このプロトコルは、ショウジョウバエアレイをモデル系として用いて基底膜タンパク質の細胞内輸送および分泌の特性評価を可能にする。我々の技術の主な利点は、内因性にタグ付けされたタンパク質およびAiryscan超解像顕微鏡法を用いて、基底膜タンパク質の細胞内輸送の高解像度イメージングを可能にすることである。このプロトコルは基底膜タンパク質の細胞内輸送を画像化するために開発されているが、関心のある他のタンパク質および細胞培養およびオルガノイドを含む他の生物学的系の輸送を研究するために拡張することができる。
まず、解剖スコープでPBS中のショウジョウバエ卵巣を解剖した後、1ミリリットルの固定溶液を加え、卵巣をナットプラットフォームに15分間固定する。固定溶液を取り出し、それぞれ1ミリリットルのPBSTで2回のクイック洗浄を行う。微量遠心チューブを5〜6回静かに反転させてから、ナットプラットフォームロッカー上で1ミリリットルのPBSTでそれぞれ10分間の長い洗浄を4回行います。
固定と洗浄を行った後、PBSTを除去し、1ミリリットルのブロッキング溶液を加え、栄養プラットフォームロッカーで卵巣を最低1時間ブロックします。次に、ブロッキング溶液を取り出し、ブロッキング溶液中に適切な濃度で希釈された一次抗体を含む一次抗体溶液を300マイクロリットル加える。摂氏4度のナットプラットフォームロッカーで一晩インキュベートします。
一次抗体溶液を除去した後、前述のように、2回のクイック洗浄と4回の長時間洗浄を行い、PBSTを除去し、使用した一次抗体を検出する蛍光二次抗体を含む500マイクロリットルの二次抗体溶液を加える。二次抗体溶液中の卵巣をナットリングプラットフォームロッカー上で室温で2時間インキュベートし、その後、ナットプラットフォームロッカーで以前に実証したように、PBSTで2回のクイックウォッシュと4回のロングウォッシュを実行します。最後の洗浄後、P-1000ピペットを使用して卵巣をチューブ内で上下に静かにピペットでピペットし、卵室を分離します。
チューブを5〜10分間直立姿勢に保ち、卵室を底に沈ませます。次に、パスツールピペットを使用してPBSTを除去し、約50マイクロリットルを残します。その後、P-200ピペットを使用して残りのPBSTをできるだけ多く取り除き、カバースリップ上に均等に広がるのに十分な2滴のマウント媒体を追加します。
粘性マウント媒体を微量遠心チューブからスライドに簡単に移送できるようにするには、P-200ピペットチップの端を切り取ります。次に、取り付け媒体内のすべての卵室をスライドガラスにゆっくりと移し、気泡を発生させないようにします。解剖顕微鏡下で、新しいP-200ピペットチップまたは鉗子を使用して、カバースリップのほぼサイズの領域をカバーするために、取り付け媒体と分離卵チャンバーを静かに広げます。
鉗子を使用して、カバースリップを気泡を避けるために卵室に慎重に斜めに置き、スライドを室温で暗闇の平らな面に2日間保管して重合させます。マウントメディアが硬化したら、スライドを暗闇の中で4°Cで数週間保管してイメージングすることができます。基底膜タンパク質の細胞内局在を可視化するには、対物レンズを63倍に設定し、レンズに浸漬油を一滴静かに置き、カバースリップを対物レンズに向けるようにスライドを対物レンズの上に置き、検体の位置を特定します。
エピ蛍光顕微鏡の接眼レンズを使用して関心領域を特定し、原稿に記載されているように蛍光色素分子を画像化するための適切な設定を含む構成を選択します。設定が完了したら、[集録モード]で[ライブ]を選択してサンプルをイメージし、ズームを2~4倍に調整してサンプルのスキャン領域を最適化します。個々のチャンネルごとに、[チャンネル]でトラックを選択し、[ライブ]をクリックします。
レンジインジケータツールを使用しながらマスターゲインとレーザーパワーを調整し、すべてのガイドラインに従って、原稿に記載されているように飽和ピクセルを避け、各チャンネルで同じことを繰り返します。集録モードのトグルウィンドウの[画像サイズ]で、[SR]をクリックして検出器の機能を最大化し、フレームサイズを自動的に調整します。Airyscanモードでは平均化をNone にしておくと、通常は必要ではなく、スキャン時間が短縮されます。
ただし、場合によっては、平均を2倍にすると信号対雑音比が向上し、スナップをクリックして画像を取得することがあります。Zスタックを取得するには、[取得]タブの下にある[Zスタック]チェックボックスをクリックします。次に、試料を観察するために所望のチャネルを選択する。
たとえば、DAPIチャンネルで[ライブ]をクリックしてライブスキャンを開始し、顕微鏡の微調整ノブを使用してZスタックの範囲を設定します。その後、「最初に設定」および「最後に設定」をクリックして、Z スタックの端点を設定します。最適な3D再構成を行うには、Zスタックの間隔を0.5マイクロメートル未満に設定してステップサイズを割り当て、[実験の開始]をクリックしてZスタックの取得を開始します。
画像またはZスタックを取得したら、[処理]、[方法]オプションをクリックし、[Airyscan処理]を選択します。オートフィルタを実行して開始し、必要に応じて、超解像値を変更してさらに手動処理を実行し、サンプルに最適な結果を得ます。最適なSR値が決定されたら、[適用]をクリックして処理された画像を生成します。
Zスタック画像の場合、3D処理ボックスをクリックして、1つのZスライスとして、またはZスタック全体として処理します。Zスタックの取得後にタンパク質のトラフィッキングを3Dで視覚化するには、プレビューウィンドウの3Dアイコンをクリックして3D画像を生成し、Airyscan処理画像の表示制御セクションに表示されます。さまざまな 3D ビューオプションから、小胞の構造を表示するときは、サーフェスビューまたは混合ビューを使用します。
最高品質の画像の場合、[最速] 設定の精度が低下し、3D レンダリングが悪くなるため、[正確] 設定を選択します。画像が生成されたら、ズームと回転によって3D画像を操作して、好みの位置に焦点を合わせます。ビューを取得したら、[3D]タブで[表示解像度]を選択し、[イメージの作成]をクリックすると、表示と同じ向きでイメージのスナップショットが作成され、さまざまなファイル形式で保存およびエクスポートできます。
共焦点顕微鏡は、取得パラメータが最適化された場合に、Viking-GFPなどの基底膜タンパク質の細胞内局在および沈着を視覚化するために使用することができる。取得と画像処理を適切に行うと、超解像顕微鏡は共焦点顕微鏡と比較して画像解像度が向上します。バイキングなどの基底膜タンパク質の細胞内輸送におけるよりよく定義された画像によって示されるように。
正射影は、共焦点または超解像イメージングを使用して、基底膜タンパク質を含む小胞および区画の全体的な分布を単一の画像で視覚化することを可能にする。共焦点または超解像イメージングによって撮影された光学Z切片のスタックを組み立てることによる3D再構成を用いて、細胞内基底膜タンパク質の局在および分布を評価した。超解像イメージングは、変異条件下での基底膜タンパク質の正確な局在を決定するために使用することができる。
例えば、Cragノックダウン上皮細胞において、基底膜タンパク質は頂端および基底の両方に蓄積し、基底膜タンパク質の分極分泌を制御していることを示している。共焦点顕微鏡および超解像顕微鏡は、共局在化実験にも用いることができる。例えば、この図は、バイキング-GFPとゴルジマーカーGM-130の部分的な共局在を示しており、バイキングが分泌前にゴルジ体に分類されていることを確認している。
超解像顕微鏡を用いて基底膜タンパク質の輸送を効率的にイメージングするためには、卵巣を慎重に装着し、集録パラメータと畳み込みパラメータの設定時に特に注意を払うことをお勧めします。このプロトコルは、基底膜タンパク質の細胞内輸送および分泌を視覚化するように最適化されている。しかし、目的の他のタンパク質のトラフィッキングを効率的に画像化するために容易に改変することができる。
