私たちのプロトコルは、テスト感覚と食物消費に関与するすべての遺伝子、受容体、ニューロンおよび神経精神ヘッドのために設計することを可能にする強力なモデル生物であるフルーツフライのための細かいアッセイを実行するように設計されています。人間のように味わう食べ物のように飛ぶ:甘い、少し塩辛い、少し酸っぱい、または苦い、塩辛すぎる、または酸っぱすぎる味の食べ物を拒絶する。この技術の力は、スピードと利便性から来ています。
複雑なセットアップなしで、多くの異なるハエを短時間でPRHでテストすることができます。我々の方法は、ハエが特定の食品のように、同様に、特定の遺伝子製品が味の好みに影響を与える方法を理解するための優れた、優れたアッセイです。動物が特定の食べ物を受け入れるか拒絶するかの確立は困難です。
したがって、動物の好みの好みをテストするための標準プロトコルを確立することが重要です。アッセイ用の飢餓バイアルを準備するために、テストする各空のプラスチックフライバイアルの底にある組織の一部を緩やかに圧縮する。紙が密な質量を形成することなく、各バイアルに約3ミリリットルの純水で、立ち水なしで組織を完全に飽和させるために、この空間を満たすような。
バイアルの壁に余分な水の大きな液滴がないことを注意してください。あるいは、ショ糖を含まない1%Agrosの5ミリリットルは、実験の24時間前に二酸化炭素が2〜4日前のハエを麻酔し、ハエを約70のグループに分類する前に、浸した紙に置き換えることができます。その後、ハエの各グループを飢餓の卑劣に追加し、各バイアルに遺伝子型と飢餓開始の時間をラベル付けします。
実験を行う前に、異なる色の色の異なる同じ食品を使用して、各色素の希釈液の範囲を準備します。0.5グラムのアグロスと50ミリリットルの純水をマイクロ波安全容器に組み合わせ、必要に応じて攪拌を溶解するまでアグロ溶液を加熱します。各食品成分を溶解します, スクロースと任意の実験化合物を含む水中で 100 倍またはそれ以上の濃度でテストされた濃度.
そして、アグロ染料と所望の実験化合物を円錐形のポリプロピレン遠心分離管に混ぜます。混合した後、分配するまで摂氏60度の水浴にチューブを置き、最初のアッセイ皿の片側に実験食品と染料溶液の1色の1ミリリットルを追加します。アグロスは、コントロールフード溶液の1ミリリットルを追加する前に固まるまで冷却し、皿の反対側に2番目の染料色でラベル付けします。
次に、アッセイ皿調製を、反対の対照及び実験用染料溶液対で繰り返す。この結果を使用して、優先インデックスがゼロになる2つの色素濃度を特定します。実験化合物が添加されていない場合。
双方向給餌アッセイを行う。フライングやクライミングなどの明らかな運動活動が観察されないまで、最初に1つの実験的なフライを氷の上で3〜5分間麻痺させた。ハエが固定されたら、バイアルを穏やかに反転させ、ハエをアッセイチャンバーに移すためにタップし、すぐに蓋をチャンバーに置きます。
すべてのグループが転送されると、すべてのアッセイ室を暗くて閉じたスペースに90分間移動します。アッセイの終わりには、約1時間、マイナス20°Cの冷凍庫でチャンバーを反転させます。各チャンバをステレオ顕微鏡下に置く前に、各実験群におけるハエの腹部色を調べる。
ハエを数え、腹部が堅牢な摂食を示す50%以上の色である場合、腹部が食べ物の悪さを示す小さな食べ物のスポットしか含たないハエを捨てる。すべてのハエがカウントされた場合は、各グループの食品嗜好指数を定量化するために方程式を使用します。このアッセイでは、35ミリメートルの皿が2週間に分けられ、赤または青の染料と相まって、アグロの食べ物を含むコンパートメントで供給します。
染料バイアスを排除するために、青色と赤色の染料濃度を慎重に精製して、これら2つの染料のみを添加した場合に好みはほぼゼロになり、湿った飢えた大人のフライローディングの90分後に、青または赤のように見えた。動物が主に青または赤の食べ物を消費した場合、ハエが青と赤の両方を消費した場合、腹部は紫色に見えた。かなりの量の食物を摂取したハエだけが採点されたが、食物摂取量が不十分なハエは数え切れなかった。
このペトリ皿ベースのアッセイをマルチウェルプレートベースのアッセイと比較すると、2つの給餌方法は、野生型ハエの甘い、苦い、塩辛い食べ物に応答して本質的に同じアッセイの摂食結果を与えたことを明らかにしました。特に、しかし、60ウェルマルチウェルプレートよりもペトリ皿で食品を準備して配布する方がはるかに速いです。新しいダイエットバッチを作った後、特に使用する染料濃度を特定してください。
この濃度は、フライライン間で異なることができます。今日の私たちのペアは、ベースの2選択肢アッセイはあまりにも非常に強力です。ハエの様子を尋ねる場合は、実際の状態に損傷を受けた内部外枠の両方を感知し、適切な給餌と行動を行います。
