Name: methods for imaging intracellular ph of the follicle stem cell lineage in live drosophila ovarian tissue
Uploaded: 2017-09-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue at JoVE.com

Wir danken Bryne Ulmschneider für Beiträge zum Protokoll und Diane Barber für Anregungen zum Manuskript. Diese Arbeit wurde durch eine National Institute of Health Grant GM116384 T.G. Nystul und d.l. Barber finanziert.

Hinweis: um pHi in der FSC-Linie messen, wir berechnen Sie das Verhältnis der Fluoreszenz-Intensität von pHluorin auf mCherry in FSCs, PFC und Follikelzellen unter physiologischen Bedingungen, und konvertieren Sie die Verhältnisse in pHi-Werte mit Standard Kalibrierkurven für jede Zelle Typ 7. Zur Messung der Fluoreszenz-Intensität von pHluorin und mCherry in Germaria in einem Puffer mit Nahco3 3, die physiologischen Bedingungen 1 , imitiert zerlegt werden erste, live imaging Experimente durchgeführt 7. nächste, standard Kurven entstehen durch Messung von pHluorin und mCherry Fluoreszenz-Intensitäten in einem Na +-frei, K +-Puffer mit Ionophore Nigericin eingestellt auf zwei unterschiedliche pH-Werte, 6,5 und 7,5. In Anwesenheit von Nigericin pHi gestalten mit dem pH des Puffers in der Plasmamembran, pHi entsprechend den extrazellulären pH verursacht. Zu guter Letzt die Standardkurven werden verwendet, um pHluorin in mCherry Verhältnisse auf geschätzte pHi-Werte zu konvertieren.
 1. Pre-Trial: Vorbereitung vor der Messung pHi In Vivo Hinweis: pHi in Vivo zu messen, muss das mCherry::pHluorin Transgen in der Zelle Art von Interesse ausgedrückt werden. Im folgenden sind einige gemeinsame Wege zu transgenen pHluorin erzeugen in der FSC-Linie fliegt. Generierung von mCherry::pHluorin Klone eignet sich besonders zur Identifizierung FSCs, die am vorderen Rand des ein FSC-Klon befinden. Gewebe-spezifische mCherry::pHluorin-Ausdruck eignet sich zur Messung von pHi über das gesamte Gewebe und ist auch bequemer, wenn kombiniert mit Ausdruck einer RNAi oder Transgen.
<ol><li>Generation von transgenen pHluorin fliegt <ol><li>mCherry::pHluorin-Label FSC Klone <ol><li>mCherry::pHluorin FSC Klone zu überqueren UAS-mCherry::pHluorin- 1, ein Akt-Gal4 Flipout Lager oder andere Lager mit einem Flp/FRT induzierbaren Gal4.</li>
			<li>Um Heatshock induzierbaren Klone machen Heatshock Erwachsenen F1s für 2 Tage post Bewegungsapparate in leeren Fläschchen für 1 h bei 37 ° C Wasserbad, viermal ungefähr alle 12 h.</li>
			<li>Für normales Wachstum und Höchstsätze der Oogenese während dieses Zeitraums zu gewährleisten, halten fliegen durch die Bereitstellung von nassen Frischhefe (ungefähr gleiche Teile trocknen Bäcker &#39; s Hefe und Wasser) täglich für mindestens 6 Tage nach Klon Induktion.</li>
		</ol></li> <li>Gewebe spezifische mCherry::pHluorin Ausdruck</li> <li>Cross UAS-mCherry::pHluorin- 1 zu einem Follikel Zelle bestimmte Treiber, y 1 w *; P {GawB} 10930/CyO (Bloomington-ID: 7023).</li>
		<li>3 Tage nachdem fliegen umhüllenden, beginnen zu sammeln und legen Sie sie in Ampullen mit nassen Hefe für mindestens 24 h vor der Dissektion.</li>
	</ol></li> <li>Lösungen Hinweis: Es ist wichtig, die folgenden Puffer am Tag des Experiments vorzubereiten, weil der pH-Wert und gelösten Konzentrationen im Puffer im Laufe der Zeit ändern können.
	<ol><li>Bikarbonat, Nigericin und Dissektion Puffer vorbereiten. Fügen Sie die Komponenten in der Reihenfolge aufgelistet, um Bildung von Ausscheidungen (siehe Tabelle 1, Tabelle 2 und Tabelle 3) zu vermeiden.</li>
	</ol></li></ol> 2. Studie: Messung von pHi in der FSC-Linie Hinweis: die Dissektion, Montage, und Schritte für die Bicarbonat-Puffer und die zwei Nigericin Pufferbedingungen live imaging können zweimal durchgeführt werden müssen: einmal auf das Mikroskop bestimmen Einstellungen und ein zweites Mal, experimentelle Daten zu sammeln. Finden Sie im Abschnitt 2.2 unten für weitere Informationen.
<ol><li>Zerlegung und Montage Hinweis: Materialien erforderlich, um diesen Schritt ausführen, finden Sie in Abbildung 1 und Tabelle der Materialien. Für 3D gedruckte Montage Kammern sind 3D-Drucker Dateien als zusätzliche Datei 1 und ergänzende Datei 2 vorgesehen.
	<ol><li>Dissektion: <ol><li>Prepare Montage Kammern, indem eine dünne Schicht des Vakuum Fett auf der flacheren Seite des 3D gedruckt Montage Kammer. Legen Sie diese Seite auf einem Deckgläschen 22 x 40 mM, das Deckglas an die Montage-Kammer zu versiegeln.</li>
		</ol></li> <li>Sezieren Eierstöcke von weiblichen Erwachsenen fliegen in 500 µL Dissektion Puffer (Bicarbonat oder Nigericin Puffer, Tabelle 3) <ol><li>3-4 fliegen mit CO 2-Gas zu betäuben und Transfer fliegt auf eine Fliege Pad durchströmt mit CO 2 Gas.</li>
			<li>Einem narkotisierten fliegen mit Zange und Ort in die Dissektion Medien abholen.</li>
			<li>Kneifen den Brustkorb der Fliege mit einem Forcep beim zerren an der Spitze der seinen Bauch, bis die Eierstöcke ausgesetzt sind.</li>
			<li>Nach Abnehmen der Eierstöcke aus den anderen Organen, necken auseinander die Ovariolen mit 22 1/2 Spritze Nadeln. Sorgfältig getrennt der Muskel Mantel aus den Eierstöcken und separate individuelle Ovariolen aus dem Cluster von Ovariolen. Eine effektive Technik, die Muskel-Hülle zu isolieren ist mit einer Spritzennadel halten die Ansammlung von Ovariolen an seinem vorderen Ende und Strich nach unten entlang der Länge der einzelnen Ovariolen.</li>
			<li>Seziert Eierstöcke in Dissektion Medien genau 10 min inkubieren, bevor Sie fortfahren mit dem Montage-Schritt, so dass genügend für die pHi der Zellen Zeit, um voll und ganz mit dem pH der Nigericin Dissektion Medien equilibrate. 
			Hinweis: Sicherstellen Sie, dass der Muskel-Mantel aus den Ovariolen entfernt wird. Die Muskel Scheide kann das Fluoreszenzsignal, das macht es schwierig, einzelne Zellen mit identifizieren dämpfen Concanavilin-A, und verursachen Ovariolen spontan während der live Aufnahme verschieben.</li>
		</ol></li> <li>Montage <ol><li>legen Sie einen kleinen Tropfen der Dissektion Medien auf die Glas-Deckglas im Inneren der Kammer Montage.</li>
			<li>Übertragung getrennt mit Pinzette Ovariolen.</li>
			<li>Germaria Zusammenhang mit früheren Stadium Ei Kammern späteren Stufe Ei Kammern trennen und versuchen sicherzustellen, dass der seziert Germaria befinden sich in der Mitte der Dissektion Medien Drop.</li>
			<li>Zwei kleine Tropfen Nagellack auf gegenüberliegenden Seiten des eine Runde 12-mm-Deckglas und lassen Sie es an der Luft trocknen für ca. 10 s.</li>
			<li>Ort die Runde Deckglas auf den Rückgang der Dissektion Medien mit getrennt Germaria, so dass dieser Seite mit Nagellack nach unten zeigt und die Dissektion Medien Kontakte. Drücken Sie auf die Teile des Randes mit Nagellack zu glätten und die Germaria in Position zu sichern. Wir empfehlen die Verwendung älterer Nagellack, weil es schmiert weniger über die Oberfläche des das Deckglas, da es im Ort gesichert ist.</li>
			<li>Füllen Sie die Montage-Kammer mit zusätzlichen Dissektion Medien. Zustand bestimmte Puffer, die keine Concanavalin-A Farbstoff enthält kann verwendet werden, um die Kammer füllen. 
			Hinweis: Die gesamte Zeit verbrachte sezieren und Montage sollte 15 Minuten nicht überschreiten. Dies ist wichtig, die Auswirkungen von Gewebeschäden und Zelltod.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Live Imaging: Hinweis: In diesem Schritt zuerst sammeln Bilder von Bicarbonat-Zustand und die zwei Nigericin um die richtige Mikroskop-Einstellungen bestimmen, die Mikroskop-Einstellungen nach Bedarf, und dann sammeln Bilder für den experimentellen Daten. Verwenden Sie ein confocal Mikroskop in der Lage Bildgebung in 3 Kanäle: GFP (475 Erregung/509 Emission), mCherry (575 Erregung/610 Emission) und dunkelrote (633 Erregung/647 Emission). 
	Hinweis: Set Mikroskop Einstellungen: die Pixelintensität Bilder gesammelt werden um die Schätzungen der pHi, zu bestimmen, so es wichtig ist, dass die Intensitätswerte des Signals in jedem Bild-Satz ist weder zu niedrig noch gesättigten quantifiziert werden. Das Spektrum der Intensitäten, die in einem Bild erfasst werden können wird durch die Bild-Bittiefe definiert. In vielen Fällen 8-Bit-Bilder werden standardmäßig generiert, aber wir empfehlen die Datenerfassung als 16-Bit-Bilder, die einen größeren Dynamikumfang haben. Es ist darauf zu achten, dass das Übersprechen zwischen den fluoreszierenden Kanälen wird minimiert, so dass die Einstellungen angepasst werden sollte, damit das Emissionsspektrum von gesammelt überlappt nicht jedes Fluorophor. Um diese Einstellungen zu testen, nehmen Sie ein Beispiel-Bild mit der Anregungsspektrums für GLP und sammeln in das Emissionsspektrum für mCherry und umgekehrt. Wenn die Einstellungen richtig eingestellt haben, sollte in jedem Fall kein Signal. Legen Sie die Mikroskop-Einstellungen (d.h., Spannungs-Einstellungen auf einem Laserscanning konfokale, Laser Power und Lochkamera Größe), so dass die Pixelintensität des Signals in allen drei Sätzen innerhalb des dynamischen Bereichs der Image-Datei. Für alle unsere Versuche haben wir einen weißen Licht Laser-scanning-confocal Mikroskop mit einem Objektiv 40 X 16-Bit-Bilder in 1.024 × 1.024 Format zu erwerben, während wir Spannungsverstärkung für jedes Experiment optimiert, je nach Bedarf verwendet. Zum Beispiel in einem Experiment setzen wir die Spannungsverstärkung für GLP, mCherry, und dunkelrote 37,8 %, sowie 72,9 % 260 %, beziehungsweise.
	<ol><li>Bild Ovariolen in Nigericin Dissektion Puffer bei pH 6,5 und Einstellungen anpassen, so dass Pixelintensität der pHluorin und mCherry Bilder sind gering, aber nicht unter der Nachweisgrenze der Kamera.</li>
		<li>Bild einen anderen Satz von Ovariolen in Nigericin Dissektion Puffer bei pH 7,5 und passen Sie die Einstellungen so, dass die Pixel-Intensitäten der pHluorin und mCherry Bilder hoch, aber nicht gesättigt sind.</li>
		<li>Bild Eierstöcke in Bikarbonat Dissektion Puffern und sicherzustellen, dass die Pixel-Intensitäten der pHluorin und mCherry Bilder nicht mit den gewählten Einstellungen gesättigt sind. Wenn die Pixel gesättigt sind, passen Sie die Einstellungen nach Bedarf. 
		Hinweis: Mikroskop Einstellparameter abweichen können basierend auf den genauen Mikroskop-Einstellungen verwendet werden und muss für jedes Experiment optimiert werden. Nachdem Mikroskop Einstellungen eingestellt haben, ändern Sie sie nicht für den Rest des Experiments. Einstellungen sollten über Kontrolle und experimentellen Bedingungen übereinstimmen. In unseren ersten pHi-Experimenten wir 2 und 3 Punkt Nigericin Kalibrierungskurven generiert und fanden keinen signifikanten Unterschied zwischen berechneten pHi mit beiden Methoden. Jedoch in der Regel die Zugabe von mehr Punkte in der Eichkurve dürften um Genauigkeit zu verbessern. Wir empfehlen daher, generieren von Kurven mit einer unterschiedlichen Anzahl von Punkten zu bestimmen, wie viele für einen bestimmten Satz von experimentellen Bedingungen erforderlich sind.</li>
	</ol></li> <li>Datenerhebung: <ol><li>Dissektion, Montage und der Proben in Bikarbonat und Nigericin Pufferbedingungen imaging durchzuführen. Nach Präparation und Befestigung, die maximale Zeit verbrachte imaging eine Reihe von Proben sollte nicht mehr als 45 min um sicherzustellen, dass die Fluoreszenz-Intensität-Messungen in live, gesundes Gewebe hergestellt werden.</li>
		<li>Für jede Bedingung abrufen von Bildern für mindestens 5 Germaria.</li>
	</ol></li></ol> 3. Nach dem Prozess: Bildanalyse <ol><li>Maßnahme Fluoreszenz-Intensität im FSCs, PFC, und Follikelzellen <ol><li>Hintergrund Subtraktion: <ol><li>Open unverarbeitete Bilder in Fidschi mit jeden Kanal in einem separaten Fenster ( Abbildung 4).</li>
			<li>Verwenden Sie das Rechteck-Werkzeug eine Region of Interest (ROI) zu zeichnen in der pHluorin-Kanal-Fenster in einem Teil des Bildes ohne Signal.</li>
			<li>Optional Schritt: die untere Grenze der Schwelle so einstellen, dass Pixel mit Intensitätswerte unter Hintergrund sind ausgeschlossen und die obere Grenze der Schwelle auf Maximum festgelegt. Wenn die Schwelle auf diese Weise festgelegt ist, die Bereiche des Bildes ohne Signal sind meist blau und das Signal ist deutlich sichtbar ( Abb. 4A).</li>
			<li>Messen die mittlere Fluoreszenzintensität im ROI. Wenn die Schwelle in Schritt 3 festgelegt wurde, stellen Sie sicher, überprüfen die &#34; Grenze, Schwelle &#34; Feld im Dialogfeld legen Sie Messungen.</li>
			<li>Subtrahieren die gemessenen Hintergrundintensität von jedem Kanal und Slice des Bildes mithilfe der Subtract-Funktion, gefunden in den Prozess &#8594; Math-Menü.</li>
			Wiederholen Sie Schritte 3.1.1.2-6 <li>für das mCherry-Kanal-Fenster außer, dass in Schritt 3.1.1.2, statt ein neues Rechteck mit dem Rechteck-Werkzeug zeichnen, verwenden Sie die Wiederherstellungsfunktion Auswahl, gefunden in den Edit &#8594; Auswahl-Menü, fügen Sie ein Rechteck mit der gleichen Abmessungen und Position auf dem Bild.</li>
		</ol></li> <li>Identifizieren FSCs, PFC und Follikelzellen: <ol><li>identifizieren das FSCs, PFC und Follikelzellen von Morphologie und Standort mit Concanavalin-A Färbung, um Zellgrenzen ( Abbildung 2) zu finden.</li>
			<li>Sind FSCs dünne dreieckigen Zellen befindet sich am Rande des Germarium an der Region 2a/2 b Grenze. Wenn mCherry::pHluorin in einer FSC-Klon zum Ausdruck kommt, FSC kann auch identifiziert werden, wie die vorderen die meisten Zelle des Klons.</li>
			<li>PFC sind unregelmäßig geformten Zellen in Region 2 b, unmittelbar neben und hinter der FSCs.</li>
			<li>Follikel sind quadratisch oder säulenartige Zellen, die die Keimzelle Zyste in Region 3 umgeben.</li>
		</ol></li> <li>Erlangung Fluoreszenz Intensität Verhältnisse <ol><li>Wählen Sie eine oder mehrere Scheiben, in denen die Zelle von Interesse höchsten Fluoreszenzintensität in der mCherry-Kanal hat, und stellen sicher, dass das Concanavalin-A Färbung, gesehen in der dunkelrote Kanal in Foc uns in die ausgewählte Slice.</li>
			<li>Zeichnen ROI um jede FSC und Maßnahme der mittlere Fluoreszenzintensität von pHluorin und mCherry in allen Scheiben für Messungen gewählt.</li>
			<li>Teilen der mittleren Fluoreszenzintensität des pHluorin Kanals durch die mittlere Fluoreszenzintensität des mCherry Kanals, ein Verhältnis von pHluorin zu mCherry Fluoreszenz zu berechnen.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Derive pHi Werte und pseudocolored Bilder generieren <ol><li>Derive pHi Werte <ol><li>In allen Fällen, die lineare Regression-Kurve sollte erzeugt werden Eierstöcke von den Fliegen des gleichen Genotyps für beide experimentelle und Bedingungen zu steuern. Generieren Sie eine lineare Regression-Kurve für jeden Zelltyp mit den Daten aus zwei Nigericin Pufferbedingungen ( Abbildung 3). In Excel kann dies durch die Daten in einem Diagramm Plotten und eine lineare Trendlinie hinzufügen. Alternativ finden Sie unter:</li> <li>Gebrauch die Steigung und y-Achsenabschnitt der linearen Regression Kurve berechnet sich aus den Nigericin Bedingungen und die Gleichung einer geraden (y = Mx + b) berechnet aus den Proben in das Bikarbonat, die pHluorin in mCherry Verhältniswerte zu konvertieren Bedingung, die pH-Werte. In dieser Gleichung b Hang Form (y-Achsenabschnitt) ersetzen, setzen die Ratio-Wert in x und lösen für y.</li>
		</ol></li> <li>Erzeugen ein pseudocolored Bild spiegelt die Ratio-Werte in Fidschi.
		<ol><li>Folgen die Einzelheiten über Hintergrundabzug (Schritt 3.1.1 und Bild 4).</li>
			<li>Teilen den pHluorin Kanal aus dem mCherry-Kanal mit der Bildrechner-Funktion im Menü "Vorgang" zu finden. Achten Sie darauf die &#34; erstellen neues Fenster &#34; und &#34; 32-Bit (Float) Ergebnis &#34; Checkboxen werden beide überprüft. Ändern der Lookup-Tabelle (LUT), finden Sie unter dem Menü "Bild" thermische oder LUT Wahl. Siehe Abbildung 4 für andere geeignetsten Optionen.</li>
			<li>Stellen Sie Helligkeit und Kontrast im Dialogfeld (Bild &#8594; Adjust &#8594; Helligkeit/Kontrast), klicken Sie auf die &#34; gesetzt &#34; Taste. Satz das Minimum Wert auf 0 und das Maximum angezeigt Wert zu einem Verhältnis, die Aufnahmen am besten die Daten in der Regel 1,0-2,0 ( Abbildung 5).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Grillo-Hill, B. K., Choi, C., Jimenez-Vidal, M., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+H++efflux+is+sufficient+to+induce+dysplasia+and+necessary+for+viability+with+oncogene+expression.">Increased H+ efflux is sufficient to induce dysplasia and necessary for viability with oncogene expression.</a> eLife. 03270, (2015).</li><li>Ulmschneider, B., Grillo-Hill, B. K., Benitez, M., Azimova, D. R., Barber, D. L., Nystul, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+intracellular+pH+is+necessary+for+adult+epithelial+and+embryonic+stem+cell+differentiation.">Increased intracellular pH is necessary for adult epithelial and embryonic stem cell differentiation.</a> J. 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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hier beschreiben wir eine Methode zur Messung der pHi der Zellen in der FSC-Linie in Wildtyp-Gewebe. Dieses Protokoll wurde entwickelt und verfeinert in den vergangenen fünf Jahren seit Beginn der pHi in Drosophila Eierstockgewebe zu studieren. Während dieser Zeit wird das Protokoll durch mehrere Untersucher in unserem Labor und auf mindestens vier verschiedenen Spinning Disc und Laser-scanning-Mikroskope erfolgreich eingesetzt. Die Reproduzierbarkeit unserer ursprünglichen Beobachtung, dass pHi erhöht wie Z...

Neuere Studien gezeigt eine Rolle für Änderungen in pHi während zelluläre Differenzierung und Dysplasie in Vivo1,2. Diese Studien herausgefunden, dass pHi bemerkenswert konsistent in den Zellen des gleichen Typs auf der gleichen Stufe der Differenzierung, ist aber, dass es ändert als Übergang von einer Stufe zur anderen Zellen. In einigen Fällen stört die Änderungen in pHi teilweise Sperrung Differenzierung, was darauf hindeutet, dass die Veränderung der pHi nicht nur eine Folge von Veränderungen der Zelle Schicksal ist aber stattdessen hilft, die Veränderung der Zelle Schicksal, vielleicht durch Einfluß auf pH-Sensitive regulatorischen zu fördern Proteine oder chemische Reaktionen zur Differenzierung erforderlich. Zukünftige Studien haben das Potenzial, einen tieferen Einblick in die vielen verschiedenen Rollen der pHi Dynamik in Vivozu offenbaren. Jedoch ist eine der Herausforderungen des Studiums pHi während der Differenzierung in Vivo genaue Messungen der pHi erhalten. Im Gegensatz zu anderen Funktionen der Differenzierung, wie Veränderungen in der zellulären Morphologie und Genexpression ist pHi eine labile chemische Eigenschaft der Zelle, die nicht in den Zellen, die wurden behoben, und permeabilized mit Standardmethoden bewahrt wird. Darüber hinaus möglicherweise pHi nicht stabil in Zellen, die gestresst sind oder sterben durch experimentelle Manipulation. Daher ist es wichtig, die Zellen lebendig und so gesund wie möglich zu halten, bei der Messung von pHi. Mehrere wichtige Farbstoffe zur Verfügung, die funktionieren gut für Messung der pHi der Zellen in Kultur3, aber in vielen Fällen sie eignen sich nicht für in Vivo Studien, weil sie das Gewebe nicht tief oder gleichmäßig eindringen, genaue Messungen zu machen .
Um das Problem der schlechten Farbstoff Penetration zu umgehen, haben wir u.a. eine genetisch codierte Sonde, mCherry::pHluorin4,5,6,7, verwendet, die speziell in der Zelle ausgedrückt werden kann Arten von Interesse und abgebildeten in lebender Gewebe. pHluorin ist eine Variante der GFP mit einer höheren pKa (~ 7,0 vs. ~ 4.0), die Falten leichter bei höheren pH-Werten; so steigt der gesamten Fluoreszenzintensität emittiert bei einer Bevölkerung von pHluorin Moleküle in der Zelle mit zunehmender pHi8. Fluoreszenz ist linear innerhalb der normalen cytosolischen Wertebereich pHi. Im Gegensatz dazu die Fluoreszenz des mCherry (pKa ~ 4.5) ist unempfindlich gegen pH-Veränderungen innerhalb der cytosolischen. Diese zwei Reporter sind kovalent miteinander als ein chimäres Protein, durch einen einzigen offenen Leserahmen codiert, so dass sie immer in gleichen Mengen vorhanden sind. Daher stellt das Verhältnis von pHluorin zu mCherry Fluoreszenzintensität eine Messung des pHi, die auf die Sonde Konzentration in jeder Zelle normalisiert ist. Die Verhältnisse können dann Schätzungen von pHi-Werten mit einer Standardkurve, die generiert wird, durch den Erwerb der pHluorin mCherry-Verhältnisse von Geweben, die auf bekannten pH-Werte equilibriert wurde umgewandelt werden.
Hier beschreiben wir die Methoden für die Verwendung von mCherry::pHluorin, um die pHi der epithelialen FSC-Linie im Drosophila Eierstock zu messen. Dieses gut charakterisierten Gewebe wurde verwendet, um viele verschiedene Aspekte der epithelialen Biologie, wie z. B. Stammzell-Selbsterneuerung und Differenzierung9,10,11, kollektive Zellmigration12 Modell , Entwicklung und Wartung von Zelle Polarität13,14. Die Follikel Epithel wird durch zwei FSCs produziert, die am vorderen Rand des Gewebes in einer Struktur namens Germarium15,16befinden. Diese Zellen teilen sich regelmäßig im Erwachsenenalter selbst zu erneuern und produzieren nachkommen, genannt prefollicle Zellen (PFC), die entweder geben Sie die Nische und ein FSC werden oder in eine der drei verschiedenen Follikel Zelltypen differenzieren: polare Zellen, Stiel Zellen oder Hauptkörper Follikelzellen. Wir zeigten, dass zuvor in Wildtyp-Gewebe, die pHi steigt stetig in den frühen Phasen der Differenzierung von pHi von ca. 6,8 in FSCs 7.0 im PFC, auf 7,3 im Follikel Zellen2. Blockieren diese Erhöhung durch RNAi Knockdown von ein ubiquitär ausgedrückt Natrium/Proton-Wärmetauscher, DNhe2, stark beeinträchtigt pFC Differenzierung, während pHi steigt durch Überexpression des DNhe2 bewirkt eine milde überschüssige Differenzierung Phänotyp. Diese Ergebnisse belegen, dass pHi bleibt stabil in der frühen FSC-Linie, dass es experimentell kann erhöht oder verringert in Vivo. Die hier beschriebenen Methoden können verwendet werden, um pHi in Wildtyp-Gewebe oder verschiedene Formen der mutierte Gewebe, einschließlich der RNAi-Zuschlag oder Überexpression mit einer Gal4 von Interesse und mitotischen Klone zu messen.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Fly Stocks&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UAS-mCherry::pHluorin[1]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>y1 w*;P{GawB}10930/CyO</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>7023</td><td></td></tr><tr><td>Act-Gal4 flipout stock</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>4409</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals for Buffer preparation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-3911</td><td></td></tr><tr><td>glucose</td><td>Mallinckrodt</td><td>4912</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M63</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C-5080</td><td></td></tr><tr><td>HCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-5761</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-9272</td><td></td></tr><tr><td>NMDG+</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-2004</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Mallinckrodt</td><td>7088</td><td>Use to Make KHPO4 pH 7.4</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP362</td><td>Use to Make KHPO4 pH 7.4</td></tr><tr><td>Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Conjugate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C21421</td><td>0.25 mg/ml dilution</td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N1495</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Dissection and mounting tools&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 Dumont Inox forceps (Size 5)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9473431</td><td></td></tr><tr><td>2 23-gauge syringe needles</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z192457</td><td></td></tr><tr><td>9-well glass dissecting dish</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-748B</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum Grease</td><td>Dow Corning</td><td>1018817</td><td></td></tr><tr><td>22 X 40 mM glass coverslips</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12545C</td><td></td></tr><tr><td>Round Glass Coverslips, 12mm diameter, 0.13-0.16mm thickness</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>26023</td><td></td></tr><tr><td>3-D mounting chamber</td><td>custom manufactured</td><td></td><td>.stl and .ipt files for 3-D printer included as supplemental files</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-620-183A</td><td>Model: Accumet AB15</td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Olympus Corporation</td><td>0H11436</td><td>Model: SZ2-ST</td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>SP5 or SP8 laser-scanning confocal microscope with a 40&amp;times; objective with a numerical aperture of 1.3</td></tr></tbody></table>

methods for imaging intracellular ph of the follicle stem cell lineage in live drosophila ovarian tissue

Änderungen im intrazellulären pH (pHi) spielen eine wichtige Rolle bei der Regulierung der viele zelluläre Funktionen, einschließlich Stoffwechsel, Proliferation und Differenzierung. In der Regel sind pHi Dynamik in kultivierten Zellen bestimmt, die Mess- und experimentell manipuliert pHi zugänglich sind. Allerdings machte es die jüngste Entwicklung von neuen Instrumenten und Methoden möglich, pHi Dynamiken intakt, live Gewebe zu studieren. Für die Drosophila -Forschung, eine wichtige Entwicklung war die Erzeugung einer transgenen Linie tragen eines Biosensors pHi mCherry::pHluorin. Hier beschreiben wir eine Protokoll, mit denen wir routinemäßig für bildgebende live Drosophila Ovariolen pHi in der epithelialen Follikel Stammzellen (FSC) Linie in mCherry::pHluorin transgenen Wildtyp-Linien zu messen; die hier beschriebenen Methoden kann jedoch für andere Gewebe, einschließlich der Flügel Scheiben und Auge Epithel leicht angepasst. Wir beschreiben Techniken für den Ausdruck von mCherry::pHluorin in der FSC-Linie die Aufrechterhaltung Eierstockgewebe während live imaging und Erwerb und Analyse von Bildern um pHi Werte zu erhalten.

Hier haben wir den Prozess der Messung pHi in die Follikel Epithel, beinhaltet mehrere Schritte beschrieben. Erstens werden die Eierstöcke von fliegen von der entsprechenden Genotyp mit Tools zum sezieren und Montage (Abbildung 1) indiziert. Die Ovariolen sind dann abgebildet mit quantitativen Fluoreszenzmikroskopie und die Bilder werden analysiert, um Messungen der pHi zu erhalten. Für jedes Bild werden die Zelltypen von Interesse identifiziert, wie beschr...

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Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Methoden für Imaging intrazellulären pH der Follikel Stem Cell Linie in Live Drosophila Eierstockgewebe

Wir bieten ein Protokoll für imaging intrazelluläre pH-Wert von einer epithelialen Stammzellen Abstammung in live Drosophila Ovargewebe. Wir beschreiben Methoden, um transgene fliegen mit dem Ausdruck einer pH-Wert-Biosensor, mCherry::pHluorin, Bild der Biosensor mit quantitativen Fluoreszenz-Bildgebung zu generieren, generieren Standardkurven und pH-Werte Fluoreszenz Intensitätswerte umwandeln.

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

methods-for-imaging-intracellular-ph-follicle-stem-cell-lineage-live

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

6.8K Aufrufe.  University of California, San Francisco. Wir bieten ein Protokoll für imaging intrazelluläre pH-Wert von einer epithelialen Stammzellen Abstammung in live Drosophila Ovargewebe. Wir beschreiben Methoden, um transgene fliegen mit dem Ausdruck einer pH-Wert-Biosensor, mCherry::pHluorin, Bild der Biosensor mit quantitativen Fluoreszenz-Bildgebung zu generieren, generieren Standardkurven und pH-Werte Fluoreszenz Intensitätswerte umwandeln.

Serie: Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Live-Cell-Imaging von Sinnesorgan Vorläuferzellen im Intact Drosophila Puppen

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Forschung

Neurowissenschaften

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a rapid and high-throughput manner. S2 cells have proven amenable to both fixed- and live-cell imaging applications. Notably, live-cell imaging can yield valuable information about how loss or knockdown of a gene can affect the kinetics and dynamics of key events during cell division, including mitotic spindle assembly, chromosome congression, and segregation, as well as overall cell cycle timing. Here we utilize S2 cells stably transfected with fluorescently tagged mCherry:&#945;-tubulin to mark the mitotic spindle and GFP:CENP-A (referred to as &#8216;CID&#8217; gene in Drosophila) to mark the centromere to analyze the effects of key mitotic genes on the timing of cell divisions, from prophase (specifically at Nuclear Envelope Breakdown; NEBD) to the onset of anaphase. This imaging protocol also allows for the visualization of the spindle microtubule and chromosome dynamics throughout mitosis. Herein, we aim to provide a simple yet comprehensive protocol that will allow readers to easily adapt S2 cells for live imaging experiments. Results obtained from such experiments should expand our understanding of genes involved in the cell division by defining their role in several simultaneous and dynamic events. Observations made in this cell culture system can be validated and further investigated in vivo using the impressive toolkit of genetic approaches in flies.

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Cell divisions can be visualized in real time using fluorescently tagged proteins and time-lapse microscopy. Using the protocol presented here, users can analyze cell division timing dynamics, mitotic spindle assembly, and chromosome congression and segregation. Defects in these events following RNA interference (RNAi)-mediated gene knockdown can be assessed and quantified.

Einsatz von Drosophila S2-Zellen für Live Imaging of Cell Division

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a ...

Genetik

Visualizing the Effects of Oxidative Damage on Drosophila Egg Chambers using Live Imaging

Live imaging of Drosophila melanogaster ovaries has been instrumental in understanding a variety of basic cellular processes during development, including ribonucleoprotein particle movement, mRNA localization, organelle movement, and cytoskeletal dynamics. There are several methods for live imaging that have been developed. Due to the fact that each method involves dissecting individual ovarioles placed in media or halocarbon oil, cellular damage due to hypoxia and/or physical manipulation will inevitably occur over time. One downstream effect of hypoxia is to increase oxidative damage in the cells. The purpose of this protocol is to use live imaging to visualize the effects of oxidative damage on the localization and dynamics of subcellular structures in Drosophila ovaries after induction of controlled cellular damage. Here, we use hydrogen peroxide to induce cellular oxidative damage and give examples of the effects of such damage on two subcellular structures, mitochondria and Clu bliss particles. However, this method is applicable to any subcellular structure. The limitations are that hydrogen peroxide can only be added to aqueous media and would not work for imaging that uses halocarbon oil. The advantages are that hydrogen peroxide is readily available and inexpensive, acts quickly, its concentrations can be modulated, and oxidative damage is a good approximation of damage caused by hypoxia as well as general tissue damage due to manipulation.

The objective of this protocol is to use live imaging to visualize the effects of oxidative damage on the localization and dynamics of subcellular structures in Drosophila ovaries.

Visualisierung der Auswirkungen oxidativer Schäden auf Drosophila-Eierkammern mit Live Imaging

Live imaging of Drosophila melanogaster ovaries has been instrumental in understanding a variety of basic cellular processes during development, including ...

Entwicklungsbiologie

Nuclear Migration in the Drosophila Oocyte

Live cell imaging is particularly necessary to understand the cellular and molecular mechanisms that regulate organelle movements, cytoskeleton rearrangements, or polarity patterning within the cells. When studying oocyte nucleus positioning, live-imaging techniques are essential to capture the dynamic events of this process. The Drosophila egg chamber is a multicellular structure and an excellent model system to study this phenomenon because of its large size and availability of numerous genetic tools. During Drosophila mid-oogenesis, the nucleus migrates from a central position within the oocyte to adopt an asymmetric position mediated by microtubule-generated forces. This migration and positioning of the nucleus are necessary to determine the polarity axes of the embryo and the subsequent adult fly. One characteristic of this migration is that it occurs in three dimensions (3D), creating a necessity for live imaging. Thus, to study the mechanisms that regulate nuclear migration, we have developed a protocol to culture the dissected egg chambers and perform live imaging for 12 h by time-lapse acquisitions using spinning-disk confocal microscopy. Overall, our conditions allow us to preserve Drosophila egg chambers alive for a long period of time, thereby enabling the completion of nuclear migration to be visualized in a large number of samples in 3D.

Nuclear Migration in the Drosophila Oocyte

In Drosophila, the oocyte nucleus undergoes microtubule-dependent migration during oogenesis. Here, we describe a protocol that was developed to follow the migration by performing live imaging on egg chambers ex-vivo. Our procedure maintains egg chambers alive for 12 h to acquire multi-position 3D time-lapse movies using spinning-disk confocal microscopy.

Kernmigration in der Drosophila-Eizelle

Live cell imaging is particularly necessary to understand the cellular and molecular mechanisms that regulate organelle movements, cytoskeleton ...

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment and maintenance of epithelial tissue morphology and organ morphogenesis. Moreover, the BM is essential for tissue modeling, serving as a signaling platform, and providing external forces to shape tissues and organs. Despite the many important roles that the BM plays during normal development and pathological conditions, the biological pathways controlling the intracellular trafficking of BM-containing vesicles and how basal secretion leads to the polarized deposition of BM proteins are poorly understood. The follicular epithelium of the Drosophila ovary is an excellent model system to study the basal deposition of BM membrane proteins, as it produces and secretes all major components of the BM. Confocal and super-resolution imaging combined with image processing in fixed tissues allows for the identification and characterization of cellular factors specifically involved in the intracellular trafficking and deposition of BM proteins. This article presents a detailed protocol for staining and imaging BM-containing vesicles and deposited BM using endogenously tagged proteins in the follicular epithelium of the Drosophila ovary. This protocol can be applied to address both qualitative and quantitative questions and it was developed to accommodate high-throughput screening, allowing for the rapid and efficient identification of factors involved in the polarized intracellular trafficking and secretion of vesicles during epithelial tissue development.

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

The basement membrane is essential for tissue and organ morphogenesis during development. To better understand the mechanisms leading to proper placement of this structure, the protocol presented describes methods to visualize and characterize the intracellular trafficking and secretion of basement membrane proteins in epithelial cells using confocal and super-resolution microscopy.

Konfokale und hochauflösende Bildgebung des polarisierten intrazellulären Transports und der Sekretion von Basalmembranproteinen während der Drosophila-Oogenese

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment ...

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to explore the dynamics of a myriad of developmental processes, such as cell division, stemness, differentiation, migration, apoptosis, autophagy, cellular adhesion, etc., over time. Recently, we have implemented an extended ex vivo culture and live imaging of the female Drosophila GSC niche. Using a Drosophila line harboring a GFP::Par-1 transgene as an example, this method allows the visualization of the GSCs&#39; asymmetric division within their niche and the description of the changes in the spectrosome morphology along the cell cycle. Here, we present a detailed protocol for the ex vivo culture of Drosophila germaria, enabling prolonged visualization of the female GSC niche. Importantly, this protocol is broadly applicable to live imaging GSCs with multiple fluorescently tagged proteins of interest that are available in stock centers and/or in the Drosophila research community.

Here, we provide a detailed protocol to perform live imaging of the asymmetric division of germline stem cells (GSCs) in the Drosophila ovarian niche. We use a transgenic line that ubiquitously expresses a green fluorescent protein (GFP) fusion of the spectrosome protein Par-1.

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to ...

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. The molecular clock within each pacemaker neuron generates circadian rhythms in gene expression, which underlie the rhythmic neuronal functions essential to the operation of the circuit. Investigation of the properties of the individual molecular oscillators in different subclasses of pacemaker neurons and their interaction with neuronal signaling yields a better understanding of the circadian pacemaker circuit. Here, we present a time-lapse fluorescent microscopy approach developed to monitor the molecular clockwork in clock neurons of cultured Drosophila larval brain. This method allows the multi-day recording of the rhythms of genetically encoded fluorescent circadian reporters at single-cell resolution. This setup can be combined with pharmacological manipulations to closely analyze real-time response of the molecular clock to various compounds. Beyond circadian rhythms, this multipurpose method in combination with powerful Drosophila genetic techniques offers the possibility to study diverse neuronal or molecular processes in live brain tissue.

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The goal of this protocol is to establish ex vivo Drosophila larval brain culture optimized to monitor circadian molecular rhythms with long-term fluorescence time-lapse imaging. The application of this method to pharmacological assays is also discussed.

Einzellige Auflösung Fluoreszenz Imaging von Drosophila zirkadiane Uhren in Larven Gehirn Kultur Leben

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

Live-Imaging von GFP-markierten Proteine ​​in<em&gt; Drosophila</em&gt; Oozyten

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Biologie

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

Imaging Durch die Puppenhülle von<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.

Studieren Mitochondrial Struktur und Funktion in<em&gt; Drosophila</em&gt; Ovarien

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial ...

Methoden für Imaging intrazellulären pH der Follikel Stem Cell Linie in Live Drosophila Eierstockgewebe

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Live-Cell-Imaging von Sinnesorgan Vorläuferzellen im Intact Drosophila Puppen

Einsatz von Drosophila S2-Zellen für Live Imaging of Cell Division

Visualisierung der Auswirkungen oxidativer Schäden auf Drosophila-Eierkammern mit Live Imaging

Kernmigration in der Drosophila-Eizelle

Konfokale und hochauflösende Bildgebung des polarisierten intrazellulären Transports und der Sekretion von Basalmembranproteinen während der Drosophila-Oogenese

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Einzellige Auflösung Fluoreszenz Imaging von Drosophila zirkadiane Uhren in Larven Gehirn Kultur Leben

Live-Imaging von GFP-markierten Proteine in

Imaging Durch die Puppenhülle von

Studieren Mitochondrial Struktur und Funktion in

Methoden für Imaging intrazellulären pH der Follikel Stem Cell Linie in Live Drosophila Eierstockgewebe

Zusammenfassung

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Live-Cell-Imaging von Sinnesorgan Vorläuferzellen im Intact Drosophila Puppen

Einsatz von Drosophila S2-Zellen für Live Imaging of Cell Division

Visualisierung der Auswirkungen oxidativer Schäden auf Drosophila-Eierkammern mit Live Imaging

Kernmigration in der Drosophila-Eizelle

Konfokale und hochauflösende Bildgebung des polarisierten intrazellulären Transports und der Sekretion von Basalmembranproteinen während der Drosophila-Oogenese

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Einzellige Auflösung Fluoreszenz Imaging von Drosophila zirkadiane Uhren in Larven Gehirn Kultur Leben

Live-Imaging von GFP-markierten Proteine ​​in

Imaging Durch die Puppenhülle von

Studieren Mitochondrial Struktur und Funktion in

Live-Imaging von GFP-markierten Proteine in