Este trabalho foi apoiado por grant GM117446 NIH de A.B.

1. preparação de células para Flow Cytometry classificação
<ol><li>Inocular tubos de ensaio de 15 mL contendo 8 mL de caldo YEPD tal que as culturas atingem uma densidade de 5 x 106 a 1,5 x 107 células / mL após crescimento durante a noite (ver discussão Nota 1).</li>
	<li>Spin para baixo de células de levedura (1.400 x g, à temperatura ambiente ou 4 ° C) em um tubo de centrifugação de tampa de rosca 15 mL por 5 min, Ressuspender as células em 1,5 mL de etanol a 70% e transferir para um tubo de microcentrífuga de 1,6 mL, deixando este sentar-se por 1h à temperatura ambiente ou pelo menos 3 h no gelo ( podem ser armazenados indefinidamente a 4 ° C) (ver ponto de discussão (2)).</li>
	<li>Spin para baixo de células de levedura na microcentrífuga (14.000 x g, 4 ° C) por 1 min, resuspenda em citrato de sódio 1 mL 50 mM, pH 7,2, spin-down (14.000 x g, 4 ° C) por 1 min, aspirar o sobrenadante, resuspenda em citrato de sódio 1 mL 50 mM, pH 7,2 , contendo 0,25 mg/mL solução de RNAse h 1 a 50 ° C, ou durante a noite a 37 ° C em banho de água ou bloco térmico.</li>
	<li>Adicionar 50 µ l solução de proteinase K (20 mg/mL resuspended em pH de Tris 10 mM 7,5, 2 mM CaCl2, peso de 50% de glicerol de volume) e incubar durante 1 h a 50 ° C.</li>
	<li>Spin para baixo de células (14.000 x g, 4 ° C), Ressuspender as células em 1 mL citrato de sódio 50 mM, pH 7,2, spin para baixo (14.000 x g, 4 ° C), aspirar o sobrenadante com vácuo, resuspenda em 1 mL 1 µM verde ácido nucleico estirpe resuspended em citrato de sódio 50 mM , pH 7,2 e incubar no escuro por 1h à temperatura ambiente, proceda à sonicação 2x para 2 s cada (2 watts de potência de saída).</li>
</ol>2. célula de triagem
<ol><li>Usando um classificador de célula, tipo de células de acordo com o conteúdo de DNA em fases G1, S, "G2 precoce" e "tarde G2", recolha de pelo menos 1,6 milhões células haploides de cada fase do ciclo celular como na Figura 1 (ver ponto de discussão (3)).</li>
	<li>Células de transferência para tubos de microcentrífuga e spin para baixo de células por 20 min a 14.000 x g a 4 ° C, na microcentrífuga e aspire o sobrenadante com vácuo (a pelota pode ser armazenada congelado a-20 ° C indefinidamente; ver discussão ponto (4)).</li>
</ol>3. DNA extração e preparação de sequenciamento de bibliotecas
Nota: As etapas a seguir são baseadas em "protocolo" na extração de DNA genômico de levedura Kit (veja a Tabela de materiais).
<ol><li>Adicione 120 µ l de "Buffer de digestão," um buffer patenteado que permite que a enzima lítica de levedura digerir a parede celular e 5 µ l da enzima lítica de levedura, resuspenda vortexing e incubar a 37 ° C por 40-60 min.</li>
	<li>Adicione 120 µ l de "Lise," uma reserva proprietária que contém detergente e difícil para 10-20 s de vórtice.</li>
	<li>Adicionar 250 clorofórmio µ l - homogeneizar por 1 min.</li>
	<li>Girar na velocidade máxima em uma microcentrífuga por 2 min.</li>
	<li>Carrega o sobrenadante para a coluna de ligação de DNA e centrifugar a velocidade máxima em uma microcentrífuga por 1 min.</li>
	<li>Adicione 300 µ l de "DNA lavagem Buffer," uma reserva proprietária que contém etanol e centrifugar por 1 min na velocidade máxima em uma microcentrífuga. Descartar o fluxo através de, adicionar 300 µ l de tampão de lavagem do DNA e repita o processo de lavagem.</li>
	<li>Transferir a coluna de rotação para um tubo de microcentrífuga fresco, Adicionar 60 µ l de água (não TE) - Espere 3 min - 1 e em seguida centrifugar durante 10 s para Eluir o DNA.</li>
	<li>Medir a concentração pela adição de 5 µ l de DNA para 195 µ l de reagente de alta sensibilidade de dsDNA que foi diluído 1: 200 em dsDNA buffer de alta sensibilidade e, em seguida, a medida de fluorescência em um dados, usando 10 µ l de fornecidos padrões para calibração; Espero que entre 10 e 50 ng do rendimento total do ADN.</li>
	<li>Proceda à sonicação (pico incidente poder 450, Factor de serviço de 30%, ciclos por 200 Burst, tratamento tempo 60 s, nível de água 6) para separar o DNA em fragmentos de bp 250-350.</li>
	<li>Preparar uma biblioteca usando o kit de preparação de amostra de DNA e sequência-(leituras de pelo menos 10 milhões 50 bp único-extremidade) do instrumento de sequenciamento de DNA no modo rápido (ver nota de discussão (5)).</li>
</ol>4. análise de dados e geração de replicação de sequenciamento perfis
<ol><li>Alinhar sequências de Saccharomyces cerevisiae sacCer3 genoma usando Gsnap12 (ver nota de discussão (6)).</li>
	<li>Determine por-base par ler profundidades usando "genomeCoverageBed" software13 dos Bedtools.</li>
	<li>Remover artefactual picos nas profundezas de leitura, se presente (ver nota de discussão (7)).</li>
	<li>Liso ler profundezas por cromossoma usando medianas em um 20KB deslizante janela usando a função "runMean" em R pacote "caTools" (ver nota de discussão (8)).</li>
	<li>Trama ler profundezas em S fase precoce G2 e G2 atrasado como uma porcentagem de profundidades de leitura completamente replicadas (ver nota de discussão (9)).</li>
</ol>

<ol><li>Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+origin+activation+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA replication origin activation in space and time.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 360-374 (2015).</li>
<li>Santocanale, C., Diffley, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mec1-+and+Rad53-dependent+checkpoint+controls+late-firing+origins+of+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Mec1- and Rad53-dependent checkpoint controls late-firing origins of DNA replication.</a> Nature. 395, 615-618 (1998).</li>
<li>Brewer, B. J., Fangman, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+replication+fork+barrier+at+the+3%27+end+of+yeast+ribosomal+RNA+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A replication fork barrier at the 3' end of yeast ribosomal RNA genes.</a> Cell. 55, 637-643 (1988).</li>
<li>Raghuraman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+dynamics+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replication dynamics of the yeast genome.</a> Science. 294, 115-121 (2001).</li>
<li>Muller, C. A., Nieduszynski, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+replication+timing+reveals+global+and+local+regulation+of+replication+origin+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Conservation of replication timing reveals global and local regulation of replication origin activity.</a> Genome Res. 22, 1953-1962 (2012).</li>
<li>Koren, A., Soifer, I., Barkai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRC1-dependent+scaling+of+the+budding+yeast+DNA+replication+timing+program%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">MRC1-dependent scaling of the budding yeast DNA replication timing program.</a> Genome Res. 20, 781-790 (2010).</li>
<li>Lang, G. I., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+rates+across+budding+yeast+chromosome+VI+are+correlated+with+replication+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Mutation rates across budding yeast chromosome VI are correlated with replication timing.</a> Genome Biol Evol. 3, 799-811 (2011).</li>
<li>Durkin, S. G., Glover, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+fragile+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromosome fragile sites.</a> Annu Rev Genet. 41, 169-192 (2007).</li>
<li>Dillon, L. W., Burrow, A. A., Wang, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+instability+at+chromosomal+fragile+sites+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genomics%22%5BJournal%5D)">DNA instability at chromosomal fragile sites in cancer.</a> Curr Genomics. 11, 326-337 (2010).</li>
<li>Widrow, R. J., Hansen, R. S., Kawame, H., Gartler, S. M., Laird, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Very+late+DNA+replication+in+the+human+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Very late DNA replication in the human cell cycle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 11246-11250 (1998).</li>
<li>Foss, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIR2+suppresses+replication+gaps+and+genome+instability+by+balancing+replication+between+repetitive+and+unique+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">SIR2 suppresses replication gaps and genome instability by balancing replication between repetitive and unique sequences.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 552-557 (2017).</li>
<li>Wu, T. D., Reeder, J., Lawrence, M., Becker, G., Brauer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GMAP+and+GSNAP+for+Genomic+Sequence+Alignment%3A+Enhancements+to+Speed%2C+Accuracy%2C+and+Functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">GMAP and GSNAP for Genomic Sequence Alignment: Enhancements to Speed, Accuracy, and Functionality.</a> Methods Mol Biol. 1418, 283-334 (2016).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).</li>
<li>Langmead, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aligning+short+sequencing+reads+with+Bowtie%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Aligning short sequencing reads with Bowtie.</a> Curr Protoc Bioinformatics. , Chapter 11, Unit 11 17(2010).</li>
<li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).</li>
<li>Kellis, M., Birren, B. W., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proof+and+evolutionary+analysis+of+ancient+genome+duplication+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Proof and evolutionary analysis of ancient genome duplication in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 428, 617-624 (2004).</li>
<li>Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coming+of+age%3A+ten+years+of+next-generation+sequencing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies.</a> Nat Rev Genet. 17, 333-351 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Enquanto esta técnica é robusta e relativamente direta, deve ser prestada especial atenção ao seguinte:
(1) recomendamos que culturas crescem pelo menos 12 h antes que eles atinjam a fase de registo, desde que diferenças se manifestar no ciclo celular distribuições se culturas são colhidas após ter alcançado a densidade desejada apenas 4 h após a inoculação. Nossa suposição é que uma distribuição de ciclo celular que atingiu um equilíbrio relativamente estável melhor repres...

Replicação do genoma eucariótico é iniciada em vários locais discretos, chamados origens de replicação, de que a replicação garfos procedem em ambas as direções (revistas em Fragkos et al, 20151). Origens variam em seu tempo e a eficiência de queima, e várias técnicas foram desenvolvidas para monitorar a atividade de origem de replicação e elucidar as causas desta variação. A atividade de origens individuais pode ser inferida níveis de single-stranded DNA2, que se forma em torno de origens ativas, ou por meio de eletroforese em gel 2D para monitorar a replicação específico intermediários3, ambos os quais podem ser detectados com sondas radioactivas. Ambas estas técnicas são mais facilmente aplicadas em S. cerevisiae do que em células de mamíferos, porque origens limitam-se a sequências específicas de conhecido na antiga. Com o advento dos microarrays, tornou-se possível avaliar globalmente a disparar de origem. Isto foi feito primeiro pela rotulagem DNA com isótopos pesados, liberando as células de um bloco de G1 no médios contendo isótopos leves e monitoramento em seguida a formação de pesados-luz híbrido DNA através do genoma4. A introdução de sequenciamento de alto throughput permitiu semelhante genoma-monitoração de atividade de origem, sem a exigência de marcação isotópica caro. As células foram classificadas em um citômetro de fluxo de acordo com o conteúdo de DNA e seu DNA submetido ao sequenciamento profundo. Porque a cobertura de sequência procede de 1x a 2x ao longo da fase S, sincronismo de replicação relativo pode ser avaliado comparando leitura profundidades de células em fase S àqueles em G1 ou G25,6. Estas técnicas, particularmente aplicadas à levedura, levaram a uma compreensão mais profunda de como sequência de DNA, estrutura da cromatina e DNA replicação proteínas regulam eficiência e sincronismo de origem.
Transmissão fiel da informação genética durante a proliferação celular requer não só sucesso iniciação da replicação do DNA, que se realiza às origens, mas também a conclusão bem sucedida da replicação, que ocorre onde encontram forquilhas de replicação. Como iniciação da replicação, o momento da conclusão da replicação varia consoante o genoma com certas regiões restantes replicadas no mesmo final do ciclo celular. Tais regiões podem ser particularmente distantes origens de replicação ativa ou podem conter sequências ou estruturas de cromatina que impedem as polimerases de DNA. Tarde, replicar as regiões pode se manifestar como sítios frágeis, que são associados com quebras cromossômicas e maiores taxas de mutação e têm sido implicados no cancro e o envelhecimento7,8,9. No entanto, apesar da importância da adequada conclusão da replicação do DNA na manutenção da estabilidade do genoma, nossa compreensão de onde e como isso ocorre tem lag muito atrás da iniciação da replicação. E enquanto os genes individuais cuja replicação final tem sido associada com doença têm sido estudados com, por exemplo, qPCR10, globais estudos dirigidos a elucidar as localizações e ultimamente tem faltado replicação de causas subjacentes. Aqui nós descrevemos uma técnica que chamamos como "G2 seq", no qual combinamos citometria de fluxo com sequenciamento de alto throughput para lançar luz sobre a conclusão da replicação do genoma em fermento11. Com pequenas alterações, este protocolo pode ser adaptado a qualquer uma das células que pode ser de fluxo-classificados de acordo com o conteúdo de DNA.

<table><tbody><tr><td>YeaStar Genomic DNA kit</td><td>Genesee Scientific</td><td>11-323</td><td></td></tr><tr><td>1 &amp;micro;M SYTOX Green</td><td>ThermoFisher</td><td>57020</td><td>resuspend in 50 mM sodium citrate, pH 7.2</td></tr><tr><td>50 mM sodium citrate, pH 7.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase solution (0.25 mg / mL)</td><td>Sigma</td><td>R6513</td><td>0.25 mg / mL RNaseA resuspended in 50 mM sodium citrate, pH 7.2, boil RNase solution for 10 minutes before the first use only, and from then on store at -20&amp;deg;</td></tr><tr><td>proteinase K solution (20 mg / mL)</td><td>ThermoFisher / Invitrogen</td><td>25530-015</td><td>resuspend in 10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50% glycerol, store at -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Model 50 Sonic Dismembrator</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB50A220</td><td></td></tr><tr><td>BD Biosciences FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td>644832</td><td></td></tr><tr><td>Zymo-spin III columns</td><td>Zymo Research</td><td>C1005</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorometer</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Covaris Model LE220 Focused-Ultrasonicator</td><td>Covaris</td><td>500219</td><td></td></tr><tr><td>Illumina TruSeq DNA LT Sample Prep Kit</td><td>Illumina</td><td>15026486</td><td></td></tr><tr><td>Illumina HiSeq 2500 instrument</td><td>Illumina</td><td>SY&amp;ndash;401&amp;ndash;2501</td><td></td></tr><tr><td>gsnap alignment software</td><td>open source software / Genentech</td><td></td><td>http://research-pub.gene.com/gmap</td></tr></tbody></table>

g2-seq: a high throughput sequencing-based technique for identifying late replicating regions of the genome

Inúmeras técnicas têm sido desenvolvidas para acompanhar o progresso da replicação do DNA através da fase S do ciclo celular. A maioria destas técnicas tem sido direcionada para elucidação do local e hora de início da duplicação do genoma, ao invés de sua conclusão. No entanto, é fundamental que nós entendemos de regiões do genoma que são última para concluir a replicação, porque essas regiões sofrem níveis elevados de quebra cromossômica e mutação, e eles têm sido associados com doenças e envelhecimento. Aqui descrevemos como nós estendemos uma técnica que tem sido usada para monitorar a iniciação de replicação para em vez disso, identificar as regiões do genoma última a replicação completa. Esta abordagem é baseada em uma combinação de citometria de fluxo e sequenciamento de alto rendimento. Embora este relatório centra-se sobre a aplicação desta técnica a levedura, a abordagem pode ser usada com qualquer uma das células que pode ser classificada em um citômetro de fluxo de acordo com o conteúdo de DNA.

Temos utilizado o procedimento descrito acima para identificar sites replicação finais no fermento de brotamento. Esta abordagem usando uma região de replicação final conhecida em um cromossomo artificial de teste provou a técnica para ser precisa e confiável. Nossos resultados também demonstraram a importância biológica da conclusão atempada da replicação, mostrando que uma tarde região replicam no cromossomo 7, que identificamos como replicação final com base nos nossos ...

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G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

G2-seq: Uma alta taxa de transferência baseada no sequenciamento técnica para identificar a tarde replicando regiões do genoma

Nós descrevemos uma técnica de combinação de citometria de fluxo e sequenciamento de alto throughput para identificar regiões de replicação finais do genoma.

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

g2-seq-high-throughput-sequencing-based-technique-for-identifying

Research

JoVE Journal

Genetics

5.8K visualizações.  Fred Hutchinson Cancer Research Center. Nós descrevemos uma técnica de combinação de citometria de fluxo e sequenciamento de alto throughput para identificar regiões de replicação finais do genoma.

Vídeo: G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic region is replicated at a distinct time during S phase through the simultaneous activation of multiple origins of replication. Time of replication (ToR) correlates with many genomic and epigenetic features and is linked to mutation rates and cancer. Comprehending the full genomic view of the replication program, in health and disease is a major future goal and challenge.
This article describes in detail the &#34;Copy Number Ratio of S/G1 for mapping genomic Time of Replication&#34; method (herein called: CNR-ToR), a simple approach to map the genome wide ToR of mammalian cells. The method is based on the copy number differences between S phase cells and G1 phase cells. The CNR-ToR method is performed in 6 steps: 1. Preparation of cells and staining with propidium iodide (PI); 2. Sorting G1 and S phase cells using fluorescence-activated cell sorting (FACS); 3. DNA purification; 4. Sonication; 5. Library preparation and sequencing; and 6. Bioinformatic analysis. The CNR-ToR method is a fast and easy approach that results in detailed replication maps.

We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

Determinação do genoma de sincronismo Replication Mammalian por DNA Medição conteúdo

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Genética

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that control the fidelity of transcription. To fill this gap in scientific knowledge, we recently optimized the circle-sequencing assay to detect transcription errors throughout the transcriptome of Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, and Caenorhabditis elegans. This protocol will provide researchers with a powerful new tool to map the landscape of transcription errors in eukaryotic cells so that the mechanisms that control the fidelity of transcription can be elucidated in unprecedented detail.

This protocol provides researchers with a new tool to monitor the fidelity of transcription in multiple model organisms.

Vigilância de todo o genoma de erros de transcrição em organismos eucarióticos

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and effect sizes of regulatory elements to a target gene. Some progress has been made with the bioinformatic prediction of the existence and function of proximal epigenetic modifications associated with activated gene expression using conserved transcription factor binding sites. Chromatin conformation capture studies have revolutionized our ability to discover physical chromatin contacts between sequences and even within an entire genome. Circular chromatin conformation capture coupled with next-generation sequencing (4C-seq), in particular, is designed to discover all possible physical chromatin interactions for a given sequence of interest (viewpoint), such as a target gene or a regulatory enhancer. Current 4C-seq strategies directly sequence from within the viewpoint but require numerous and diverse viewpoints to be simultaneously sequenced to avoid the technical challenges of uniform base calling (imaging) with next generation sequencing platforms. This volume of experiments may not be practical for many laboratories. Here, we report a modified approach to the 4C-seq protocol that incorporates both an additional restriction enzyme digest and qPCR-based amplification steps that are designed to facilitate a greater capture of diverse sequence reads and mitigate the potential for PCR bias, respectively. Our modified 4C method is amenable to the standard molecular biology lab for assessing chromatin architecture.

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

The identification of physical interactions between genes and regulatory elements is challenging but has been facilitated by chromosome conformation capture methods. This modification to the 4C-seq protocol mitigates PCR bias by minimizing over-amplification of PCR templates and maximizes the mappability of reads by incorporating an addition restriction enzyme digest step.

Identificação do elevado-throughput de sequências de genes regulatórios utilizando a próxima geração sequenciamento de conformação Circular cromossoma capturar (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in telomere biology, including heterochromatin formation and telomere length homeostasis. Recent findings revealed that TERRA molecules also interact with internal chromosomal regions to regulate gene expression in mouse embryonic stem (ES) cells. In line with this evidence, RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) analyses have shown that only a subset of TERRA transcripts localize at chromosome ends. A better understanding of the dynamics of TERRA molecules will help define their function and mechanisms of action. Here, we describe a method to label and visualize single-telomere TERRA transcripts in cancer cells using the MS2-GFP system. To this aim, we present a protocol to generate stable clones, using the AGS human stomach cancer cell line, containing MS2 sequences integrated at a single subtelomere. Transcription of TERRA from the MS2-tagged telomere results in the expression of MS2-tagged TERRA molecules that are visualized by live-cell fluorescence microscopy upon co-expression of a MS2 RNA-binding protein fused to GFP (MS2-GFP). This approach enables researchers to study the dynamics of single-telomere TERRA molecules in cancer cells, and it can be applied to other cell lines.

Here, we present a protocol to generate cancer cell clones containing a MS2 sequence tag at a single subtelomere. This approach, relying on the MS2-GFP system, enables visualization of the endogenous transcripts of telomeric repeat-containing RNA (TERRA) expressed from a single telomere in living cells.

Geração de Clones de células câncer Visualizar oligospermia Repeat-contendo RNA TERRA expressado de um único dos telômeros em células vivas

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

<meta charset="utf8"></head><body>Eletroforese em gel 2D para análise de replicação de DNA e eventos de parada de garfo

Electrophoretic Analysis of Replication Through Structure-Prone DNA Repeats Within the SV40-Based Human Episome

Two-dimensional neutral/neutral gel-electrophoresis (2DGE) emerged as a benchmark technique to analyze DNA replication through natural impediments. This protocol describes how to analyze replication fork progression through structure-prone, expandable DNA repeats within the simian virus 40 (SV40)-based episome in human cells. In brief, upon plasmid transfection into human cells, replication intermediates are isolated by the modified Hirt protocol and treated with the DpnI restriction enzyme to remove non-replicated DNA. Intermediates are then digested by appropriate restriction enzymes to place the repeat of interest within the origin-distal half of a 3-5 kb-long DNA fragment. The replication intermediates are separated into two perpendicular dimensions, first by size and then by shape. Following Southern blot hybridization, this approach allows researchers to observe fork stalling at various structure-forming repeats on the descending half of the replication Y-arc. Furthermore, this positioning of the stall site allows the visualization of various outcomes of repeat-mediated fork stalling, such as fork reversal, the advent of a converging fork, and recombinational fork restart.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Caracterizando a replicação do DNA de repetições patogênicas para descobrir mecanismos de paralisação e expansão do garfo de replicação

Here, we outline the procedure for analyzing replication progression through pathogenic, structure-prone repeats using 2-dimensional gel electrophoresis.

Análise eletroforética da replicação por meio de repetições de DNA propensas à estrutura dentro do epissoma humano baseado em SV40

Two-dimensional neutral/neutral gel-electrophoresis (2DGE) emerged as a benchmark technique to analyze DNA replication through natural impediments. This ...

Gel-seq: A Method for Simultaneous Sequencing Library Preparation of DNA and RNA Using Hydrogel Matrices

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the standard protocols for generating genomic or transcriptomic libraries are incompatible and researchers must choose whether to sequence DNA or RNA for a particular sample. Gel-seq solves this problem by enabling researchers to simultaneously prepare libraries for both DNA and RNA starting with 100 - 1000 cells using a simple hydrogel device. This paper presents a detailed approach for the fabrication of the device as well as the biological protocol to generate paired libraries. We designed Gel-seq so that it could be easily implemented by other researchers; many genetics labs already have the necessary equipment to reproduce the Gel-seq device fabrication. Our protocol employs commonly-used kits for both whole-transcript amplification (WTA) and library preparation, which are also likely to be familiar to researchers already versed in generating genomic and transcriptomic libraries. Our approach allows researchers to bring to bear the power of both DNA and RNA sequencing on a single sample without splitting and with negligible added cost.

Gel-seq enables researchers to simultaneously prepare libraries for both DNA- and RNA-seq at negligible added cost starting from 100 - 1000 cells using a simple hydrogel device. This paper presents a detailed approach for the fabrication of the device as well as the biological protocol to generate paired libraries.

Gel-seq: Um método para a preparação de biblioteca simultânea de sequenciamento de DNA e RNA usando matrizes de hidrogel

The ability to amplify and sequence either DNA or RNA from small starting samples has only been achieved in the last five years. Unfortunately, the ...

Bioengenharia

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

Tempo cromossomo Replicando Combinado com Fluorescente<em&gt; Em situ</em&gt; Hibridização

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Biologia

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on cancer, and especially cancer genetics. Current knowledge and future discoveries will make it necessary to study a huge number of genes that could be involved in a genetic predisposition to cancer. In this regard, we developed a Nextera design to study 11 complete genes involved in DNA damage repair. This protocol was developed to safely study 11 genes (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80, and TP53) from promoter to 3&#39;-UTR in 24 patients simultaneously. This protocol, based on transposase technology and gDNA enrichment, gives a great advantage in terms of time for the genetic diagnosis thanks to sample multiplexing. This protocol can be safely used with blood gDNA.

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

gDNA enrichment for NGS sequencing is an easy and powerful tool for the study of constitutional mutations. In this article, we present the procedure to analyse simply the complete sequence of 11 genes involved in DNA damage repair.

gDNA Enriquecimento por uma tecnologia baseada em transposase para NGS Análise de toda a sequência de<em&gt; BRCA1</em&gt;,<em&gt; BRCA2</em&gt; e 9 genes envolvidos na reparação de danos no DNA

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

G2-seq: Uma alta taxa de transferência baseada no sequenciamento técnica para identificar a tarde replicando regiões do genoma

Resumo

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Determinação do genoma de sincronismo Replication Mammalian por DNA Medição conteúdo

Vigilância de todo o genoma de erros de transcrição em organismos eucarióticos

Identificação do elevado-throughput de sequências de genes regulatórios utilizando a próxima geração sequenciamento de conformação Circular cromossoma capturar (4C-seq)

Geração de Clones de células câncer Visualizar oligospermia Repeat-contendo RNA TERRA expressado de um único dos telômeros em células vivas

Análise eletroforética da replicação por meio de repetições de DNA propensas à estrutura dentro do epissoma humano baseado em SV40

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