この仕事は a. b. に NIH GM117446 助成金によって支えられました。

1 のセルの準備の流れ Cytometry の並べ替え
<ol><li>文化一晩成長後 5 x 106 1.5 mL あたり7セルを 10 倍の密度に達するような YEPD 液 8 mL を含む 15 mL の試験管を接種する (注 1 の議論」を参照)。</li>
	<li>酵母 (1,400 × g、室温、4 ° C で) 5 分 15 mL スクリュー キャップ遠心管でスピンダウン、1.5 mL 70% エタノールで 1.6 の mL および microfuge の管に転送この座っている部屋の温度で 1 時間または氷 (少なくとも 3 h をさせる細胞を再懸濁します4 ° C で不明確に保存されることができます) (議論点 (2) を参照)。</li>
	<li>1 分の microfuge (14,000 x g、4 ° C) で酵母をスピン、1 分の 1 mL 50 mM クエン酸ナトリウム、pH 7.2、スピン ・ ダウン (14,000 x g, 4 ° C) で再懸濁します、上清を吸引、1 mL 50 mM クエン酸ナトリウム、pH 7.2 で再懸濁します、0.25 mg/mL 50 ° c または一晩熱ブロックまたは水浴で 37 ° C で 1 h RNAse ソリューションを含みます。</li>
	<li>50 μ L, プロテイナーゼ K 溶液 (20 mg/mL 10 mM Tris pH 7.5、2 mM CaCl2、ボリューム グリセリン 50% の重量で再停止される) を追加し、50 ° C で 1 時間インキュベート</li>
	<li>Cells (14,000 × g, 4 ° C) スピンダウン、1 mL 50 mM クエン酸ナトリウム、pH 7.2 細胞を再懸濁します、スピン ・ ダウン (14,000 x g、4 ° C)、真空上清を吸引、クエン酸ナトリウム 50 mM で再停止される 1 mL 1 μ M 緑核酸ひずみで再懸濁します、pH 7.2 室温で 1 時間暗闇の中で孵化、2 x 2 の超音波 s 各 (出力 2 ワット)。</li>
</ol>2. 細胞選別
<ol><li>図 1のように各細胞周期の段階から、少なくとも 160 万単相細胞を収集フェーズ G1、S、"初期 G2 は、"、「後半 G2」は、DNA 内容に従ってセルを並べ替えるセルの並べ替えアイコンを使用して、(議論点 (3) を参照)。</li>
	<li>Microfuge の管にセルを転送およびスピン ・ ダウンで 4 ° C、および microfuge 14,000 x g で 20 分間細胞と真空上清を吸引 (ペレットは、無期限に-20 ° C で凍結保存ことができます; ポイント (4) の議論を参照)。</li>
</ol>3. DNA の抽出とシーケンシング ライブラリの準備
注: 次の手順に基づいて酵母ゲノム DNA 抽出キットで「議定書 I」(材料の表を参照してください).
<ol><li>酵母細胞壁溶解酵素細胞壁や酵母細胞壁溶解酵素の 5 μ L を消化、ボルテックス、によって再懸濁します、37 ° C、40-60 分インキュベートすることができる独自のバッファー「消化バッファー」の 120 μ L を追加します。</li>
	<li>「換散バッファー、」洗剤と渦 10-20 s ハードを含む独自のバッファーの 120 μ L を追加します。</li>
	<li>250 μ L のクロロホルムを追加 - 徹底的にミックス 1 分。</li>
	<li>2 分間および microfuge の最高速度で回転します。</li>
	<li>DNA 結合列と、および microfuge の最高速度で 1 分間遠心上清をロードします。</li>
	<li>「DNA 洗浄バッファーの「エタノール、および、および microfuge の最大の速度で 1 分間遠心を含む独自バッファー 300 μ l を追加します。流れを破棄 DNA 洗浄バッファーの 300 μ L を追加し、洗浄プロセスを繰り返します。</li>
	<li>新鮮なおよび microfuge の管にスピン列を転送、水 (ない TE) の 60 μ L を追加 - 1-3 分待って、10 の遠心分離機、DNA を溶出します。</li>
	<li>された dsDNA 高感度バッファーで希釈 1: 200 と、指定された規格の 10 μ L を用いた校正、蛍光光度計で測定蛍光 dsDNA 高感度試薬の 195 μ L DNA の 5 μ L を追加することによって濃度を測定します。10 と 50 ng の DNA 収量の間期待します。</li>
	<li>超音波 (ピーク事件電源 450、デューティー比 30%、サイクル/バースト 200、治療時間 60 秒、水レベル 6) 250-350 bp の断片を DNA を破壊します。</li>
	<li>DNA サンプル調製キットを使用してライブラリを準備し、高速モードで DNA シーケンス楽器でシーケンス処理するそれ (少なくとも 1000 万 50 bp シングル エンド ヒット) (議論注 (5) を参照)。</li>
</ol>4. データ ・ レプリケーションの世代シーケンスの解析のプロファイルします。
<ol><li>Gsnap12を用いた出芽酵母sacCer3 ゲノム シーケンスを配置 (ディスカッション注 (6) を参照)。</li>
	<li>塩基あたりを読む Bedtools の"genomeCoverageBed"ソフトウェア13を使用して深さを決定します。</li>
	<li>存在する場合、読み取りの深さで artefactual スパイクを削除 (ディスカッション注 (7) を参照)。</li>
	<li>滑らかな読む深さ r"runMean"関数を使用してウィンドウをスライド 20 kb で中央分離帯を用いた染色体によってパッケージ"caTools"(ディスカッション注 (8) 参照)。</li>
	<li>プロットは完全にレプリケートされた読み取りの深さ (ディスカッション注 (9) を参照) の割合として S 段階、初期 G2 後半 G2 で深さを読みます。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+origin+activation+in+space+and+time.">DNA replication origin activation in space and time.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 360-374 (2015).</li><li>Santocanale, C., Diffley, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mec1-+and+Rad53-dependent+checkpoint+controls+late-firing+origins+of+DNA+replication.">A Mec1- and Rad53-dependent checkpoint controls late-firing origins of DNA replication.</a> Nature. 395, 615-618 (1998).</li><li>Brewer, B. J., Fangman, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+replication+fork+barrier+at+the+3'+end+of+yeast+ribosomal+RNA+genes.">A replication fork barrier at the 3' end of yeast ribosomal RNA genes.</a> Cell. 55, 637-643 (1988).</li><li>Raghuraman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+dynamics+of+the+yeast+genome.">Replication dynamics of the yeast genome.</a> Science. 294, 115-121 (2001).</li><li>Muller, C. A., Nieduszynski, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+replication+timing+reveals+global+and+local+regulation+of+replication+origin+activity.">Conservation of replication timing reveals global and local regulation of replication origin activity.</a> Genome Res. 22, 1953-1962 (2012).</li><li>Koren, A., Soifer, I., Barkai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRC1-dependent+scaling+of+the+budding+yeast+DNA+replication+timing+program.">MRC1-dependent scaling of the budding yeast DNA replication timing program.</a> Genome Res. 20, 781-790 (2010).</li><li>Lang, G. I., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+rates+across+budding+yeast+chromosome+VI+are+correlated+with+replication+timing.">Mutation rates across budding yeast chromosome VI are correlated with replication timing.</a> Genome Biol Evol. 3, 799-811 (2011).</li><li>Durkin, S. G., Glover, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+fragile+sites.">Chromosome fragile sites.</a> Annu Rev Genet. 41, 169-192 (2007).</li><li>Dillon, L. W., Burrow, A. A., Wang, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+instability+at+chromosomal+fragile+sites+in+cancer.">DNA instability at chromosomal fragile sites in cancer.</a> Curr Genomics. 11, 326-337 (2010).</li><li>Widrow, R. J., Hansen, R. S., Kawame, H., Gartler, S. M., Laird, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Very+late+DNA+replication+in+the+human+cell+cycle.">Very late DNA replication in the human cell cycle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 11246-11250 (1998).</li><li>Foss, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIR2+suppresses+replication+gaps+and+genome+instability+by+balancing+replication+between+repetitive+and+unique+sequences.">SIR2 suppresses replication gaps and genome instability by balancing replication between repetitive and unique sequences.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 552-557 (2017).</li><li>Wu, T. D., Reeder, J., Lawrence, M., Becker, G., Brauer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GMAP+and+GSNAP+for+Genomic+Sequence+Alignment:+Enhancements+to+Speed,+Accuracy,+and+Functionality.">GMAP and GSNAP for Genomic Sequence Alignment: Enhancements to Speed, Accuracy, and Functionality.</a> Methods Mol Biol. 1418, 283-334 (2016).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).</li><li>Langmead, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aligning+short+sequencing+reads+with+Bowtie.">Aligning short sequencing reads with Bowtie.</a> Curr Protoc Bioinformatics. , 17 (2010).</li><li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform.">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).</li><li>Kellis, M., Birren, B. W., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proof+and+evolutionary+analysis+of+ancient+genome+duplication+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Proof and evolutionary analysis of ancient genome duplication in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 428, 617-624 (2004).</li><li>Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coming+of+age:+ten+years+of+next-generation+sequencing+technologies.">Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies.</a> Nat Rev Genet. 17, 333-351 (2016).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

一方、この手法は堅牢で、比較的まっすぐな前方、特に注意は次に捧げられるべき。
(1) 以来、文化は接種後必要な密度だけ 4 h に到達した後収穫される場合細胞周期の分布に相違が顕在ログ段階に達する前に少なくとも 12 時間の文化が成長するを推奨します。我々 の仮定では比較的安定した平衡に達した細胞周期の分布はより飽和させた文化は、最近では新鮮な媒体に...

真核生物ゲノムのレプリケーションは、レプリケーションでは、レプリケーションからフォーク (Fragkosら2015年1文献) 両方の方向で進むの起源と呼ばれる複数の個別サイトで開始されます。起源が異なるタイミングと、焼成の効率とレプリケーション元のアクティビティを監視し、この変化の原因を解明するいくつかの手法が開発されました。個々 の原点の活動は、単一座礁させた DNA2、アクティブな起源の周りのフォームのレベルから推論できるまたは特定の複製中間体3を監視する第 2 ゲルの電気泳動を使用して、どちらで検出できます。放射性プローブ。起源は、前者の特定の知られていたシーケンスに制限され、これらの手法の両方はより簡単に出芽酵母よりも哺乳類セルので適用されます。マイクロ アレイの出現により、世界的に焼成の起源を評価することが可能になりました。これは最初重い同位体と DNA の分類、中含まれている軽い同位体に G1 ブロックから細胞を放出、重・軽ハイブリッド DNA ゲノム4の形成を監視によって行われました。高スループット シーケンスの導入許可同様ゲノムは、高価な同位体ラベリングの要件なしで活動を起源の監視します。細胞は、DNA の内容によると流れの cytometer のディープ シーケンスを受ける DNA ソートされます。シーケンスのカバレッジが S 期にわたって 2 倍に 1 x から進むにつれて、ので相対的なレプリケーションのタイミングは G1 あるいは G25,6S 期細胞の読み取りの深さを比較することによって評価できます。特に酵母に適用これらのテクニックは、dna 塩基配列、クロマチン構造と DNA 複製タンパク質起源タイミングと効率の規制方法のより深い理解につながった。
細胞増殖の中に遺伝情報の忠実な伝達には、DNA の複製の起源で行われるの唯一の成功の開始だけでなく、複製フォークが満たすために発生するレプリケーションが正常に完了が必要です。レプリケーションの開始のようなレプリケーションの完了のタイミングは、残りの細胞周期の後半でもレプリケートされていない特定の領域にゲノム間で異なります。このような領域は特にアクティブな複製の起源から遠いかシーケンスやクロマチン構造の DNA ポリメラーゼを阻害する場合があります。後期地域をレプリケートする染色体の破損および高い突然変異率と関連付けられ、がんと老化7,8,9に関与している壊れやすいサイトとして自分自身のマニフェストことができます。しかし、ゲノムの安定性の維持に DNA の複製が正しく完了の重要性にもかかわらずこれが起こる場所と方法の理解が遅れてレプリケーション開始。後半レプリケーションは病気に関連付けられている個々 の遺伝子の中で、たとえば、qPCR10場所の解明と後半のレプリケーションを欠けている原因の基礎となるグローバル研究検討されています。ここで我々 は"G2 seq"高スループット シーケンスのゲノム複製の完了に光を当てるとフローサイトメトリーを組み合わせる我々 として酵母の11を参照手法について述べる。軽微な変更は、このプロトコルは DNA 量順の流れをすることができます任意のセルに合わせることができます。

<table><tbody><tr><td>YeaStar Genomic DNA kit</td><td>Genesee Scientific</td><td>11-323</td><td></td></tr><tr><td>1 &amp;micro;M SYTOX Green</td><td>ThermoFisher</td><td>57020</td><td>resuspend in 50 mM sodium citrate, pH 7.2</td></tr><tr><td>50 mM sodium citrate, pH 7.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase solution (0.25 mg / mL)</td><td>Sigma</td><td>R6513</td><td>0.25 mg / mL RNaseA resuspended in 50 mM sodium citrate, pH 7.2, boil RNase solution for 10 minutes before the first use only, and from then on store at -20&amp;deg;</td></tr><tr><td>proteinase K solution (20 mg / mL)</td><td>ThermoFisher / Invitrogen</td><td>25530-015</td><td>resuspend in 10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50% glycerol, store at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Model 50 Sonic Dismembrator</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB50A220</td><td></td></tr><tr><td>BD Biosciences FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td>644832</td><td></td></tr><tr><td>Zymo-spin III columns</td><td>Zymo Research</td><td>C1005</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorometer</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Covaris Model LE220 Focused-Ultrasonicator</td><td>Covaris</td><td>500219</td><td></td></tr><tr><td>Illumina TruSeq DNA LT Sample Prep Kit</td><td>Illumina</td><td>15026486</td><td></td></tr><tr><td>Illumina HiSeq 2500 instrument</td><td>Illumina</td><td>SY&amp;ndash;401&amp;ndash;2501</td><td></td></tr><tr><td>gsnap alignment software</td><td>open source software / Genentech</td><td></td><td>http://research-pub.gene.com/gmap</td></tr></tbody></table>

g2-seq: a high throughput sequencing-based technique for identifying late replicating regions of the genome

多数の技術は、細胞周期の S 期で DNA 複製の進行状況を追跡する開発されています。これらの技術のほとんどは、場所の解明とゲノム重複ではなく、その完了の開始時期に向かって指示されています。しかし、我々 はこれらの地域の染色体の破損や、突然変異レベルが上昇に苦しむので、レプリケーションを完了する最後はゲノムの領域を理解し、彼らは病気と高齢化に関連付けられていることが重要です。ここで我々 は我々 が代わりにレプリケーションを完了する最後のゲノムのこれらの領域を識別するために複製開始反応を監視するために使用されている技術を拡張する方法について説明します。このアプローチは、フローサイトメトリーと高スループット シーケンスの組み合わせに基づいています。このレポートは、この手法の酵母への応用に焦点を当て、アプローチは DNA の内容によると流れの cytometer で並べ替えることができます任意のセルで使用できます。

我々 は出芽酵母における後半の複製サイトを識別するために上記の手順を使用しています。人工染色体の知られている遅い複製領域を使用してこの方法をテストを正確かつ信頼性の高い技術を証明しました。我々 の結果も示しているレプリケーションのタイムリーな完了の生物学的重要性染色体 7、我々 は G2 seq 結果に基づいて後期複製として識別、後期複製領域が...

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G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-seq: 高スループット シーケンス ベースを識別する方法後半ゲノムの領域を複製します。

フローサイトメトリーとゲノムの後半の複製領域を識別する高スループット シーケンスを結合する手法について述べる。

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

g2-seq-high-throughput-sequencing-based-technique-for-identifying

Research

JoVE Journal

Genetics

5.7K ビュー.  Fred Hutchinson Cancer Research Center. フローサイトメトリーとゲノムの後半の複製領域を識別する高スループット シーケンスを結合する手法について述べる。

ビデオ: G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable development and differentiation of different tissue types. Dysregulation of this process is often the hallmark of various diseases like cancer. Here, we outline one of the recent sequencing techniques, Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq), used to quantify methylation in various normal and disease tissues for large patient cohorts. We describe a detailed protocol of this affinity enrichment approach along with a bioinformatics pipeline to achieve optimal quantification. This technique has been used to sequence hundreds of patients across various cancer types as a part of the 1,000 methylome project (Cancer Methylome System).

Here we present a protocol to investigate genome wide DNA methylation in large scale clinical patient screening studies using the Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq or MBD-seq) technology and the subsequent bioinformatics analysis pipeline.

患者の組織のためのメチル結合DNA捕捉シーケンシング

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

遺伝学

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic region is replicated at a distinct time during S phase through the simultaneous activation of multiple origins of replication. Time of replication (ToR) correlates with many genomic and epigenetic features and is linked to mutation rates and cancer. Comprehending the full genomic view of the replication program, in health and disease is a major future goal and challenge.
This article describes in detail the &#34;Copy Number Ratio of S/G1 for mapping genomic Time of Replication&#34; method (herein called: CNR-ToR), a simple approach to map the genome wide ToR of mammalian cells. The method is based on the copy number differences between S phase cells and G1 phase cells. The CNR-ToR method is performed in 6 steps: 1. Preparation of cells and staining with propidium iodide (PI); 2. Sorting G1 and S phase cells using fluorescence-activated cell sorting (FACS); 3. DNA purification; 4. Sonication; 5. Library preparation and sequencing; and 6. Bioinformatic analysis. The CNR-ToR method is a fast and easy approach that results in detailed replication maps.

We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

DNA含有量測定法による哺乳類の複製タイミングのゲノムワイドな決意

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that control the fidelity of transcription. To fill this gap in scientific knowledge, we recently optimized the circle-sequencing assay to detect transcription errors throughout the transcriptome of Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, and Caenorhabditis elegans. This protocol will provide researchers with a powerful new tool to map the landscape of transcription errors in eukaryotic cells so that the mechanisms that control the fidelity of transcription can be elucidated in unprecedented detail.

This protocol provides researchers with a new tool to monitor the fidelity of transcription in multiple model organisms.

真核生物の転写エラーのゲノム全体の監視

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and effect sizes of regulatory elements to a target gene. Some progress has been made with the bioinformatic prediction of the existence and function of proximal epigenetic modifications associated with activated gene expression using conserved transcription factor binding sites. Chromatin conformation capture studies have revolutionized our ability to discover physical chromatin contacts between sequences and even within an entire genome. Circular chromatin conformation capture coupled with next-generation sequencing (4C-seq), in particular, is designed to discover all possible physical chromatin interactions for a given sequence of interest (viewpoint), such as a target gene or a regulatory enhancer. Current 4C-seq strategies directly sequence from within the viewpoint but require numerous and diverse viewpoints to be simultaneously sequenced to avoid the technical challenges of uniform base calling (imaging) with next generation sequencing platforms. This volume of experiments may not be practical for many laboratories. Here, we report a modified approach to the 4C-seq protocol that incorporates both an additional restriction enzyme digest and qPCR-based amplification steps that are designed to facilitate a greater capture of diverse sequence reads and mitigate the potential for PCR bias, respectively. Our modified 4C method is amenable to the standard molecular biology lab for assessing chromatin architecture.

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

The identification of physical interactions between genes and regulatory elements is challenging but has been facilitated by chromosome conformation capture methods. This modification to the 4C-seq protocol mitigates PCR bias by minimizing over-amplification of PCR templates and maximizes the mappability of reads by incorporating an addition restriction enzyme digest step.

円の染色体構造の次世代シーケンシングによる遺伝子制御配列の高スループット識別キャプチャ (4 C seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

<meta charset="utf8"></head><body>DNA複製およびフォークストールイベントの解析のための2Dゲル電気泳動

Electrophoretic Analysis of Replication Through Structure-Prone DNA Repeats Within the SV40-Based Human Episome

Two-dimensional neutral/neutral gel-electrophoresis (2DGE) emerged as a benchmark technique to analyze DNA replication through natural impediments. This protocol describes how to analyze replication fork progression through structure-prone, expandable DNA repeats within the simian virus 40 (SV40)-based episome in human cells. In brief, upon plasmid transfection into human cells, replication intermediates are isolated by the modified Hirt protocol and treated with the DpnI restriction enzyme to remove non-replicated DNA. Intermediates are then digested by appropriate restriction enzymes to place the repeat of interest within the origin-distal half of a 3-5 kb-long DNA fragment. The replication intermediates are separated into two perpendicular dimensions, first by size and then by shape. Following Southern blot hybridization, this approach allows researchers to observe fork stalling at various structure-forming repeats on the descending half of the replication Y-arc. Furthermore, this positioning of the stall site allows the visualization of various outcomes of repeat-mediated fork stalling, such as fork reversal, the advent of a converging fork, and recombinational fork restart.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:病原性リピートのDNA複製の特性評価による複製フォークの停止と拡大のメカニズムの解明

Here, we outline the procedure for analyzing replication progression through pathogenic, structure-prone repeats using 2-dimensional gel electrophoresis.

SV40ベースのヒトエピソーム内での構造性DNAリピートを介した複製の電気泳動解析

Two-dimensional neutral/neutral gel-electrophoresis (2DGE) emerged as a benchmark technique to analyze DNA replication through natural impediments. This ...

Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the standard protocols for generating genomic or transcriptomic libraries are incompatible and researchers must choose whether to sequence DNA or RNA for a particular sample. Gel-seq solves this problem by enabling researchers to simultaneously prepare libraries for both DNA and RNA starting with 100 - 1000 cells using a simple hydrogel device. This paper presents a detailed approach for the fabrication of the device as well as the biological protocol to generate paired libraries. We designed Gel-seq so that it could be easily implemented by other researchers; many genetics labs already have the necessary equipment to reproduce the Gel-seq device fabrication. Our protocol employs commonly-used kits for both whole-transcript amplification (WTA) and library preparation, which are also likely to be familiar to researchers already versed in generating genomic and transcriptomic libraries. Our approach allows researchers to bring to bear the power of both DNA and RNA sequencing on a single sample without splitting and with negligible added cost.

Gel-seq enables researchers to simultaneously prepare libraries for both DNA- and RNA-seq at negligible added cost starting from 100 - 1000 cells using a simple hydrogel device. This paper presents a detailed approach for the fabrication of the device as well as the biological protocol to generate paired libraries.

ゲル-seq: DNA および RNA のゲルのマトリックスを使用しての同時配列ライブラリの準備の方法

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the ...

生物工学

Integration of Wet and Dry Bench Processes Optimizes Targeted Next-generation Sequencing of Low-quality and Low-quantity Tumor Biopsies

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using bioinformatics pipelines (&#34;dry bench&#34;). Both elements are essential to produce accurate and reliable results, which are particularly critical for clinical laboratories. Targeted NGS technologies have increasingly found favor in oncology applications to help advance precision medicine objectives, yet the methods often involve disconnected and variable wet and dry bench workflows and uncoordinated reagent sets. In this report, we describe a method for sequencing challenging cancer specimens with a 21-gene panel as an example of a comprehensive targeted NGS system. The system integrates functional DNA quantification and qualification, single-tube multiplexed PCR enrichment, and library purification and normalization using analytically-verified, single-source reagents with a standalone bioinformatics suite. As a result, accurate variant calls from low-quality and low-quantity formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) and fine-needle aspiration (FNA) tumor biopsies can be achieved. The method can routinely assess cancer-associated variants from an input of 400 amplifiable DNA copies, and is modular in design to accommodate new gene content. Two different types of analytically-defined controls provide quality assurance and help safeguard call accuracy with clinically-relevant samples. A flexible &#34;tag&#34; PCR step embeds platform-specific adaptors and index codes to allow sample barcoding and compatibility with common benchtop NGS instruments. Importantly, the protocol is streamlined and can produce 24 sequence-ready libraries in a single day. Finally, the approach links wet and dry bench processes by incorporating pre-analytical sample quality control results directly into the variant calling algorithms to improve mutation detection accuracy and differentiate false-negative and indeterminate calls. This targeted NGS method uses advances in both wetware and software to achieve high-depth, multiplexed sequencing and sensitive analysis of heterogeneous cancer samples for diagnostic applications.

An integrated system for targeted next-generation sequencing of oncology specimens is described. This cross-platform system is optimized for low-quality and low-quantity tumor biopsies, accommodates low DNA inputs, includes well-characterized multi-variant controls, and features a novel variant caller that is informed by quantitative pre-analytical quality control measures.

ウェットとドライベンチ・プロセスの統合は、低品質と低量腫瘍生検の標的次世代シーケンシングを最適化

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using ...

医学

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes and analysis of complex structural variants. Nanopore platforms perform single-molecule sequencing by directly measuring the current changes mediated by DNA passage through the pores and can generate hundreds of kilobase (kb) reads with minimal capital cost. This platform has been adopted by many researchers for a variety of applications. Achieving longer sequencing read lengths is the most critical factor to leverage the value of nanopore sequencing platforms. To generate ultra-long reads, special consideration is required to avoid DNA breakages and gain efficiency to generate productive sequencing templates. Here, we provide the detailed protocol of ultra-long DNA sequencing including high molecular weight (HMW) DNA extraction from fresh or frozen cells, library construction by mechanical shearing or transposase fragmentation, and sequencing on a nanopore device. From 20-25 &#181;g of HMW DNA, the method can achieve N50 read length of 50-70 kb with mechanical shearing and N50 of 90-100 kb read length with transposase mediated fragmentation. The protocol can be applied to DNA extracted from mammalian cells to perform whole genome sequencing for the detection of structural variants and genome assembly. Additional improvements on the DNA extraction and enzymatic reactions will further increase the read length and expand its utility.

Long-read sequences greatly facilitate the assembly of complex genomes and characterization of structural variation. We describe a method to generate ultra-long sequences by nanopore-based sequencing platforms. The approach adopts an optimized DNA extraction followed by modified library preparations to generate hundreds of kilobase reads with moderate coverage from human cells.

全 Genomic DNA 分析のための超長いリード シーケンス

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...

G2-seq: 高スループットシーケンスベースを識別する方法後半ゲノムの領域を複製します。

要約

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患者の組織のためのメチル結合DNA捕捉シーケンシング

DNA含有量測定法による哺乳類の複製タイミングのゲノムワイドな決意

真核生物の転写エラーのゲノム全体の監視

円の染色体構造の次世代シーケンシングによる遺伝子制御配列の高スループット識別キャプチャ (4 C seq)

SV40ベースのヒトエピソーム内での構造性DNAリピートを介した複製の電気泳動解析

SV40ベースのヒトエピソーム内での構造性DNAリピートを介した複製の電気泳動解析

SV40ベースのヒトエピソーム内での構造性DNAリピートを介した複製の電気泳動解析

ゲル-seq: DNA および RNA のゲルのマトリックスを使用しての同時配列ライブラリの準備の方法

ウェットとドライベンチ・プロセスの統合は、低品質と低量腫瘍生検の標的次世代シーケンシングを最適化

全 Genomic DNA 分析のための超長いリードシーケンス

G2-seq: 高スループット シーケンス ベースを識別する方法後半ゲノムの領域を複製します。

要約

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患者の組織のためのメチル結合DNA捕捉シーケンシング

DNA含有量測定法による哺乳類の複製タイミングのゲノムワイドな決意

真核生物の転写エラーのゲノム全体の監視

円の染色体構造の次世代シーケンシングによる遺伝子制御配列の高スループット識別キャプチャ (4 C seq)

SV40ベースのヒトエピソーム内での構造性DNAリピートを介した複製の電気泳動解析

SV40ベースのヒトエピソーム内での構造性DNAリピートを介した複製の電気泳動解析

SV40ベースのヒトエピソーム内での構造性DNAリピートを介した複製の電気泳動解析

ゲル-seq: DNA および RNA のゲルのマトリックスを使用しての同時配列ライブラリの準備の方法

ウェットとドライベンチ・プロセスの統合は、低品質と低量腫瘍生検の標的次世代シーケンシングを最適化

全 Genomic DNA 分析のための超長いリード シーケンス

G2-seq: 高スループットシーケンスベースを識別する方法後半ゲノムの領域を複製します。

全 Genomic DNA 分析のための超長いリードシーケンス