Name: methods for imaging intracellular ph of the follicle stem cell lineage in live drosophila ovarian tissue
Uploaded: 2017-09-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue at JoVE.com

Bryne Ulmschneider Protokolü ve Diane Barber telkin üstünde el yazması için katkılarından dolayı teşekkür ediyoruz. Bu eser sağlık grant GM116384 T.G. Nystul ve D.L. Kuaför için Ulusal Enstitüsü tarafından finanse edildi.

Not: pHi FSC Silsilesi içinde ölçmek için Floresans yoğunluklarını, pHluorin mCherry FSCs, PFC ve folikül hücreleri fizyolojik koşullar için oranını hesaplamak ve pHi değerleri standart oranları dönüştürmek her hücre için kalibrasyon eğrileri 7 yazın. İlk, canlı görüntüleme deneyler Floresans yoğunluklarını pHluorin ve mCherry germaria NaHCO 3 fizyolojik şartlarda 1 , taklit eden, içeren bir arabelleğe disseke ölçmek için gerçekleştirilir 7. sonraki, standart eğrileri na + pHluorin ve mCherry floresan yoğunluklarını ölçerek oluşturulur-ücretsiz, K + arabellek ionophore nigericin içeren iki farklı pH değerine ayarlanmış 6.5 ve 7,5. Nigericin huzurunda, pHi pHi ekstrasellüler pH eşleştirilecek neden plazma zarı arasında tampon pH ile Sakinleştiği. Son olarak, standart eğrileri pHluorin mCherry oranları tahmini pHi değerlere dönüştürmek için kullanılır.
 1. duruşma öncesi: önce hazırlık ölçme pHi In Vivo Not: pHi vivo ölçmek için mCherry::pHluorin transgene faiz hücre türü ifade edilebilir. Aşağıda transgenik pHluorin üretmek için ortak bazı yollar FSC lineage sinekler vardır. MCherry::pHluorin klonlar üretiliyor FSC klon ön kenarında bulunan FSCs tanımlamak için özellikle yararlıdır. Doku belirli mCherry::pHluorin ifade tüm doku pHi ölçmek için yararlıdır ve aynı zamanda bir RNAi veya transgene ifade ile birleştirirken daha uygundur.
<ol><li>MCherry::pHluorin etiketli-FSC transgenik pHluorin nesil uçar <ol><li>mCherry::pHluorin FSC klonlar, yapmak klonlar <ol><li>çapraz UAS-mCherry::pHluorin 1 bir Act-Gal4 fiske vurmak için hisse senedi veya diğer hisse senedi ile Flp/FRT indüklenebilir Gal4.</li>
			<li>Heatshock indüklenebilir klonlar, heatshock yapmak eclosion bir 37 ° C su banyosunda dört kez yaklaşık 12 her h. 1 h için boş şişeleri içinde yetişkin F1s 2 gün sonrası</li>
			<li>Uçar normal büyüme ve oogenesis en büyük oranda bu dönemde emin olmak için taze ıslak Maya sağlayarak korumak (yaklaşık eşit parçaya kuru baker &#39; s Maya ve su) günlük için en az 6 gün sonra klon indüksiyon.</li>
		</ol></li> <li>Doku belirli mCherry::pHluorin ifade</li> <li>çapraz UAS-mCherry::pHluorin 1 folikül hücre belirli bir sürücü için y 1 w *; P {GawB} 10930/CyO (Bloomington kimliği: 7023).</li>
		<li>3 gün sonra eclosing, sinekler başlatmak toplamak ve en az 24 saat önce diseksiyon için ıslak Maya içeren şişeleri yerleştirebilirsiniz.</li>
	</ol></li> <li>Çözümleri yapma Not: tampon pH ve çözünen konsantrasyonlarda zamanla değişebilir çünkü aşağıdaki arabellekleri deneme günü hazırlamak önemlidir.
	<ol><li>Hazırla bikarbonat, nigericin ve diseksiyon arabellekleri. Bileşenleri sırada listelenen precipitates (Tablo 1, Tablo 2 ve Tablo 3 bakın) oluşumunu önlemek için eklemek.</li>
	</ol></li></ol> 2. Deneme: FSC Lineage pHi ölçme Not: diseksiyon, montaj ve canlı görüntüleme bikarbonat tampon ve iki nigericin tampon koşulları için adımları iki kez yapılması gerekebilir: mikroskop belirlemek için bir kez ayarları ve ikinci kez deneysel veri toplamak için. 2.2 aşağıda daha fazla bilgi için bkz:.
<ol><li>Diseksiyon ve montaj Not: Bu adımı gerçekleştirmek için gereken malzemeler için bakınız şekil 1 ve Tablo malzemeler için. 3D yazdırılan montaj salonları için 3D yazıcı dosyaları ek dosya 1 ve ek dosya 2 sağlanır.
	<ol><li>Diseksiyonu: <ol><li>hazırla montaj Odaları ince bir kaplama vakum yağ 3D düz tarafına uygulayarak yazdırılan montaj odası. Coverslip montaj odasına imzalamaya 22 x 40 mM coverslip o tarafa yerleştirin.</li>
		</ol></li> <li>Yumurtalık kadın yetişkin sinekler 500 µL diseksiyon arabelleği (bikarbonat veya nigericin tampon, Tablo 3) üzerinden incelemek <ol><li>3-4 sinekler CO 2 gaz kullanarak anestezi ve transfer uçar CO ile derin bir sinek yastık üzerine 2 gaz.</li>
			<li>İmzalat bir sinek kadar forseps ve yer diseksiyon medya içine almak.</li>
			<li>Bir forcep, sinek göğüs, yumurtalık maruz kadar onun karın ucunda çekiştirmeye süre çimdik.</li>
			<li>Yumurtalıklar diğer organlara üzerinden ayırma sonra ayrı 22 1/2 şırınga iğneleri kullanarak ovarioles tease. Dikkatle ayrı kas kılıf yumurtalık ve ovarioles kümesinden ayrı tek tek ovarioles. Kas kılıf yalıtmak için etkili bir teknik ovarioles küme ön tarafında yerde tutun ve aşağı doğru tek ovarioles uzunluğu boyunca inme bir şırınga iğnesi kullanmaktır.</li>
			<li>Böylece tam nigericin diseksiyon ortam pH ile equilibrate hücrelerinin pHi için yeterli zaman montaj adıma geçmeden önce tam olarak 10 dk diseksiyon medyada disseke yumurtalık kuluçkaya. 
			Not: kas kılıf ovarioles kaldırıldığından emin olmak. Kas kılıf kullanarak tek tek hücreleri tanımlamak zordur Floresans sinyal azaltmak Concanavilin-A ve canlı görüntüleme sırasında kendiliğinden taşımak ovarioles neden olabilir.</li>
		</ol></li> <li>Montaj <ol><li>diseksiyon medya cam coverslip üzerine küçük bir damla içinde montaj odası yerleştirin.</li>
			<li>Transfer ayrılmış forseps kullanarak ovarioles.</li>
			<li>Önceki sahne yumurta chambers ile ilişkili germaria dan sonraki sahne yumurta odaları ayrı ve disseke germaria diseksiyon medya bırakma Merkezi'nde yerleştirilir emin olmak deneyin.</li>
			<li>Yuvarlak bir 12 mm coverslip ters tarafı için tırnak cilası iki küçük damla ekleyin ve yaklaşık 10 için kurutma s.</li>
			Öyle ki tırnak cilası ile o tarafı aşağı bakıyor olmalıdır ve diseksiyon medya rehber <li>yer yuvarlak coverslip üstünde belgili tanımlık damla diseksiyon medya içeren germaria ayrılmış. Oje dümdüz ve germaria pozisyonda güvenli kenarlı parçalarda bastırın. Çünkü o yerde güvenli olarak daha az coverslip yüzey üzerinde smear büyük tırnak cilası kullanmanızı öneririz.</li>
			<li>Montaj odası ek diseksiyon medya ile doldurun. Concanavalin-A boya içeren belirli bir arabellek durum-ebilmek var olmak kullanılmış-odası doldurmak için. 
			Not: Harcanan toplam zaman anatomi ve montaj 15dk aşmaması gerekir. Bu doku hasarı etkilerini en aza indirmek önemlidir ve hücre ölüm.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Canlı görüntüleme: Not: Bu adımda, önce bikarbonat durumu ve uygun mikroskop ayarları belirlemek için iki nigericin koşul görüntüleri toplamak; mikroskop ayarları gerektiği gibi ayarlayın ve görüntüler için deneysel veri toplamak. Confocal mikroskop görüntüleme yeteneğine sahip 3 kanallarında kullanın: GFP (475 uyarma/509 emisyon), mCherry (575 uyarma/610 emisyon) ve far-red (633 uyarma/647 emisyon). 
	Not: Kümesi mikroskop ayarları: toplanan görüntülerin piksel yoğunluklarda yoğunluk değerleri her resim kümesindeki sinyalinin ne çok düşük ne de doymuş olduğunu önemlidir bu yüzden Phi, tahminleri belirlemek için sayılabilir. Bir görüntü yakalanan yoğunluklarını dizi görüntü bit derinliği tarafından tanımlanır. Birçok durumda, 8 bitlik görüntüler varsayılan olarak oluşturulur, ancak daha geniş bir dinamik alan var 16-bit görüntüleri veri alma öneririz. Crosstalk floresan kanallar arasında en aza indirilir, böylece emisyon spektrum toplanan ayarları ayarlanması gereken bu yüzden her fluorophore değil üst üste emin olmak önemlidir. Bu ayarları sınamak için GFP için uyarma spektrumu kullanılarak bir örnek görüntü almak ve mCherry ve tersi için emisyon spektrumda toplamak. Eğer ayarları düzgün ayarlanabilir olması, her iki durumda da hiçbir sinyal olmalı. Böylece tüm üç görüntü kümeleri içinde sinyal piksel yoğunluklarda resim dosyasının dinamik aralığı içinde mikroskop (Yani, bir lazer tarama voltaj ayarları confocal, lazer güç ve iğne deliği boyutu) ayarlarını. Bizim deneyler için gerektiği gibi gerilim kazancı her deneme için optimize ederken 1.024 × 1024 biçimdeki 16-bit görüntüleri elde etmek için 40 x amacı ile confocal mikroskobu tarama beyaz bir ışık lazer kullanılır. Örneğin, bir deneyde, GFP, mCherry, gerilim kazancını ayarlayın ve %37.8, %72.9 ve %260, far-red anılan sıraya göre.
	<ol><li>Görüntü ovarioles nigericin diseksiyon tampon pH 6,5 ve öyle ki pHluorin ve mCherry görüntülerin piksel yoğunluklarda düşüktür ama kameranın algılama sınırları aşağıda ayarlarını.</li>
		<li>Ovarioles içinde nigericin diseksiyon tampon pH 7.5 başka bir set görüntü ve yüksek, ama değil doymuş pHluorin ve mCherry görüntülerin piksel yoğunluklarda vardır öyle ki ayarlarını.</li>
		<li>Görüntü yumurtalık bikarbonat diseksiyon tampon ve pHluorin ve mCherry görüntülerin piksel yoğunluklarda seçtiğiniz ayarlarla doymuş değil emin olun. Piksel doymuş, ayarları gerektiği gibi ayarlayın. 
		Not: ayar parametreleri farklı olabilir mikroskop kullanılan tam mikroskop kurulumu temel alınarak ve her deneme için optimize edilmiş olması gerekir. Mikroskop ayarlarını ayarladıktan sonra bunları deneme geri kalanı için değiştirmeyin. Ayarları kontrol ve deneysel koşullar arasında tutarlı olması gerekir. Bizim ilk pHi deneylerde, 2 ve 3 nokta nigericin kalibrasyon eğrileri oluşturulan ve iki yöntemden herhangi birini kullanarak hesaplanan pHi arasında anlamlı bir fark bulunamadı. Ancak, genel olarak, daha fazla puan kalibrasyon eğrisi içinde ek doğruluğunu geliştirmek için beklenir. Bu nedenle, eğrileri ile puan kaç deneysel koşullar belirli bir kümesi için gerektiğini belirlemek için farklı sayı üreten önerilir.</li>
	</ol></li> <li>Veri toplama: <ol><li>montaj ve bikarbonat ve nigericin arabellek koşullarda örneklerinin Imaging diseksiyon, gerçekleştirmek. Bir el örnekleri Imaging diseksiyon ve montaj, en uzun süreyi geçirdikten sonra Floresans yoğunluk ölçümleri canlı, sağlıklı doku yapılır emin olmak için 45 dk geçmemelidir.</li>
		<li>Her koşul için en az 5 germaria için görüntüleri elde.</li>
	</ol></li></ol> 3. Sonrası deneme: Görüntü analizi <ol><li>ölçü Floresans yoğunluklarını FSCs, PFC, ve folikül hücre <ol><li>arka plan çıkarma: <ol><li>Açık işlenmemiş FIJI Albümdeki her kanalda bir ayrı pencere (ile şekil 4 c).</li>
			<li>Sinyal olmadan görüntünün bir parçasını pHluorin kanal penceresinde bir bölge (ROI) ilgi çizmek için Dikdörtgen aracını kullanın.</li>
			<li>İsteğe bağlı adım: eşik alt sınırı ayarlayabilir, böylece arka plan aşağıda yoğunluk değerlerine sahip pikseller hariç ve eşik üst sınırını maksimuma ayarlayın. Eşik bu şekilde ayarladığınızda, sinyal olmadan görüntünün alanlarını çoğunlukla mavi ve açıkça görülebilir ( şekil 4A) sinyaldir.</li>
			<li>Ortalama Floresans şiddeti ROI ölçmek. Eşik adım 3'te ayarlarsanız, kontrol ettiğinizden emin olun &#34; Eşik sınırı &#34; ölçümleri ayarla iletişim kutusundaki.</li>
			<li>Ölçülen arka plan yoğunluğu her kanal ve süreç içinde bulunan çıkarma işlevini kullanarak görüntü dilim çıkarma &#8594; matematik menü.</li>
			<li>Yinele adımları 3.1.1.2-6 adım 3.1.1.2, mCherry kanal penceresinde, hariç için yeni bir dikdörtgen Dikdörtgen aracıyla çizim yerine, geri yükleme seçimi işlevini kullanın, Düzenle buldum &#8594; aynı olan bir dikdörtgen eklemek için seçim menüsü boyutları ve konumu görüntüde.</li>
		</ol></li> <li>FSCs tanımlamak, PFC ve folikül hücreleri: <ol><li>FSCs, PFC ve folikül hücre morfolojisi ve hücre sınırları ( Şekil 2) bulmak için kullanarak Concanavalin-A boyama konumuna göre tanımlama.</li>
			<li>FSCs bölge 2a/2b sınır germarium kenarında bulunan ince üçgen hücrelerdir. Eğer mCherry::pHluorin bir FSC klon ifade, FSC klon ön çoğu hücre da belirlenebilir.</li>
			<li>PFC hücreler düzensiz şekilli bölge 2B, hemen bitişiğinde ve aşağı FSCs.</li>
			<li>Folikül hücrelerdir germ hücreli kist bölge 3 çevreleyen kare veya sütunlar halinde hücre.</li>
		</ol></li> <li>Floresan yoğunluğu oranları elde etmek <ol><li>, faiz hücrenin bulunduğu yüksek floresan yoğunluğu mCherry kanalda bir veya birden çok dilim seçin ve Concanavalin-A, far-red kanalda gördüm bir boyama foc olduğundan emin olun Seçili dilim içimizde.</li>
			<li>Her FSC ve pHluorin ve mCherry tüm ortalama Floresans yoğunluğunu dilimler ölçümleri için seçilen ölçü ROI çizmek.</li>
			<li>PHluorin kanal ortalama Floresans yoğunluğunu pHluorin mCherry floresan için oranını hesaplamak için mCherry kanal ortalama Floresans yoğunluğunu tarafından bölmek.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Özellik türet pHi değer verir ve pseudocolored görüntüler oluşturmak <ol><li>özellik türet pHi değerleri <ol><li>her durumda, yumurtalık aynı genotip sinekler üzerinden kullanarak doğrusal regresyon eğrisi oluşturulmalıdır deneysel her ikisi için ve kontrol koşulları. İki nigericin tampon koşulları ( şekil 3) verilerini kullanarak her hücre türü için bir doğrusal regresyon eğrisi oluşturur. Excel'de, bu grafikte veri çizme ve doğrusal bir eğilim çizgisi ekleme yapılabilir. Alternatif olarak, bakın:</li> <li>eğim ve y kesme noktası doğrusal regresyon eğrisi hesaplanan nigericin koşulları ve doğrunun denklemi kullanım (y = mx + b) pHluorin mCherry oranı değerlere dönüştürmek için hesaplanan bikarbonat örneklerinden pH değerleri durumuna. Bu denklemdeki b için eğim formu (y-kesişim noktası) yerine, içinde oranı değeri x için koymak ve y. için çözmek</li>
		</ol></li> <li>FIJI oranı değerleri yansıtan bir pseudocolored görüntü oluşturmak.
		<ol><li>Takip yukarıdaki yordamı için arka plan çıkarma (Adım 3.1.1 ve şekil 4).</li>
			<li>İşlem menüsünden bulunan görüntü hesaplama işlevini kullanarak mCherry kanal pHluorin kanaldan bölün. Emin olun &#34; Oluştur yeni pencere &#34; ve &#34; 32-bit (float) sonucu &#34; onay kutuları işaretli. Arama tablosu (LUT) değiştirmek, termal veya LUT seçtiğiniz görüntü menüsü altında bulundu. şekil 4 uygun diğer seçenekler için bkz:.</li>
			<li>Ayarlayın parlaklık ve kontrast iletişim kutusunda (görüntü &#8594; ayarla &#8594; Parlaklık/Kontrast),'ı tıklatın &#34; ayarla &#34; düğmesi. Küme asgari görüntülenen değeri 0 olarak ve en fazla değer esir alma en iyi bir oranı için görüntülenen veri, genellikle 1.0-2.0 ( şekil 5).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Grillo-Hill, B. K., Choi, C., Jimenez-Vidal, M., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+H++efflux+is+sufficient+to+induce+dysplasia+and+necessary+for+viability+with+oncogene+expression.">Increased H+ efflux is sufficient to induce dysplasia and necessary for viability with oncogene expression.</a> eLife. 03270, (2015).</li><li>Ulmschneider, B., Grillo-Hill, B. K., Benitez, M., Azimova, D. R., Barber, D. L., Nystul, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+intracellular+pH+is+necessary+for+adult+epithelial+and+embryonic+stem+cell+differentiation.">Increased intracellular pH is necessary for adult epithelial and embryonic stem cell differentiation.</a> J. Cell Biol. 215 (3), 345-355 (2016).</li><li>Han, J., Burgess, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Indicators+for+Intracellular+pH.">Fluorescent Indicators for Intracellular pH.</a> Chemical reviews. 110 (5), 2709-2728 (2010).</li><li>Koivusalo, M., Welch, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amiloride+inhibits+macropinocytosis+by+lowering+submembranous+pH+and+preventing+Rac1+and+Cdc42+signaling.">Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling.</a> J. Cell Biol. 188 (4), 547-563 (2010).</li><li>Choi, C. -. H., Webb, B. A., Chimenti, M. S., Jacobson, M. P., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+sensing+by+FAK-His58+regulates+focal+adhesion+remodeling.">pH sensing by FAK-His58 regulates focal adhesion remodeling.</a> J. Cell Biology. 202 (6), 849-859 (2013).</li><li>Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+pH-indicators+reveal+activity-dependent+cytosolic+acidification+of+Drosophila+motor+nerve+termini+in+vivo.">Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo.</a> J. Phys. 591 (7), 1691-1706 (2013).</li><li>Grillo-Hill, B. K., Webb, B. A., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+imaging+of+pH+probes.">Ratiometric imaging of pH probes.</a> Methods in Cell Biol. 123, 429-448 (2014).</li><li>Miesenb&#246;ck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li><li>Kirilly, D., Xie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+ovary:+an+active+stem+cell+community.">The Drosophila ovary: an active stem cell community.</a> Cell research. 17 (1), 15-25 (2007).</li><li>Sahai-Hernandez, P., Castanieto, A., Nystul, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+models+of+epithelial+stem+cells+and+their+niches.">Drosophila models of epithelial stem cells and their niches.</a> Wiley interdisciplinary reviews. Dev. Biol. 1 (3), 447-457 (2012).</li><li>Losick, V. P., Morris, L. X., Fox, D. T., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+stem+cell+niches:+a+decade+of+discovery+suggests+a+unified+view+of+stem+cell+regulation.">Drosophila stem cell niches: a decade of discovery suggests a unified view of stem cell regulation.</a> Dev. Cell. 21 (1), 159-171 (2011).</li><li>Pocha, S. M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+single+and+collective+cell+migrations+in+Drosophila:+themes+and+variations.">Cellular and molecular mechanisms of single and collective cell migrations in Drosophila: themes and variations.</a> Ann Rev. of Gen. 48, 295-318 (2014).</li><li>St Johnston, D., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+polarity+in+eggs+and+epithelia:+parallels+and+diversity.">Cell polarity in eggs and epithelia: parallels and diversity.</a> Cell. 141 (5), 757-774 (2010).</li><li>Castanieto, A., Johnston, M. J., Nystul, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR+signaling+promotes+self-renewal+through+the+establishment+of+cell+polarity+in+Drosophila+follicle+stem+cells.">EGFR signaling promotes self-renewal through the establishment of cell polarity in Drosophila follicle stem cells.</a> eLife. 3, (2014).</li><li>Margolis, J., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+behavior+of+epithelial+stem+cells+in+the+Drosophila+ovary.">Identification and behavior of epithelial stem cells in the Drosophila ovary.</a> Development. 121 (11), 3797-3807 (1995).</li><li>Nystul, T. G., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+epithelial+niche+in+the+Drosophila+ovary+undergoes+long-range+stem+cell+replacement.">An epithelial niche in the Drosophila ovary undergoes long-range stem cell replacement.</a> Cell stem cell. 1 (3), 277-285 (2007).</li><li>Morris, L. X., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live+imaging+provides+new+insight+into+stem+cell+regulation+and+germline-soma+coordination+in+the+Drosophila+ovary.">Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary.</a> Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+(MARCM)+for+Drosophila+neural+development.">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends in neuro. 24 (5), 251-254 (2001).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada, biz FSC Silsilesi içinde wildtype doku hücrelerinin pHi ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu iletişim kuralı geliştirilmiştir ve ilk pHi Drosophila yumurtalık dokusu içinde çalışmaya başlamasından bu yana son beş yılda rafine. Bu süre içinde protokol başarıyla birden fazla müfettişler laboratuarımızın içinde ve en az dört farklı iplik disk ve mikroskoplar tarama lazer tarafından kullanılmıştır. PHi artar FSC lineage hücrelerinde folikül hücre durumuna pFC i...

Son yıllarda yapılan çalışmalarda bir rol pHi değişimler için hücresel farklılaşma displazi vivo içinde1,ve2sırasında ortaya koydu. Bu çalışmalar bir aşamasından geçiş hücreleri olarak değişir ama bu o pHi son derece tutarlı farklılaşma, aynı tür aynı aşamada hücrelerde bulunur. Bazı durumlarda, pHi değişimler kısmen engelleme farklılaşma, pHi değişikliği sadece bir hücre kader değişimler sonucu değil ama bunun yerine belki de pH duyarlı düzenleyici etkisi ile hücre kaderi değiştirmek tanıtmak için yardımcı olur düşündüren bozan proteinler veya kimyasal reaksiyonlar farklılaşması için gerekli. Gelecekteki çalışmalar pHi dynamics vivo içindebirçok farklı rolleri içine daha fazla fikir ortaya potansiyeline sahip. Ancak, doğru ölçümler Phi pHi sırasında farklılaşma vivo içinde eğitim zorluklardan biri almaktır. Diğer şekil-in hücresel morfoloji ve gen ekspresyonu, değişiklikler gibi farklılaşma pHi bir değişken kimyasal özelliği sabit ve standart yöntemlerle permeabilized hücrelere korunmaz hücre benzemez. Buna ek olarak, pHi istikrarlı streslisin hücrelerdeki veya deneysel manipülasyon sonucu ölen olmayabilir. Böylece, pHi ölçerken hücreleri canlı ve mümkün olduğu kadar sağlıklı tutmak önemlidir. Birkaç hayati boya iş hücre kültür3ama birçok pHi ölçme durumlarda için onlar iyi ki uygun değildir çünkü onların doku derin veya eşit nüfuz değil in vivo çalışmalar için kullanılabilir doğru ölçümler sağlamak yeterli .
Zavallı boya penetrasyon sorunu aşmak için biz ve diğerleri genetik olarak kodlanmış bir sonda, özellikle hücreye ifade mCherry::pHluorin4,5,6,7, kullanmıştır faiz ve içinde görüntülü canlı doku türleri. pHluorin olduğunu GFP bir değişken ile daha yüksek bir pKa (~ 7.0 vs ~ 4.0) bu kıvrımlar daha kolay daha yüksek pH; Bu yüzden pHluorin moleküllerinin hücredeki bir popülasyondan yayılan toplam floresan yoğunluğu pHi8artan ile artar. Önemlisi, Floresans pHi değerleri normal sitozolik aralıkta doğrusal. Buna karşılık, mCherry floresan (pKa ~ 4.5) sitozolik aralığındaki pH değişimlerine duyarsız. Bu iki gazetecilere kovalent bir tek chimeric protein, böylece her zaman eşit miktarlarda mevcut tek açık okuma çerçevesi tarafından kodlanmış olarak birbirine bağlı. Bu nedenle, pHluorin için mCherry floresan yoğunluğu oranı her hücrede sonda konsantrasyon için normalleştirilmiş Phi bir ölçüm sağlar. Oranları tahminleri pHi değerleri bilinen pH değerine equilibrated dokulara gelen pHluorin mCherry oranları elde ederek oluşturulan standart bir eğri kullanarak dönüştürülebilir.
Burada, Drosophila yumurtalık içinde epitel FSC soyundan pHi ölçmek için mCherry::pHluorin kullanma yöntemleri açıklanmaktadır. Bu iyi karakterize doku epitel biyoloji, kök hücre kendini yenileme ve farklılaşma9,10,11, toplu hücre göç12 gibi birçok farklı yönleri model oluşturmak için kullanılan , geliştirme ve bakım hücre polarite13,14. Folikül epitel doku ön kenarında germarium15,16adı verilen bir yapısında bulunan iki FSCs tarafından üretilmektedir. Sırasında düzenli olarak yetişkinlik kendini yenilemek ve döl, niş yeniden girebilir ve bir FSC olmak veya üç farklı folikül hücre türden birine ayırt prefollicle hücreleri (PFC) denilen üretmek için bu hücreleri Böl: kutup hücreleri, SAP hücreler, veya Ana gövde folikül hücreleri. Biz daha önce wildtype dokusunda pHi farklılaşma yaklaşık FSCs yılında 6,8 PFC, 7.0 pHi üzerinden 7,3 folikül hücreleri2için erken aşamalarında giderek artar gösterdi ki. Bu artış bir ubiquitously ifade sodyum/proton değiştirici, DNhe2, RNAi nakavt tarafından engelleme ciddi pFC farklılaşma bozar, pHi DNhe2 overexpression tarafından artan ise hafif bir aşırı farklılaşma neden olur fenotip. Bu bulgular pHi stabil erken FSC lineage korunur ve deneysel olarak olabilir artırılması veya azaltılması vivo içindegöstermektedir. Yöntem tanımlamak burada pHi wildtype doku ya da mutant dokular, RNAi nakavt veya faiz ve Mitotik klonları bir Gal4 kullanarak overexpression da dahil olmak üzere çeşitli formları ölçmek için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Fly Stocks&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UAS-mCherry::pHluorin[1]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>y1 w*;P{GawB}10930/CyO</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>7023</td><td></td></tr><tr><td>Act-Gal4 flipout stock</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>4409</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals for Buffer preparation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-3911</td><td></td></tr><tr><td>glucose</td><td>Mallinckrodt</td><td>4912</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M63</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C-5080</td><td></td></tr><tr><td>HCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-5761</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-9272</td><td></td></tr><tr><td>NMDG+</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-2004</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Mallinckrodt</td><td>7088</td><td>Use to Make KHPO4 pH 7.4</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP362</td><td>Use to Make KHPO4 pH 7.4</td></tr><tr><td>Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Conjugate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C21421</td><td>0.25 mg/ml dilution</td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N1495</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Dissection and mounting tools&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 Dumont Inox forceps (Size 5)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9473431</td><td></td></tr><tr><td>2 23-gauge syringe needles</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z192457</td><td></td></tr><tr><td>9-well glass dissecting dish</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-748B</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum Grease</td><td>Dow Corning</td><td>1018817</td><td></td></tr><tr><td>22 X 40 mM glass coverslips</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12545C</td><td></td></tr><tr><td>Round Glass Coverslips, 12mm diameter, 0.13-0.16mm thickness</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>26023</td><td></td></tr><tr><td>3-D mounting chamber</td><td>custom manufactured</td><td></td><td>.stl and .ipt files for 3-D printer included as supplemental files</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-620-183A</td><td>Model: Accumet AB15</td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Olympus Corporation</td><td>0H11436</td><td>Model: SZ2-ST</td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>SP5 or SP8 laser-scanning confocal microscope with a 40&amp;times; objective with a numerical aperture of 1.3</td></tr></tbody></table>

methods for imaging intracellular ph of the follicle stem cell lineage in live drosophila ovarian tissue

Hücre içi pH (pHi) değişimler, metabolizma, yayılmasını önleme ve farklılaşma da dahil olmak üzere birçok hücresel fonksiyonların yönetmelikte önemli rol oynarlar. Genellikle, pHi dynamics ölçme ve deneysel olarak pHi değiştirmeye mükellef bulunmaktadır kültürlü hücrelerdeki belirlenir. Ancak, son gelişme metodolojileri ve yeni araçlar pHi dynamics bozulmamış, canlı doku içinde çalışmaya mümkün kıldı. Drosophila araştırma için bir önemli gelişme pHi Biyoalgılayıcı taşıyan bir transgenik satır nesil oldu mCherry::pHluorin. Burada, biz düzenli olarak görüntüleme canlı Drosophila ovarioles için epitel folikül kök hücre (FSC) soy mCherry::pHluorin transgenik vahşi türü satırlarındaki pHi ölçmek için kullandığımız bir protokol tanımlamak; Ancak, yöntem tanımlamak burada kanat diskler ve göz epitel de dahil olmak üzere diğer dokular için kolayca adapte edilebilir. Biz FSC soy mCherry::pHluorin ifade etmek için teknikleri yumurtalık dokusu canlı görüntüleme ve edinme ve pHi değerler elde etmek için görüntüleri analiz sırasında korumak açıklar.

Burada birkaç adımdan oluşur folikül epitel pHi ölçme işlemi anlatmıştık. İlk olarak, yumurtalık anatomi ve montaj için araçlarını kullanarak uygun genotip (şekil 1) sinekler disseke. Ovarioles sonra kantitatif floresan mikroskopi kullanarak yansıma ve görüntüleri Phi ölçümler elde etmek için analiz edilir. Her görüntü için faiz hücre türde bölüm 3.1 (Şekil 2) açıklandığı gibi tanımlanır. ...

Watch this Scientific Journal Video about Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue at JoVE.com

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Canlı Drosophila yumurtalık dokusu içinde folikül kök hücre soyundan Imaging hücre içi pH için yöntemleri

Hücre içi pH bir epitel kök hücre soydan canlı Drosophila yumurtalık dokusu içinde görüntüleme için bir protokol sağlar. Transgenik sinekler bir pH Biyoalgılayıcı, mCherry::pHluorin, görüntü kantitatif floresan Imaging'i kullanma Biyoalgılayıcı ifade oluşturmak, standart eğriler oluşturmak ve pH değerleri Floresans yoğunluk değerleri dönüştürmek için yöntemleri açıklanmaktadır.

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

methods-for-imaging-intracellular-ph-follicle-stem-cell-lineage-live

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

6.8K Görüntüleme.  University of California, San Francisco. Hücre içi pH bir epitel kök hücre soydan canlı Drosophila yumurtalık dokusu içinde görüntüleme için bir protokol sağlar. Transgenik sinekler bir pH Biyoalgılayıcı, mCherry::pHluorin, görüntü kantitatif floresan Imaging'i kullanma Biyoalgılayıcı ifade oluşturmak, standart eğriler oluşturmak ve pH değerleri Floresans yoğunluk değerleri dönüştürmek için yöntemleri açıklanmaktadır.

Video: Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Bozulmamış Duyu Organ Öncü Hücreler Canlı hücre Görüntüleme Drosophila Pupa

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Nörobilim

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a rapid and high-throughput manner. S2 cells have proven amenable to both fixed- and live-cell imaging applications. Notably, live-cell imaging can yield valuable information about how loss or knockdown of a gene can affect the kinetics and dynamics of key events during cell division, including mitotic spindle assembly, chromosome congression, and segregation, as well as overall cell cycle timing. Here we utilize S2 cells stably transfected with fluorescently tagged mCherry:&#945;-tubulin to mark the mitotic spindle and GFP:CENP-A (referred to as &#8216;CID&#8217; gene in Drosophila) to mark the centromere to analyze the effects of key mitotic genes on the timing of cell divisions, from prophase (specifically at Nuclear Envelope Breakdown; NEBD) to the onset of anaphase. This imaging protocol also allows for the visualization of the spindle microtubule and chromosome dynamics throughout mitosis. Herein, we aim to provide a simple yet comprehensive protocol that will allow readers to easily adapt S2 cells for live imaging experiments. Results obtained from such experiments should expand our understanding of genes involved in the cell division by defining their role in several simultaneous and dynamic events. Observations made in this cell culture system can be validated and further investigated in vivo using the impressive toolkit of genetic approaches in flies.

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Cell divisions can be visualized in real time using fluorescently tagged proteins and time-lapse microscopy. Using the protocol presented here, users can analyze cell division timing dynamics, mitotic spindle assembly, and chromosome congression and segregation. Defects in these events following RNA interference (RNAi)-mediated gene knockdown can be assessed and quantified.

Hücre Bölünmesi Canlı Görüntüleme için Drosophila S2 Hücrelerinin Kullanımı

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a ...

Genetik

Visualizing the Effects of Oxidative Damage on Drosophila Egg Chambers using Live Imaging

Live imaging of Drosophila melanogaster ovaries has been instrumental in understanding a variety of basic cellular processes during development, including ribonucleoprotein particle movement, mRNA localization, organelle movement, and cytoskeletal dynamics. There are several methods for live imaging that have been developed. Due to the fact that each method involves dissecting individual ovarioles placed in media or halocarbon oil, cellular damage due to hypoxia and/or physical manipulation will inevitably occur over time. One downstream effect of hypoxia is to increase oxidative damage in the cells. The purpose of this protocol is to use live imaging to visualize the effects of oxidative damage on the localization and dynamics of subcellular structures in Drosophila ovaries after induction of controlled cellular damage. Here, we use hydrogen peroxide to induce cellular oxidative damage and give examples of the effects of such damage on two subcellular structures, mitochondria and Clu bliss particles. However, this method is applicable to any subcellular structure. The limitations are that hydrogen peroxide can only be added to aqueous media and would not work for imaging that uses halocarbon oil. The advantages are that hydrogen peroxide is readily available and inexpensive, acts quickly, its concentrations can be modulated, and oxidative damage is a good approximation of damage caused by hypoxia as well as general tissue damage due to manipulation.

The objective of this protocol is to use live imaging to visualize the effects of oxidative damage on the localization and dynamics of subcellular structures in Drosophila ovaries.

Canlı Görüntüleme Kullanarak Oksidatif Hasarın Drosophila Yumurta Odaları Üzerindeki Etkilerini Görselleştirme

Live imaging of Drosophila melanogaster ovaries has been instrumental in understanding a variety of basic cellular processes during development, including ...

Gelişim Biyolojisi

Nuclear Migration in the Drosophila Oocyte

Live cell imaging is particularly necessary to understand the cellular and molecular mechanisms that regulate organelle movements, cytoskeleton rearrangements, or polarity patterning within the cells. When studying oocyte nucleus positioning, live-imaging techniques are essential to capture the dynamic events of this process. The Drosophila egg chamber is a multicellular structure and an excellent model system to study this phenomenon because of its large size and availability of numerous genetic tools. During Drosophila mid-oogenesis, the nucleus migrates from a central position within the oocyte to adopt an asymmetric position mediated by microtubule-generated forces. This migration and positioning of the nucleus are necessary to determine the polarity axes of the embryo and the subsequent adult fly. One characteristic of this migration is that it occurs in three dimensions (3D), creating a necessity for live imaging. Thus, to study the mechanisms that regulate nuclear migration, we have developed a protocol to culture the dissected egg chambers and perform live imaging for 12 h by time-lapse acquisitions using spinning-disk confocal microscopy. Overall, our conditions allow us to preserve Drosophila egg chambers alive for a long period of time, thereby enabling the completion of nuclear migration to be visualized in a large number of samples in 3D.

Nuclear Migration in the Drosophila Oocyte

In Drosophila, the oocyte nucleus undergoes microtubule-dependent migration during oogenesis. Here, we describe a protocol that was developed to follow the migration by performing live imaging on egg chambers ex-vivo. Our procedure maintains egg chambers alive for 12 h to acquire multi-position 3D time-lapse movies using spinning-disk confocal microscopy.

Drosophila Oosyte'de Nükleer Göç

Live cell imaging is particularly necessary to understand the cellular and molecular mechanisms that regulate organelle movements, cytoskeleton ...

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment and maintenance of epithelial tissue morphology and organ morphogenesis. Moreover, the BM is essential for tissue modeling, serving as a signaling platform, and providing external forces to shape tissues and organs. Despite the many important roles that the BM plays during normal development and pathological conditions, the biological pathways controlling the intracellular trafficking of BM-containing vesicles and how basal secretion leads to the polarized deposition of BM proteins are poorly understood. The follicular epithelium of the Drosophila ovary is an excellent model system to study the basal deposition of BM membrane proteins, as it produces and secretes all major components of the BM. Confocal and super-resolution imaging combined with image processing in fixed tissues allows for the identification and characterization of cellular factors specifically involved in the intracellular trafficking and deposition of BM proteins. This article presents a detailed protocol for staining and imaging BM-containing vesicles and deposited BM using endogenously tagged proteins in the follicular epithelium of the Drosophila ovary. This protocol can be applied to address both qualitative and quantitative questions and it was developed to accommodate high-throughput screening, allowing for the rapid and efficient identification of factors involved in the polarized intracellular trafficking and secretion of vesicles during epithelial tissue development.

Confocal and Super-Resolution Imaging of Polarized Intracellular Trafficking and Secretion of Basement Membrane Proteins During Drosophila Oogenesis

The basement membrane is essential for tissue and organ morphogenesis during development. To better understand the mechanisms leading to proper placement of this structure, the protocol presented describes methods to visualize and characterize the intracellular trafficking and secretion of basement membrane proteins in epithelial cells using confocal and super-resolution microscopy.

Drosophila Oogenezi Sırasında Polarize Hücre İçi Kaçakçılığın ve Bazalton Membran Proteinlerinin Sekresyonunun Konfokal ve Süper Rezolüsyonlu Görüntülenmesi

The basement membrane (BM) - a specialized sheet of extracellular matrix present at the basal side of epithelial cells - is critical for the establishment ...

Real-Time Imaging of Germline Stem Cells in Drosophila Ex Vivo Germaria Culture

Extended Live Imaging of Female Drosophila melanogaster Germline Stem Cell Niches

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to explore the dynamics of a myriad of developmental processes, such as cell division, stemness, differentiation, migration, apoptosis, autophagy, cellular adhesion, etc., over time. Recently, we have implemented an extended ex vivo culture and live imaging of the female Drosophila GSC niche. Using a Drosophila line harboring a GFP::Par-1 transgene as an example, this method allows the visualization of the GSCs&#39; asymmetric division within their niche and the description of the changes in the spectrosome morphology along the cell cycle. Here, we present a detailed protocol for the ex vivo culture of Drosophila germaria, enabling prolonged visualization of the female GSC niche. Importantly, this protocol is broadly applicable to live imaging GSCs with multiple fluorescently tagged proteins of interest that are available in stock centers and/or in the Drosophila research community.

Here, we provide a detailed protocol to perform live imaging of the asymmetric division of germline stem cells (GSCs) in the Drosophila ovarian niche. We use a transgenic line that ubiquitously expresses a green fluorescent protein (GFP) fusion of the spectrosome protein Par-1.

Live imaging methods allow the analysis of dynamic cellular processes in detail and in real-time. The Drosophila ovary represents an excellent model to ...

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. The molecular clock within each pacemaker neuron generates circadian rhythms in gene expression, which underlie the rhythmic neuronal functions essential to the operation of the circuit. Investigation of the properties of the individual molecular oscillators in different subclasses of pacemaker neurons and their interaction with neuronal signaling yields a better understanding of the circadian pacemaker circuit. Here, we present a time-lapse fluorescent microscopy approach developed to monitor the molecular clockwork in clock neurons of cultured Drosophila larval brain. This method allows the multi-day recording of the rhythms of genetically encoded fluorescent circadian reporters at single-cell resolution. This setup can be combined with pharmacological manipulations to closely analyze real-time response of the molecular clock to various compounds. Beyond circadian rhythms, this multipurpose method in combination with powerful Drosophila genetic techniques offers the possibility to study diverse neuronal or molecular processes in live brain tissue.

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The goal of this protocol is to establish ex vivo Drosophila larval brain culture optimized to monitor circadian molecular rhythms with long-term fluorescence time-lapse imaging. The application of this method to pharmacological assays is also discussed.

Tek hücreli çözünürlük Floresans canlı görüntüleme Drosophila sirkadiyen saatler larva beyin kültür

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

GFP etiketli Proteinlerin Görüntüleme Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Oosit

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Biyoloji

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled analysis of cell and developmental biology from a variety of methodological angles. Live imaging is an emerging method for observing dynamic cell processes, such as cell division or cell motility. Having isolated mutations in uncharacterized putative cell cycle proteins it became essential to observe mitosis in situ using live imaging. Most live imaging studies in Drosophila have focused on the embryonic stages that are accessible to manipulation and observation because of their small size and optical clarity. However, in these stages the cell cycle is unusual in that it lacks one or both of the gap phases. By contrast, cells of the pupal wing of Drosophila have a typical cell cycle and undergo a period of rapid mitosis spanning about 20 hr of pupal development. It is easy to identify and isolate pupae of the appropriate stage to catch mitosis in situ. Mounting intact pupae provided the best combination of tractability and durability during imaging, allowing experiments to run for several hours with minimal impact on cell and animal viability. The method allows observation of features as small as, or smaller than, fly chromosomes. Adjustment of microscope settings and the details of mounting, allowed extension of the preparation to visualize membrane dynamics of adjacent cells and fluorescently labeled proteins such as tubulin. This method works for all tested fluorescent proteins and can capture submicron scale features over a variety of time scales. While limited to the outer 20 &#181;m of the pupa with a conventional confocal microscope, this approach to observing protein and cellular dynamics in pupal tissues in vivo may be generally useful in the study of cell and developmental biology in these tissues.

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

This paper demonstrates the use of a fast scanning confocal microscope to image cell behavior directly through the puparium. By leaving the pupal case intact, this method allows observation and measurement of dynamic cell processes at a stage of Drosophila development that is difficult to study directly.

Ve Pupa Durumunda sayesinde görüntüleme<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.

Mitokondriyal Yapısı ve İşlevi incelenmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Yumurtalıklar

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial ...

Canlı Drosophila yumurtalık dokusu içinde folikül kök hücre soyundan Imaging hücre içi pH için yöntemleri

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler