Bryne Ulmschneider Protokolü ve Diane Barber telkin üstünde el yazması için katkılarından dolayı teşekkür ediyoruz. Bu eser sağlık grant GM116384 T.G. Nystul ve D.L. Kuaför için Ulusal Enstitüsü tarafından finanse edildi.

Not: pHi FSC Silsilesi içinde ölçmek için Floresans yoğunluklarını, pHluorin mCherry FSCs, PFC ve folikül hücreleri fizyolojik koşullar için oranını hesaplamak ve pHi değerleri standart oranları dönüştürmek her hücre için kalibrasyon eğrileri 7 yazın. İlk, canlı görüntüleme deneyler Floresans yoğunluklarını pHluorin ve mCherry germaria NaHCO 3 fizyolojik şartlarda 1 , taklit eden, içeren bir arabelleğe disseke ölçmek için gerçekleştirilir 7. sonraki, standart eğrileri na + pHluorin ve mCherry floresan yoğunluklarını ölçerek oluşturulur-ücretsiz, K + arabellek ionophore nigericin içeren iki farklı pH değerine ayarlanmış 6.5 ve 7,5. Nigericin huzurunda, pHi pHi ekstrasellüler pH eşleştirilecek neden plazma zarı arasında tampon pH ile Sakinleştiği. Son olarak, standart eğrileri pHluorin mCherry oranları tahmini pHi değerlere dönüştürmek için kullanılır.
 1. duruşma öncesi: önce hazırlık ölçme pHi In Vivo Not: pHi vivo ölçmek için mCherry::pHluorin transgene faiz hücre türü ifade edilebilir. Aşağıda transgenik pHluorin üretmek için ortak bazı yollar FSC lineage sinekler vardır. MCherry::pHluorin klonlar üretiliyor FSC klon ön kenarında bulunan FSCs tanımlamak için özellikle yararlıdır. Doku belirli mCherry::pHluorin ifade tüm doku pHi ölçmek için yararlıdır ve aynı zamanda bir RNAi veya transgene ifade ile birleştirirken daha uygundur.
<ol><li>MCherry::pHluorin etiketli-FSC transgenik pHluorin nesil uçar <ol><li>mCherry::pHluorin FSC klonlar, yapmak klonlar <ol><li>çapraz UAS-mCherry::pHluorin 1 bir Act-Gal4 fiske vurmak için hisse senedi veya diğer hisse senedi ile Flp/FRT indüklenebilir Gal4.</li>
			<li>Heatshock indüklenebilir klonlar, heatshock yapmak eclosion bir 37 ° C su banyosunda dört kez yaklaşık 12 her h. 1 h için boş şişeleri içinde yetişkin F1s 2 gün sonrası</li>
			<li>Uçar normal büyüme ve oogenesis en büyük oranda bu dönemde emin olmak için taze ıslak Maya sağlayarak korumak (yaklaşık eşit parçaya kuru baker &#39; s Maya ve su) günlük için en az 6 gün sonra klon indüksiyon.</li>
		</ol></li> <li>Doku belirli mCherry::pHluorin ifade</li> <li>çapraz UAS-mCherry::pHluorin 1 folikül hücre belirli bir sürücü için y 1 w *; P {GawB} 10930/CyO (Bloomington kimliği: 7023).</li>
		<li>3 gün sonra eclosing, sinekler başlatmak toplamak ve en az 24 saat önce diseksiyon için ıslak Maya içeren şişeleri yerleştirebilirsiniz.</li>
	</ol></li> <li>Çözümleri yapma Not: tampon pH ve çözünen konsantrasyonlarda zamanla değişebilir çünkü aşağıdaki arabellekleri deneme günü hazırlamak önemlidir.
	<ol><li>Hazırla bikarbonat, nigericin ve diseksiyon arabellekleri. Bileşenleri sırada listelenen precipitates (Tablo 1, Tablo 2 ve Tablo 3 bakın) oluşumunu önlemek için eklemek.</li>
	</ol></li></ol> 2. Deneme: FSC Lineage pHi ölçme Not: diseksiyon, montaj ve canlı görüntüleme bikarbonat tampon ve iki nigericin tampon koşulları için adımları iki kez yapılması gerekebilir: mikroskop belirlemek için bir kez ayarları ve ikinci kez deneysel veri toplamak için. 2.2 aşağıda daha fazla bilgi için bkz:.
<ol><li>Diseksiyon ve montaj Not: Bu adımı gerçekleştirmek için gereken malzemeler için bakınız şekil 1 ve Tablo malzemeler için. 3D yazdırılan montaj salonları için 3D yazıcı dosyaları ek dosya 1 ve ek dosya 2 sağlanır.
	<ol><li>Diseksiyonu: <ol><li>hazırla montaj Odaları ince bir kaplama vakum yağ 3D düz tarafına uygulayarak yazdırılan montaj odası. Coverslip montaj odasına imzalamaya 22 x 40 mM coverslip o tarafa yerleştirin.</li>
		</ol></li> <li>Yumurtalık kadın yetişkin sinekler 500 µL diseksiyon arabelleği (bikarbonat veya nigericin tampon, Tablo 3) üzerinden incelemek <ol><li>3-4 sinekler CO 2 gaz kullanarak anestezi ve transfer uçar CO ile derin bir sinek yastık üzerine 2 gaz.</li>
			<li>İmzalat bir sinek kadar forseps ve yer diseksiyon medya içine almak.</li>
			<li>Bir forcep, sinek göğüs, yumurtalık maruz kadar onun karın ucunda çekiştirmeye süre çimdik.</li>
			<li>Yumurtalıklar diğer organlara üzerinden ayırma sonra ayrı 22 1/2 şırınga iğneleri kullanarak ovarioles tease. Dikkatle ayrı kas kılıf yumurtalık ve ovarioles kümesinden ayrı tek tek ovarioles. Kas kılıf yalıtmak için etkili bir teknik ovarioles küme ön tarafında yerde tutun ve aşağı doğru tek ovarioles uzunluğu boyunca inme bir şırınga iğnesi kullanmaktır.</li>
			<li>Böylece tam nigericin diseksiyon ortam pH ile equilibrate hücrelerinin pHi için yeterli zaman montaj adıma geçmeden önce tam olarak 10 dk diseksiyon medyada disseke yumurtalık kuluçkaya. 
			Not: kas kılıf ovarioles kaldırıldığından emin olmak. Kas kılıf kullanarak tek tek hücreleri tanımlamak zordur Floresans sinyal azaltmak Concanavilin-A ve canlı görüntüleme sırasında kendiliğinden taşımak ovarioles neden olabilir.</li>
		</ol></li> <li>Montaj <ol><li>diseksiyon medya cam coverslip üzerine küçük bir damla içinde montaj odası yerleştirin.</li>
			<li>Transfer ayrılmış forseps kullanarak ovarioles.</li>
			<li>Önceki sahne yumurta chambers ile ilişkili germaria dan sonraki sahne yumurta odaları ayrı ve disseke germaria diseksiyon medya bırakma Merkezi'nde yerleştirilir emin olmak deneyin.</li>
			<li>Yuvarlak bir 12 mm coverslip ters tarafı için tırnak cilası iki küçük damla ekleyin ve yaklaşık 10 için kurutma s.</li>
			Öyle ki tırnak cilası ile o tarafı aşağı bakıyor olmalıdır ve diseksiyon medya rehber <li>yer yuvarlak coverslip üstünde belgili tanımlık damla diseksiyon medya içeren germaria ayrılmış. Oje dümdüz ve germaria pozisyonda güvenli kenarlı parçalarda bastırın. Çünkü o yerde güvenli olarak daha az coverslip yüzey üzerinde smear büyük tırnak cilası kullanmanızı öneririz.</li>
			<li>Montaj odası ek diseksiyon medya ile doldurun. Concanavalin-A boya içeren belirli bir arabellek durum-ebilmek var olmak kullanılmış-odası doldurmak için. 
			Not: Harcanan toplam zaman anatomi ve montaj 15dk aşmaması gerekir. Bu doku hasarı etkilerini en aza indirmek önemlidir ve hücre ölüm.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Canlı görüntüleme: Not: Bu adımda, önce bikarbonat durumu ve uygun mikroskop ayarları belirlemek için iki nigericin koşul görüntüleri toplamak; mikroskop ayarları gerektiği gibi ayarlayın ve görüntüler için deneysel veri toplamak. Confocal mikroskop görüntüleme yeteneğine sahip 3 kanallarında kullanın: GFP (475 uyarma/509 emisyon), mCherry (575 uyarma/610 emisyon) ve far-red (633 uyarma/647 emisyon). 
	Not: Kümesi mikroskop ayarları: toplanan görüntülerin piksel yoğunluklarda yoğunluk değerleri her resim kümesindeki sinyalinin ne çok düşük ne de doymuş olduğunu önemlidir bu yüzden Phi, tahminleri belirlemek için sayılabilir. Bir görüntü yakalanan yoğunluklarını dizi görüntü bit derinliği tarafından tanımlanır. Birçok durumda, 8 bitlik görüntüler varsayılan olarak oluşturulur, ancak daha geniş bir dinamik alan var 16-bit görüntüleri veri alma öneririz. Crosstalk floresan kanallar arasında en aza indirilir, böylece emisyon spektrum toplanan ayarları ayarlanması gereken bu yüzden her fluorophore değil üst üste emin olmak önemlidir. Bu ayarları sınamak için GFP için uyarma spektrumu kullanılarak bir örnek görüntü almak ve mCherry ve tersi için emisyon spektrumda toplamak. Eğer ayarları düzgün ayarlanabilir olması, her iki durumda da hiçbir sinyal olmalı. Böylece tüm üç görüntü kümeleri içinde sinyal piksel yoğunluklarda resim dosyasının dinamik aralığı içinde mikroskop (Yani, bir lazer tarama voltaj ayarları confocal, lazer güç ve iğne deliği boyutu) ayarlarını. Bizim deneyler için gerektiği gibi gerilim kazancı her deneme için optimize ederken 1.024 × 1024 biçimdeki 16-bit görüntüleri elde etmek için 40 x amacı ile confocal mikroskobu tarama beyaz bir ışık lazer kullanılır. Örneğin, bir deneyde, GFP, mCherry, gerilim kazancını ayarlayın ve %37.8, %72.9 ve %260, far-red anılan sıraya göre.
	<ol><li>Görüntü ovarioles nigericin diseksiyon tampon pH 6,5 ve öyle ki pHluorin ve mCherry görüntülerin piksel yoğunluklarda düşüktür ama kameranın algılama sınırları aşağıda ayarlarını.</li>
		<li>Ovarioles içinde nigericin diseksiyon tampon pH 7.5 başka bir set görüntü ve yüksek, ama değil doymuş pHluorin ve mCherry görüntülerin piksel yoğunluklarda vardır öyle ki ayarlarını.</li>
		<li>Görüntü yumurtalık bikarbonat diseksiyon tampon ve pHluorin ve mCherry görüntülerin piksel yoğunluklarda seçtiğiniz ayarlarla doymuş değil emin olun. Piksel doymuş, ayarları gerektiği gibi ayarlayın. 
		Not: ayar parametreleri farklı olabilir mikroskop kullanılan tam mikroskop kurulumu temel alınarak ve her deneme için optimize edilmiş olması gerekir. Mikroskop ayarlarını ayarladıktan sonra bunları deneme geri kalanı için değiştirmeyin. Ayarları kontrol ve deneysel koşullar arasında tutarlı olması gerekir. Bizim ilk pHi deneylerde, 2 ve 3 nokta nigericin kalibrasyon eğrileri oluşturulan ve iki yöntemden herhangi birini kullanarak hesaplanan pHi arasında anlamlı bir fark bulunamadı. Ancak, genel olarak, daha fazla puan kalibrasyon eğrisi içinde ek doğruluğunu geliştirmek için beklenir. Bu nedenle, eğrileri ile puan kaç deneysel koşullar belirli bir kümesi için gerektiğini belirlemek için farklı sayı üreten önerilir.</li>
	</ol></li> <li>Veri toplama: <ol><li>montaj ve bikarbonat ve nigericin arabellek koşullarda örneklerinin Imaging diseksiyon, gerçekleştirmek. Bir el örnekleri Imaging diseksiyon ve montaj, en uzun süreyi geçirdikten sonra Floresans yoğunluk ölçümleri canlı, sağlıklı doku yapılır emin olmak için 45 dk geçmemelidir.</li>
		<li>Her koşul için en az 5 germaria için görüntüleri elde.</li>
	</ol></li></ol> 3. Sonrası deneme: Görüntü analizi <ol><li>ölçü Floresans yoğunluklarını FSCs, PFC, ve folikül hücre <ol><li>arka plan çıkarma: <ol><li>Açık işlenmemiş FIJI Albümdeki her kanalda bir ayrı pencere (ile şekil 4 c).</li>
			<li>Sinyal olmadan görüntünün bir parçasını pHluorin kanal penceresinde bir bölge (ROI) ilgi çizmek için Dikdörtgen aracını kullanın.</li>
			<li>İsteğe bağlı adım: eşik alt sınırı ayarlayabilir, böylece arka plan aşağıda yoğunluk değerlerine sahip pikseller hariç ve eşik üst sınırını maksimuma ayarlayın. Eşik bu şekilde ayarladığınızda, sinyal olmadan görüntünün alanlarını çoğunlukla mavi ve açıkça görülebilir ( şekil 4A) sinyaldir.</li>
			<li>Ortalama Floresans şiddeti ROI ölçmek. Eşik adım 3'te ayarlarsanız, kontrol ettiğinizden emin olun &#34; Eşik sınırı &#34; ölçümleri ayarla iletişim kutusundaki.</li>
			<li>Ölçülen arka plan yoğunluğu her kanal ve süreç içinde bulunan çıkarma işlevini kullanarak görüntü dilim çıkarma &#8594; matematik menü.</li>
			<li>Yinele adımları 3.1.1.2-6 adım 3.1.1.2, mCherry kanal penceresinde, hariç için yeni bir dikdörtgen Dikdörtgen aracıyla çizim yerine, geri yükleme seçimi işlevini kullanın, Düzenle buldum &#8594; aynı olan bir dikdörtgen eklemek için seçim menüsü boyutları ve konumu görüntüde.</li>
		</ol></li> <li>FSCs tanımlamak, PFC ve folikül hücreleri: <ol><li>FSCs, PFC ve folikül hücre morfolojisi ve hücre sınırları ( Şekil 2) bulmak için kullanarak Concanavalin-A boyama konumuna göre tanımlama.</li>
			<li>FSCs bölge 2a/2b sınır germarium kenarında bulunan ince üçgen hücrelerdir. Eğer mCherry::pHluorin bir FSC klon ifade, FSC klon ön çoğu hücre da belirlenebilir.</li>
			<li>PFC hücreler düzensiz şekilli bölge 2B, hemen bitişiğinde ve aşağı FSCs.</li>
			<li>Folikül hücrelerdir germ hücreli kist bölge 3 çevreleyen kare veya sütunlar halinde hücre.</li>
		</ol></li> <li>Floresan yoğunluğu oranları elde etmek <ol><li>, faiz hücrenin bulunduğu yüksek floresan yoğunluğu mCherry kanalda bir veya birden çok dilim seçin ve Concanavalin-A, far-red kanalda gördüm bir boyama foc olduğundan emin olun Seçili dilim içimizde.</li>
			<li>Her FSC ve pHluorin ve mCherry tüm ortalama Floresans yoğunluğunu dilimler ölçümleri için seçilen ölçü ROI çizmek.</li>
			<li>PHluorin kanal ortalama Floresans yoğunluğunu pHluorin mCherry floresan için oranını hesaplamak için mCherry kanal ortalama Floresans yoğunluğunu tarafından bölmek.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Özellik türet pHi değer verir ve pseudocolored görüntüler oluşturmak <ol><li>özellik türet pHi değerleri <ol><li>her durumda, yumurtalık aynı genotip sinekler üzerinden kullanarak doğrusal regresyon eğrisi oluşturulmalıdır deneysel her ikisi için ve kontrol koşulları. İki nigericin tampon koşulları ( şekil 3) verilerini kullanarak her hücre türü için bir doğrusal regresyon eğrisi oluşturur. Excel'de, bu grafikte veri çizme ve doğrusal bir eğilim çizgisi ekleme yapılabilir. Alternatif olarak, bakın:</li> <li>eğim ve y kesme noktası doğrusal regresyon eğrisi hesaplanan nigericin koşulları ve doğrunun denklemi kullanım (y = mx + b) pHluorin mCherry oranı değerlere dönüştürmek için hesaplanan bikarbonat örneklerinden pH değerleri durumuna. Bu denklemdeki b için eğim formu (y-kesişim noktası) yerine, içinde oranı değeri x için koymak ve y. için çözmek</li>
		</ol></li> <li>FIJI oranı değerleri yansıtan bir pseudocolored görüntü oluşturmak.
		<ol><li>Takip yukarıdaki yordamı için arka plan çıkarma (Adım 3.1.1 ve şekil 4).</li>
			<li>İşlem menüsünden bulunan görüntü hesaplama işlevini kullanarak mCherry kanal pHluorin kanaldan bölün. Emin olun &#34; Oluştur yeni pencere &#34; ve &#34; 32-bit (float) sonucu &#34; onay kutuları işaretli. Arama tablosu (LUT) değiştirmek, termal veya LUT seçtiğiniz görüntü menüsü altında bulundu. şekil 4 uygun diğer seçenekler için bkz:.</li>
			<li>Ayarlayın parlaklık ve kontrast iletişim kutusunda (görüntü &#8594; ayarla &#8594; Parlaklık/Kontrast),'ı tıklatın &#34; ayarla &#34; düğmesi. Küme asgari görüntülenen değeri 0 olarak ve en fazla değer esir alma en iyi bir oranı için görüntülenen veri, genellikle 1.0-2.0 ( şekil 5).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Grillo-Hill, B. K., Choi, C., Jimenez-Vidal, M., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+H++efflux+is+sufficient+to+induce+dysplasia+and+necessary+for+viability+with+oncogene+expression.">Increased H+ efflux is sufficient to induce dysplasia and necessary for viability with oncogene expression.</a> eLife. 03270, (2015).</li><li>Ulmschneider, B., Grillo-Hill, B. K., Benitez, M., Azimova, D. R., Barber, D. L., Nystul, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+intracellular+pH+is+necessary+for+adult+epithelial+and+embryonic+stem+cell+differentiation.">Increased intracellular pH is necessary for adult epithelial and embryonic stem cell differentiation.</a> J. Cell Biol. 215 (3), 345-355 (2016).</li><li>Han, J., Burgess, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Indicators+for+Intracellular+pH.">Fluorescent Indicators for Intracellular pH.</a> Chemical reviews. 110 (5), 2709-2728 (2010).</li><li>Koivusalo, M., Welch, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amiloride+inhibits+macropinocytosis+by+lowering+submembranous+pH+and+preventing+Rac1+and+Cdc42+signaling.">Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling.</a> J. Cell Biol. 188 (4), 547-563 (2010).</li><li>Choi, C. -. H., Webb, B. A., Chimenti, M. S., Jacobson, M. P., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+sensing+by+FAK-His58+regulates+focal+adhesion+remodeling.">pH sensing by FAK-His58 regulates focal adhesion remodeling.</a> J. Cell Biology. 202 (6), 849-859 (2013).</li><li>Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+pH-indicators+reveal+activity-dependent+cytosolic+acidification+of+Drosophila+motor+nerve+termini+in+vivo.">Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo.</a> J. Phys. 591 (7), 1691-1706 (2013).</li><li>Grillo-Hill, B. K., Webb, B. A., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratiometric+imaging+of+pH+probes.">Ratiometric imaging of pH probes.</a> Methods in Cell Biol. 123, 429-448 (2014).</li><li>Miesenb&#246;ck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li><li>Kirilly, D., Xie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+ovary:+an+active+stem+cell+community.">The Drosophila ovary: an active stem cell community.</a> Cell research. 17 (1), 15-25 (2007).</li><li>Sahai-Hernandez, P., Castanieto, A., Nystul, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+models+of+epithelial+stem+cells+and+their+niches.">Drosophila models of epithelial stem cells and their niches.</a> Wiley interdisciplinary reviews. Dev. Biol. 1 (3), 447-457 (2012).</li><li>Losick, V. P., Morris, L. X., Fox, D. T., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+stem+cell+niches:+a+decade+of+discovery+suggests+a+unified+view+of+stem+cell+regulation.">Drosophila stem cell niches: a decade of discovery suggests a unified view of stem cell regulation.</a> Dev. Cell. 21 (1), 159-171 (2011).</li><li>Pocha, S. M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+single+and+collective+cell+migrations+in+Drosophila:+themes+and+variations.">Cellular and molecular mechanisms of single and collective cell migrations in Drosophila: themes and variations.</a> Ann Rev. of Gen. 48, 295-318 (2014).</li><li>St Johnston, D., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+polarity+in+eggs+and+epithelia:+parallels+and+diversity.">Cell polarity in eggs and epithelia: parallels and diversity.</a> Cell. 141 (5), 757-774 (2010).</li><li>Castanieto, A., Johnston, M. J., Nystul, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EGFR+signaling+promotes+self-renewal+through+the+establishment+of+cell+polarity+in+Drosophila+follicle+stem+cells.">EGFR signaling promotes self-renewal through the establishment of cell polarity in Drosophila follicle stem cells.</a> eLife. 3, (2014).</li><li>Margolis, J., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+behavior+of+epithelial+stem+cells+in+the+Drosophila+ovary.">Identification and behavior of epithelial stem cells in the Drosophila ovary.</a> Development. 121 (11), 3797-3807 (1995).</li><li>Nystul, T. G., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+epithelial+niche+in+the+Drosophila+ovary+undergoes+long-range+stem+cell+replacement.">An epithelial niche in the Drosophila ovary undergoes long-range stem cell replacement.</a> Cell stem cell. 1 (3), 277-285 (2007).</li><li>Morris, L. X., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live+imaging+provides+new+insight+into+stem+cell+regulation+and+germline-soma+coordination+in+the+Drosophila+ovary.">Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary.</a> Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+(MARCM)+for+Drosophila+neural+development.">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends in neuro. 24 (5), 251-254 (2001).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada, biz FSC Silsilesi içinde wildtype doku hücrelerinin pHi ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu iletişim kuralı geliştirilmiştir ve ilk pHi Drosophila yumurtalık dokusu içinde çalışmaya başlamasından bu yana son beş yılda rafine. Bu süre içinde protokol başarıyla birden fazla müfettişler laboratuarımızın içinde ve en az dört farklı iplik disk ve mikroskoplar tarama lazer tarafından kullanılmıştır. PHi artar FSC lineage hücrelerinde folikül hücre durumuna pFC i...

Son yıllarda yapılan çalışmalarda bir rol pHi değişimler için hücresel farklılaşma displazi vivo içinde1,ve2sırasında ortaya koydu. Bu çalışmalar bir aşamasından geçiş hücreleri olarak değişir ama bu o pHi son derece tutarlı farklılaşma, aynı tür aynı aşamada hücrelerde bulunur. Bazı durumlarda, pHi değişimler kısmen engelleme farklılaşma, pHi değişikliği sadece bir hücre kader değişimler sonucu değil ama bunun yerine belki de pH duyarlı düzenleyici etkisi ile hücre kaderi değiştirmek tanıtmak için yardımcı olur düşündüren bozan proteinler veya kimyasal reaksiyonlar farklılaşması için gerekli. Gelecekteki çalışmalar pHi dynamics vivo içindebirçok farklı rolleri içine daha fazla fikir ortaya potansiyeline sahip. Ancak, doğru ölçümler Phi pHi sırasında farklılaşma vivo içinde eğitim zorluklardan biri almaktır. Diğer şekil-in hücresel morfoloji ve gen ekspresyonu, değişiklikler gibi farklılaşma pHi bir değişken kimyasal özelliği sabit ve standart yöntemlerle permeabilized hücrelere korunmaz hücre benzemez. Buna ek olarak, pHi istikrarlı streslisin hücrelerdeki veya deneysel manipülasyon sonucu ölen olmayabilir. Böylece, pHi ölçerken hücreleri canlı ve mümkün olduğu kadar sağlıklı tutmak önemlidir. Birkaç hayati boya iş hücre kültür3ama birçok pHi ölçme durumlarda için onlar iyi ki uygun değildir çünkü onların doku derin veya eşit nüfuz değil in vivo çalışmalar için kullanılabilir doğru ölçümler sağlamak yeterli .
Zavallı boya penetrasyon sorunu aşmak için biz ve diğerleri genetik olarak kodlanmış bir sonda, özellikle hücreye ifade mCherry::pHluorin4,5,6,7, kullanmıştır faiz ve içinde görüntülü canlı doku türleri. pHluorin olduğunu GFP bir değişken ile daha yüksek bir pKa (~ 7.0 vs ~ 4.0) bu kıvrımlar daha kolay daha yüksek pH; Bu yüzden pHluorin moleküllerinin hücredeki bir popülasyondan yayılan toplam floresan yoğunluğu pHi8artan ile artar. Önemlisi, Floresans pHi değerleri normal sitozolik aralıkta doğrusal. Buna karşılık, mCherry floresan (pKa ~ 4.5) sitozolik aralığındaki pH değişimlerine duyarsız. Bu iki gazetecilere kovalent bir tek chimeric protein, böylece her zaman eşit miktarlarda mevcut tek açık okuma çerçevesi tarafından kodlanmış olarak birbirine bağlı. Bu nedenle, pHluorin için mCherry floresan yoğunluğu oranı her hücrede sonda konsantrasyon için normalleştirilmiş Phi bir ölçüm sağlar. Oranları tahminleri pHi değerleri bilinen pH değerine equilibrated dokulara gelen pHluorin mCherry oranları elde ederek oluşturulan standart bir eğri kullanarak dönüştürülebilir.
Burada, Drosophila yumurtalık içinde epitel FSC soyundan pHi ölçmek için mCherry::pHluorin kullanma yöntemleri açıklanmaktadır. Bu iyi karakterize doku epitel biyoloji, kök hücre kendini yenileme ve farklılaşma9,10,11, toplu hücre göç12 gibi birçok farklı yönleri model oluşturmak için kullanılan , geliştirme ve bakım hücre polarite13,14. Folikül epitel doku ön kenarında germarium15,16adı verilen bir yapısında bulunan iki FSCs tarafından üretilmektedir. Sırasında düzenli olarak yetişkinlik kendini yenilemek ve döl, niş yeniden girebilir ve bir FSC olmak veya üç farklı folikül hücre türden birine ayırt prefollicle hücreleri (PFC) denilen üretmek için bu hücreleri Böl: kutup hücreleri, SAP hücreler, veya Ana gövde folikül hücreleri. Biz daha önce wildtype dokusunda pHi farklılaşma yaklaşık FSCs yılında 6,8 PFC, 7.0 pHi üzerinden 7,3 folikül hücreleri2için erken aşamalarında giderek artar gösterdi ki. Bu artış bir ubiquitously ifade sodyum/proton değiştirici, DNhe2, RNAi nakavt tarafından engelleme ciddi pFC farklılaşma bozar, pHi DNhe2 overexpression tarafından artan ise hafif bir aşırı farklılaşma neden olur fenotip. Bu bulgular pHi stabil erken FSC lineage korunur ve deneysel olarak olabilir artırılması veya azaltılması vivo içindegöstermektedir. Yöntem tanımlamak burada pHi wildtype doku ya da mutant dokular, RNAi nakavt veya faiz ve Mitotik klonları bir Gal4 kullanarak overexpression da dahil olmak üzere çeşitli formları ölçmek için kullanılabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fly Stocks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-mCherry::pHluorin[1]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>y1 w*;P{GawB}10930/CyO</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Act-Gal4 flipout stock</td>
			<td>Bloomington Stock Center</td>
			<td>4409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals for Buffer preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P-3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>4912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>M63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C-5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S-5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M-9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMDG+</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>7088</td>
			<td>Use to Make KHPO4 pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>BP362</td>
			<td>Use to Make KHPO4 pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C21421</td>
			<td>0.25 mg/ml dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nigericin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N1495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection and mounting tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 Dumont Inox forceps (Size 5)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC9473431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 23-gauge syringe needles</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z192457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-well glass dissecting dish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-748B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>1018817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 X 40 mM glass coverslips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12545C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Glass Coverslips, 12mm diameter, 0.13-0.16mm thickness</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>26023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-D mounting chamber</td>
			<td>custom manufactured</td>
			<td></td>
			<td>.stl and .ipt files for 3-D printer included as supplemental files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13-620-183A</td>
			<td>Model: Accumet AB15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>0H11436</td>
			<td>Model: SZ2-ST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>SP5 or SP8 laser-scanning confocal microscope with a 40&#215; objective with a numerical aperture of 1.3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for imaging intracellular ph of the follicle stem cell lineage in live drosophila ovarian tissue

Hücre içi pH (pHi) değişimler, metabolizma, yayılmasını önleme ve farklılaşma da dahil olmak üzere birçok hücresel fonksiyonların yönetmelikte önemli rol oynarlar. Genellikle, pHi dynamics ölçme ve deneysel olarak pHi değiştirmeye mükellef bulunmaktadır kültürlü hücrelerdeki belirlenir. Ancak, son gelişme metodolojileri ve yeni araçlar pHi dynamics bozulmamış, canlı doku içinde çalışmaya mümkün kıldı. Drosophila araştırma için bir önemli gelişme pHi Biyoalgılayıcı taşıyan bir transgenik satır nesil oldu mCherry::pHluorin. Burada, biz düzenli olarak görüntüleme canlı Drosophila ovarioles için epitel folikül kök hücre (FSC) soy mCherry::pHluorin transgenik vahşi türü satırlarındaki pHi ölçmek için kullandığımız bir protokol tanımlamak; Ancak, yöntem tanımlamak burada kanat diskler ve göz epitel de dahil olmak üzere diğer dokular için kolayca adapte edilebilir. Biz FSC soy mCherry::pHluorin ifade etmek için teknikleri yumurtalık dokusu canlı görüntüleme ve edinme ve pHi değerler elde etmek için görüntüleri analiz sırasında korumak açıklar.

Burada birkaç adımdan oluşur folikül epitel pHi ölçme işlemi anlatmıştık. İlk olarak, yumurtalık anatomi ve montaj için araçlarını kullanarak uygun genotip (şekil 1) sinekler disseke. Ovarioles sonra kantitatif floresan mikroskopi kullanarak yansıma ve görüntüleri Phi ölçümler elde etmek için analiz edilir. Her görüntü için faiz hücre türde bölüm 3.1 (Şekil 2) açıklandığı gibi tanımlanır. ...

Watch this Scientific Journal Video about Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue at JoVE.com

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Canlı Drosophila yumurtalık dokusu içinde folikül kök hücre soyundan Imaging hücre içi pH için yöntemleri

Hücre içi pH bir epitel kök hücre soydan canlı Drosophila yumurtalık dokusu içinde görüntüleme için bir protokol sağlar. Transgenik sinekler bir pH Biyoalgılayıcı, mCherry::pHluorin, görüntü kantitatif floresan Imaging'i kullanma Biyoalgılayıcı ifade oluşturmak, standart eğriler oluşturmak ve pH değerleri Floresans yoğunluk değerleri dönüştürmek için yöntemleri açıklanmaktadır.

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

methods-for-imaging-intracellular-ph-follicle-stem-cell-lineage-live

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

6.8K Görüntüleme.  University of California, San Francisco. Hücre içi pH bir epitel kök hücre soydan canlı Drosophila yumurtalık dokusu içinde görüntüleme için bir protokol sağlar. Transgenik sinekler bir pH Biyoalgılayıcı, mCherry::pHluorin, görüntü kantitatif floresan Imaging'i kullanma Biyoalgılayıcı ifade oluşturmak, standart eğriler oluşturmak ve pH değerleri Floresans yoğunluk değerleri dönüştürmek için yöntemleri açıklanmaktadır.

Video: Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Canlı-görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupa Göz

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Gelişim Biyolojisi

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

Ve tahlil Kan Hücresi popülasyonlar<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

Fare Malı İnsani Kemik İliği Mikro Çevrelerinin Biyomühendisliği ve Canlı Görüntüleme ile Görselleştirilmesi

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

Vitro Zigot polarizasyon, Live-hücre görüntüleme ve Arabidopsis thaliana embriyo desenlendirme için ovule ekimi

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Fare İkincil Palin Füzyonunun Canlı Görüntüsü

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with development, tissue homeostasis, and disease processes. Drosophila spermatocytes undergoing meiosis are ideal for this analysis because (1) whole Drosophila testes containing spermatocytes are relatively easy to prepare for microscopy, (2) the spermatocytes&#8217; large size makes them well suited for high resolution imaging, and (3) powerful Drosophila genetic tools can be integrated with in vivo analysis. Here, we present a readily accessible protocol for the preparation of whole testes from Drosophila third instar larvae and early pupae. We describe how to identify meiotic spermatocytes in prepared whole testes and how to image them live by time-lapse microscopy. Protocols for fixation and immunostaining whole testes are also provided. The use of larval testes has several advantages over available protocols that use adult testes for spermatocyte analysis. Most importantly, larval testes are smaller and less crowded with cells than adult testes, and this greatly facilitates high resolution imaging of spermatocytes. To demonstrate these advantages and the applications of the protocols, we present results showing the redistribution of the endoplasmic reticulum with respect to spindle microtubules during cell division in a single spermatocyte imaged by time-lapse confocal microscopy. The protocols can be combined with expression of any number of fluorescently tagged proteins or organelle markers, as well as gene mutations and other genetic tools, making this approach especially powerful for analysis of cell division mechanisms in the physiological context of whole tissues and organs.

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

The goal of this protocol is to analyze cell division in intact tissue by live and fixed cell microscopy using Drosophila meiotic spermatocytes. The protocol demonstrates how to isolate whole, intact testes from Drosophila larvae and early pupae, and how to process and mount them for microscopy.

Drosophila Larval ve Pupal Testislerinin Canlı, Sağlam Dokuda Hücre Bölünmesi Analizi İçin Hazırlanması

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin rods are a hallmark of a conserved, inducible Actin Stress Response (ASR) that accompanies human pathologies, including neurodegenerative disease. Previously, we showed that the ASR contributes to morphogenesis failures and reduced viability of developing embryos. This protocol allows the continued study of mechanisms underlying actin rod assembly and the ASR in a model system that is highly amenable to imaging, genetics and biochemistry. Embryos are collected and mounted on a coverslip to prepare them for injection. Rhodamine-conjugated globular actin (G-actinRed) is diluted and loaded into a microneedle. A single injection is made into the center of each embryo. After injection, embryos are incubated at elevated temperature and intranuclear actin rods are then visualized by confocal microscopy. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments may be performed on the actin rods; and other actin-rich structures in the cytoplasm can also be imaged. We find that G-actinRed polymerizes like endogenous G-actin and does not, on its own, interfere with normal embryo development. One limitation of this protocol is that care must be taken during injection to avoid serious injury to the embryo. However, with practice, injecting G-actinRed into Drosophila embryos is a fast and reliable way to visualize actin rods and can easily be used with flies of any genotype or with the introduction of other cellular stresses, including hypoxia and oxidative stress.

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

The goal of this protocol is to inject Rhodamine-conjugated globular actin into Drosophila embryos and image intranuclear actin rod assembly following heat stress.

Canlı Isı Stresli Drosophila Embriyolarında İntranükleer Akin Çubuklarının Görüntülenmesi

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, germ cell development, piRNA biology, and niche formation. Here, we present a dissection technique to live-image the gonad ex vivo during a period when in vivo live-imaging is highly ineffective. This protocol outlines how to transfer embryos to an imaging dish, choose appropriately-staged male embryos, and dissect the gonad from its surrounding tissue while still maintaining its structural integrity. Following dissection, gonads can be imaged using a confocal microscope to visualize dynamic cellular processes. The dissection procedure requires precise timing and dexterity, but we provide insight on how to prevent common mistakes and how to overcome these challenges. To our knowledge this is the first dissection protocol for the Drosophila embryonic gonad, and will permit live-imaging during an otherwise inaccessible window of time. This technique can be combined with pharmacological or cell-type specific transgenic manipulations to study any dynamic processes occurring within or between the&#160;cells in their natural gonadal environment.

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Here, we provide a dissection protocol required to live-image the late embryonic Drosophila male gonad. This protocol will permit observation of dynamic cellular processes under normal conditions or after transgenic or pharmacological manipulation.

Geç Embriyonik Drosophila Gonad'ın Diseksiyonu ve Canlı Görüntülemesi

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of the fly such as imaginal discs, the larval brain or egg chambers of adult females or the adult intestine can be extracted and kept in culture for imaging with time-lapse microscopy, providing valuable insights into cell and developmental biology. Here, we describe in detail our current protocol for the dissection of Drosophila larval brains, and then present our current approach for immobilizing and orienting larval brains and other tissues on a glass coverslip using Fibrin clots. This immobilization method only requires the addition of Fibrinogen and Thrombin to the culture medium. It is suitable for high-resolution time lapse imaging on inverted microscopes of multiple samples in the same culture dish, minimizes the lateral drifting frequently caused by movements of the microscope stage in multi-point visiting microscopy and allows for the addition and removal of reagents during the course of imaging. We also present custom-made macros that we routinely use to correct for drifting and to extract and process specific quantitative information from time-lapse analysis.

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

This protocol describes applications of sample immobilization using Fibrin clots, limiting drifting, and allowing the addition and washout of reagents during live imaging. Samples are transferred to a drop of Fibrinogen containing culture medium on the surface of a coverslip, after which polymerization is induced by adding thrombin.

Canlı Görüntüleme İçin Fibrin Pıhtıları ile Drosophila Dokularının Hareketsiz Hale Getirilmesi Uygulamaları

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of ...

Isolation of Rat Adipose Tissue Mesenchymal Stem Cells for Differentiation into Insulin-producing Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs)-especially those isolated from adipose tissue (Ad-MSCs)-have gained special attention as a renewable, abundant source of stem cells that does not pose any ethical concerns. However, current methods to isolate Ad-MSCs are not standardized and employ complicated protocols that require special equipment. We isolated Ad-MSCs from the epididymal fat of Sprague-Dawley rats using a simple, reproducible method. The isolated Ad-MSCs usually appear within 3 days post isolation, as adherent cells display fibroblastic morphology. Those cells reach 80% confluency within 1 week of isolation. Afterward, at passage 3-5 (P3-5), a full characterization was carried out for the isolated Ad-MSCs by immunophenotyping for characteristic MSC cluster of differentiation (CD) surface markers such as CD90, CD73, and CD105, as well as inducing differentiation of these cells down the osteogenic, adipogenic, and chondrogenic lineages. This, in turn, implies the multipotency of the isolated cells. Furthermore, we induced the differentiation of the isolated Ad-MSCs toward the insulin-producing cells (IPCs) lineage via a simple, relatively short protocol by incorporating high glucose Dulbecco&#39;s modified Eagle medium (HG-DMEM), &#946;-mercaptoethanol, nicotinamide, and exendin-4. IPCs differentiation was genetically assessed, firstly, via measuring the expression levels of specific &#946;-cell markers such as MafA, NKX6.1, Pdx-1, and Ins1, as well as dithizone staining for the generated IPCs. Secondly, the assessment was also carried out functionally by a glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) assay. In conclusion, Ad-MSCs can be easily isolated, exhibiting all MSC characterization criteria, and they can indeed provide an abundant, renewable source of IPCs in the lab for diabetes research.

Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (Ad-MSCs) can be a potential source of MSCs that differentiate into insulin-producing cells (IPCs). In this protocol, we provide detailed steps for the isolation and characterization of rat epididymal Ad-MSCs, followed by a simple, short protocol for the generation of IPCs from the same rat Ad-MSCs.

Sıçan Yağ Dokusu Mezenkimal Kök Hücrelerinin İnsülin Üreten Hücrelere Farklılaşması İçin İzolasyonu

Mesenchymal stem cells (MSCs)-especially those isolated from adipose tissue (Ad-MSCs)-have gained special attention as a renewable, abundant source of ...

Canlı Drosophila yumurtalık dokusu içinde folikül kök hücre soyundan Imaging hücre içi pH için yöntemleri

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Canlı-görüntüleme

Ve tahlil Kan Hücresi popülasyonlar