Name: high fat diet feeding and high throughput triacylglyceride assay in drosophila melanogaster
Uploaded: 2017-09-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster at JoVE.com

Wir möchte Erika Taylor für die Bearbeitung dieser Handschrift. Diese Arbeit wurde finanziert durch Zuschüsse aus der National Institutes of Health (P01 HL098053, P01 AG033561 und R01 HL054732), r.b., doctoral Research Ergänzung (R01 HL085481) und ein Stipendium (AAUW), S.B.D. und Zuschüsse aus der American Heart Association, S.B.D. und R.T.B.

1. HFD Fütterung Protokoll <img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/56029/56029table1.jpg" /> Tabelle 1. Fliege Nahrungsmittelrezept. 
Diese Tabelle fasst die verschiedenen Zutaten zur Zubereitung unserer Kontrolle. Sobald gebildet, 10 mL des Essens ist in Fläschchen gegossen, gekühlt und bei 4 ° C für langfristige Lagerung gelagert.
<ol><li>HFD Vorbereitung <ol><li>um 1 kg des hohen Fett essen machen, wiegt 700 g vorgefertigte normale fliegen Nahrung (siehe Tabelle 1) und 300 g Kokosöl in zwei getrennten Behältern mit einer Analysenwaage.</li>
		<li>Erhitzen jeder Behälter einzeln in der Mikrowelle, bis der Inhalt vollständig schmelzen. Gießen Sie das Kokosöl in die Fliege Lunchbox. Rühren mit einem Schneebesen, bis das Öl gut in die Fliege Nahrung vermischt ist. 
		Hinweis: Keine Klumpen von Lebensmitteln oder Öl sollte sichtbar sein. Wenn das fliegende Essen in der Mikrowelle schmelzen, zu stoppen, in Abständen von 1 min auf das Essen zu mischen und zu verhindern, überkochen.</li>
		<li>Re wiegen die hohen Fette essen. Wenn das Gesamtgewicht beträgt weniger als 1 kg (700 g Lebensmittel + 300 g Kokosöl), fügen Sie Wasser (ca. 10 mL) zum Ausgleich von Verdunstung während des Erhitzens und bringen wieder das Gewicht auf 1 kg.</li>
		<li>Pour gut durchmischten ca. 10 mL hohe fettreiche Nahrung pro Vial (rund 25 % des Volumens der Durchstechflasche). Als nächstes decken mit Gaze, fliegen zu verhindern &#39; Kontamination. Für 1 h bei Raumtemperatur abkühlen lassen dann die Fläschchen auf 4 ° C für die Lagerung bis zu 4 Wochen übertragen. 
		Hinweis: Die normale Nahrung (NF) wird als Kontrolle Lebensmittel verwendet. Auch Gießen Sie 10 mL (ca. 25 % des Volumens der Vial) NF pro Fläschchen. Ersetzen Sie für die HFD Lebensmittel 30 % der NF-Lebensmittel mit Kokosnuss-Öl. Zur Steuerung und experimentellen Bedingungen, die fliegen erhielten die gleiche Menge an NF und HFD (10 mL Futter pro Fläschchen).</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56029/56029fig1.jpg" /> Abbildung 1 . HFD Fütterung in Drosophila. 
Das Schema zeigt die verschiedenen Fütterung Schritte für fliegen auf einem Steuerelement Essen (normale Ernährung ohne Zusatz von Kokosöl-NF) oder HFD (mit dem Zusatz von Kokosöl). Der gesamte Prozess dauert 10 Tage nach der ersten Sammlung von Erwachsenen fliegen. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56029/56029fig1large.jpg" target="_blank"> Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<ol start="2"> <li>HFD Fütterung von D. Melanogaster Hinweis: dieses Protokoll beinhaltet Kontrolle Essen und HFD Fütterung Verfahren, die mit einer Fliege Linie kompatibel sind. Kontrolle und experimentelle fliegen werden in Ampullen mit der gleichen Menge Essen (NF oder HFD) gelegt.
	<ol><li>Einsatz CO 2 um die fliegen zu betäuben. 
		: Für Neulinge, bitte lesen Hinweis 21 für einen Überblick über Erziehung und Umgang mit D. Melanogaster.</li>
		<li>Sammeln 0-5 Tag alt fliegen von Vials und Transfer (mit Spiegeln) die fliegen in neue Ampullen mit NF (vorher bei Raumtemperatur erwärmt). Lassen Sie das Fliegen Alter für 5 zusätzliche Tage bei 21 ° c</li>
		<li>Am Ende der 5 Tage, nehmen Sie das Fläschchen mit HFD und NF von 4 ° c 
		Hinweis: wie Kälte Leben fliegen, stress können lassen Sie die Fläschchen für 30 min bei Raumtemperatur zum Aufwärmen vor dem Einsatz sitzen.</li>
		<li>Mit Feuchttücher, reinigen und entfernen Sie überschüssigen Flüssigkeit von den Seiten der Durchstechflaschen.</li>
		<li>Legen Sie ein kleines Stück Filterpapier, über 1 cm x 3 cm, in den hohen Fett essen, überschüssige Flüssigkeit zu absorbieren. 
		Hinweis: Dieser Schritt ist wichtig, zu verhindern, dass die fliegen kleben auf HFD Nahrung.</li>
		<li>Transfer als nächstes die fliegen auf den hohen Fett essen (mit Spiegeln). Legen Sie die Flaschen horizontal auf ihrer Seite (nicht stehend) bei 21-22 ° C für 5 Tage. 
		Hinweis: Vermeiden Sie höhere Temperaturen, da dies teilweise hohe fettreiche Nahrung, wodurch die fliegen zu essen und sterben Stick schmelzen kann.</li>
		<li>Nach 5 Tagen, transfer (mit Spiegeln) die fliegen von NF und HFD in neue Fläschchen ohne Nahrung für ihren Mut, für 30 min leer lassen. Als nächstes gehen Sie zum Wiegen der Flies. 
		Hinweis: Die entscheidenden Schritte in dieser HFD Fütterung Protokoll gehört zu einer gut durchmischten HFD, frei von jeder Brocken fliegen Essen oder kondensierten Öl vorzubereiten. Homogen mischen und Kühlung der HFD auf 45-30 ° C ist ratsam, vor dem Gießen in Fläschchen und Lagerung der Lebensmittel im richtigen Alter von 4 ° c Anpassung der Steuerung und experimentellen fliegen ist ebenso wichtig wie kontrollierte Ernährung und ökologischen Bedingungen vor die HFD Fütterung. Während der Einlaufphase Kontrolle und experimentelle fliegt die gleiche Menge an NF und HFD anzugeben. Sammeln Sie nie fliegen aus überfüllten Fläschchen oder Flaschen (zur Vermeidung von generationenübergreifenden Effekte). Setzen Sie immer maximal 25 fliegen pro Fläschchen während NF und HFD Fütterung um diätetische Einschränkung oder andere crowding Effekte zu vermeiden. Die HFD besteht aus 30 % Kokosöl, somit Temperaturen über 22 ° C könnte teilweise schmelzen HFD, wodurch die fliegen zum Aufkleben auf die fettige Lebensmittel und sterben. Reinigen Sie bevor die fliegen auf der HFD die Fläschchen, entfernen das restliche Öl und legen ein Filterpapier überschüssigen Flüssigkeit in der Nahrung zu absorbieren. Während der Inkubation der fliegen auf HFD, regelt die Fläschchen auf ihren Seiten um eine fettfreie horizontale Oberfläche für die fliegen.</li>
	</ol></li> <li>Wiegen die fliegen <ol><li>für jeden Genotyp und Geschlecht getestet werden, eine hochempfindliches Skala verwenden, um die Gewichte bereits beschriftete, leere 1,7 mL Röhrchen aufnehmen.</li>
		<li>Mit Fliege Betäubung oder CO 2, zu betäuben und 36 fliegen von den gleichen Genotyp, Geschlecht, zu sammeln und Einspeisung Status mit einem Pinsel in einer Pre-1,7 mL-Tube wog.</li>
		<li>Wiegen die Röhrchen mit fliegen mit der gleichen hochempfindliches Skala.</li>
		<li>Bestimmen das Durchschnittsgewicht fliegende nach dieser Formel: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56029/56029eq1.jpg" /> Hinweis: die Anzahl der fliegen in diesem Protokoll ist 36.</li>
		<li>Blitz Einfrieren der 1,7 mL-Röhrchen mit fliegen durch Eintauchen in flüssigem Stickstoff für 2 min. sammeln und die Rohre in Boxen. Als nächstes übertragen die Boxen bis-80 ° C (bevorzugte Temperatur) für die Lagerung bis zur Verwendung mit dem TAG-Assay. 
		Achtung: Flüssiger Stickstoff ist bei einer sehr niedrigen Temperatur. Bitte geeignete persönliche Schutzausrüstung benutzen.</li>
	</ol></li></ol> 2. TAG-Assay <ol><li>Vorbereitung der TAG standard Konzentrationen <ol><li>500 mL PBT vorbereiten (PBS 1 X 0,05 % Triton).</li>
		<li>Mit 0,5 mL Röhrchen und die TAG-Lösung (Table of Materials), bereiten Sie 100 µL des Rohlings (nur PBT) und 100 µL der sechs standard-TAG-Konzentrationen (2 µg/µL 1 µg/µL 0,5 µg/µL; 0,25 µg/µL; 0,125 µg/µL; 0,0625 µg/µL) mit der PBT.</li>
		<li>Die Rohre auf Eis legen und fahren Sie mit Schleifen fliegen.</li>
	</ol></li> <li>Schleifen die fliegen <ol><li>nehmen Sie die gefrorenen fliegen von-80 ° C (Schritt 1.3). Übertragen Sie die Röhrchen mit der fliegen auf Ice</li>
		<li>Zuerst legen Sie 2 mm Metall Mahlkugeln in eine 96-Well-Kugel-Spender, verwenden Sie einen kleinen Pinsel Extrakugeln entfernen.</li>
		<li>Ort der 96-Well-Schleifen Platte auf dem Kopf stehend auf dem Ball Dispenser und Flip die Metallkugeln direkt in die reibende Platte übertragen. Es sollte ein Ball pro Bohrloch.</li>
		<li>Mit einer Multi-Kanal-Pipette 600 µL PBT in jeder Zeile der Schleifscheibe 96-Well-Platte hinzufügen.</li>
		<li>Mit der Pinzette, fügen Sie 3 fliegt pro Bohrloch. Der Genotyp, Geschlecht und Ernährung Zustand der fliegen in jeder Zeile/gut von den Schleifen 96-Well-Platte.</li>
		<li>Legen Sie fest die Kappen auf die Schleifscheibe 96-Well-Platte. Band darf Sie nach oben, um sicherzustellen, dass es kein Durchsickern.</li>
		<li>Setzen Sie richtig die Schleifen 96-Well-Platten der Schleifmaschine. Die Maschine setzen, um die höchste Geschwindigkeit und Presse &#34; laufen &#34; die fliegen für 3 min. mahlen</li>
		<li>Nach 3 min, stoppen die Schleifen und fahren Sie mit Platte Zentrifugation: bewiesenge für 15 min bei 4.000 x g, 4 ° C. Nach Zentrifugation, verwalten die reibende Platte sorgfältig, um zu vermeiden, Mischen des Überstands mit dem Pellet.</li>
	</ol></li> <li>Probenbeladung und Bestimmung des TAG <ol><li>eine neue Spektralphotometer 96-Well-Platte zu nehmen. Mit einer Multi-Kanal-Pipette 200 µL des Reagenz TAG in jeder Zeile der Platte laden.</li>
		<li>Last 20 µL PBT in den ersten Brunnen der ersten Zeile ein Leerzeichen erstellen. Mischen von Pipettieren rauf und runter. Vermeiden Sie Luftblasen.</li>
		<li>Last 20 µL jeder standard Verdünnung (aus Schritt 2.1.2) in den übrigen Brunnen von der ersten Zeile und der Mix von Pipettieren rauf und runter. Vermeiden Sie Luftblasen.</li>
		<li>Mit einer Multi-Kanal-Pipette 20 µL des Überstandes aus jeder Zeile der reibende Platte auf die entsprechende Zeile in der 96-Well-Photometer-Platte übertragen. Pipette rauf und runter, gut mischen. Vermeiden Sie Luftblasen.</li>
		<li>Setzen Sie eine gasdurchlässige Folie oberhalb des 96-Well-Platte.</li>
		<li>Brüten die Platte bei 37 ° C für 10 min. 
		Hinweis: In den Brunnen gibt es Bläschen, Zentrifugieren der Platte für 2 min bei 2.000 x g um alle Luftblasen zu entfernen. Bläschen beeinträchtigt auch die Extinktion lesen.</li>
		<li>Lesen Sie die Absorption von jedem Bohrloch der Platte bei 550 nm mit einem kompatiblen Mikrotestplatte Reader. Als nächstes verfolgen die Standardkurve und bestimmen die Konzentration [µg/µL] unbekannter Proben.</li>
		<li>Um den Betrag des TAG-Inhalt pro mittlere fliegen Gewicht ermitteln verwenden Sie die folgende Formel: 
		<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56029/56029eq2.jpg" /> Hinweis: In diesem Protokoll wurden 3 fliegen in 600 µL PBT gehackt; in der Folge ist das mittlere Volumen pro Fliege 200 µL.</li>
	</ol></li> <li>Bradford-Test und Normalisierung des TAG-Inhalt mit Protein-Inhalt <ol><li>bereiten sieben 100 µL Rinderserumalbumin (BSA) standard Verdünnungen (75 µg/mL; 100 µg/mL; 150 µg/mL; 200 µg/mL; 250 µg/mL; 500 µg/mL; 1.000 µg/mL) mit der PBT.</li>
		<li>Nehmen eine neue 96-Well-Platte und 200 µL 1 X Bradford-Reagenz in jeder Zeile der Platte laden.</li>
		<li>In die erste Vertiefung der ersten Zeile fügen Sie 10 µL PBT erstelle ich eine leere. Mischen von Pipettieren rauf und runter. Vermeiden Sie Luftblasen.</li>
		<li>Fügen Sie 10 µL jeder standard Verdünnung in den verbleibenden Brunnen von der ersten Zeile und der Mix von Pipettieren rauf und runter. Vermeiden Sie Luftblasen.</li>
		<li>Mit einer Multi-Kanal-Pipette 10 µL Überstand der Fliege aus jeder Zeile der reibende Platte in die entsprechende Zeile in der 96-Well-Platte übertragen. Pipette rauf und runter, gut mischen. Vermeiden Sie Luftblasen.</li>
		<li>Legen Sie eine gasdurchlässige Folie oberhalb des 96-Well-Platte.</li>
		<li>Die Platte bei 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. In den Vertiefungen gibt es Bläschen, Zentrifugieren die Platte für 2 min bei 2.000 x g um sie zu entfernen. 
		Hinweis: Bläschen wird das Ablesen der Absorption stören.</li>
		<li>Einsatz einem Spektrophotometer zu lesen die Extinktion des Rohlings, Normen und unbekannte Proben bei 595 nm. Die Standardkurve verwenden, um die Konzentrationen [µg/µL] der Proben in jeder Zeile bestimmen.</li>
		<li>Normalisieren das TAG zufrieden mit Protein-Ebene mit Hilfe der folgenden Formel: 
		<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56029/56029eq3.jpg" /></li></ol></li></ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Adipositas-Induktion bei Mäusen kann Monate19,20nehmen. In Fliegen ermöglicht dieser HFD Fütterung Protokoll für die Induktion von überschüssigen Fettansammlung in einer Angelegenheit von Tagen oder weniger, verursachen erhöht in Fettansammlung erst nach 18 Uhr (siehe Abbildung 2). HFD füttern mit dem beschriebenen Protokoll Glukose Inhalt 12 erhöht oder verringert Bmm Lipase und PGC-1 Ausdru...

Wir befinden uns in einer Zeit, wo Übergewicht und die damit verbundenen wirtschaftlichen Belastungen ist ein weltweites Problem1. Zwei von drei Amerikanern sind übergewichtig oder fettleibig mit den damit verbundenen Herz Krankheiten, die primäre Ursache des Todes in der erwachsenen Bevölkerung2. Neue effiziente Methoden sind notwendig, um die genetischen und molekularen Komponenten beteiligt an der Regulation des metabolischen Syndroms mit Modellorganismen angemessen zu untersuchen. Aus diesem Grund wählen wir die Fruchtfliege Drosophila -Modell, weil es die grundlegende biologische Prozesse mit Säugetieren, einschließlich Menschen und Mäusen3,4,5,6teilt. Drosophila-Genom ist im Laufe der Evolution hoch konservierte aber insgesamt viel kleiner mit weniger Genduplikation und metabolische Komplexität, wodurch es ideal für das Verständnis der grundlegenden Mechanismen in vielen menschlichen Krankheiten4 verwickelt , 7 , 8. auch charakteristische Prozesse durchgeführt durch Fettgewebe, Darm und Bauchspeicheldrüse sind vertreten in der Fliege und vermitteln Regulierungsaufgaben in Glukose und Lipid-Stoffwechsel, zum Beispiel, die ähnlich wie Menschen9, 10,11. Darüber hinaus sind die grundlegende molekulare Wege der Kontrolle von Übergewicht, Insulinresistenz und Diabetes beim Menschen beteiligt in Drosophila Melanogaster12,13,14 funktionell konserviert. , 15 , 16. wie höhere Organismen, Drosophila hat ein schlagendes Herz, die während der Entwicklung durch ähnliche Prozesse der Säugetier-Herz3,17entsteht. So bieten die Entwicklung einer zuverlässigen HFD Fütterung Protokoll und hohem Durchsatz TAG Assay, angepasst für effiziente Sortierung Zwecke mit Hilfe den genetischen Werkzeugkasten von Drosophila, ein wichtiges Mittel zu untersuchen und verstehen die grundlegenden genetische Grundlagen zugrunde liegenden komplexen Stoffwechselerkrankungen.
Das HFD Essen selbst besteht aus einem Standardlabor fliegen Lebensmittel ergänzt mit Kokosnuss-Öl, besteht hauptsächlich aus gesättigten Fettsäuren bekannt, metabolisches Syndrom18zugeordnet werden soll. Während Fettleibigkeit bei Säugetieren Modelle, wie Nagetiere, Induktion Monate19,20nehmen kann, erhöht unsere optimierte HFD Protokoll in Drosophila füttern, effektiv und reproduzierbar organismal Fettgehalt in wenigen Tage12,14. Dieses Protokoll ermöglicht in Verbindung mit einem hohen Durchsatz TAG-Assay, effiziente mass Screening für die Auswirkungen der genetischen Faktoren, Umwelteinflüssen und Medikamentenkandidaten neue Modulatoren des Fettstoffwechsels zu entdecken. In der Folge dürften diese Protokolle zu verstehen und/oder Übergewicht und Fettleibigkeit verbundenen menschlichen Krankheiten zu bekämpfen.
Die Fütterung Protokoll ist vielseitig und kann angewendet werden, um die Stoffwechsel- und funktionelle Auswirkungen der einzelnen gesättigte oder ungesättigte Fettsäure zu studieren. Der Einsatz von Hochdurchsatz-TAG Assays beschränkt sich nicht auf D. Melanogaster, sondern kann auf eine Vielzahl von kleinen Modellorganismen mit Kutikula oder harte extrazellulären Matrizen(z. B.andere Drosophila -Arten, C. Elegans angepasst werden und anderen Wirbellosen Modellorganismen) Fettgehalt unter verschiedenen ökologischen, genetischen und physiologischen Bedingungen, in jedem Stadium der Entwicklung, Erwachsenenalter oder Phase Stoffwechselerkrankung zu messen. Die TAG-Assay basiert auf eine farbmetrische Messung aus einer Reihe von enzymatischen Reaktionen, die verschlechtern die TAGs in freie Fettsäuren, Glycerin, Glycerol-3-Phosphat und schließlich H2O2 , das mit 4-Aminoantipyrine (4-AAP) und 3,5 - reagiert Dichlor-2-Hydroxybenzene Sulfonate (3,5 DHBS) eine rote farbige Produkt zu produzieren, die mit einer 96-Well-Spektralphotometer gemessen wird.

<table><tbody><tr><td>Talboys Ball dropper/bead Dispenser</td><td>Talboys</td><td>#: 930150</td><td></td></tr><tr><td>Talboys High Throughput Homogenizer</td><td>Talboys</td><td>#: 930145</td><td></td></tr><tr><td>Grinding Balls, Stainless Steel&amp;nbsp;</td><td>OPS Diagnostics, LLC</td><td># GBSS 156-5000-01</td><td>5000 balls</td></tr><tr><td>Masterblock 96 Well deep Microplates</td><td>Greiner Bio-One</td><td># T-3058-1</td><td>case of 80 plates</td></tr><tr><td>Greiner&amp;nbsp; 96 well microplate flat bottom</td><td>Sigma Aldrich</td><td># M4436</td><td>40 plates</td></tr><tr><td>Greiner CapMat for sealing multiwell plates</td><td>Sigma Aldrich</td><td># C3606</td><td>50 sealing plates</td></tr><tr><td>Reagent Reservoirs&amp;nbsp;</td><td>Thomas Scientific</td><td># 1192T71</td><td>12/PK</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Finnpipette 4661040</td><td>Thermo Scientific</td><td># 4661040</td><td>1-10 ul multipipette</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Finnpipette 4661070</td><td>Thermo Scientific</td><td># 4661070</td><td>30-300ul multipipette</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Finnpipette 4661020</td><td>Thermo Scientific</td><td>#4661020</td><td>10-100ul multipipette</td></tr><tr><td>Multichannel tips</td><td>Denville Scientific Inc</td><td># P3131-S</td><td>for 10 uL pipette</td></tr><tr><td>Multichannel tips</td><td>Denville Scientific Inc</td><td># P3133-S</td><td>for 200 uL pipette</td></tr><tr><td>Multichannel tips</td><td>Denville Scientific Inc</td><td>#P1125</td><td>for 100 uL pipette</td></tr><tr><td>Forceps&amp;nbsp;</td><td>Roboz Surgical</td><td># 5 Dumonts</td><td>Super fine forceps</td></tr><tr><td>Mettler Toledo Excellence XS Analytical Balance Mfr# XS64</td><td>Cole-Parmer scientific experts</td><td># EW-11333-00</td><td></td></tr><tr><td>Metler Toledo Excellence XS Toploading Balance</td><td>Cole-Parmer scientific experts</td><td># EW-11333-49</td><td></td></tr><tr><td>96-Well microplate Centrifuge</td><td>Hettich Zentrifugen</td><td># Rotina 420R</td><td></td></tr><tr><td>Microplate Reader</td><td>Molecular devices</td><td># SpectraMax 190</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Line Bench Top Orbit Environ Shaker Incubator</td><td>Biostad</td><td># 3527</td><td></td></tr><tr><td>Infinity Triglycerides reagent</td><td>Thermo Scientific</td><td># TR22421</td><td></td></tr><tr><td>Triglyceride Standard</td><td>Stanbio</td><td>#2103 - 030</td><td></td></tr><tr><td>Quick Start Bradford Protein Assay</td><td>Bio-RAD</td><td># 500-0205</td><td>1x dye Reagent</td></tr><tr><td>Coconut oil</td><td>Nutiva</td><td># 692752200014</td><td>15 0z jar</td></tr><tr><td>PBS 10X</td><td>Thermo Scientific</td><td># AM9625</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td># 9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Gas-permeable Foil</td><td>Macherey-Nagel</td><td># 740675</td><td>50 pieces</td></tr><tr><td>filter Paper</td><td>VWR</td><td># 28317-241</td><td>Pack of 100</td></tr><tr><td>Drosophila vials</td><td>Genesee Scientific</td><td>Cat #: 32-116SB</td><td></td></tr><tr><td>Quick Start Bovine Serum Albumin Standard</td><td>Bio-Rad</td><td># 5000206</td><td></td></tr><tr><td>FlyNap Anesthetic</td><td>Carolina</td><td># 173025</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Kimwipes Low-Lint</td><td>Uline</td><td># S-8115</td><td>1-Ply, 4.4 x 8.4&quot;</td></tr></tbody></table>

high fat diet feeding and high throughput triacylglyceride assay in drosophila melanogaster

Herzkrankheit ist die häufigste Ursache des menschlichen Todes weltweit. Zahlreiche Studien haben starke Verbindungen zwischen Adipositas und kardiale Störungen beim Menschen gezeigt, aber mehr Instrumente und Forschungsanstrengungen sind erforderlich, die Mechanismen besser aufzuklären. Seit mehr als einem Jahrhundert, das genetisch sehr gefügig Modell von Drosophila maßgeblich an der Entdeckung der Schlüsselgene und molekulare Signalwege, die erwies sich als hoch über Artgrenzen konserviert werden. Viele biologische Prozesse und Krankheitsmechanismen sind funktionell in der Fliege, wie Entwicklung (z.B., Körper Plan, Herz), Krebs und Neurodegenerative Erkrankung erhalten. Vor kurzem spielte das Studium der Fettleibigkeit und sekundären Krankheiten wie Herz-Kreislauferkrankungen in Modellorganismen, eine sehr wichtige Rolle bei der Identifizierung der wichtigsten Regulatoren metabolisches Syndrom beim Menschen beteiligt.
Hier schlagen wir vor, diesem Modellorganismus als ein effizientes Werkzeug zu induzieren, Adipositas, d. h., übermäßige Fettansammlung, und entwickeln ein effizientes Protokoll zur Überwachung der Fettgehalt in Form von TAGs Anhäufung verwenden. Neben den hoch konservierte, aber weniger komplexes Genom hat die Fliege auch eine kurze Lebensdauer für schnelle Experimente, kombiniert mit Wirtschaftlichkeit. Dieser Artikel bietet ein detailliertes Protokoll für hohen Fett-Diät (HFD) Fütterung in Drosophila , Übergewicht und ein hoher Durchsatz Triacylglyceride (TAG) Assay für die Messung der damit verbundenen Zunahme der Fettgehalt, mit dem Ziel, sehr reproduzierbar zu induzieren und effizient für große genetische oder chemische Screening. Diese Protokolle bieten neue Möglichkeiten, um effizient Regulationsmechanismen beteiligt Fettleibigkeit zu untersuchen, sowie bieten eine standardisierte Plattform für Droge-Entdeckung-Forschung für die schnelle Prüfung der Wirkung von Medikamenten-Kandidaten auf die Entwicklung oder Vorbeugung von Fettleibigkeit, Diabetes und metabolische Erkrankungen.

In D. Melanogasterwie der Fall mit anderen Arten ist gibt es Geschlechtsdimorphismus zwischen Männchen und Weibchen22. Es ist bekannt, dass die Weibchen größer, mit mehr Fett in ihre Bäuche als Männchen22 sind. Um die Wirksamkeit unserer Protokoll zu testen, haben wir TAG Tests ermitteln die TAG inhaltliche Unterschiede zwischen Männchen und Weibchen Standardlabor Wildtyp (w1118) fliegt. Die Daten zeigen, d...

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High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Fettreiche Ernährung Fütterung und Hochdurchsatz Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Dies ist eine fettreiche Ernährung Fütterung Protokoll zur Fettleibigkeit in Drosophila, ein Modell für Verständnis grundlegende molekulare Mechanismen in Lipotoxicity verwickelt zu induzieren. Es bietet auch einen hohen Durchsatz Triacylglyceride Assay zur Messung der Fettansammlung in Drosophila und möglicherweise andere (Insekt) Modelle unter verschiedenen diätetischen, Umwelt, genetische oder physiologischen Bedingungen.

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

11.2K Aufrufe.  Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute. Dies ist eine fettreiche Ernährung Fütterung Protokoll zur Fettleibigkeit in Drosophila, ein Modell für Verständnis grundlegende molekulare Mechanismen in Lipotoxicity verwickelt zu induzieren. Es bietet auch einen hohen Durchsatz Triacylglyceride Assay zur Messung der Fettansammlung in Drosophila und möglicherweise andere (Insekt) Modelle unter verschiedenen diätetischen, Umwelt, genetische oder physiologischen Bedingungen.

Serie: High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

The incidence of complex metabolic diseases has increased as a result of a widespread transition towards lifestyles of increased caloric intake and lowered activity levels. These multifactorial diseases arise from a combination of genetic, environmental, and behavioral factors. One such complex disease is Metabolic Syndrome (MetS), which is a cluster of metabolic disorders, including hypertension, hyperglycemia, and abdominal obesity. Exercise and dietary intervention are the primary treatments recommended by doctors to mitigate obesity and its subsequent metabolic diseases. Exercise intervention, in particular aerobic interval training, stimulates favorable changes in the common risk factors for Type 2 Diabetes Mellitus (T2DM), Cardiovascular Disease (CVD), and other conditions. With the influx of evidence describing the therapeutic effect exercise has on metabolic health, establishing a system that models exercise in a controlled setting provides a valuable tool for assessing the effects of exercise in an experimental context. Drosophila melanogaster is a great tool for investigating the physiological and molecular changes that result from exercise intervention. The flies have short lifespans and similar mechanisms of metabolizing nutrients when compared to humans. To induce exercise in Drosophila, we developed a machine called the TreadWheel, which utilizes the fly&#39;s innate, negative geotaxis tendency to gently induce climbing. This enables researchers to perform experiments on large cohorts of genetically diverse flies to better understand the genotype-by-environment interactions underlying the effects of exercise on metabolic health.

The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster

The TreadWheel uses rotational motion to gently induce exercise in adult Drosophila melanogaster by exploiting flies&#39; innate, negative geotaxis. It allows for analysis of the interactions between exercise and factors, such as genotype, sex, and diet, and their effect on physiological and molecular assays to assess metabolic health.

TreadWheel: Intervall Trainingsprotokoll sanft induzierte Bewegung in Drosophila melanogaster

The incidence of complex metabolic diseases has increased as a result of a widespread transition towards lifestyles of increased caloric intake and ...

Forschung

Genetik

Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila

Food consumption is under the tight control of the brain, which integrates the physiological status, palatability, and nutritional contents of the food, and issues commands to start or stop feeding. Deciphering the processes underlying the decision-making of timely and moderate feeding carries major implications in our understanding of physiological and psychological disorders related to feeding control. Simple, quantitative, and robust methods are required to measure the food ingestion of animals after experimental manipulation, such as forcibly increasing the activities of certain target neurons. Here, we introduced dye-labeling-based feeding assays to facilitate the neurogenetic study of feeding control in adult fruit flies. We review available feeding assays, and then describe our methods step-by-step from setup to analysis, which combine thermogenetic and optogenetic manipulation of neurons controlling feeding motivation with dye-labeled food intake assay. We also discuss the advantages and limitations of our methods, compared with other feeding assays, to help readers choose an appropriate assay.

Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila

Quantitative food-intake assays with dyed food provide a robust and high-throughput means to evaluate feeding motivation. Combining the food consumption assay with thermogenetic and optogenetic screens is a powerful approach to investigate the neural circuits underlying appetite in adult Drosophila melanogaster.

Kombination von quantitativer Nahrungsaufnahme Assays und zwangsweise Aktivierung von Neuronen um Appetit in Drosophila studieren

Food consumption is under the tight control of the brain, which integrates the physiological status, palatability, and nutritional contents of the food, ...

Verhalten

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

Quantifying food intake in Drosophila is used to study the genetic and physiological underpinnings of consumption-associated traits, their environmental factors, and the toxicological and pharmacological effects of numerous substances. Few methods currently implemented are amenable to high throughput measurement. The Microplate Feeder Assay (MFA) was developed for quantifying the consumption of liquid food for individual flies using absorbance. In this assay, flies consume liquid food medium from select wells of a 1536-well microplate. By incorporating a dilute tracer dye into the liquid food medium and loading a known volume into each well, absorbance measurements of the well acquired before and after consumption reflect the resulting change in volume (i.e., volume consumed). To enable high throughput analysis with this method, a 3D-printed coupler was designed that allows flies to be sorted individually into 96-well microplates. This device precisely orients 96- and 1536-well microplates to give each fly access to up to 4 wells for consumption, thus enabling food preference quantification in addition to regular consumption. Furthermore, the device has barrier strips that toggle between open and closed positions to allow for controlled containment and release of a column of samples at a time. This method enables high throughput measurements of consumption of aqueous solutions by many flies simultaneously. It also has the potential to be adapted to other insects and to screen consumption of nutrients, toxins, or pharmaceuticals.

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

The microplate feeder assay offers an economical, high throughput method for quantifying liquid food consumption in Drosophila. A 3D-printed device connects a 96-well microplate in which flies are housed to a 1536-well microplate from which flies consume a feeding solution with a tracer dye. The solution volume decline is measured spectrophotometrically.

Ein Hochdurchsatz-Mikroplatten-Feeder-Assay zur Quantifizierung des Verbrauchs in Drosophila

Quantifying food intake in Drosophila is used to study the genetic and physiological underpinnings of consumption-associated traits, their environmental ...

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. When selecting sites to deposit their eggs, female flies are capable of ranking the relative attractiveness of their options and choosing the &#34;greater of two goods.&#34; However, most egg-laying preference assays are not practical if one wants to take a systematic genetic screening approach to search for the circuit basis underlying this simple decision-making process, as they are population-based and laborious to set up. To increase the throughput of studying of egg-laying preferences of single females, we developed custom chambers that each can simultaneously assay egg-laying preferences of up to thirty individual flies as well as a protocol that ensures each female has a high egg-laying rate (so that their preference is readily discernable and more convincing). Our approach is simple to execute and produces very consistent results. Additionally, these chambers can be equipped with different attachments to allow video recording the egg-laying animals and to deliver light for optogenetics studies. This article provides the blueprints for fabricating these chambers and the procedure for preparing the flies to be assayed in these chambers.

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

This protocol describes a high throughput assay for testing egg-laying preferences of Drosophila melanogaster at single-animal resolution. This assay provides a simple, efficient, and scalable platform to identify genes and circuit components that control a simple decision-making process.

Assay mit hohem Durchsatz Eiablage Präferenzen der einzelnen zu untersuchen<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. ...

Neurowissenschaften

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We demonstrate a simple way to tap into the fly reward system, modify experiences related to natural reward, and use voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states. The approach serves as a relevant tool to study the neurons and genes that play a role in experience-mediated changes of internal state. The protocol is composed of two discrete parts: exposing the flies to rewarding and nonrewarding experiences, and assaying voluntary ethanol consumption as a measure of the motivation to obtain a drug reward. The two parts can be used independently to induce the modulation of experience as an initial step for further downstream assays or as an independent two-choice feeding assay, respectively. The protocol does not require a complicated setup and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for inducing rewarding and nonrewarding experiences in fruit flies (Drosophila melanogaster) using voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states.

Ein einfacher Weg zu messen Veränderungen in Reward-seeking Verhalten verwenden<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of the right type and quantity of food therefore has a major influence on quality of life. Research on feeding behavior focuses on the underlying processes that ensure actual feeding and unravels the role of factors regulating internal energy homeostasis and the neuronal bases of decision-making. The model organism Drosophila melanogaster, with its great variety of genetically traceable tools for labeling and manipulating single neurons, allows mapping of neuronal networks and identification of molecular signaling cascades involved in the regulation of food intake. This report demonstrates the CApillary FEeder assay (CAFE) and shows how to measure food intake in a group of flies for time spans ranging from hours to days. This easy-to-use assay consists of glass capillaries filled with liquid food that flies can freely access and feed on. Food consumption in the assay is accurately determined using simple measurement tools. Herein we describe step-by-step the method from setup to successful execution of the CAFE assay, and provide practical examples to analyze the food intake of a group of flies under controlled conditions. The reader is guided through possible limitations of the assay, and advantages and disadvantages of the method compared to other feeding assays in D. melanogaster are evaluated.

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

The CApillary FEeder (CAFE) assay is a simple, budget-friendly, highly reliable method for investigating mechanisms underlying food intake. Used with the highly versatile genetic model organism Drosophila melanogaster, it provides a powerful means of gaining new insights into regulatory mechanisms of food intake.

Die kapillare feeder Assay misst die Nahrungsaufnahme in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

Stoffwechselanalyse von Drosophila Melanogaster Schildzecken und erwachsenen Gehirn

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

Biochemische und High Throughput Mikroskopische Beurteilung der Fettmasse in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

Biologie

Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Foraging and feeding behaviors allow animals to access sources of energy and nutrients essential for their development, health, and fitness. Investigating the neuronal regulation of these behaviors is essential for the understanding of the physiological and molecular mechanisms underlying nutritional homeostasis. The use of genetically tractable animal models such as worms, flies, and fish greatly facilitates these types of studies. In the last decade, the fruit fly Drosophila melanogaster has been used as a powerful animal model by neurobiologists investigating the neuronal control of feeding and foraging behaviors. While undoubtedly valuable, most studies examine adult flies. Here, we describe a protocol that takes advantage of the simpler larval nervous system to investigate neuronal substrates controlling feeding behaviors when larvae are exposed to diets differing in their protein and carbohydrates content. Our methods are based on a quantitative colorimetric no-choice feeding assay, performed in the context of a neuronal thermogenetic-activation screen. As a read-out, the amount of food eaten by larvae over a 1 h interval was used when exposed to one of the three dye-labeled diets that differ in their protein to carbohydrates (P:C) ratios. The efficacy of this protocol is demonstrated in the context of a neurogenetic screen in larval Drosophila, by identifying candidate neuronal populations regulating the amount of food eaten in diets of different macronutrient quality. We were also able to classify and group the genotypes tested into phenotypic classes. Besides a brief review of the currently available methods in the literature, the advantages and limitations of these methods are discussed and, also, some suggestions are provided about how this protocol might be adapted to other specific experiments.

Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Described here is a protocol that enables the colorimetric quantification of the amount of food eaten within a defined interval of time by Drosophila melanogaster larvae exposed to diets of different macronutrient quality. These assays are conducted in the context of a neuronal thermogenetic screen.

Quantifizierung der Zufuhr von Makronährstoffen in einem thermogenetischen neuronalen Bildschirm mit Drosophila Larven

Foraging and feeding behaviors allow animals to access sources of energy and nutrients essential for their development, health, and fitness. Investigating ...

A Rapid Food-Preference Assay in Drosophila

To select food with nutritional value while avoiding the consumption of harmful agents, animals need a sophisticated and robust taste system to evaluate their food environment. The fruit fly, Drosophila melanogaster, is a genetically tractable model organism that is widely used to decipher the molecular, cellular, and neural underpinnings of food preference. To analyze fly food preference, a robust feeding method is needed. Described here is a two-choice feeding assay, which is rigorous, cost-saving, and fast. The assay is Petri-dish-based and involves the addition of two different foods supplemented with blue or red dye to the two halves of the dish. Then, ~70 prestarved, 2-4-day-old flies are placed in the dish and&#160;allowed to choose between blue and red foods in the dark for about 90 min. Examination of the abdomen of each fly is followed by the calculation of the preference index. In contrast to multiwell plates, each Petri dish takes only ~20 s to fill and saves time and effort. This feeding assay can be employed to quickly determine whether flies like or dislike a particular food.

A Rapid Food-Preference Assay in Drosophila

We present a protocol for a two-choice feeding assay for flies. This feeding assay is fast and easy to run and is suitable not only for small-scale laboratory research, but also for high-throughput behavioral screens in flies.

Ein schneller Food-Preference-Test in Drosophila

To select food with nutritional value while avoiding the consumption of harmful agents, animals need a sophisticated and robust taste system to evaluate ...

Fettreiche Ernährung Fütterung und Hochdurchsatz Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

TreadWheel: Intervall Trainingsprotokoll sanft induzierte Bewegung in Drosophila melanogaster

Kombination von quantitativer Nahrungsaufnahme Assays und zwangsweise Aktivierung von Neuronen um Appetit in Drosophila studieren

Ein Hochdurchsatz-Mikroplatten-Feeder-Assay zur Quantifizierung des Verbrauchs in Drosophila

Assay mit hohem Durchsatz Eiablage Präferenzen der einzelnen zu untersuchen

Ein einfacher Weg zu messen Veränderungen in Reward-seeking Verhalten verwenden

Die kapillare feeder Assay misst die Nahrungsaufnahme in

Stoffwechselanalyse von Drosophila Melanogaster Schildzecken und erwachsenen Gehirn

Biochemische und High Throughput Mikroskopische Beurteilung der Fettmasse in

Quantifizierung der Zufuhr von Makronährstoffen in einem thermogenetischen neuronalen Bildschirm mit Drosophila Larven

Ein schneller Food-Preference-Test in Drosophila