ショ ウジョウバエ・ ウーサイトにおける核移動

この技術により、生体イメージング顕微鏡を用いて、卵母細胞核遊離など、解剖されたショウジョウバエ卵室における長い生物学的プロセスを観察することが可能となる。このプロトコルは、生画像顕微鏡を実行するために12時間生きている解剖卵室を維持する方法を説明します。まず、シュナイダーミディアムのピペット200マイクロリットルを、ミリリットルインスリンあたり10ミリグラムの30マイクロリットルで補い、4マイクロリットルの熱不活性化胎児子牛血清を加えます。

ピペットチップを使用して、穿刺されたスライドの下側の穴の周りに少量のシリコーングリースを塗布します。カバースリップを配置し、ピペットチップの広い端を使用してカバースリップに圧力をかけ、シリコーングリースを平らにしてシリコーンリング内部をスライドに作成します。麻酔をした雌のハエを、150マイクロリットルの撮像媒体を含む解剖ウェルに移す。

女性を解剖するには、鉗子を使用して胸郭をつかみ、後部腹部のキューティクルを2番目の鉗子でつまみます。子宮、卵管、筋鞘を慎重に取り除きます。キューティクルの開口部に見える卵巣のペアを分離し、取り外します。

10~15マイクロリットルの画像媒体を卵巣に置き、1つの卵巣を画像チャンバーに移す。卵巣を分離するために、針を使用して卵巣の後端を保持する。別の針を使用して、卵胞を引き離すためにゲルマリウムを慎重に引っ張ります。

1本の針で鞘を保持し、卵室の残りの筋肉鞘を取り除くために別の針で大きな部屋を通して卵巣を引っ張ります。覆いの外に出たオヴァロルを沈め、カバースリップに接触させる。鉗子を使用してマイクロチャンバーから後期および卵巣の残りの部分を取り除く。

針を使用して、慎重に卵巣子を距離を計り、取得を容易にします。透過性膜の小さな10を10ミリメートル四方に切ります。慎重に任意の気泡を排出するために、イメージング媒体の上部に膜を適用します。

その後、膜の輪郭の井戸の周りにハロカーボン油の薄い層でチャンバーを密閉します。反転顕微鏡のスライドホルダーにイメージング設定を置き、40Xの目的を使用します。野生型卵室の卵母細胞核の移動は、ライブイメージング顕微鏡を用いて捕捉した。

核は、2つの原形質膜の交点で最終的な位置に到達するために軌道に沿ってスライドする前に、前形質膜または横形形質膜のいずれかに達する。膜の変形、組織化されていない濾胞細胞、スタント細胞、および縮んだ核は、死にかけている卵室の最初の徴候である。8時間のイメージング前の脱退卵卵細胞は、通常は検出されない。

しかし、初期変性のまれなケースは、解剖または取り付けステップ中の問題によるものです。卵室にダメージを与えると、その生存が損なう。だから繊細な手の精密解剖とマイクロチャンバーの準備が最も重要です。

この手順により、卵母細胞核は移動中に3つの異なる軌道を取ることができ、異なるオルガネラが卵母細胞内のこれらの軌道を調節できることを視覚化することができました。