עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH GM117446 א.

1. הכנת התאים עבור Flow Cytometry מיון
<ol><li>לחסן 15 מ"ל מבחנות המכילות 8 מ ל כל אחד YEPD מרק כזה התרבויות להגיע צפיפות של 5 x 106 כדי 1.5 x 107 תאים לכל mL לאחר צמיחה לילה (ראה דיון הערה 1).</li>
	<li>ספין למטה תאי שמרים (1,400 x g, בטמפרטורת החדר או 4 ° C) בשפופרת צנטרפוגה בורג מכסה 15 mL במשך 5 דקות, resuspend תאים 1.5 מ ל-70% אתנול, העברת צינור microfuge מ ל 1.6, נותן זה שב h 1 בטמפרטורת החדר או לפחות 3 h בקרח ( ניתן לאחסן עד אין סוף ב 4 ° C) (ראה דיון פוינט (2)).</li>
	<li>ספין למטה תאי שמרים microfuge (14,000 x g, 4 ° C) במשך 1 דקה, resuspend ב 1 מ"ל 50 מ מ סודיום ציטרט, pH 7.2, ספין למטה (g 14,000 x, 4 ° C) במשך 1 דקה, תשאף תגובת שיקוע, resuspend ב 1 מ"ל 50 מ מ סודיום ציטרט, pH 7.2 , המכילה 0.25 מ"ג/מ"ל פתרון RNAse h 1 ב 50 מעלות צלזיוס או ללון ב 37 מעלות צלזיוס באמבטיה בלוק או מים חום.</li>
	<li>הוספת µL 50 proteinase K פתרון (20 מ"ג/מ"ל resuspended ב- 10 מ מ טריס pH 7.5, מ מ 2 CaCl2, 50% משקל נפח גליצרול) ואת תקופת דגירה של h 1 ב 50 º C.</li>
	<li>ספין למטה תאים (14,000 x g, 4 ° C), resuspend תאים 1 מ"ל 50 מ מ סודיום ציטרט, pH 7.2, ספין למטה (14,000 x g, 4 ° C), תשאף תגובת שיקוע עם ואקום, resuspend ב 1 מ"ל 1 מיקרומטר חומצת גרעין ירוק זן resuspended ב-50 מ מ סודיום ציטרט , pH 7.2 ו דגירה בחושך לשעה בטמפרטורת החדר, sonicate 2 x עבור 2 s כל (פלט כוח 2 וואט).</li>
</ol>2. התא מיון
<ol><li>שימוש של סדרן התא, למיין תאים על פי תוכן ה-DNA לשלבים G1 ', ' S ', "G2 מוקדם", ו "G2 מאוחר", איסוף תאים הפלואידי לפחות 1.6 מיליון כל שלב מחזור התא כמו באיור 1 (ראה הדיון בנקודה (3)).</li>
	<li>להעביר תאים microfuge צינורות ו ספין למטה תאים עבור 20 דקות ב g 14,000 x-4 מעלות צלזיוס ב microfuge האחות תגובת שיקוע עם ואקום (בגדר ניתן לאחסן קפוא ב-20 ° C ללא הגבלת זמן; ראה דיון הצבע (4)).</li>
</ol>3. דנ א החילוץ, הכנת רצף ספריות
הערה: השלבים הבאים מבוססים על "פרוטוקול אני" בהפקת דנ א גנומי שמרים קיט (ראה טבלה של חומרים).
<ol><li>הוסף µL 120 "מאגר עיכול," מאגר קנייני המאפשרת שמרים אנזים lytic לעכל את דופן התא, µL 5 של האנזים lytic שמרים, resuspend על ידי vortexing של דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 40-60 דקות.</li>
	<li>הוסף µL 120 "מאגר פירוק," מאגר קניינית המכיל חומרי ניקוי, ואת מערבולת קשה עבור s 10-20.</li>
	<li>הוסף כלורופורם µL 250 - לערבב היטב עבור 1 דקות.</li>
	<li>ספין במהירות מקסימלית microfuge למשך 2 דקות.</li>
	<li>לטעון את תגובת שיקוע עמודה איגוד ה-DNA ועל צנטריפוגה במהירות מקסימלית microfuge עבור 1 דקות.</li>
	<li>להוסיף 300 µL "ה-DNA שטיפה מאגר," מאגר קניינית המכיל אתנול, צנטריפוגה עבור 1 דקות במהירות מקסימלית microfuge. למחוק את הזרימה, להוסיף 300 µL מאגר ה-DNA לשטוף, לחזור על התהליך לשטוף.</li>
	<li>להעביר את העמודה ספין צינור microfuge טריים, להוסיף 60 µL של מים (לא טה) - לחכות 1-3 דקות, ואז צנטריפוגה 10 s כדי elute את ה-DNA.</li>
	<li>למדוד ריכוז על ידי הוספת 5 µL של ה-DNA µL 195 של ריאגנט רגישות גבוהה dsDNA, כי כבר 1:200 מדולל במאגר רגישות גבוהה dsDNA ולאחר מכן פלורסצנטיות מדידה ב fluorometer, באמצעות µL 10 התקנים שסופקו לכיול; מצפה בין 10 עד 50 ng של התשואה הכוללת הדנ א.</li>
	<li>Sonicate (שיא האירוע כוח 450, פקטור חובה 30%, מחזורים לכל פרץ 200, טיפול זמן 60 s, מפלס המים 6) כדי לשבור את ה-DNA לחלקים bp 250-350.</li>
	<li>להכין ספריה באמצעות ערכת הכנה דגימת דנ א, רצף זה (לפחות 10 מיליון 50 bp יחיד-end reads) על הכלי רצפי DNA במצב מהיר (ראה הערה לדיון (5)).</li>
</ol>4. ניתוח של רצף נתונים והפקת שכפול פרופילים
<ol><li>ליישר רצפי הגנום sacCer3 האפייה באמצעות Gsnap12 (ראה הערה לדיון (6)).</li>
	<li>לקבוע לכל בסיס זוג לקרוא לעומק באמצעות תוכנת Bedtools' "genomeCoverageBed"13.</li>
	<li>להסיר קוצים artefactual בעומקים קרא, אם מתנה (ראה הערה לדיון (7)).</li>
	<li>חלקה לקרוא לעומק על ידי כרומוזום באמצעות medians 20 kb הזזה חלון באמצעות הפונקציה "runMean" ב- R חבילת "caTools" (ראה הערה לדיון (8)).</li>
	<li>מגרש לקרוא לעומק שלב S, G2 מוקדם ו G2 מאוחר כאחוז משוכפל לגמרי במעמקי קריאה (ראה הערה לדיון (9)).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+origin+activation+in+space+and+time.">DNA replication origin activation in space and time.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 360-374 (2015).</li><li>Santocanale, C., Diffley, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mec1-+and+Rad53-dependent+checkpoint+controls+late-firing+origins+of+DNA+replication.">A Mec1- and Rad53-dependent checkpoint controls late-firing origins of DNA replication.</a> Nature. 395, 615-618 (1998).</li><li>Brewer, B. J., Fangman, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+replication+fork+barrier+at+the+3'+end+of+yeast+ribosomal+RNA+genes.">A replication fork barrier at the 3' end of yeast ribosomal RNA genes.</a> Cell. 55, 637-643 (1988).</li><li>Raghuraman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+dynamics+of+the+yeast+genome.">Replication dynamics of the yeast genome.</a> Science. 294, 115-121 (2001).</li><li>Muller, C. A., Nieduszynski, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+replication+timing+reveals+global+and+local+regulation+of+replication+origin+activity.">Conservation of replication timing reveals global and local regulation of replication origin activity.</a> Genome Res. 22, 1953-1962 (2012).</li><li>Koren, A., Soifer, I., Barkai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRC1-dependent+scaling+of+the+budding+yeast+DNA+replication+timing+program.">MRC1-dependent scaling of the budding yeast DNA replication timing program.</a> Genome Res. 20, 781-790 (2010).</li><li>Lang, G. I., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+rates+across+budding+yeast+chromosome+VI+are+correlated+with+replication+timing.">Mutation rates across budding yeast chromosome VI are correlated with replication timing.</a> Genome Biol Evol. 3, 799-811 (2011).</li><li>Durkin, S. G., Glover, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+fragile+sites.">Chromosome fragile sites.</a> Annu Rev Genet. 41, 169-192 (2007).</li><li>Dillon, L. W., Burrow, A. A., Wang, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+instability+at+chromosomal+fragile+sites+in+cancer.">DNA instability at chromosomal fragile sites in cancer.</a> Curr Genomics. 11, 326-337 (2010).</li><li>Widrow, R. J., Hansen, R. S., Kawame, H., Gartler, S. M., Laird, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Very+late+DNA+replication+in+the+human+cell+cycle.">Very late DNA replication in the human cell cycle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 11246-11250 (1998).</li><li>Foss, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIR2+suppresses+replication+gaps+and+genome+instability+by+balancing+replication+between+repetitive+and+unique+sequences.">SIR2 suppresses replication gaps and genome instability by balancing replication between repetitive and unique sequences.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 552-557 (2017).</li><li>Wu, T. D., Reeder, J., Lawrence, M., Becker, G., Brauer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GMAP+and+GSNAP+for+Genomic+Sequence+Alignment:+Enhancements+to+Speed,+Accuracy,+and+Functionality.">GMAP and GSNAP for Genomic Sequence Alignment: Enhancements to Speed, Accuracy, and Functionality.</a> Methods Mol Biol. 1418, 283-334 (2016).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).</li><li>Langmead, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aligning+short+sequencing+reads+with+Bowtie.">Aligning short sequencing reads with Bowtie.</a> Curr Protoc Bioinformatics. , 17 (2010).</li><li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform.">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).</li><li>Kellis, M., Birren, B. W., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proof+and+evolutionary+analysis+of+ancient+genome+duplication+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Proof and evolutionary analysis of ancient genome duplication in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 428, 617-624 (2004).</li><li>Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coming+of+age:+ten+years+of+next-generation+sequencing+technologies.">Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies.</a> Nat Rev Genet. 17, 333-351 (2016).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

טכניקה זו היא חזקה, יחסית ישר קדימה, תשומת לב מיוחדת צריכה להיות מוקדש הבאות:
(1) אנו ממליצים כי תרבויות לגדול במשך לפחות 12 שעות לפני שהם מגיעים שלב יומן, שכן ההבדלים באה לידי ביטוי מחזור התא הפצות אם תרבויות נקצרים לאחר שהגיעו ה הרצוי צפיפות 4 רק לאחר חיסון. ההנחה שלנו היא כי הת...

שכפול גנום האיקריוטים מאותחלת באתרים נפרדים מרובים, שנקרא מקורותיה של שכפול, בשכפול אילו מזלגות להמשיך בשני הכיוונים (שבתוך Fragkos. et al., 20151). המקורות נבדלים הן שלהם העיתוי ואת היעילות של ירי, מספר טכניקות פותחו כדי לעקוב אחר פעילות מקור שכפול, להבהיר את הסיבות של וריאציה זו. הפעילות של המקורות הבודדים שניתן להסיק מן רמות של דנ א חד גדילי2, המהווה סביב מקורות פעילים, או באמצעות דו-ממדית בג'ל כדי לפקח על שכפול ספציפי ביניים3, אשר שניהם להיות מזוהה עם הגששים רדיואקטיבי. שניהם של טכניקות אלה יוחלו ביתר קלות לפי cerevisiae ס מאשר בתאי יונקים, כי מקורות מוגבלים ספציפית ידועים רצפי לשעבר. עם כניסתו של מיקרו-מערכים, זה הפך אפשרי להעריך מקור ירי באופן גלובלי. זה נעשה לראשונה על ידי תיוג DNA עם איזוטופים כבדים, שחרור תאים בלוק G1 לתוך בינוני המכיל אור האיזוטופים, וניטור ואז היווצרות של כבד-אור היברידית DNA ברחבי הגנום4. המבוא של רצפי התפוקה גבוהה מותר הגנום כולו דומה ניטור של מקור פעילות ללא הדרישה של תיוג איזוטרופי יקר. התאים היו ממויין של cytometer הזרימה על פי תוכן ה-DNA ו- DNA שלהם נתון רצף עמוק. בגלל רצף כיסוי בהתאמה מ 1 x 2 x במהלך שלב S, תזמון שכפול יחסית יכול להיות מוערך על ידי השוואת בעומק קריאה של תאים בשלב S לאלה ב- G1 או G25,6. שיטות אלה, במיוחד שהוחל שמרים, הובילה הבנה עמוקה יותר של כיצד רצף הדנ א הכרומטין, חלבונים שכפול ה-DNA להסדיר מקור תזמון ויעילות.
הנאמן והעברת מידע גנטי במהלך ההפצה הסלולר מחייב חניכה לא רק מוצלח של שכפול ה-DNA, באישון מוצאו, אלא גם סיומו המוצלח של שכפול, אשר מתרחשת שבו נפגשים מזלגות שכפול. כמו חניכה של שכפול, העיתוי של השלמת השכפול משתנה לאורך הגנום עם אזורים מסוימים שנותרו unreplicated אפילו מאוחר במחזור התא. אזורים כאלה עשויים להיות רחוקים במיוחד ממוצא שכפול active או עשוי להכיל רצפים או מבנים כרומטין הפוגעים דנ א polymerases. מאוחר לבצע שיכפול אזורים עלולים להתבטא כמו אתרים שבירים, אשר משויכות כרומוזומלית וקצבי מוטציה גבוהה יותר, היו מעורבים בסרטן, הזדקנות-7,-8,-9. עם זאת, למרות החשיבות של השלמה נאותה של שכפול ה-DNA בתחזוקה של יציבות הגנום, ההבנה שלנו של איפה ואיך זה מתרחש יש פיגרה של שכפול חניכה. בעוד גנים בודדים שכפול מאוחר אשר שויכה המחלה נחקרו עם, למשל, qPCR10, מחקרים הכללית מכוונת שחקרתי את המיקומים, שבבסיס גורם של המנוח מחסירה שכפול. כאן נתאר טכניקה שאנו מתייחסים כאל "G2 seq" שבו אנו משלבים cytometry זרימה עם תפוקה גבוהה רצף לשפוך אור על השלמתו של שכפול גנום של שמרים11. עם שינויים קלים, ניתן להתאים פרוטוקול זה תאים שניתן זרימה ממוין על פי תוכן ה-DNA.

<table><tbody><tr><td>YeaStar Genomic DNA kit</td><td>Genesee Scientific</td><td>11-323</td><td></td></tr><tr><td>1 &amp;micro;M SYTOX Green</td><td>ThermoFisher</td><td>57020</td><td>resuspend in 50 mM sodium citrate, pH 7.2</td></tr><tr><td>50 mM sodium citrate, pH 7.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase solution (0.25 mg / mL)</td><td>Sigma</td><td>R6513</td><td>0.25 mg / mL RNaseA resuspended in 50 mM sodium citrate, pH 7.2, boil RNase solution for 10 minutes before the first use only, and from then on store at -20&amp;deg;</td></tr><tr><td>proteinase K solution (20 mg / mL)</td><td>ThermoFisher / Invitrogen</td><td>25530-015</td><td>resuspend in 10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50% glycerol, store at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Model 50 Sonic Dismembrator</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB50A220</td><td></td></tr><tr><td>BD Biosciences FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td>644832</td><td></td></tr><tr><td>Zymo-spin III columns</td><td>Zymo Research</td><td>C1005</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorometer</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Covaris Model LE220 Focused-Ultrasonicator</td><td>Covaris</td><td>500219</td><td></td></tr><tr><td>Illumina TruSeq DNA LT Sample Prep Kit</td><td>Illumina</td><td>15026486</td><td></td></tr><tr><td>Illumina HiSeq 2500 instrument</td><td>Illumina</td><td>SY&amp;ndash;401&amp;ndash;2501</td><td></td></tr><tr><td>gsnap alignment software</td><td>open source software / Genentech</td><td></td><td>http://research-pub.gene.com/gmap</td></tr></tbody></table>

g2-seq: a high throughput sequencing-based technique for identifying late replicating regions of the genome

טכניקות רבות פותחו כדי לעקוב אחר ההתקדמות של שכפול ה-DNA באמצעות שלב S של מחזור התא. רוב שיטות אלה מכוונת כלפי הבהרה של המיקום והעיתוי של חניכה של שכפול גנום ולא להשלמתו. עם זאת, קריטי כי אנחנו מבינים אזורים בגנום כי הם אחרון להשלמת השכפול, כי אזורים אלה סובלים רמות גבוהות של כרומוזומלית, מוטציה, הם קושרו עם מחלה והזדקנות. כאן נתאר איך הרחבנו את טכניקה בה נעשה שימוש כדי לפקח על שכפול חניכה במקום לזהות אזורים אלה של הגנום אחרונה על שכפול מלאה. גישה זו מבוססת על שילוב של cytometry זרימה ורצף תפוקה גבוהה. למרות הדו ח מתמקד היישום של טכניקה זו שמרים, הגישה ניתן להשתמש עם כל התאים ניתן למיין ב cytometer זרימה לפי תוכן ה-DNA.

השתמשנו ההליך המתואר לעיל כדי לזהות אתרים שכפול מאוחר ניצני שמרים. בדיקות גישה זו באמצעות אזור שכפול מאוחר ידוע על כרומוזום מלאכותי הוכיח את הטכניקה להיות מדויקות ואמינות. התוצאות שלנו הוכיחו את חשיבות במועד השלמת השכפול הביולוגית על-ידי הצגת מאוחר שכפול אזור בכרומוזום...

Watch this Scientific Journal Video about G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome at JoVE.com

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-seq: תפוקה גבוהה המבוססת על רצף טכניקה לזיהוי מאוחר לבצע שיכפול אזורים בגנום

אנו מתארים שיטה לשילוב cytometry זרימה ורצף תפוקה גבוהה כדי לזהות אזורים שכפול מאוחר של הגנום.

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

g2-seq-high-throughput-sequencing-based-technique-for-identifying

Research

JoVE Journal

Genetics

5.7K Views.  Fred Hutchinson Cancer Research Center. אנו מתארים שיטה לשילוב cytometry זרימה ורצף תפוקה גבוהה כדי לזהות אזורים שכפול מאוחר של הגנום.

Video: G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic region is replicated at a distinct time during S phase through the simultaneous activation of multiple origins of replication. Time of replication (ToR) correlates with many genomic and epigenetic features and is linked to mutation rates and cancer. Comprehending the full genomic view of the replication program, in health and disease is a major future goal and challenge.
This article describes in detail the &#34;Copy Number Ratio of S/G1 for mapping genomic Time of Replication&#34; method (herein called: CNR-ToR), a simple approach to map the genome wide ToR of mammalian cells. The method is based on the copy number differences between S phase cells and G1 phase cells. The CNR-ToR method is performed in 6 steps: 1. Preparation of cells and staining with propidium iodide (PI); 2. Sorting G1 and S phase cells using fluorescence-activated cell sorting (FACS); 3. DNA purification; 4. Sonication; 5. Library preparation and sequencing; and 6. Bioinformatic analysis. The CNR-ToR method is a fast and easy approach that results in detailed replication maps.

We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

קביעת הגנום כולו של תזמון שכפול יונק ידי מדידת תוכן DNA

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that control the fidelity of transcription. To fill this gap in scientific knowledge, we recently optimized the circle-sequencing assay to detect transcription errors throughout the transcriptome of Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, and Caenorhabditis elegans. This protocol will provide researchers with a powerful new tool to map the landscape of transcription errors in eukaryotic cells so that the mechanisms that control the fidelity of transcription can be elucidated in unprecedented detail.

This protocol provides researchers with a new tool to monitor the fidelity of transcription in multiple model organisms.

מעקב ברמת הגנום של שגיאות תיעתוק היצורים האיקריוטים

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and effect sizes of regulatory elements to a target gene. Some progress has been made with the bioinformatic prediction of the existence and function of proximal epigenetic modifications associated with activated gene expression using conserved transcription factor binding sites. Chromatin conformation capture studies have revolutionized our ability to discover physical chromatin contacts between sequences and even within an entire genome. Circular chromatin conformation capture coupled with next-generation sequencing (4C-seq), in particular, is designed to discover all possible physical chromatin interactions for a given sequence of interest (viewpoint), such as a target gene or a regulatory enhancer. Current 4C-seq strategies directly sequence from within the viewpoint but require numerous and diverse viewpoints to be simultaneously sequenced to avoid the technical challenges of uniform base calling (imaging) with next generation sequencing platforms. This volume of experiments may not be practical for many laboratories. Here, we report a modified approach to the 4C-seq protocol that incorporates both an additional restriction enzyme digest and qPCR-based amplification steps that are designed to facilitate a greater capture of diverse sequence reads and mitigate the potential for PCR bias, respectively. Our modified 4C method is amenable to the standard molecular biology lab for assessing chromatin architecture.

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

The identification of physical interactions between genes and regulatory elements is challenging but has been facilitated by chromosome conformation capture methods. This modification to the 4C-seq protocol mitigates PCR bias by minimizing over-amplification of PCR templates and maximizes the mappability of reads by incorporating an addition restriction enzyme digest step.

זיהוי תפוקה גבוהה של ג'ין רצפים תקינה באמצעות רצף הדור הבא של כרומוזום מעגלי קונפורמציה ללכוד (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in telomere biology, including heterochromatin formation and telomere length homeostasis. Recent findings revealed that TERRA molecules also interact with internal chromosomal regions to regulate gene expression in mouse embryonic stem (ES) cells. In line with this evidence, RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) analyses have shown that only a subset of TERRA transcripts localize at chromosome ends. A better understanding of the dynamics of TERRA molecules will help define their function and mechanisms of action. Here, we describe a method to label and visualize single-telomere TERRA transcripts in cancer cells using the MS2-GFP system. To this aim, we present a protocol to generate stable clones, using the AGS human stomach cancer cell line, containing MS2 sequences integrated at a single subtelomere. Transcription of TERRA from the MS2-tagged telomere results in the expression of MS2-tagged TERRA molecules that are visualized by live-cell fluorescence microscopy upon co-expression of a MS2 RNA-binding protein fused to GFP (MS2-GFP). This approach enables researchers to study the dynamics of single-telomere TERRA molecules in cancer cells, and it can be applied to other cell lines.

Here, we present a protocol to generate cancer cell clones containing a MS2 sequence tag at a single subtelomere. This approach, relying on the MS2-GFP system, enables visualization of the endogenous transcripts of telomeric repeat-containing RNA (TERRA) expressed from a single telomere in living cells.

הדור של סרטן התא שיבוטים כדי להמחיש Telomeric המכילים חוזר RNA טרה הביע מ טלומר יחיד בתאים חיים

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

<meta charset="utf8"></head><body>אלקטרופורזה ג'ל דו-ממדית לניתוח שכפול DNA ואירועי עיכוב מזלג

Electrophoretic Analysis of Replication Through Structure-Prone DNA Repeats Within the SV40-Based Human Episome

Two-dimensional neutral/neutral gel-electrophoresis (2DGE) emerged as a benchmark technique to analyze DNA replication through natural impediments. This protocol describes how to analyze replication fork progression through structure-prone, expandable DNA repeats within the simian virus 40 (SV40)-based episome in human cells. In brief, upon plasmid transfection into human cells, replication intermediates are isolated by the modified Hirt protocol and treated with the DpnI restriction enzyme to remove non-replicated DNA. Intermediates are then digested by appropriate restriction enzymes to place the repeat of interest within the origin-distal half of a 3-5 kb-long DNA fragment. The replication intermediates are separated into two perpendicular dimensions, first by size and then by shape. Following Southern blot hybridization, this approach allows researchers to observe fork stalling at various structure-forming repeats on the descending half of the replication Y-arc. Furthermore, this positioning of the stall site allows the visualization of various outcomes of repeat-mediated fork stalling, such as fork reversal, the advent of a converging fork, and recombinational fork restart.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: אפיון שכפול DNA של חזרות פתוגניות כדי לחשוף מנגנונים של שכפול מזלג עיכוב והתפשטות

Here, we outline the procedure for analyzing replication progression through pathogenic, structure-prone repeats using 2-dimensional gel electrophoresis.

ניתוח אלקטרופורטי של שכפול באמצעות DNA נוטה למבנה חוזר בתוך אפיזום אנושי מבוסס SV40

Two-dimensional neutral/neutral gel-electrophoresis (2DGE) emerged as a benchmark technique to analyze DNA replication through natural impediments. This ...

Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the standard protocols for generating genomic or transcriptomic libraries are incompatible and researchers must choose whether to sequence DNA or RNA for a particular sample. Gel-seq solves this problem by enabling researchers to simultaneously prepare libraries for both DNA and RNA starting with 100 - 1000 cells using a simple hydrogel device. This paper presents a detailed approach for the fabrication of the device as well as the biological protocol to generate paired libraries. We designed Gel-seq so that it could be easily implemented by other researchers; many genetics labs already have the necessary equipment to reproduce the Gel-seq device fabrication. Our protocol employs commonly-used kits for both whole-transcript amplification (WTA) and library preparation, which are also likely to be familiar to researchers already versed in generating genomic and transcriptomic libraries. Our approach allows researchers to bring to bear the power of both DNA and RNA sequencing on a single sample without splitting and with negligible added cost.

Gel-seq enables researchers to simultaneously prepare libraries for both DNA- and RNA-seq at negligible added cost starting from 100 - 1000 cells using a simple hydrogel device. This paper presents a detailed approach for the fabrication of the device as well as the biological protocol to generate paired libraries.

ג'ל-seq: שיטת הכנת ספריה סימולטני רצף DNA ו- RNA באמצעות מטריצות הידרוג

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the ...

Bioengineering

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

עיתוי מעתיק כרומוזום בשילוב עם פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Biology

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on cancer, and especially cancer genetics. Current knowledge and future discoveries will make it necessary to study a huge number of genes that could be involved in a genetic predisposition to cancer. In this regard, we developed a Nextera design to study 11 complete genes involved in DNA damage repair. This protocol was developed to safely study 11 genes (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80, and TP53) from promoter to 3&#39;-UTR in 24 patients simultaneously. This protocol, based on transposase technology and gDNA enrichment, gives a great advantage in terms of time for the genetic diagnosis thanks to sample multiplexing. This protocol can be safely used with blood gDNA.

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA enrichment for NGS sequencing is an easy and powerful tool for the study of constitutional mutations. In this article, we present the procedure to analyse simply the complete sequence of 11 genes involved in DNA damage repair.

gDNA העשרה על ידי טכנולוגיה מבוססת Transposase לניתוח NGS של הרצף השלם של<em&gt; BRCA1</em&gt;,<em&gt; BRCA2</em&gt;, ו -9 גנים המעורבים בתיקון נזק לדנ&quot;א

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

G2-seq: תפוקה גבוהה המבוססת על רצף טכניקה לזיהוי מאוחר לבצע שיכפול אזורים בגנום

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

קביעת הגנום כולו של תזמון שכפול יונק ידי מדידת תוכן DNA

מעקב ברמת הגנום של שגיאות תיעתוק היצורים האיקריוטים

זיהוי תפוקה גבוהה של ג'ין רצפים תקינה באמצעות רצף הדור הבא של כרומוזום מעגלי קונפורמציה ללכוד (4C-seq)

הדור של סרטן התא שיבוטים כדי להמחיש Telomeric המכילים חוזר RNA טרה הביע מ טלומר יחיד בתאים חיים

ניתוח אלקטרופורטי של שכפול באמצעות DNA נוטה למבנה חוזר בתוך אפיזום אנושי מבוסס SV40

ניתוח אלקטרופורטי של שכפול באמצעות DNA נוטה למבנה חוזר בתוך אפיזום אנושי מבוסס SV40

ניתוח אלקטרופורטי של שכפול באמצעות DNA נוטה למבנה חוזר בתוך אפיזום אנושי מבוסס SV40

ג'ל-seq: שיטת הכנת ספריה סימולטני רצף DNA ו- RNA באמצעות מטריצות הידרוג

עיתוי מעתיק כרומוזום בשילוב עם פלורסנט

gDNA העשרה על ידי טכנולוגיה מבוססת Transposase לניתוח NGS של הרצף השלם של