著者はバイオ マーカーと免疫アッセイの貢献を認識したいアッセイの開発製品開発チーム。さらに、データ分析ソフトウェア パッケージの設計の彼らの共同の努力の Vigene テクノロジー株式会社に感謝したいと思います。

<ol>
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著者は、本稿に記載されている試薬を製造する BioLegend によって用いられます。株式会社 Vigene 技術は、本稿に記載されている分析から生成されたデータを分析するために使用 LEGENDplex データ解析ソフトウェアを開発しました。

このプロトコルで記述されているアッセイ フォーマットは、実験者を提供された生体試料中の可溶性調停プロファイルの堅牢な定量化は良い研究室技術と推奨されるプロトコルに準拠して提供できます。
信頼性の高い結果を保証するために従う必要がありますいくつかの主要な手順があります。まず、ポリプロピレン チューブにのみ希釈後、アッセイバッファー推奨、フルタイムを再構成する組換え基準を許可しなければなりません。ポリスチレンのチューブは、蛋白質の標準曲線を生成するときに低信号につながることができるチューブの壁への付着を促進することが。第二に、適切な培養手順中に揺れが重要です。適切な撹拌せず試金ビーズの結合特性を著しく妨げられること。さらに、インキュベーションのステップの間の適切な洗浄も必要です。実験者は過剰試薬がプロトコルの次のステップを開始する前に井戸から削除されることを確認してください。使用して試金ビーズ フローサイトの機器設定は、同様に最適化されなければなりません。特に、PMT の設定を調整して、適切なビードの分離と標準的なカーブの広いダイナミック レンジを確保する必要があります。最後に、cytometer で分析される直前にビーズに vortexed 適切なサスペンションを保証するために、集計結果を曲げるの形成を回避する必要があります。
このプロトコルは、研究者はプレート全体の大規模な分析を実行する前に、換散のプロトコルを最適化するために喜んで提供される組織乳剤として本稿で説明したサンプルの種類を分析する可能性のある変更ことができます。実際の手法は、組織の種類によってもちろん異なりますただし、一般的にプロトコルがイオンの塩の生理学的濃度、変性無農薬、好ましくない洗剤を含む中性 pH バッファーを使用する必要があります。洗剤を使用する必要がある場合非イオン性洗剤濃度は最小値 (例えばは 1% 以上) に保つ必要があります。バッファーは、標的タンパク質の分解を防ぐために十分なプロテアーゼ阻害剤を含める必要があります。換散のプロトコルが使用されるに関係なく微粒子分析の前に削除する最終準備を遠心する必要があります。
試金の制限に関する生物学的サンプルの型内の試料ターゲットの濃度が異なります。適切濃度を定量化するために、標準的なカーブのための上位および下位の値に収まる必要があります。カーブの値の外挿は、必ずしも信頼性がないと、お勧めしません。したがって調査官は、完全版の試金を実行する前にパイロット実験でそれらの特定のサンプルの希釈液を最適化する必要があります。さらに、試金するのに生物学的サンプルの入念な準備は、このアッセイの形式の成功に重要です。Lipemic、溶血されました、または蛋白質の破片を含むサンプルはこの免疫測定法の基本原則を定義する抗原抗体の相互作用に影響を与える、解釈である結果をレンダリングします。
この試金はいくつかの理由のための既存の定量化方法に関して重要です。正しく実行されると、アッセイの形式することができます量的に表わす伝統的な ELISA アッセイを使用してサンプルを分析する必要があるよりもはるかに小さいボリュームを使用してサンプルから最大 13 検体。このアッセイ フォーマットも必要ありません専用計測を実行するために。これは、アッセイは、一般的に使用される流れの cytometers の任意の数を使用して実行できる、他の市販のビーズを用いたイムノアッセイと比較利点です。
健康ネットワーク分泌因子とサイトカイン演じる役割への科学的な調査と病が拡大しています。本稿で説明している分析書式は、これらの多面的で複雑な現象を理解しようとする研究者にとって貴重なツールを使用できます。アクティブな生物医学研究プログラムは、だけでなくエリアなど、一般化された炎症6、におけるサイトカイン ネットワークの役割だけでなく、アテローム性動脈硬化、癌、neuroinflammationなど特定の病気の状態のコンテキストを探検し始めています。15,16,17。間違いなく、調査は、これら慢性疾患治療の検索が拡張されるとこれらの分野で成長を続けるでしょう。これらの疾患に関連付けられている溶性メディエーターの正確性と信頼性の定量化のための必要性は、重要な研究の優先順位になります。

水溶性のシグナル伝達分子としての役割、サイトカインは宿主免疫反応を支配する因子と高い調整能力のプロセスを仲介します。彼らは解像度に開始からの炎症性プロセスのすべての段階の間に表現し、独自の合成とその細胞の受容体1を含む複雑な相互作用ネットワークを調整します。この通信ネットワークは個々 のコンポーネント間があります相乗的あるいは敵対関係を超えた複雑さと階層化します。確かに、冗長または少なくとも部分的に重なり合う機能2,3を共有する多くのサイトカインが知られています。
同時に複数のサイトカイン analytes を定量化する統合システムバイオロジーは現在複数疾患の基になる免疫反応を調整するユニークな cytokinomes のますます包括的な理解を提供します。4、5 を状態します。これら疾患状態まで炎症から癌、神経変性疾患、および心血管疾患6,7,8,9です。
LEGENDplex ビーズを用いたイムノアッセイを効果的に使用してこのようなサイトカイン ネットワークを尋問することができます。これらの試金はサンドイッチ酵素免疫測定法 (ELISA) と同じ原理に基づいています、エンコードされた蛍光マイクロスフィアを使用し表面に共有結合接続キャプチャ抗体。これらの抗体は ELISA の従来のフォーマットに必要なそれらより小さい表面領域に固定します。これにより、このような試金をはるかに少ないサンプル量と同時に非固有のバインドおよび提供を減らすいくつかの検体の分析を多重実行します。
このプロトコルで説明アッセイは、同時に最大 13 ターゲット量的にこの技術を利用しています。この試金のデータはさまざまな一般的な流れの cytometers を使用して取得することができますとは異なり、他の利用可能なアッセイを必要としない専用の試金固有のインストルメンテーションを使用。検証済み試料パネルの拡大カタログ、いくつか継続的な生物医学研究プロジェクト10、11,12,13これらのアッセイを使用されています。
使いやすさとマウスの T ヘルパー サイトカイン パネルを使用して、量的にこの実験で、アッセイ フォーマットの有用性を実証するには、13 別の複数の下で培養したマウス脾細胞から得られた培養上清からのサイトカイン濃度刺激の条件。組織培養上清、に加えてこのアッセイも実行できます血清または血漿サンプルを使用しています。

<table><tbody><tr><td>Allegra 6R Centrifuge with MICROPLUS Carrier Adaptor</td><td>Beckman Coulter</td><td>366816</td><td>For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional)</td></tr><tr><td>LEGENDplex Mouse T helper Cytokine Panel</td><td>BioLegend</td><td>740005</td><td>Multiplex Immunoassay (13-plex)</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD3&amp;epsilon; antibody</td><td>BioLegend</td><td>100314</td><td>Clone 145-2C11, low endotoxin, azide free format</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD28 antibody</td><td>BioLegend</td><td>102112</td><td>Clone 37.51, low endotoxin, azide free format</td></tr><tr><td>Vacuum Pump</td><td>EMD Millipore</td><td>WP6111560</td><td>For LEGENDplex assays using filter plates (recommended)</td></tr><tr><td>Vacuum Manifold</td><td>EMD Millipore</td><td>MSVMHTS00</td><td>For LEGENDplex assays using filter plates (recommended)</td></tr><tr><td>Sterile Disposable Reagent Reservoirs</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-130</td><td>Or equivalent</td></tr><tr><td>Polypropylene MicroFACS Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-842-90</td><td>For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional)</td></tr><tr><td>Pipette Kit</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-388-100</td><td>Four pipette sizes (0.2-2&amp;micro;L, 2-20&amp;micro;L, 20-200&amp;micro;L, 100-1000&amp;micro;L)</td></tr><tr><td>Multi-Channel Pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>FA10011G</td><td>capable of dispensing 5 &amp;mu;L to 200 &amp;mu;L</td></tr><tr><td>Microplate Shaker</td><td>Fisher Scientific</td><td>88880023</td><td>Or equivalent</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>75002410</td><td>Or equivalent</td></tr><tr><td>FACS tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9885747</td><td>12 x 75 mm round bottom</td></tr><tr><td>PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide (LPS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-8274</td><td>&lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt; O26:B6</td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Branson B200 Ultrasonic Cleaner</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z305359</td><td>Or equivalent</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z666505</td><td>1.5 mL polypropylene tubes</td></tr><tr><td>Flow Cytometer</td><td>Various</td><td>Various</td><td>Cytometer equipped with single laser (488nm blue) or two lasers (488nm blue or 532nm green + 633nm Red) capable of reading emission wavelengths at 575nm and 660nm</td></tr><tr><td>96-Well Polypropylene Plate</td><td>VWR</td><td>82050-662</td><td>For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional)</td></tr></tbody></table>

multiplex cytokine profiling of stimulated mouse splenocytes using a cytometric bead-based immunoassay platform

ビーズを用いたイムノアッセイ サンドイッチ免疫測定と同じ基本的な原理を採用しています。ビーズのサイズと内部アロフィコシアニン (APC) 蛍光強度によって区別することができます、特定の試料に特異抗体に共役をキャプチャします。次に、定義されているキャプチャ ビーズ セットの選択したパネルは、キャプチャー抗体に固有のターゲット analytes を含む生物学的サンプルと培養です。ビオチン標識検出抗体のカクテルが追加されます、キャプチャ ビーズ検体検出抗体サンドイッチの形成に 。
最後に、バインドされた試料の量に比例した蛍光信号強度を提供するビオチン検出抗体に結合するストレプトアビジン-フィコエ リスリン (SA PE) が追加されます。PE は蛍光ビーズ検体特異的領域の信号が、フローサイトメトリーを用いた定量化し、特定検体の濃度は、データ分析ソフトウェアとアッセイで生成される標準の曲線を使用して決定されます。
この実験では、マウス T ヘルパー サイトカイン パネルを使用して、同時に様々 な刺激条件下で培養マウス脾細胞から収集した組織培養上清中に 13 の独立したサイトカイン ターゲットの濃度を定量化します。

このプロトコルは、ビーズを用いたイムノアッセイ プラットフォームを使用して同時に流れの cytometer を用いる生体試料からのサイトカインを量的に方法を示します。この例で使用されている生物学的サンプルいた以前様々 な作動条件の下で培養されていたマウス脾細胞から細胞培養上清アッセイ フォーマットは、血清または血漿サンプルで使用する検証されています。
アッセイから生成されるデータを使用して、多重パネルですべての検体の標準曲線を構築します。データ解析ソフトウェアは、ユニークなビーズのサイズと APC 強度に基づいて各特定の試料を分類し、PE レポーターを使用してそれらを定量化します。図 2 aの対数-対数スケールでプロットすると、アッセイの感度と同様に動的な範囲が示されています。ソフトウェアを使用して、分析データ、すべて標準曲線 (テーブル 1 のハイエンドとローエンドの生体試料も検出限界を提供だけでなくユーザーの検体の濃度を正確に計算する 5 パラメーター曲線近似アルゴリズム).このプロトコルで説明する形式はまた、非常に堅牢な測定精度を提供します。図 2 bおよび2 Cの各試料の測定内変動を描いたデータを掲載されています。2 つの別々 の標準蛋白質濃度 (高低) を各サンプル 16 複製し、1 つの分析で行った。図 2と2 Dは、3 つの独立した試金からターゲット検体の測定間変動を表します。測定内の精密実験と高低標準濃度を行った 3 とそれぞれ独立した実験の複製します。ターゲット蛋白質の計算される濃度の最小変動がはっきりと見えるです。
マウス脾細胞サイトカイン発現プロファイルを尋問でビーズを用いたフローサイトメトリーによるアッセイの有用性を実証するために様々 な作動条件の下で培養。些細のコントロールでは、セルも LP、抗 CD3/抗 CD28 抗体またはホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート イオノマイシンと培養。細胞培養上清は、48 時間後、マウスの T ヘルパー サイトカイン パネルを使用して試金を収集しました。この実験から定量化の結果は図 3で表され、サイトカイン濃度に及ぼす刺激条件を明確に線引き。
上記結果は実験者がありよい実験室技術提供の試金のプロトコルに続く限り、典型的であります。この試金の形式でエラーのソースは、サンプルの分析に使用される流れの cytometer でインキュベーション時間、洗浄、試薬ボリュームの偏差や不適切な PMT 設定からを発生します。図 4 a散布図では、成功した試金からプロットは、明確に定義された 2 の異なるビーズ人口を示しています。これは、図 4 b、どこに洗濯とプロトコルのコンプライアンスの低下が 2 つの集団をぼかしビーズ凝集体に導いたに対比ことができます。さらに、左下腹部の残骸によって証明されるようゲート イベントのみの優先のフォーマットではなく、分析の合計 cytometer イベントが輸出されました。設定適切な cytometer は、このアッセイで信頼性の高いデータを生成するのに不可欠です。図 4適切な pmt 関数の設定は APC 分類チャネル 6 検体のそれぞれの解像度のこと。不適切な光電子増倍管の設定は図 4 APC チャネルが重複分類強度を持つビーズ集団で提示したようなデータになります。試金ビーズの明確に定義された集団なし濃度を計算することが可能になりますので、試金は無効になります。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56440/56440fig2.jpg"> 
図 2: 標準曲線の範囲と測定精度。(A)マウスの T ヘルパー サイトカイン パネルを使用して生成された代表的な標準的なカーブです。標準的な曲線は、各アッセイで実行されなければなりません。(B ・ C)測定内の有効桁数です。ターゲット蛋白質 (高低) の濃度の異なる 2 つのサンプルを各サンプル 16 複製し、1 つの分析で行った。データは、平均 + 標準偏差として表されます。(D ・ E)測定間の精度。ターゲット蛋白質 (高低) の濃度の異なる 2 つのサンプルは、各サンプルに対して 3 の複製を 3 つの独立したアッセイで行った。データは、平均 + 標準偏差として表されます。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56440/56440fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56440/56440fig3.jpg"> 
図 3: 代表結果の定量化します。37 ° C + 5% CO2様々 な条件下で培養したマウス脾細胞 (1 x 10 の6セル): 些細、LPS (100 ng/mL)、αCD3 (1 μ G/ml プレート コーティング) + αCD28 (1 μ g/mL 水溶性)、PMA (20 ng/mL) + イオノマイシン (500 ng/mL)。培養上清は 48 時間後に収集されたし、マウス T ヘルパー サイトカイン パネルを使用して量を示されます。刺激条件に応じて各種サイトカイン発現プロファイルが明確に表示されます。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56440/56440fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56440/56440fig4.jpg"> 
図 4: 失敗した試金と成功の結果します。(A)成功した試金微粒子集団の異なるビーズ人口しているが。(B)失敗したアッセイでお越しの貧しい人口分離、ビーズの集計、および収集されたイベントが多すぎます。(C)正常な試金がゲートし、定量化しやすい分類蛍光チャネルの強度が明確に定義します。(D)失敗した試金が不十分な分離と分類強度定量化を難しく、複数のビーズ集団を重複します。注意付着試金のプロトコルを介してこれらのエラーの多くを回避できます。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56440/56440fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">標準曲線</td>
			<td colspan="2">感度 (pg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>検体</td>
			<td>フィット式</td>
			<td>CV</td>
			<td>R2</td>
			<td>分。</td>
			<td>Max。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-Γ</td>
			<td>5 P.log(4.43, 14.40, 0.54, 9.11, 0.01)</td>
			<td>1.77%</td>
			<td>0.99</td>
			<td>2.1</td>
			<td>18105.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-5</td>
			<td>5 P.log(4.36, 12.68, 0.64, 5.73, 0.36)</td>
			<td>1.32%</td>
			<td>1</td>
			<td>1.9</td>
			<td>14514.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF Α</td>
			<td>5 P.log(4.36, 11.63, 0.79, 5.45, 0.37)</td>
			<td>1.48%</td>
			<td>0.99</td>
			<td>1.9</td>
			<td>20109.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-2</td>
			<td>5 P.log(4.46, 12.62, 0.78, 5.07, 0.34)</td>
			<td>1.34%</td>
			<td>1</td>
			<td>1.9</td>
			<td>25109.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-6</td>
			<td>5 P.log(4.58, 11.66, 0.64, 5.77, 0.37)</td>
			</tr></tbody></table>td>1.70%
			<td>0.99</td>
			<td>2.0</td>
			<td>7022.0</td>
		
		<tr>
			<td>IL-4</td>
			<td>5 P.log(4.27, 12.23, 0.62, 5.72, 0.36)</td>
			<td>1.36%</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>13273.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-10</td>
			<td>5 P.log(4.67, 11.65, 1.20, 6.28, 0.61)</td>
			<td>1.81%</td>
			<td>0.99</td>
			<td>2.2</td>
			<td>5190.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL 9</td>
			<td>5 P.log(4.32, 13.86, 0.86, 5.90, 0.45)</td>
			<td>1.82%</td>
			<td>1</td>
			<td>1.9</td>
			<td>12602.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL 17A</td>
			<td>5 P.log(4.06, 14.03, 0.47, 6.52, 0.32)</td>
			<td>0.99%</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>12285.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL 17F</td>
			<td>5 P.log(4.52, 12.15, 0.61, 5.52, 0.34)</td>
			<td>0.92%</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>14841.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>イリノイ 21</td>
			<td>5 P.log(4.90, 8.03, 1.77, 4.74, 1.11)</td>
			<td>0.79%</td>
			<td>1</td>
			<td>9.0</td>
			<td>12943.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL 22</td>
			<td>5 P.log(4.57, 12.56, 0.63, 6.06, 0.39)</td>
			<td>1.16%</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>6408.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL 13</td>
			<td>5 P.log(4.40, 11.44, 0.22, 3.19, 1.45)</td>
			<td>1.11%</td>
			<td>1</td>
			<td>2.1</td>
			<td>16728.0</td>
		</tr>
	

表 1: 標準的なカーブ フィットとアッセイ感度。データ解析ソフトウェアは、マルチプレックス アッセイに含まれているすべての分析の標準的な曲線の生成に使用されました。この全自動分析アッセイからアルゴリズムを希釈シリーズ規格にふさわしい堅牢な 5 パラメーター曲線を適用し、検出の理論的な限界を使用してアッセイ感度の定義にも使用されました。

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Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform

このプロトコルでは、数量的なマルチプレックス ビーズ ベース イムノアッセイ ・ システムと流れの cytometer を使用して刺激マウス脾細胞から収集した組織培養上清中に同時に複数のサイトカイン目標について説明します。

フローサイトメトリーによる免疫プラットフォームを使用して刺激マウス脾細胞のサイトカインがプロファイリングを多重化します。

Bead-based immunoassays employ the same basic principle as sandwich immunoassays. Capture beads, which can be differentiated by size and internal ...

multiplex-cytokine-profiling-stimulated-mouse-splenocytes-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

44.8K ビュー.  BioLegend. このプロトコルでは、数量的なマルチプレックス ビーズ ベース イムノアッセイ ・ システムと流れの cytometer を使用して刺激マウス脾細胞から収集した組織培養上清中に同時に複数のサイトカイン目標について説明します。

ビデオ: Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform

Detection and Isolation of Viable Mouse IL-17-Secreting T Cells

The MACS Cytokine Secretion Assay technology allows detection of secreted cytokines on the single cell level and sensitive isolation of viable cytokine-secreting cells. In order to label IL-17-secreting cells, a single cell suspension of mouse splenocytes is prepared and stimulated at 37&deg;C with PMA/ionomycin to induce cytokine secretion. To stop secretion cells are then placed on ice and are exposed to the IL-17 Catch Reagent   a bi-specific antibody that binds to CD45 on the cell surface of leukocytes and to IL-17 as it is secreted and caught near the cell surface. Secretion is then re-started by increasing the temperature to 37&deg;C and IL-17 is trapped by the Catch Reagent. Secretion is then stopped again, by placing cells on ice. To detect the trapped IL-17, cells are incubated with a second IL-17-specific antibody conjugated to biotin and an Anti-Biotin-PE antibody. Cells can now be directly analyzed by flow cytometry or prepared for isolation and enrichment by subsequent labeling with Anti-PE conjugated MicroBeads.

This procedure describes the detection and isolation of mouse TH17 leukocytes that actively secrete IL-17 upon stimulation.

生存マウスIL - 17分泌T細胞の検出と分離

The MACS Cytokine Secretion Assay technology allows detection of secreted cytokines on the single cell level and sensitive isolation of viable ...

生物学

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

小分子のハイスループットスクリーニングのための適切な蛍光ベースのリンパ球アッセイ

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

免疫・感染学

Bead Based Multiplex Assay for Analysis of Tear Cytokine Profiles

Tear film is a complex mixture of lipids, proteins and minerals which covers the external surface of the eye, thereby providing lubrication, nutrition and protection to the underlying cells. Analysis of tears is an emerging area for the identification of biomarkers for the prediction, diagnosis, and prognosis of various ocular diseases. Tears are easily accessible and their collection is non-invasive. Therefore, advancing technologies are gaining prominence for identification of multiple analytes in tears to study changes in protein or metabolite composition and its association with pathological conditions. Tear cytokines are ideal biomarkers for studying the health of the ocular surface and also help in understanding the mechanisms of different ocular surface disorders like dry eye disease and vernal conjunctivitis. Bead based multiplex assays have the capability of detecting multiple analytes in a small amount of sample with a higher sensitivity. Here we describe a standardized protocol of tear sample collection, extraction and analysis of cytokine profiling using a bead based multiplex assay.

Analysis of tear film cytokines helps in studying various ocular diseases. Bead based multiplex assays are simple and sensitive and enable the testing of multiple targets in samples with small volumes. Here we describe a protocol for tear film cytokine profiling a using bead based multiplex assay.

ビーズ ベースの涙サイトカイン解析マルチプレックス アッセイ

Tear film is a complex mixture of lipids, proteins and minerals which covers the external surface of the eye, thereby providing lubrication, nutrition and ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies in an attempt to understand the precise mechanisms that lead to the breakdown of self-tolerance and subsequent autoimmunity. Approaches thus far have been based on the study of one specific aspect of the immune system (a single or few cell types or cytokines), and do not offer a global assessment of complex autoimmune disease. While patient sera-based studies have afforded important insights into autoimmunity, they do not provide the specific cellular source of the dysregulated cytokines detected. A comprehensive single-cell approach to evaluate cytokine production in multiple immune cell subsets, within the context of &#34;intrinsic&#34; patient-specific plasma circulating factors, is described here. This approach enables monitoring of the patient-specific immune phenotype (surface markers) and function (cytokines), either in its native &#34;intrinsic pathogenic&#34; disease state, or in the presence of therapeutic agents (in vivo or ex vivo).

Here we describe a single-cell proteomic approach to evaluate immune phenotypic and functional (intracellular cytokine induction) alterations in peripheral whole blood samples, analyzed via mass cytometry.

イムノフェノ タイプと大量のフローサイトメトリーによる末梢血中のサイトカイン産生の単一細胞解析

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

Using Reference Reagents to Confirm Robustness of Cytokine Release Assays for the Prediction of Monoclonal Antibody Safety

New immunostimulatory antibody drugs designed to either directly stimulate specific immune cells or indirectly enhance the immune response by blocking or activating an endogenous regulator of the immune system have the potential to cause serious immune-related adverse events such as cytokine release syndrome (CRS). It is, therefore crucial to assess the safety profile of such drugs with a combination of in vivo and in vitro experiments before first-in-human dose administration. Cytokine release assays (CRAs), where the proposed antibody therapeutic is co-cultured with human immune cells (such as peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), whole blood, or otherwise) and the amount of inflammatory cytokine produced is measured, are critical for hazard identification. However, different labs using different control antibodies can threaten the harmonization of CRAs, and clinically relevant controls (such as TGN1412) can be difficult to source, which can lead to less accurate or reliable results or data which are difficult to compare between laboratories. The inclusion of positive and negative controls in a CRA can ensure the accuracy and reliability of the results. The National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC) has produced a panel of lyophilized antibody controls intended for use in various CRA platforms to harmonize results across various laboratories and assay methods. A set of three different positive control antibodies include anti-CD52, anti-CD3, and anti-CD28 superagonist (SA), which are known to induce dose-dependent CRS in patients. Each antibody is provided with an isotype-matched negative control antibody. This panel of reference reagents has previously been shown to have good inter-lab reproducibility and are suitable controls to increase the confidence and robustness of safety data from a variety of CRA platforms.

The use of cytokine release assay reference reagents allows for more reproducible and standardized in vitro safety profiles of immunotherapeutic monoclonal antibodies. Here we describe how cytokine release assays can be used alongside a reference reagent panel to predict the safety of some therapeutic monoclonal antibodies.

New immunostimulatory antibody drugs designed to either directly stimulate specific immune cells or indirectly enhance the immune response by blocking or ...

<meta charset="utf8"></head><body>シングルセルサイトカイン分泌解析のためのマイクロ流体液滴アッセイ

Microfluidic Approach to Resolve Simultaneous and Sequential Cytokine Secretion of Individual Polyfunctional Cells

Infections, autoimmune diseases, desired and adverse immunological responses to treatment can lead to a complex and dynamic cytokine response in vivo. This response involves numerous immune cells secreting various cytokines to orchestrate the immune reaction. However, the secretion dynamics, amounts, and co-occurrence of the different cytokines by various cell subtypes remain poorly understood due to a lack of appropriate tools to study them. Here, we describe a protocol using a microfluidic droplet platform that allows the time-resolved quantitative measurement of secretion dynamics for several cytokines in parallel on the single-cell level. This is enabled by the encapsulation of individual cells into microfluidic droplets together with a multiplexed immunoassay for parallel quantification of cytokine concentrations, their immobilization for dynamic fluorescent imaging, and the analysis of the respective images to derive secreted quantities and dynamics. The protocol describes the preparation of functionalized magnetic nanoparticles, calibration experiments, cell preparation, and the encapsulation of the cells and nanoparticles into droplets for fluorescent imaging and subsequent image and data analysis using the example of lipopolysaccharide-stimulated human peripheral blood mononuclear cells. The presented platform identified distinct cytokine secretion behavior for single and co-secreting cells, characterizing the expected phenotypic heterogeneity in the measured cell sample. Furthermore, the modular nature of the assay allows its adaptation and application to study a variety of proteins, cytokines, and cell samples, potentially leading to a deeper understanding of the interplay between different immune cell types and the role of the different cytokines secreted dynamically to shape the tightly regulated immune response. These new insights could be particularly interesting in the studies of immune dysregulations or in identifying target populations in therapy and drug development.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:免疫応答における多機能性と不均一性の解明

The protocol describes an advanced microfluidic platform to quantitatively measure cytokine secretion dynamics of individual human peripheral blood mononuclear cells. The platform measures up to three cytokines in parallel (IL-6, TNF&#945;, and IL-1&#946;) for each individual cell stimulated with lipopolysaccharide as an example.

個々の多機能細胞の同時および逐次サイトカイン分泌を解明するためのマイクロ流体アプローチ 

Infections, autoimmune diseases, desired and adverse immunological responses to treatment can lead to a complex and dynamic cytokine response in vivo. ...

<meta charset="utf8"></head><body>真菌およびウイルス免疫の分析に最適化された全血イムノアッセイ

Whole Blood Assay with Dual Co-Stimulation for Antigen-Specific Analysis of Host Immunity to Fungal and Viral Pathogens

Rapid and resource-efficient sample processing, high throughput, and high robustness are critical for effective scientific and clinical application of advanced antigen-specific immunoassays. Traditionally, such immunoassays, especially antigen-specific T-cell analysis by flow cytometry or enzyme-linked immunosorbent spot assays, often rely on the isolation of peripheral blood mononuclear cells. This process is time-consuming, subject to many pre-analytic confounders, and requires large blood volumes. Whole blood-based assays provide a facile alternative with increased pre-analytic robustness and lower blood volume requirements. Furthermore, whole blood-based assays allow for the preservation of inter-cellular interactions that are not captured by assays using isolated cell subsets. Recently, a refined whole blood immunoassay with dual anti-CD28 and anti-CD49d co-stimulation for comprehensive analysis of both antigen-specific T-cell functions and complex intercellular interactions in response to various fungal and viral antigens has been proposed. This protocol provides guidance for the preparation of stimulation tubes, blood stimulation, and downstream sample processing for flow cytometry, cytokine secretion assays, and transcriptional analyses. This includes a validated and functionally equivalent, previously unpublished, low-volume protocol (250 &#181;L) to make flow cytometric and cytokine-based T-cell monitoring more accessible for studies in pediatric patients or preclinical studies in small animals (e.g., mice). Altogether, these protocols provide a versatile toolbox for complex antigen-specific immune analysis in both clinical and translational research settings.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:全血アッセイを使用した救命救急患者における免疫モニタリングの進歩

Whole blood-based immunoassays provide a facile and resource-efficient tool to analyze antigen-specific immunity for diagnostic and research purposes. This article provides an optimized whole blood-based protocol with dual co-stimulation for comprehensive analysis of host immunity to fungal and viral pathogens, including a low-volume version for pediatric patients and small animals.

真菌およびウイルス性病原体に対する宿主免疫の抗原特異的解析のための二重共刺激による全血アッセイ

Rapid and resource-efficient sample processing, high throughput, and high robustness are critical for effective scientific and clinical application of ...

フローサイトメトリーによる免疫プラットフォームを使用して刺激マウス脾細胞のサイトカインがプロファイリングを多重化します。

要約

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生存マウスIL - 17分泌T細胞の検出と分離

小分子のハイスループットスクリーニングのための適切な蛍光ベースのリンパ球アッセイ

ビーズベースの涙サイトカイン解析マルチプレックスアッセイ

イムノフェノタイプと大量のフローサイトメトリーによる末梢血中のサイトカイン産生の単一細胞解析

Using Reference Reagents to Confirm Robustness of Cytokine Release Assays for the Prediction of Monoclonal Antibody Safety

個々の多機能細胞の同時および逐次サイトカイン分泌を解明するためのマイクロ流体アプローチ

個々の多機能細胞の同時および逐次サイトカイン分泌を解明するためのマイクロ流体アプローチ

個々の多機能細胞の同時および逐次サイトカイン分泌を解明するためのマイクロ流体アプローチ

真菌およびウイルス性病原体に対する宿主免疫の抗原特異的解析のための二重共刺激による全血アッセイ

真菌およびウイルス性病原体に対する宿主免疫の抗原特異的解析のための二重共刺激による全血アッセイ

フローサイトメトリーによる免疫プラットフォームを使用して刺激マウス脾細胞のサイトカインがプロファイリングを多重化します。

要約

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生存マウスIL - 17分泌T細胞の検出と分離

小分子のハイスループットスクリーニングのための適切な蛍光ベースのリンパ球アッセイ

ビーズ ベースの涙サイトカイン解析マルチプレックス アッセイ

イムノフェノ タイプと大量のフローサイトメトリーによる末梢血中のサイトカイン産生の単一細胞解析

Using Reference Reagents to Confirm Robustness of Cytokine Release Assays for the Prediction of Monoclonal Antibody Safety

個々の多機能細胞の同時および逐次サイトカイン分泌を解明するためのマイクロ流体アプローチ

個々の多機能細胞の同時および逐次サイトカイン分泌を解明するためのマイクロ流体アプローチ

個々の多機能細胞の同時および逐次サイトカイン分泌を解明するためのマイクロ流体アプローチ

真菌およびウイルス性病原体に対する宿主免疫の抗原特異的解析のための二重共刺激による全血アッセイ

真菌およびウイルス性病原体に対する宿主免疫の抗原特異的解析のための二重共刺激による全血アッセイ

ビーズベースの涙サイトカイン解析マルチプレックスアッセイ

イムノフェノタイプと大量のフローサイトメトリーによる末梢血中のサイトカイン産生の単一細胞解析