Name: methods for imaging intracellular ph of the follicle stem cell lineage in live drosophila ovarian tissue
Uploaded: 2017-09-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
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ブリーネ Ulmschneider に原稿に関する提案プロトコルおよびダイアン床屋への貢献ありがちましょう。この仕事健康付与 GM116384 T.G. Nystul と d. l. 床屋の国立研究所によって資金を供給されました。

注: FSC 系統のピピを測定する Fsc、pFCs、生理的条件下で卵胞細胞の mCherry に 1p-169 の蛍光強度の比を計算し、標準でピピ値比に変換各セルの較正曲線は、 7 を入力します。PHluorin と mCherry germaria NaHCO 3、生理的条件 1 , を模倣するを含むバッファーに解剖での蛍光強度を測定するためまず、ライブ イメージング実験を行った 7. ナ + で pHluorin と mCherry の蛍光強度を測定することによって次に、標準的なカーブが生成されます-無料、イオノフォア nigericin を含む K + のバッファーは、2 つの異なる pH 値の調整 6.5、7.5。Nigericin の存在下でピピは細胞外 pH を一致するファイを引き起こす膜の間でバッファーの pH をあります。標準曲線を使用して pHluorin を mCherry 比の推定ピピ値に変換する最後に。
 1。 予審: In Vivo 測定前準備ピピ 注: ピピ 体内 測定、mCherry::pHluorin 遺伝子が興味のセル型で表されます。FSC 系統で飛ぶ遺伝子 pHluorin を生成するいくつかの一般的な方法のとおりです。MCherry::pHluorin のクローンを生成する FSC クローンの前方の端に配置されている Fsc を識別する場合に特に便利です。ティッシュ特定の mCherry::pHluorin 式は全体の組織の間でピピの計測に有用、またより便利な RNAi や遺伝子の表現を組み合わせるとき。
<ol>遺伝子組換え 1p-169 世代ハエ <ol><li>mCherry::pHluorin ラベル FSC <li>クローン <ol><li>mCherry::pHluorin FSC のクローンを作成するは、株式やその他法律 Gal4 flipout に UA mCherry::pHluorin 1 をクロスFlp/FRT 誘導 Gal4 と貯蔵</li>。
			<li>誘引可能なクローンは、heatshock を作成する heatshock 2 日間大人 F1s 投稿 37 ° C の水浴、4 回 12 h. に約 1 時間の空の小瓶で羽化</li>
			<li>にこの期間中には、正常な成長と卵形成の最大レートを確保するため、新鮮なウェット酵母を提供することによってハエを維持 (約等しい部品乾燥パン屋 &#39; s 酵母と水) クローン誘導後少なくとも 6 日の毎日</li>。
		</ol></li> <li>組織特定 mCherry::pHluorin 式</li> <li>卵胞細胞特定のドライバーを y 1 w *; UA mCherry::pHluorin 1 をクロスP {GawB} 10930/CyO (ブルーミントン ID: 7023).</li>
		<li>ハエを eclosing、開始後 3 日を収集し、ウェット酵母、解剖前に少なくとも 24 時間を含むバイアル内に配置します</li>。
	</ol></li> <li>ソリューション 注: バッファーの pH, 溶質濃度は時間の経過と共に変更できるので、実験の日に次のバッファーを準備することが重要です。
	<ol><li>重炭酸塩、nigericin、および郭清のバッファーを準備します。(表 1 表 2、および 表 3 参照) の沈殿物の形成を避けるために記載されている順序でコンポーネントを追加します</li>。
	</ol></li></ol> 2。試み: 測定 FSC 血統でピピ 注: 郭清、マウント、およびライブ イメージング炭酸バッファーと 2 つの nigericin バッファー条件について 2 回実行する必要があります: 顕微鏡を判断します。設定、2 回目の実験データを収集します。詳細については、セクション 2.2 以下を参照してください。
<ol><li>郭清と取付 注: この手順を実行する必要な材料 材料の表 と 図 1 を参照してください。3 D 印刷取り付け部屋 3 D プリンター ファイル 補足のファイル 1 と ファイル 2 の補足 として提供しています。
	<ol><li>郭清: <ol><li>準備取付チャンバー真空用グリースの薄膜コーティングを 3 D の平坦な面に適用することによってプリント取付商工会議所。22 × 40 mM coverslip 取付室 coverslip を密封するためにその辺を配置します</li>。
		</ol></li> <li>500 μ L 解剖バッファー (重炭酸塩または nigericin、表 3) で雌成虫の卵巣の解剖 <ol><li>CO 2 ガスを使用して 3-4 ハエを麻酔し、転送飛ぶ飛ぶパッド CO と灌流に 2 ガス</li>。
			<li>鉗子と郭清のメディアに場所で麻酔のフライをピックアップします</li>。
			<li>の卵巣が公開されるまで、腹部の先端にえい航しながら 1 つの鉗子を使ってオンザフライの胸郭をピンチします</li>。
			<li>卵巣が他の臓器をデタッチ後離れて 22 の 1/2 の注射針を使用して卵巣小管をいじめます。慎重に独立した筋肉の卵巣と卵巣小管のクラスターから別の個別卵巣小管から外装します。筋肉の鞘を分離するための効果的な手法の前方の端の場所で卵巣小管のクラスターを保持し、単一の卵巣小管の長さに沿って下向きストローク 1 つの注射針を使用することです</li>。
			<li>Nigericin 郭清メディアの pH で完全に平衡にセルのファイの十分な時間があるので取り付けの手順に進む前に丁度 10 分間解離メディアで切り裂かれた卵巣をインキュベートします 。
			注: は、卵巣小管から筋鞘を削除することを確認します。筋肉の鞘が困難を使用して個々 のセルを識別するために蛍光信号を減衰させる、Concanavilin のライブ イメージング中に自発的に移動する卵巣小管を引き起こす可能性があります</li>。
		</ol></li> <li>マウント <ol><li>取り付け室内ガラス基盤上に郭清メディアの小滴を配置します</li>。
			<li>転送分離鉗子を用いた卵巣小管</li>。
			<li>以前の段階の卵室に関連付けられている germaria から後ステージ卵室を分離し、切り裂かれた germaria が郭清メディア ドロップの中心に置かれることを確認してください</li>。
			<li>ラウンド 12 mm カバーガラスの両端に爪のポーランド語の 2 つの小滴を追加し、それが空気乾燥約 10 s.</li>
			<li>場所ラウンド coverslip を含む解剖メディアのドロップは、マニキュアと側下の顔解剖メディアの連絡先、germaria を分離しました。平らにし、位置に germaria を確保するマニキュアとエッジの部分を押してください。スメアほど、カバーガラスの表面上の場所でそれを確保するために古いマニキュアを使用して勧めします</li>。
			<li>では、追加解剖メディアでの取付をチャンバーします。チャンバーにコンカナバリン A 染料を含まない条件特定のバッファーを使用できます 。
			注: 時間の合計を過ごした解剖. 取付は 15 分を超えないようにしてください。これは組織の損傷の影響を最小限に抑えることが重要です。細胞死と</li>。
		</ol></li></ol></li> <li>ライブ イメージング: 注: この手順ではまず炭酸状態と顕微鏡の適切な設定を決定する 2 つの nigericin 条件から画像を収集; 必要に応じて顕微鏡設定を調整その後、実験データの画像を収集しています。3 チャネルでイメージングできる共焦点顕微鏡を使用: GFP (475 励起/509 排出), mCherry (575 励起/610 排出) と遠 (633 励起/647 排出). 
	注: 顕微鏡設定: 各画像セットの信号強度の値が低すぎても飽和ことが重要ですので、ピピの見積もりを決定するを収集した画像のピクセル強度を定量化するでしょう。画像でキャプチャできる強度の範囲は、画像のビット深度によって定義されます。多くの場合、既定では、8 ビットの画像で生成がより広いダイナミック レンジを持つ 16 ビット イメージとしてデータを取得することをお勧めします。蛍光チャネル間のクロストークを最小化発光スペクトルから収集された設定を調整する必要がありますので、各 fluorophore は重複しないことを確認することが重要です。これらの設定をテストするには、励起スペクトルを用いた GFP サンプル画像を取る、mCherry と その逆 の発光スペクトルの収集します。設定は、正しく調整されている場合、必要がありますない信号どちらの場合。すべての 3 つのイメージ セットの信号の輝度がイメージ ファイルの動的範囲内でされるように顕微鏡設定 (すなわち、電圧設定を共焦点レーザー スキャン、レーザー パワーとピンホールのサイズ) を設定します。すべての実験において、必要に応じて、我々 はすべての実験のための電圧利得を最適化しながら、1,024 × 1,024 形式で 16 ビット画像を取得するのに白い光レーザー共焦点顕微鏡 40 倍対物を使用しました。たとえば、1 つの実験で mCherry、GFP の電圧利得が設定と 37.8%、72.9%、260%、赤外それぞれ。
	<ol><li>Nigericin 郭清 pH 6.5、buffer 内卵巣小管のイメージし、pHluorin と mCherry の画像の輝度が低く、しかし、カメラの検出限界以下の設定を調整します</li>。
		<li>Nigericin 郭清 pH 7.5 buffer 内卵巣小管の別のセットをイメージし、pHluorin と mCherry の画像のピクセル強度が高いが、飽和していないように設定を調整します</li>。
		<li>重炭酸の解離イメージ卵巣はバッファーに格納し、pHluorin と mCherry の画像の輝度が選択した設定と飽和していないことを確認します。ピクセルを飽和している場合は、必要に応じて設定を調整します 。
		注: 顕微鏡のパラメーターの設定が異なる場合があります使用されている正確な顕微鏡の設定に基づいて、各実験のために最適化する必要があります。顕微鏡設定が設定された後、実験の残りのそれらを変更しないでください。設定すべきコントロールと実験条件間で一貫しました。初期ピピ実験で 2 と 3 点 nigericin の較正曲線を生成し、いずれかの方法を使用して計算されるピピ差が見つかりません。ただし、一般に、較正曲線のより多くのポイントの追加に期待される精度を向上させます。したがって、実験条件の特定のセットの必要な数を決定するポイントの数が異なる曲線を生成するをお勧めします</li>。
	</ol></li> <li>データ収集: <ol><li>郭清、マウント、および重炭酸塩と nigericin のバッファー条件で試料のイメージングを実行します。1 組のサンプルの画像をライブ、健康な組織の蛍光強度の測定をように 45 分超えない郭清と取り付け、最大の時間を過ごした後</li>。
		<li>条件ごとに、少なくとも 5 の germaria の画像を取得します</li>。
	</ol></li></ol> 3。後の試み: 画像解析 <ol><li>Fsc、pFCs、卵胞細胞の蛍光強度を測定 <ol><li>バック グラウンド減算: <ol><li>オープン未処理の別のウィンドウ (各チャネルにフィジーの画像 図 4).</li>
			<li>PHluorin チャネル ウィンドウの信号なしのイメージの一部で利益 (率 ROI) の領域を描画する四角形ツールを使用します</li>。
			<li>オプションの手順: しきい値の下限を設定し、背景下強度値を持つピクセルは除外し、最大しきい値の上限を設定します。この方法でしきい値を設定すると、信号のないイメージの領域は、主に青と信号が明確に表示されます ( 図 4 a).</li>
			<li>は、投資収益率の平均蛍光強度を測定します。しきい値は、手順 3 で設定された場合は、ご確認ください、&#34; のしきい値制限 &#34; 測定の設定] ダイアログ ボックスの</li>。
			<li>各チャネルおよびプロセスは、減算関数を使用してイメージのスライスから測定したバック グラウンド強度を引く &#8594; 数学メニュー</li>。
			<li>繰り返しの手順 3.1.1.2-6 3.1.1.2 の手順でを除いて、mCherry チャネル ウィンドウの矩形ツールを使って新しい四角形を描画する代わりに復元の選択機能を使用して、編集の &#8594; と同じ四角形を追加する選択メニューサイズと画像を位置します</li>。
		</ol></li> <li>を識別する場合、Fsc、pFCs、卵胞細胞: <ol><li>Fsc、pFCs、卵胞細胞形態およびコンカナバリン A の染色を使用してセルの境界 ( 図 2) を検索する場所を特定します</li>。
			<li>Fsc、薄い三角形セル領域 2 a ・ 2 b の枠線上で germarium の端に位置します。FSC には mCherry::pHluorin は、FSC クローンで表されます場合、クローンの前のほとんどの細胞として識別できます</li>。
			<li>pFCs は地域 2 b、すぐに隣接して、Fsc の下流で不規則な形をした細胞</li>。
			<li>卵胞細胞が地域 3 胚細胞嚢胞を囲む正方形または円柱状細胞</li>。
		</ol></li> <li>取得の蛍光強度比 <ol><li>興味のセルが mCherry チャネルで最高の蛍光強度を 1 つまたは複数のスライスを選択し、foc が遠チャネルで見られるコンカナバリン A 染色確認選択したスライス内私たち</li>。
			<li>各 FSC と pHluorin とすべての mCherry の平均蛍光強度の測定のために選択したスライス メジャーの周りを描く ROI</li>。
			<li>MCherry 蛍光 1p-169 比を計算する mCherry チャネルの平均蛍光強度で pHluorin チャネルの平均蛍光強度を分割します</li>。
		</ol></li></ol></li> <li>取得値し、pseudocolored の画像を生成する <ol><li>取得ファイ値 <ol><li>同じ遺伝子型のハエから卵巣の場合、線形回帰曲線を生成します。両方の実験条件を制御し、。2 つの nigericin バッファー条件 ( 図 3) からのデータを使用して各セルの型に回帰曲線を生成します。Excel では、グラフにデータをプロットし、線形近似曲線を追加することで実行できます。代わりに、参照してください:</li> <li>使用 nigericin 条件と直線の式から算出する斜面と線形回帰曲線の y 切片 (y = mx+b と)、pHluorin を mCherry 比の値に変換する重炭酸塩のサンプルから計算pH 値の条件。この式の b の代わりに斜面形 (y 切片)、x のための比の値を入れて、裕の解決</li>
		</ol></li> <li>フィジーの比率値を反映して pseudocolored 画像を生成します。
		<ol><li>バック グラウンド減算 (ステップ 3 上記の手順に従ってくださいします。1.1 および 図 4).</li>
			<li>は、pHluorin のチャネル mCherry プロセスのメニュー画像電卓関数を使用して分割します。必ず、&#34; を作成する新しいウィンドウ &#34; と &#34; 32 ビット (浮動小数点) の結果 &#34; のチェック ボックスの両方がオンします。変更するルックアップ テーブル (LUT)、熱または選択の LUT イメージ メニューの下にあります。その他の適切なオプションの 図 4 を参照してください</li>。
			<li>調整明るさとコントラスト ダイアログ ボックス (画像 &#8594; 調整 &#8594; 明るさ/コントラスト) をクリックして、&#34; 設定 &#34; ボタン。セット最小表示値を 0、最大表示値比は、その最高のキャプチャ データは、通常 1.0-2.0 ( 図 5).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Grillo-Hill, B. K., Choi, C., Jimenez-Vidal, M., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+H++efflux+is+sufficient+to+induce+dysplasia+and+necessary+for+viability+with+oncogene+expression.">Increased H+ efflux is sufficient to induce dysplasia and necessary for viability with oncogene expression.</a> eLife. 03270, (2015).</li><li>Ulmschneider, B., Grillo-Hill, B. K., Benitez, M., Azimova, D. R., Barber, D. L., Nystul, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+intracellular+pH+is+necessary+for+adult+epithelial+and+embryonic+stem+cell+differentiation.">Increased intracellular pH is necessary for adult epithelial and embryonic stem cell differentiation.</a> J. 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著者が明らかに何もありません。

ここでは、野生型組織内 FSC 系統の細胞のピピの測定法について述べる.このプロトコルを開発し、ショウジョウバエ卵巣組織のピピを勉強する最初を開始して以来、過去 5 年間で洗練されました。その間、プロトコルは、複数の捜査官当研究室と、少なくとも 4 つの異なる回転する円盤とレーザ走査型顕微鏡で正常に使用されています。当社独自の観測、ピピ増加卵胞細胞状態に pFC ?...

最近の研究は、細胞分化と異生体内で1,2ピピの変化のための役割を明らかにしました。これらの研究は、細胞 1 つの段階から別への移行が変更されるが、そのファイは著しく分化、同じステージで同じ型のセルで一貫性のあるを発見します。いくつかのケースでピピで変更を部分的にブロック分化、ピピの変化は細胞の運命の変化の結果だけではないが、代わりにおそらく pH に敏感な調節に及ぼす影響を細胞の運命の変化を促進するのに役立ちます示唆を妨害します。タンパク質や分化に必要な化学反応。今後の研究には、ピピ動態の生体内でさまざまな役割にもっと洞察力を明らかにする可能性があります。しかし、生体内での分化時にピピを研究の課題の 1 つがピピの正確な測定を取得します。分化細胞の形態と遺伝子発現の変化などの他の機能とは異なりピピはセルが固定され、標準的な方法でグリセリンのセルに保存されていないの不安定な化学プロパティです。さらに、強調している細胞の安定や実験操作の結果として死んで、ピピはできません。したがって、ピピを測定するとき生きていると可能な限り健康細胞を保つために重要です。いくつかの重要な染料が生体内研究深くまたは均等に、彼らは組織を浸透しないので、場合は細胞文化3ではなく、多くのピピを測定、それらのためによく働くが適していないいる利用可能な正確な測定を提供するために十分な.
貧しい染料の浸透の問題を回避するために私たちと他の人は、遺伝的コード化プローブ、mCherry::pHluorin4,5,6、7セルで具体的に表すことができるを使用しています。興味とイメージで生体の種類。pHluorin は高い pKa と GFP のバリアント (~ 対 7.0 〜 4.0) を折るより容易により高い ph;だから pHluorin 分子の人口から放出される総蛍光強度は φ8の増加とともに増加します。重要なは、蛍光、ピピ値の正常細胞質範囲内で線形です。対照的に、mCherry の蛍光 (pKa 〜 4.5) ゾル性細胞質範囲内の pH の変化に敏感ではないです。これらの 2 つの記者が均等に存在している常にので、1 つのオープンリーディング フレームによって符号化される単一のキメラ蛋白質として一緒にリンク共有されます。したがって、mCherry の蛍光強度を 1p-169 比は、各セルにプローブ濃度に正規化されたファイの測定を提供します。比率は、知られている pH 値を平衡して組織から mCherry 比、pHluorin を取得することによって生成された標準的なカーブを使用して φ 値の推定値に変換できます。
ここでは、mCherry::pHluorin を使用してショウジョウバエ卵巣上皮の FSC 系統のピピを測定する方法をについて説明します。このよ特徴付けられた組織は、上皮の生物学、幹細胞の自己複製と分化9,10,11, 集団細胞遊走12 などのさまざまな側面をモデルに使用されています、および開発、細胞極性13,14の保守。卵胞上皮は、germarium15,16と呼ばれる構造に組織の前方の端にある 2 つの Fsc によって生成されます。これらの細胞が自己更新し、ニッチを再入力と FSC になるまたは 3 つの異なる卵胞細胞の種類のいずれかに分化する実行できる prefollicle 細胞 (pFCs) と呼ばれる子孫を生成する成人期に定期的に分割: 極細胞、茎細胞、または本体卵胞細胞。我々, 以前では野生型組織、ファイは、Pfc の 7.0 に Fsc の約 6.8 のピピから、卵胞細胞27.3 への分化の初期段階の間に着実に増加します。深刻な pFC 分化を損なう、 DNhe2の過剰発現によるピピの増加に対し原因軽度の過剰な分化の普遍的発現ナトリウム/プロトン交換、 DNhe2、RNAi ノックダウンでこの増加をブロック表現型。これらの調査結果は、ピピは初期の FSC 系統の維持安定、生体内で増減実験できることを示しています。ここで説明する方法は、野生型組織や RNAi ノックダウンまたは利子および有糸分裂のクローンの Gal4 を使用して過剰発現を含む突然変異体の組織の様々 な形のピピを測定する使用できます。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Fly Stocks&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UAS-mCherry::pHluorin[1]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>y1 w*;P{GawB}10930/CyO</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>7023</td><td></td></tr><tr><td>Act-Gal4 flipout stock</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>4409</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals for Buffer preparation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-3911</td><td></td></tr><tr><td>glucose</td><td>Mallinckrodt</td><td>4912</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M63</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C-5080</td><td></td></tr><tr><td>HCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-5761</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-9272</td><td></td></tr><tr><td>NMDG+</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-2004</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Mallinckrodt</td><td>7088</td><td>Use to Make KHPO4 pH 7.4</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP362</td><td>Use to Make KHPO4 pH 7.4</td></tr><tr><td>Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Conjugate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C21421</td><td>0.25 mg/ml dilution</td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N1495</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Dissection and mounting tools&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 Dumont Inox forceps (Size 5)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9473431</td><td></td></tr><tr><td>2 23-gauge syringe needles</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z192457</td><td></td></tr><tr><td>9-well glass dissecting dish</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-748B</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum Grease</td><td>Dow Corning</td><td>1018817</td><td></td></tr><tr><td>22 X 40 mM glass coverslips</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12545C</td><td></td></tr><tr><td>Round Glass Coverslips, 12mm diameter, 0.13-0.16mm thickness</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>26023</td><td></td></tr><tr><td>3-D mounting chamber</td><td>custom manufactured</td><td></td><td>.stl and .ipt files for 3-D printer included as supplemental files</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-620-183A</td><td>Model: Accumet AB15</td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Olympus Corporation</td><td>0H11436</td><td>Model: SZ2-ST</td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>SP5 or SP8 laser-scanning confocal microscope with a 40&amp;times; objective with a numerical aperture of 1.3</td></tr></tbody></table>

methods for imaging intracellular ph of the follicle stem cell lineage in live drosophila ovarian tissue

細胞内 pH (pHi) の変化は、代謝、増殖、分化など多くの細胞機能の調節に重要な役割を果たします。通常、ピピのダイナミクスは、測定やピピの実験操作に適している培養細胞で決定されます。ただし、新しいツールと方法論の最近の発展が可能そのままに、ライブの組織内のピピのダイナミクスを研究します。ショウジョウバエ研究の 1 つの重要な開発だったピピ バイオ センサーを運ぶ遺伝子組換えラインの世代 mCherry::pHluorin。ここでは、我々 は mCherry::pHluorin 遺伝子の野生型の行数で卵胞上皮幹細胞 (FSC) 系統のピピを測定するイメージング ライブショウジョウバエ卵巣小管に頻繁に使用されるプロトコルについて述べるただし、ここで説明する方法は翅原基と眼の上皮を含む他の組織のために容易に適応することができます。ライブ イメージング、および集録および解析ピピ値を取得する画像中の卵巣組織の維持 FSC 系統 mCherry::pHluorin を表現するための手法について述べる。

ここでいくつかの手順を含む卵胞上皮のピピを計測するプロセスを説明しました。まず、卵巣は解剖や実装のためのツールを使用して適切な遺伝子 (図 1) のハエから解剖しました。卵巣小管が定量的蛍光顕微鏡を使ってイメージ化して、ピピの測定画像を分析します。各イメージ セクション 3.1 (図 2) で説明されているよ?...

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Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

ライブショウジョウバエ卵巣組織の卵胞幹細胞系列のイメージング細胞内 pH の方法

ライブショウジョウバエ卵巣組織の上皮幹細胞系列の細胞内 pH のイメージングのためのプロトコルを提供します。定量的蛍光イメージングを用いたバイオ センサー pH センサー、mCherry::pHluorin、イメージを表現する遺伝子組換えハエを生成し、標準曲線を生成 pH 値に変換する蛍光強度の方法について述べる。

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

methods-for-imaging-intracellular-ph-follicle-stem-cell-lineage-live

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

6.8K ビュー.  University of California, San Francisco. ライブショウジョウバエ卵巣組織の上皮幹細胞系列の細胞内 pH のイメージングのためのプロトコルを提供します。定量的蛍光イメージングを用いたバイオ センサー pH センサー、mCherry::pHluorin、イメージを表現する遺伝子組換えハエを生成し、標準曲線を生成 pH 値に変換する蛍光強度の方法について述べる。

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Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

無傷の感覚器官の前駆細胞の生細胞イメージングショウジョウバエ蛹

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

神経科学

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a rapid and high-throughput manner. S2 cells have proven amenable to both fixed- and live-cell imaging applications. Notably, live-cell imaging can yield valuable information about how loss or knockdown of a gene can affect the kinetics and dynamics of key events during cell division, including mitotic spindle assembly, chromosome congression, and segregation, as well as overall cell cycle timing. Here we utilize S2 cells stably transfected with fluorescently tagged mCherry:&#945;-tubulin to mark the mitotic spindle and GFP:CENP-A (referred to as &#8216;CID&#8217; gene in Drosophila) to mark the centromere to analyze the effects of key mitotic genes on the timing of cell divisions, from prophase (specifically at Nuclear Envelope Breakdown; NEBD) to the onset of anaphase. This imaging protocol also allows for the visualization of the spindle microtubule and chromosome dynamics throughout mitosis. Herein, we aim to provide a simple yet comprehensive protocol that will allow readers to easily adapt S2 cells for live imaging experiments. Results obtained from such experiments should expand our understanding of genes involved in the cell division by defining their role in several simultaneous and dynamic events. Observations made in this cell culture system can be validated and further investigated in vivo using the impressive toolkit of genetic approaches in flies.

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Cell divisions can be visualized in real time using fluorescently tagged proteins and time-lapse microscopy. Using the protocol presented here, users can analyze cell division timing dynamics, mitotic spindle assembly, and chromosome congression and segregation. Defects in these events following RNA interference (RNAi)-mediated gene knockdown can be assessed and quantified.

細胞分裂のライブイメージングのためのショウジョウバエS2細胞の使用

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a ...

遺伝学

Visualizing the Effects of Oxidative Damage on Drosophila Egg Chambers using Live Imaging

Live imaging of Drosophila melanogaster ovaries has been instrumental in understanding a variety of basic cellular processes during development, including ribonucleoprotein particle movement, mRNA localization, organelle movement, and cytoskeletal dynamics. There are several methods for live imaging that have been developed. Due to the fact that each method involves dissecting individual ovarioles placed in media or halocarbon oil, cellular damage due to hypoxia and/or physical manipulation will inevitably occur over time. One downstream effect of hypoxia is to increase oxidative damage in the cells. The purpose of this protocol is to use live imaging to visualize the effects of oxidative damage on the localization and dynamics of subcellular structures in Drosophila ovaries after induction of controlled cellular damage. Here, we use hydrogen peroxide to induce cellular oxidative damage and give examples of the effects of such damage on two subcellular structures, mitochondria and Clu bliss particles. However, this method is applicable to any subcellular structure. The limitations are that hydrogen peroxide can only be added to aqueous media and would not work for imaging that uses halocarbon oil. The advantages are that hydrogen peroxide is readily available and inexpensive, acts quickly, its concentrations can be modulated, and oxidative damage is a good approximation of damage caused by hypoxia as well as general tissue damage due to manipulation.

The objective of this protocol is to use live imaging to visualize the effects of oxidative damage on the localization and dynamics of subcellular structures in Drosophila ovaries.

ライブイメージングを用いたショウジョウバエ卵チャンバに対する酸化損傷の効果の可視化

Live imaging of Drosophila melanogaster ovaries has been instrumental in understanding a variety of basic cellular processes during development, including ...

発生生物学

Nuclear Migration in the Drosophila Oocyte

Live cell imaging is particularly necessary to understand the cellular and molecular mechanisms that regulate organelle movements, cytoskeleton rearrangements, or polarity patterning within the cells. When studying oocyte nucleus positioning, live-imaging techniques are essential to capture the dynamic events of this process. The Drosophila egg chamber is a multicellular structure and an excellent model system to study this phenomenon because of its large size and availability of numerous genetic tools. During Drosophila mid-oogenesis, the nucleus migrates from a central position within the oocyte to adopt an asymmetric position mediated by microtubule-generated forces. This migration and positioning of the nucleus are necessary to determine the polarity axes of the embryo and the subsequent adult fly. One characteristic of this migration is that it occurs in three dimensions (3D), creating a necessity for live imaging. Thus, to study the mechanisms that regulate nuclear migration, we have developed a protocol to culture the dissected egg chambers and perform live imaging for 12 h by time-lapse acquisitions using spinning-disk confocal microscopy. Overall, our conditions allow us to preserve Drosophila egg chambers alive for a long period of time, thereby enabling the completion of nuclear migration to be visualized in a large number of samples in 3D.

Nuclear Migration in the Drosophila Oocyte

In Drosophila, the oocyte nucleus undergoes microtubule-dependent migration during oogenesis. Here, we describe a protocol that was developed to follow the migration by performing live imaging on egg chambers ex-vivo. Our procedure maintains egg chambers alive for 12 h to acquire multi-position 3D time-lapse movies using spinning-disk confocal microscopy.

ショ ウジョウバエ・ ウーサイトにおける核移動

Live cell imaging is particularly necessary to understand the cellular and molecular mechanisms that regulate organelle movements, cytoskeleton ...

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment and maintenance of epithelial tissue morphology and organ morphogenesis. Moreover, the BM is essential for tissue modeling, serving as a signaling platform, and providing external forces to shape tissues and organs. Despite the many important roles that the BM plays during normal development and pathological conditions, the biological pathways controlling the intracellular trafficking of BM-containing vesicles and how basal secretion leads to the polarized deposition of BM proteins are poorly understood. The follicular epithelium of the Drosophila ovary is an excellent model system to study the basal deposition of BM membrane proteins, as it produces and secretes all major components of the BM. Confocal and super-resolution imaging combined with image processing in fixed tissues allows for the identification and characterization of cellular factors specifically involved in the intracellular trafficking and deposition of BM proteins. This article presents a detailed protocol for staining and imaging BM-containing vesicles and deposited BM using endogenously tagged proteins in the follicular epithelium of the Drosophila ovary. This protocol can be applied to address both qualitative and quantitative questions and it was developed to accommodate high-throughput screening, allowing for the rapid and efficient identification of factors involved in the polarized intracellular trafficking and secretion of vesicles during epithelial tissue development.

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

The basement membrane is essential for tissue and organ morphogenesis during development. To better understand the mechanisms leading to proper placement of this structure, the protocol presented describes methods to visualize and characterize the intracellular trafficking and secretion of basement membrane proteins in epithelial cells using confocal and super-resolution microscopy.

ショウジョウバエの卵子形成期における分極細胞内輸送と基底膜タンパク質の分泌の共焦点および超解像イメージング

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment ...

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to explore the dynamics of a myriad of developmental processes, such as cell division, stemness, differentiation, migration, apoptosis, autophagy, cellular adhesion, etc., over time. Recently, we have implemented an extended ex vivo culture and live imaging of the female Drosophila GSC niche. Using a Drosophila line harboring a GFP::Par-1 transgene as an example, this method allows the visualization of the GSCs&#39; asymmetric division within their niche and the description of the changes in the spectrosome morphology along the cell cycle. Here, we present a detailed protocol for the ex vivo culture of Drosophila germaria, enabling prolonged visualization of the female GSC niche. Importantly, this protocol is broadly applicable to live imaging GSCs with multiple fluorescently tagged proteins of interest that are available in stock centers and/or in the Drosophila research community.

Here, we provide a detailed protocol to perform live imaging of the asymmetric division of germline stem cells (GSCs) in the Drosophila ovarian niche. We use a transgenic line that ubiquitously expresses a green fluorescent protein (GFP) fusion of the spectrosome protein Par-1.

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to ...

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. The molecular clock within each pacemaker neuron generates circadian rhythms in gene expression, which underlie the rhythmic neuronal functions essential to the operation of the circuit. Investigation of the properties of the individual molecular oscillators in different subclasses of pacemaker neurons and their interaction with neuronal signaling yields a better understanding of the circadian pacemaker circuit. Here, we present a time-lapse fluorescent microscopy approach developed to monitor the molecular clockwork in clock neurons of cultured Drosophila larval brain. This method allows the multi-day recording of the rhythms of genetically encoded fluorescent circadian reporters at single-cell resolution. This setup can be combined with pharmacological manipulations to closely analyze real-time response of the molecular clock to various compounds. Beyond circadian rhythms, this multipurpose method in combination with powerful Drosophila genetic techniques offers the possibility to study diverse neuronal or molecular processes in live brain tissue.

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The goal of this protocol is to establish ex vivo Drosophila larval brain culture optimized to monitor circadian molecular rhythms with long-term fluorescence time-lapse imaging. The application of this method to pharmacological assays is also discussed.

単一セルの解像度蛍光は住む幼虫脳文化のショウジョウバエ概日時計のイメージング

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

でGFP標識タンパク質のイメージングを生きる<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;卵母細胞

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

生物学

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

の蛹ケースを画像化<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.

ミトコンドリアの構造と機能の研究に<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;卵巣

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial ...

ライブショウジョウバエ卵巣組織の卵胞幹細胞系列のイメージング細胞内 pH の方法

要約

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無傷の感覚器官の前駆細胞の生細胞イメージングショウジョウバエ蛹

細胞分裂のライブイメージングのためのショウジョウバエS2細胞の使用

ライブイメージングを用いたショウジョウバエ卵チャンバに対する酸化損傷の効果の可視化

ショウジョウバエ・ウーサイトにおける核移動

ショウジョウバエの卵子形成期における分極細胞内輸送と基底膜タンパク質の分泌の共焦点および超解像イメージング

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

単一セルの解像度蛍光は住む幼虫脳文化のショウジョウバエ概日時計のイメージング

でGFP標識タンパク質のイメージングを生きる

の蛹ケースを画像化

ミトコンドリアの構造と機能の研究に

ライブショウジョウバエ卵巣組織の卵胞幹細胞系列のイメージング細胞内 pH の方法

要約

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無傷の感覚器官の前駆細胞の生細胞イメージングショウジョウバエ蛹

細胞分裂のライブイメージングのためのショウジョウバエS2細胞の使用

ライブイメージングを用いたショウジョウバエ卵チャンバに対する酸化損傷の効果の可視化

ショ ウジョウバエ・ ウーサイトにおける核移動

ショウジョウバエの卵子形成期における分極細胞内輸送と基底膜タンパク質の分泌の共焦点および超解像イメージング

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

単一セルの解像度蛍光は住む幼虫脳文化のショウジョウバエ概日時計のイメージング

でGFP標識タンパク質のイメージングを生きる

の蛹ケースを画像化

ミトコンドリアの構造と機能の研究に

ショウジョウバエ・ウーサイトにおける核移動