [µg/µL] der Proben in jeder Zeile bestimmen.</li>
		<li>Normalisieren das TAG zufrieden mit Protein-Ebene mit Hilfe der folgenden Formel: 
		<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56029/56029eq3.jpg" /></li></ol></li></ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Adipositas-Induktion bei Mäusen kann Monate19,20nehmen. In Fliegen ermöglicht dieser HFD Fütterung Protokoll für die Induktion von überschüssigen Fettansammlung in einer Angelegenheit von Tagen oder weniger, verursachen erhöht in Fettansammlung erst nach 18 Uhr (siehe Abbildung 2). HFD füttern mit dem beschriebenen Protokoll Glukose Inhalt 12 erhöht oder verringert Bmm Lipase und PGC-1 Ausdru...

Wir befinden uns in einer Zeit, wo Übergewicht und die damit verbundenen wirtschaftlichen Belastungen ist ein weltweites Problem1. Zwei von drei Amerikanern sind übergewichtig oder fettleibig mit den damit verbundenen Herz Krankheiten, die primäre Ursache des Todes in der erwachsenen Bevölkerung2. Neue effiziente Methoden sind notwendig, um die genetischen und molekularen Komponenten beteiligt an der Regulation des metabolischen Syndroms mit Modellorganismen angemessen zu untersuchen. Aus diesem Grund wählen wir die Fruchtfliege Drosophila -Modell, weil es die grundlegende biologische Prozesse mit Säugetieren, einschließlich Menschen und Mäusen3,4,5,6teilt. Drosophila-Genom ist im Laufe der Evolution hoch konservierte aber insgesamt viel kleiner mit weniger Genduplikation und metabolische Komplexität, wodurch es ideal für das Verständnis der grundlegenden Mechanismen in vielen menschlichen Krankheiten4 verwickelt , 7 , 8. auch charakteristische Prozesse durchgeführt durch Fettgewebe, Darm und Bauchspeicheldrüse sind vertreten in der Fliege und vermitteln Regulierungsaufgaben in Glukose und Lipid-Stoffwechsel, zum Beispiel, die ähnlich wie Menschen9, 10,11. Darüber hinaus sind die grundlegende molekulare Wege der Kontrolle von Übergewicht, Insulinresistenz und Diabetes beim Menschen beteiligt in Drosophila Melanogaster12,13,14 funktionell konserviert. , 15 , 16. wie höhere Organismen, Drosophila hat ein schlagendes Herz, die während der Entwicklung durch ähnliche Prozesse der Säugetier-Herz3,17entsteht. So bieten die Entwicklung einer zuverlässigen HFD Fütterung Protokoll und hohem Durchsatz TAG Assay, angepasst für effiziente Sortierung Zwecke mit Hilfe den genetischen Werkzeugkasten von Drosophila, ein wichtiges Mittel zu untersuchen und verstehen die grundlegenden genetische Grundlagen zugrunde liegenden komplexen Stoffwechselerkrankungen.
Das HFD Essen selbst besteht aus einem Standardlabor fliegen Lebensmittel ergänzt mit Kokosnuss-Öl, besteht hauptsächlich aus gesättigten Fettsäuren bekannt, metabolisches Syndrom18zugeordnet werden soll. Während Fettleibigkeit bei Säugetieren Modelle, wie Nagetiere, Induktion Monate19,20nehmen kann, erhöht unsere optimierte HFD Protokoll in Drosophila füttern, effektiv und reproduzierbar organismal Fettgehalt in wenigen Tage12,14. Dieses Protokoll ermöglicht in Verbindung mit einem hohen Durchsatz TAG-Assay, effiziente mass Screening für die Auswirkungen der genetischen Faktoren, Umwelteinflüssen und Medikamentenkandidaten neue Modulatoren des Fettstoffwechsels zu entdecken. In der Folge dürften diese Protokolle zu verstehen und/oder Übergewicht und Fettleibigkeit verbundenen menschlichen Krankheiten zu bekämpfen.
Die Fütterung Protokoll ist vielseitig und kann angewendet werden, um die Stoffwechsel- und funktionelle Auswirkungen der einzelnen gesättigte oder ungesättigte Fettsäure zu studieren. Der Einsatz von Hochdurchsatz-TAG Assays beschränkt sich nicht auf D. Melanogaster, sondern kann auf eine Vielzahl von kleinen Modellorganismen mit Kutikula oder harte extrazellulären Matrizen(z. B.andere Drosophila -Arten, C. Elegans angepasst werden und anderen Wirbellosen Modellorganismen) Fettgehalt unter verschiedenen ökologischen, genetischen und physiologischen Bedingungen, in jedem Stadium der Entwicklung, Erwachsenenalter oder Phase Stoffwechselerkrankung zu messen. Die TAG-Assay basiert auf eine farbmetrische Messung aus einer Reihe von enzymatischen Reaktionen, die verschlechtern die TAGs in freie Fettsäuren, Glycerin, Glycerol-3-Phosphat und schließlich H2O2 , das mit 4-Aminoantipyrine (4-AAP) und 3,5 - reagiert Dichlor-2-Hydroxybenzene Sulfonate (3,5 DHBS) eine rote farbige Produkt zu produzieren, die mit einer 96-Well-Spektralphotometer gemessen wird.

<table width="924">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Talboys Ball dropper/bead Dispenser</td>
			<td style="width:209px;">Talboys</td>
			<td style="width:148px;">#: 930150</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Talboys High Throughput Homogenizer</td>
			<td style="width:209px;">Talboys</td>
			<td style="width:148px;">#: 930145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="width:400px;height:17px;">Grinding Balls, Stainless Steel&#160;</td>
			<td style="width:209px;">OPS Diagnostics, LLC</td>
			<td style="width:148px;"># GBSS 156-5000-01</td>
			<td>5000 balls</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Masterblock 96 Well deep Microplates</td>
			<td style="width:209px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:148px;"># T-3058-1</td>
			<td>case of 80 plates</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="width:400px;height:22px;">Greiner&#160; 96 well microplate flat bottom</td>
			<td style="width:209px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:148px;"># M4436</td>
			<td>40 plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Greiner CapMat for sealing multiwell plates</td>
			<td style="width:209px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:148px;"># C3606</td>
			<td>50 sealing plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Reagent Reservoirs&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:148px;"># 1192T71</td>
			<td>12/PK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Scientific Finnpipette 4661040</td>
			<td style="width:209px;">Thermo Scientific</td>
			<td># 4661040</td>
			<td>1-10 ul multipipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Scientific Finnpipette 4661070</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td># 4661070</td>
			<td>30-300ul multipipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Scientific Finnpipette 4661020</td>
			<td style="width:209px;">Thermo Scientific</td>
			<td>#4661020</td>
			<td>10-100ul multipipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multichannel tips</td>
			<td style="width:209px;">Denville Scientific Inc</td>
			<td># P3131-S</td>
			<td>for 10 uL pipette</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Multichannel tips</td>
			<td style="width:209px;">Denville Scientific Inc</td>
			<td># P3133-S</td>
			<td>for 200 uL pipette</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Multichannel tips</td>
			<td style="width:209px;">Denville Scientific Inc</td>
			<td>#P1125</td>
			<td>for 100 uL pipette</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Roboz Surgical</td>
			<td># 5 Dumonts</td>
			<td>Super fine forceps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mettler Toledo Excellence XS Analytical Balance Mfr# XS64</td>
			<td style="width:209px;">Cole-Parmer scientific experts</td>
			<td># EW-11333-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Metler Toledo Excellence XS Toploading Balance</td>
			<td style="width:209px;">Cole-Parmer scientific experts</td>
			<td># EW-11333-49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">96-Well microplate Centrifuge</td>
			<td style="width:209px;">Hettich Zentrifugen</td>
			<td style="width:148px;"># Rotina 420R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Microplate Reader</td>
			<td style="width:209px;">Molecular devices</td>
			<td style="width:148px;"># SpectraMax 190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Lab-Line Bench Top Orbit Environ Shaker Incubator</td>
			<td style="width:209px;">Biostad</td>
			<td style="width:148px;"># 3527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Infinity Triglycerides reagent</td>
			<td style="width:209px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:148px;"># TR22421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Triglyceride Standard</td>
			<td style="width:209px;">Stanbio</td>
			<td style="width:148px;">#2103 - 030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Quick Start Bradford Protein Assay</td>
			<td style="width:209px;">Bio-RAD</td>
			<td style="width:148px;"># 500-0205</td>
			<td>1x dye Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Coconut oil</td>
			<td style="width:209px;">Nutiva</td>
			<td># 692752200014</td>
			<td>15 0z jar</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">PBS 10X</td>
			<td style="width:209px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:148px;"># AM9625</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:209px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:148px;"># 9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Gas-permeable Foil</td>
			<td style="width:209px;">Macherey-Nagel</td>
			<td style="width:148px;"># 740675</td>
			<td>50 pieces</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">filter Paper</td>
			<td style="width:209px;">VWR</td>
			<td style="width:148px;"># 28317-241</td>
			<td>Pack of 100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">Drosophila vials</td>
			<td style="width:209px;">Genesee Scientific</td>
			<td>Cat #: 32-116SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quick Start Bovine Serum Albumin Standard</td>
			<td style="width:209px;">Bio-Rad</td>
			<td># 5000206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:400px;height:21px;">FlyNap Anesthetic</td>
			<td style="width:209px;">Carolina</td>
			<td style="width:148px;"># 173025</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kimwipes Low-Lint</td>
			<td style="width:209px;">Uline</td>
			<td style="width:148px;"># S-8115</td>
			<td>1-Ply, 4.4 x 8.4&#34;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high fat diet feeding and high throughput triacylglyceride assay in drosophila melanogaster

Herzkrankheit ist die häufigste Ursache des menschlichen Todes weltweit. Zahlreiche Studien haben starke Verbindungen zwischen Adipositas und kardiale Störungen beim Menschen gezeigt, aber mehr Instrumente und Forschungsanstrengungen sind erforderlich, die Mechanismen besser aufzuklären. Seit mehr als einem Jahrhundert, das genetisch sehr gefügig Modell von Drosophila maßgeblich an der Entdeckung der Schlüsselgene und molekulare Signalwege, die erwies sich als hoch über Artgrenzen konserviert werden. Viele biologische Prozesse und Krankheitsmechanismen sind funktionell in der Fliege, wie Entwicklung (z.B., Körper Plan, Herz), Krebs und Neurodegenerative Erkrankung erhalten. Vor kurzem spielte das Studium der Fettleibigkeit und sekundären Krankheiten wie Herz-Kreislauferkrankungen in Modellorganismen, eine sehr wichtige Rolle bei der Identifizierung der wichtigsten Regulatoren metabolisches Syndrom beim Menschen beteiligt.
Hier schlagen wir vor, diesem Modellorganismus als ein effizientes Werkzeug zu induzieren, Adipositas, d. h., übermäßige Fettansammlung, und entwickeln ein effizientes Protokoll zur Überwachung der Fettgehalt in Form von TAGs Anhäufung verwenden. Neben den hoch konservierte, aber weniger komplexes Genom hat die Fliege auch eine kurze Lebensdauer für schnelle Experimente, kombiniert mit Wirtschaftlichkeit. Dieser Artikel bietet ein detailliertes Protokoll für hohen Fett-Diät (HFD) Fütterung in Drosophila , Übergewicht und ein hoher Durchsatz Triacylglyceride (TAG) Assay für die Messung der damit verbundenen Zunahme der Fettgehalt, mit dem Ziel, sehr reproduzierbar zu induzieren und effizient für große genetische oder chemische Screening. Diese Protokolle bieten neue Möglichkeiten, um effizient Regulationsmechanismen beteiligt Fettleibigkeit zu untersuchen, sowie bieten eine standardisierte Plattform für Droge-Entdeckung-Forschung für die schnelle Prüfung der Wirkung von Medikamenten-Kandidaten auf die Entwicklung oder Vorbeugung von Fettleibigkeit, Diabetes und metabolische Erkrankungen.

In D. Melanogasterwie der Fall mit anderen Arten ist gibt es Geschlechtsdimorphismus zwischen Männchen und Weibchen22. Es ist bekannt, dass die Weibchen größer, mit mehr Fett in ihre Bäuche als Männchen22 sind. Um die Wirksamkeit unserer Protokoll zu testen, haben wir TAG Tests ermitteln die TAG inhaltliche Unterschiede zwischen Männchen und Weibchen Standardlabor Wildtyp (w1118) fliegt. Die Daten zeigen, d...

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High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Fettreiche Ernährung Fütterung und Hochdurchsatz Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Dies ist eine fettreiche Ernährung Fütterung Protokoll zur Fettleibigkeit in Drosophila, ein Modell für Verständnis grundlegende molekulare Mechanismen in Lipotoxicity verwickelt zu induzieren. Es bietet auch einen hohen Durchsatz Triacylglyceride Assay zur Messung der Fettansammlung in Drosophila und möglicherweise andere (Insekt) Modelle unter verschiedenen diätetischen, Umwelt, genetische oder physiologischen Bedingungen.

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

11.1K Aufrufe.  Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute. Dies ist eine fettreiche Ernährung Fütterung Protokoll zur Fettleibigkeit in Drosophila, ein Modell für Verständnis grundlegende molekulare Mechanismen in Lipotoxicity verwickelt zu induzieren. Es bietet auch einen hohen Durchsatz Triacylglyceride Assay zur Messung der Fettansammlung in Drosophila und möglicherweise andere (Insekt) Modelle unter verschiedenen diätetischen, Umwelt, genetische oder physiologischen Bedingungen.

Serie: High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal transduction pathways, transcriptional regulatory networks, gene expression, genome-editing, and gene-silencing. Furthermore, significant progress has been made in the regeneration of plants from protoplasts, which has generated even more interest in the use of these systems for plant genomics. In this work, a protocol has been developed for automation of protoplast isolation and transformation from a &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) tobacco suspension culture using a robotic platform. The transformation procedures were validated using an orange fluorescent protein (OFP) reporter gene (pporRFP) under the control of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter (35S). OFP expression in protoplasts was confirmed by epifluorescence microscopy. Analyses also included protoplast production efficiency methods using propidium iodide. Finally, low-cost food-grade enzymes were used for the protoplast isolation procedure, circumventing the need for lab-grade enzymes that are cost-prohibitive in high-throughput automated protoplast isolation and analysis. Based on the protocol developed in this work, the complete procedure from protoplast isolation to transformation can be conducted in under 4 hr, without any input from the operator. While the protocol developed in this work was validated with the BY-2 cell culture, the procedures and methods should be translatable to any plant suspension culture/protoplast system, which should enable acceleration of crop genomics research.

A high-throughput, automated, tobacco protoplast production and transformation methodology is described. The robotic system enables massively parallel gene expression and discovery in the model BY-2 system that should be translatable to non-model crops.

Ein Roboter-Plattform für Hochdurchsatz-Isolierung von Protoplasten und Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Forschung

Genetik

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the conventional approaches of permanent gene deletion cannot be applied to essential genes. We have pioneered a unique collection of ~70 temperature-sensitive (ts) lethal mutants for studying cell cycle regulation in the unicellular green algae Chlamydomonas reinhardtii1. These mutations identify essential genes, and the ts alleles can be conditionally inactivated by temperature shift, providing valuable tools to identify and analyze essential functions. Mutant collections are much more valuable if they are close to comprehensive, since scattershot collections can miss important components. However, this requires the efficient collection of a large number of mutants, especially in a wide-target screen. Here, we describe a robotics-based pipeline for generating ts lethal mutants and analyzing their phenotype in Chlamydomonas. This technique can be applied to any microorganism that grows on agar. We have collected over 3000 ts mutants, probably including mutations in most or all cell-essential pathways, including about 200 new candidate cell cycle mutations. Subsequent molecular and cellular characterization of these mutants should provide new insights in plant cell biology; a comprehensive mutant collection is an essential prerequisite to ensure coverage of a broad range of biological pathways. These methods are integrated with downstream genetics and bioinformatics procedures for efficient mapping and identification of the causative mutations that are beyond the scope of this manuscript.

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Temperature-sensitive (ts) lethal mutants are valuable tools to identify and analyze essential functions. Here we describe methods to generate and classify ts lethal mutants in high throughput.

Hochdurchsatz-robotically Assisted Isolation von temperaturempfindlichen Lethal Mutants in<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for understanding the development and evolution of morphological phenotypes. Abdominal pigmentation in Drosophila melanogaster has been particularly useful, allowing researchers to identify the loci that underlie inter- and intraspecific variations in morphology. Hitherto, however, D. melanogaster abdominal pigmentation has been largely assayed qualitatively, through scoring, rather than quantitatively, which limits the forms of statistical analysis that can be applied to pigmentation data. This work describes a new methodology that allows for the quantification of various aspects of the abdominal pigmentation pattern of adult D. melanogaster. The protocol includes specimen mounting, image capture, data extraction, and analysis. All the software used for image capture and analysis feature macros written for open-source image analysis. The advantage of this approach is the ability to precisely measure pigmentation traits using a methodology that is highly reproducible across different imaging systems. While the technique has been used to measure variation in the tergal pigmentation patterns of adult D. melanogaster, the methodology is flexible and broadly applicable to pigmentation patterns in myriad different organisms.

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

This work presents a method to quickly and precisely quantify the abdominal pigmentation of Drosophila melanogaster using digital image analysis. This method streamlines the procedures between phenotype acquisition and data analysis and includes specimen mounting, image acquisition, pixel value extraction, and trait measurement.

Quantifizierung der Bauchpigmentierung in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution based analysis methodology (nucleosome density ChIP-seq; ndChIP-seq) that enables the generation of combined measurements of micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification genome-wide. Nucleosome position and local density, and the posttranslational modification of their histone subunits, act in concert to regulate local transcription states. Combinatorial measurements of nucleosome accessibility with histone modification generated by ndChIP-seq allows for the simultaneous interrogation of these features. The ndChIP-seq methodology is applicable to small numbers of primary cells inaccessible to cross-linking based ChIP-seq protocols. Taken together, ndChIP-seq enables the measurement of histone modification in combination with local nucleosome density to obtain new insights into shared mechanisms that regulate RNA transcription within rare primary cell populations.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) methodology for the generation of sequence datasets suitable for a nucleosome density ChIP-seq analytical framework integrating micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification measurements.

Erzeugung von nativen Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung Bibliotheken für Nukleosom Dichteanalyse

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of tissues, we have developed numerous modifications and improvements to our original fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol. To facilitate throughput and cost effectiveness, all steps, from probe generation to signal detection, are performed using exon 96-well microtiter plates. Digoxygenin (DIG)-labelled antisense RNA probes are produced using either cDNA clones or genomic DNA as templates. After tissue fixation and permeabilization, probes are hybridized to transcripts of interest and then detected using a succession of anti-DIG antibody conjugated to biotin, streptavidin conjugated to horseradish peroxidase (HRP) and fluorescently conjugated tyramide, which in the presence of HRP, produces a highly reactive intermediate that binds to electron dense regions of immediately adjacent proteins. These amplification and localization steps produce a robust and highly localized signal that facilitates both cellular and subcellular transcript localization. The protocols provided have been optimized to produce highly specific signals in a variety of tissues and developmental stages. References are also provided for additional variations that allow the simultaneous detection of multiple transcripts, or transcripts and proteins, at the same time.

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

The described RNA in situ hybridization protocol allows the detection of RNA in whole Drosophila embryos or dissected tissues. Using 96-well microtiter plates and tyramide signal amplification, transcripts can be detected at high resolution, sensitivity, and throughput, and at a relatively low cost.

Hochauflösender Fluoreszenz In Situ Hybridisierung in Drosophila Embryos und Gewebe mit Tyramide Signalverstärkung

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with a number of challenges including sample preservation quality, degraded DNA, and destructive sampling of rare specimens. In order to more effectively use herbarium material in large sequencing projects, a dependable and scalable method of DNA isolation and library preparation is needed. This paper demonstrates a robust, beginning-to-end protocol for DNA isolation and high-throughput library construction from herbarium specimens that does not require modification for individual samples. This protocol is tailored for low quality dried plant material and takes advantage of existing methods by optimizing tissue grinding, modifying library size selection, and introducing an optional reamplification step for low yield libraries. Reamplification of low yield DNA libraries can rescue samples derived from irreplaceable and potentially valuable herbarium specimens, negating the need for additional destructive sampling and without introducing discernible sequencing bias for common phylogenetic applications. The protocol has been tested on hundreds of grass species, but is expected to be adaptable for use in other plant lineages after verification. This protocol can be limited by extremely degraded DNA, where fragments do not exist in the desired size range, and by secondary metabolites present in some plant material that inhibit clean DNA isolation. Overall, this protocol introduces a fast and comprehensive method that allows for DNA isolation and library preparation of 24 samples in less than 13 h, with only 8 h of active hands-on time with minimal modifications.

This article demonstrates a detailed protocol for DNA isolation and high-throughput sequencing library construction from herbarium material including rescue of exceptionally poor-quality DNA.

Robuste DNA-Isolierung und Hochdurchsatz-Sequenzierung Bibliotheksbau für Herbar

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our entire society's ability to treat systemic infections. In the United States alone, antibiotic-resistant infections kill approximately 23,000 people a year and cost around 20 billion USD in additional healthcare. One approach to combat antimicrobial resistance is combination therapy, which is particularly useful in the critical early stage of infection, before the infecting organism and its drug resistance profile have been identified. Many antimicrobial treatments use combination therapies. However, most of these combinations are additive, meaning that the combined efficacy is the same as the sum of the individual antibiotic efficacy. Some combination therapies are synergistic: the combined efficacy is much greater than additive. Synergistic combinations are particularly useful because they can inhibit the growth of antimicrobial drug resistant strains. However, these combinations are rare and difficult to identify. This is due to the sheer number of molecules needed to be tested in a pairwise manner: a library of 1,000 molecules has 1 million potential combinations. Thus, efforts have been made to predict molecules for synergy. This article describes our high-throughput method for predicting synergistic small molecule pairs known as the Overlap2 Method (O2M). O2M uses patterns from chemical-genetic datasets to identify mutants that are hypersensitive to each molecule in a synergistic pair but not to other molecules. The Brown lab exploits this growth difference by performing a high-throughput screen for molecules that inhibit the growth of mutant but not wild-type cells. The lab's work previously identified molecules that synergize with the antibiotic trimethoprim and the antifungal drug fluconazole using this strategy. Here, the authors present a method to screen for novel synergistic combinations, which can be altered for multiple microorganisms.

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Synergistic drug combinations are difficult and time-consuming to identify empirically. Here, we describe a method for identifying and validating synergistic small molecules.

Hochdurchsatz-Identifizierung von synergistischen Wirkstoffkombinationen durch die Überlappung2 Methode

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short generation time, are easy to handle, display a high reproductive rate, low cost, and are easily amenable to genetic manipulations by microinjection of DNA in embryos. Recent advances in gene editing tools are enabling precise introduction of mutations and transgenes in zebrafish. Disease modeling in zebrafish often leads to larval phenotypes and early death which can be challenging to interpret if genotypes are unknown. This early identification of genotypes is also needed in experiments requiring sample pooling, such as in gene expression or mass spectrometry studies. However, extensive genotypic screening is limited by traditional methods, which in most labs are performed only on adult zebrafish or in postmortem larvae. We addressed this problem by adapting a method for the isolation of PCR-ready genomic DNA from live zebrafish larvae that can be achieved as early as 72 h post-fertilization (hpf). This time and cost-effective technique, improved from a previously published genotyping protocol, allows the identification of genotypes from microscopic fin biopsies. The fins quickly regenerate as the larvae develop. Researchers are then able to select and raise the desired genotypes to adulthood by utilizing this high-throughput PCR-based genotyping procedure.

Zebrafish have been used as reliable genetic model organisms in biomedical research, especially with the advent of gene-editing technologies. When larval phenotypes are expected, DNA extraction and genotype identification can be challenging. Here, we describe an efficient genotyping procedure for zebrafish larvae, by tail clipping, as early as 72-h post-fertilization.

Hochdurchsatz-DNA-Extraktion und Genotypisierung von 3dpf Zebrafischlarven durch Fin Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often performed at low throughput, it is moreover time-consuming and error-prone, even more so when multiplexing several plasmids. We developed an easy, fast, and accurate method to perform cell transfection in a 384-well plate layout using acoustic droplet ejection (ADE) technology. The nanodispenser device used in this study&#160;is based on this technology and allows precise nanovolume delivery at high speed from a source well plate to a destination one. It can dispense and multiplex DNA and transfection reagent according to a predesigned spreadsheet. Here we present an optimal protocol to perform ADE-based high-throughput plasmid transfection which makes it possible to reach an efficiency of up to 90% and a nearly 100% cotransfection in cotransfection experiments. We extend initial work by proposing a user-friendly spreadsheet-based macro, able to manage up to four plasmids/wells from a library containing up to 1,536 different plasmids, and a tablet-based pipetting guide application. The macro designs the necessary template(s) of the source plate(s) and generates the ready-to-use files for the nanodispenser and tablet-based application. The four-steps transfection protocol involves i) a diluent dispense with a classical liquid handler, ii) plasmid distribution and multiplexing, iii) a transfection reagent dispense by the nanodispenser, and iv) cell plating on the prefilled wells. The described software-based control of ADE plasmid multiplexing and transfection allows even nonspecialists in the field to perform a reliable cell transfection in a fast and safe way. This method enables rapid identification of optimal settings for a given cell type and can be transposed to higher-scale and manual approaches. The protocol eases applications, such as human ORFeome protein (set of open reading frames [ORFs] in a genome) expression or CRISPR-Cas9-based gene function validation, in nonpooled screening strategies.

This protocol describes high-throughput plasmid transfection of mammalian cells in a 384-well plate using acoustic droplet ejection technology. The time-consuming, error-prone DNA dispensing and multiplexing, but also the transfection reagent dispensing, are software-driven and performed by a nanodispenser device. The cells are then seeded in these prefilled wells.

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing und Transfektion mit akustischer Nanodispensing-Technologie

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to perform and its ability to standardize the fitness of many strains to a wild-type organism. The technique is limited, however, by available phenotypic markers and the number of strains that can be assessed simultaneously, creating the need for a great number of replicate experiments. Concurrent with large numbers of experiments, the labor and material costs for quantifying bacteria based on phenotypic markers are not insignificant. To overcome these negative aspects while retaining the positive aspects, we have developed a molecular-based approach to directly quantify microorganisms after engineering genetic markers onto bacterial chromosomes. Unique, 25 base pair DNA barcodes were inserted at an innocuous locus on the chromosome of wild-type and mutant strains of Salmonella. In vitro competition experiments were performed using inocula consisting of pooled strains. Following the competition, the absolute numbers of each strain were quantified using digital PCR and the competitive indices for each strain were calculated from those values. Our data indicate that this approach to quantifying Salmonella is extremely sensitive, accurate, and precise for detecting both highly abundant (high fitness) and rare (low fitness) microorganisms. Additionally, this technique is easily adaptable to nearly any organism with chromosomes capable of modification, as well as to various experimental designs that require absolute quantification of microorganisms.

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

This molecular-based approach for determining bacterial fitness facilitates precise and accurate detection of microorganisms using unique genomic DNA barcodes that are quantified via digital PCR. The protocol describes calculating the competitive index for Salmonella strains; however, the technology is readily adaptable to protocols requiring absolute quantification of any genetically-malleable organism.

Digitaler PCR-basierter Wettbewerbsindex für High-Throughput-Analyse der Fitness bei Salmonellen

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...