Name: detection and isolation of viable mouse il-17-secreting t cells
Uploaded: 2008-12-18T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection and Isolation of Viable Mouse IL-17-Secreting T Cells at JoVE.com

試薬の準備<ol><li> BSAを含むPBS（0.5％）、および2mM EDTAを含むバッファーを加えます。気泡は、MACS分離カラムをブロックすることができるため、バッファーは2〜8℃使用前に脱気し、格納する必要があります。 </li><li>我々は、5％のマウス血清を含むRPMI 1640培地を使用してください。培地は、これらの化合物が細胞刺激の特異性を変えてしまうように、BSAまたはFCSを含めてはいけません。 </li><li>マウスIL - 17 Secretion Assayは - ミルテニーバイオテク-から細胞分離キット。 IL - 17キャッチ試薬、IL - 17検出抗体（ビオチン）、抗ビオチン- PE、およびAnti - PE MicroBeadsは：キットには、次のコンポーネントが含まれています。 </li></ol>脾細胞を刺激する<ol><li>このプロトコルは、このような非刺激脾細胞とT細胞のための対比として、陰性と陽性対照の存在下で行われる。このプロトコルは、無菌操作を用いて行われる。 </li><li> gentleMACS™のDissociatorを用いて分離されたマウスの脾細胞の単一の細胞懸濁液を準備します。細胞の濃度は、細胞計数を介して所定の必要があります。室温で10分間、200 × gでペレットは、細胞。 </li><li>遠心分離に続いて、ピペットを用いてペレットから上清を吸引除去する。ペレットの損失を避けるためにチューブをデカントしてください。 </li><li>今、培地中の細胞を再懸濁し、その後ウェルに加える。 mLのごとに10万セルと平方センチメートルあたり5万個の細胞の濃度に対して十分なメディアを追加。 </li><li>私たちの再懸濁した細胞の免疫応答を刺激するために、我々は、サンプルにイオノマイシン（1μg/ mLの）とPMA（10 ng / mL）を加え、穏やかにピペッティングして混合液を。その後、井戸はそれに応じてラベルが付いています。 </li><li>今、我々は37℃で3時間、私たちの細胞をインキュベートする予定° C刺激期間を開始するためにないミキシングを持つ。刺激の開始からのIL - 17の分析3時間に進みますので、それに応じて計画しています。 </li><li>分泌を停止するには、細胞を氷の上に置き、我々は静かに冷緩衝液をピペッティングによって刺激された細胞を収集している。次いで、細胞をウェルからのチューブに移していると二回目を洗浄しています。 </li><li>すべてのセルが収集されることを保証するために、それは顕微鏡下でお皿をチェックすることをお勧めします。細胞がまだ接続されている残っている場合には、冷緩衝液で皿を洗浄することにより、残りの細胞を収集することができます。あなたの細胞懸濁液内の任意のセルの塊は、事前に分離フィルタを使用して削除できます。 </li></ol>キャッチ試薬で細胞をラベリング<ol><li>それは、IL - 17分泌細胞の2％未満が存在する場合、このアッセイは最適に動作することを、注意することは重要です。 </li><li> IL - 17分泌細胞の濃度はそれに応じてボリュームを調整する2％を超えると予想される場合。 <img src="/files/ftp_upload/old/1037_2008_12_8_6/figure8.png" alt="図8" width="500" height="162" /></li><li>この手順の1つの潜在的な落とし穴は、それによって偽陽性を生成する、隣接するリンパ球から分泌される。二重特異性抗体は、非分泌性T細胞とトラップに結合するIL - 17を標識する際に発生する可能性がキャッチ試薬のクロスコンタミネーション、です。 </li><li>この問題を回避するためには、それはダウン前の冷緩衝液でラベリングや仕事へのIL - 17の拡散を遅くし、このクロスコンタミネーションを避けるために、細胞を冷却することが重要です。細胞は冷たい保つことに加え、それらは定義されている濃度に保たれている必要があります。 </li><li>ラベリングの手順を開始するには、我々は、15ミリリットル閉鎖可能なチューブに10万セルを使用してください。高い細胞数を使用するがある場合は、単にそれに応じてすべてのボリュームをスケールアップ。最適な細胞濃度が取得された後、冷緩衝液10mlを添加することにより細胞を洗浄。 </li><li>冷却遠心機（2〜8℃）で10分間、300 × gで細胞をスピンダウン。 </li><li>遠心分離に続いて、完全にピペットを用いて上清を吸引除去する。これは、セルの損失や不正確なボリュームにつながるとして、上清をデカントしてください。コー​​ルドバッファ、遠心分離、そして吸引10mlのを追加することで構成され、洗浄ステップを繰り返します。 </li><li>今我々は、所望の純度のペレットを持っていることを、冷たい培地80μLに細胞を懸濁します。それらにラベルを付けるには、我々は今マウスIL - 17キャッチ試薬20μLを追加します。 </li><li>氷上で5分間細胞をインキュベート。 </li><li>氷上で5分間のインキュベーション期間の後、チューブを取り外し、37℃の暖かい培地10 mlに細胞を希釈する。その後MACSmixチューブローテーター上にチューブを固定し、37チューブをインキュベート° Cを連続的に動きの下で45分間。温度を37増加させると、° Cは、サイトカインの分泌を再起動します。 </li></ol> IL - 17検出抗体（ビオチン）とAnti - Biotin - PEと細胞のラベリング<ol><li> 37℃で45分間の分泌期間の後、氷上ですぐにチューブを置きます。これは、サイトカインの分泌を停止します。ここからその上に氷の上で細胞を維持することが重要です。コー​​ルドバッファを操作するキャッチ試薬のクロスコンタミネーションを避けることができます。 </li><li> 2〜8℃で300xgで冷緩衝液および遠心機でチューブを埋める℃で10分間。完全に上清を吸引除去する。洗浄工程の1つのより多くの時間を繰り返します。 </li><li>細胞ペレットを冷緩衝液80μLに再懸濁され、チューブを氷上に配置されます。 </li><li>抗体の非特異的な結合を避けるために、我々は、5分間氷上で10μlをのFcRブロッキング試薬とインキュベートの追加をお勧めします。その後、我々は、氷上で10分間、ビオチンとインキュベートする共役であるマウスIL - 17検出抗体（ビオチン）の20μLを加える。 </li><li>我々は2〜8℃で300xgでコールドバッファと遠心10mLを加えることによって前に行っているので、再度、細胞を洗浄℃で10分間。 </li><li>今すぐ上清を吸引し、冷バッファー80μlで細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>私たちの二次抗体、抗ビオチン- PEの20μLを追加。 </li><li>細胞および二次抗体溶液を混合し、再び氷上で10分間チューブをインキュベートする。 </li><li>この2回目のインキュベーションが完了したら、10 mLの冷緩衝液および遠心で細胞を洗浄する。 </li><li>ペレットは現在、冷緩衝液500μlで再懸することができます。 </li><li>細胞はさらに下流の分析のために分離する必要がある場合、それらは磁気抗PE - MicroBeadsで標識し、MACSカラムとMACSのセパレーターを使用して手動または自動分離することができます。 </li><li>我々は現在、脾細胞のラベリングを完了し、分析のために準備が整いました。 </li></ol> FACS解析<ol><li>我々の分析では、フローサイトメトリーにより刺激と刺激脾細胞を比較します。 </li><li>フローサイトメトリー分析の前に、細胞が死細胞外ゲートに0.5μg/ mlで、ヨウ化プロピジウムで染色されています。 MACSQuant™アナライザーは、サンプルごとに20万セルにロードされており、我々は現在、サンプル中の相対的な抗体の反応性の散布図を見に行くされています。希少細胞の解析のための2つの重要な考慮事項 - IL - 17陽性細胞のような - フローサイトメトリーでは、次のとおりです。 <ul><li>前方散乱対側の散布図でリンパ球にゲートを設定</li><li>と死細胞（ヨウ化プロピジウムで染色）およびB -細胞（非特異的バックグラウンド染色を引き起こす可能性があります）をゲーティングは、さらに検出感度を高めるために</li></ul></li><li>我々はT細胞とB細胞を検出するためにCD45R/B220-PerCP抗体を検出するためにCD4 - APC抗体を使用。我々は、試料の前方および側方散乱の特性を参照してくださいとリンパ球集団にゲートを適用します。 </li><li>秒のゲートは、染色した死細胞と染色したB細胞（Y軸）を参照に適用した。これらの細胞は、T細胞の解析から除外されます。 </li><li>約0.003％（図4） - この例では、基本的に私たちのネガティブコントロールである、我々は非常に少数のIL - 17刺激を受けていない試料の分泌CD4陽性T細胞があることがわかります。 0.367％程度（図5A）分離前とMACS技術（図5B）と磁気分離後の60.76パーセント - 刺激T細胞集団を見ると、我々はその分泌IL - 17 CD4陽性T細胞のかなりの数を見ることができます。 </li></ol>

すべてのプロトコルとデータシートはwww.miltenyibiotec.comでご利用いただけます。 警告 試薬はアジ化ナトリウムが含まれています。酸性条件下でアジ化ナトリウムは極めて毒性がアジ化水素酸を、もたらします。アジド化合物は、廃棄する前に流水で希釈してください。これらの予防措置は、爆発の危険が生じる可能性のある配管内の付着物を避けることをお勧めします。

Th17細胞は適応免疫と炎症反応において重要な役割を果たし、自己免疫炎症を推進する上で重要なコンポーネントです。 細胞分離キット（PE） - 国内でのみ有効のマウスIL - 17 Secretion Assayは使用方法をこのビデオドキュメント。この手順を行うときには、出発細胞調製物におけるIL - 17分泌細胞の頻度の推定をすることが重要です。ラベリングおよびサイトカイン分泌の期間中に適切な細胞濃度は懸濁状態で他の細胞によるクロスコンタミネーションを防ぎ、信頼性の高い結果を保証します。

<table><tbody><tr><td>Mouse IL-17 Secretion Assay Cell Enrichment and Detection Kit (PE) </td><td>Reagent</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-213</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_98_1005_Mouse_IL_17_Secretion_Assay_Cell_Enrichment_and_Detection_Kit.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_98_1005_Mouse_IL_17_Secretion_Assay_Cell_Enrichment_and_Detection_Kit.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Medium</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-440</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_243_293_RPMI_1640.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_243_293_RPMI_1640.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD4-APC</td><td>Reagent</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-611</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_327_CD4.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_327_CD4.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD8a-FITC</td><td>Reagent</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-605</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Propidium Iodide Solution</td><td>Reagent</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-233</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>FcR Blocking reagent, mouse </td><td>Reagent</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_601_435_FcR_Blocking_Reagent_mouse_.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_601_435_FcR_Blocking_Reagent_mouse_.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Dead Cell Removal Kit </td><td>Reagent</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>MACSmix Tube Rotator</td><td>Instrument</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>gentleMACS&amp;#8482; Dissociator</td><td>Instrument</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>autoMACS Pro Starting Kit</td><td>Instrument</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_651_679_autoMACS_Pro_Starting_Kit.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_651_679_autoMACS_Pro_Starting_Kit.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MACS Columns</td><td>Tool</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MACS Separator</td><td>Tool</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detection and isolation of viable mouse il-17-secreting t cells

MACSサイトカイン分泌アッセイ技術は、単一細胞レベルと実行可能なサイトカイン分泌細胞の高感度分離に分泌されたサイトカインを検出することができます。 IL - 17分泌細胞を標識するためには、マウス脾細胞の単一細胞の懸濁液を37に調製し、刺激°回転PMA /イオノマイシンとCは、サイトカイン分泌を誘導する。停止するには分泌細胞は、氷の上に配置され、IL - 17キャッチ試薬には、細胞表面の近くに分泌され、捕捉されたとして、白血球の細胞表面上のCD45に特異的に結合し、IL - 17に二重特異性抗体を公開されています。分泌は、その後、温度を37増加させることによって再起動され° CとIL - 17がキャッチ試薬によってトラップされる。分泌は、その後、氷上で細胞を配置することにより、再び停止されます。トラップされたIL - 17を検出するために、細胞はビオチンに結合した第二のIL - 17特異的抗体とAnti - Biotin - PE抗体とインキュベートされています。セルが、直接、フローサイトメトリーによって分析またはAnti - PEコンジュゲートマイクロビーズと、その後の標識によって分離と濃縮のために調製することができる。

Watch this Scientific Journal Video about Detection and Isolation of Viable Mouse IL-17-Secreting T Cells at JoVE.com

Detection and Isolation of Viable Mouse IL-17-Secreting T Cells

この手順では、刺激により活発に分泌するIL - 17マウスTh17細胞の白血球の検出と分離を説明します。

生存マウスIL - 17分泌T細胞の検出と分離

The MACS Cytokine Secretion Assay technology allows detection of secreted cytokines on the single cell level and sensitive isolation of viable ...

<a class="grey_button" href="/video/1044">
ChineseVersion
</a>


<a class="grey_button" href="/video/1233">
JapaneseVersion
</a>

detection-and-isolation-of-viable-mouse-il-17-secreting-t-cells

Research

JoVE Journal

Biology

11.2K ビュー.  Miltenyi Biotec,GmbH.  ChineseVersion JapaneseVersion 

ビデオ: Detection and Isolation of Viable Mouse IL-17-Secreting T Cells

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

離とナイーブCD4 Tリンパ球のTh17分化

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

免疫・感染学

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH isotypes, such as IgA, IgE and IgG. Measurement of IgH CSR in vitro is a key method for the study of a number of biologic processes ranging from DNA recombination and repair to aspects of molecular and cellular immunology. In vitro CSR assay involves the flow cytometric measurement surface Ig expression on activated B cells. While measurement of IgA and IgG subclasses is straightforward, measurement of IgE by this method is problematic due to soluble IgE binding to Fc&#949;RII/CD23 expressed on the surface of activated B cells. Here we describe a unique procedure for accurate measurement of IgE-producing mouse B cells that have undergone CSR in culture. The method is based on trypsin-mediated cleavage of IgE-CD23 complexes on cell surfaces, allowing for detection of IgE-producing B lineage cells by cytoplasmic staining. This procedure offers a convenient solution for flow cytometric analysis of CSR to IgE.

In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.

真のIgE発現するマウスB系統細胞の検出

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

マウスの樹状細胞サブセットの単離のための効率的かつ高収率方法

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance and homeostasis maintenance by regulating the immune response. The primary role of Treg cells is to suppress the proliferation of effector T (Teff) cells and the production of cytokines such as IFN-&#947;, TNF-&#945;, and IL-2. It has been demonstrated that Treg cells&#39; ability to inhibit the function of Teff cells is enhanced during persistent pathogen infection and cancer development. To clarify the function of Treg cells under resting or inflamed conditions, a variety of in vitro suppression assays using mouse or human Treg cells have been devised. The main aim of this study is to develop a method to compare the differences in phenotype and suppressive function between resting and activated Treg cells. To isolate activated Treg cells, mice were infected with lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) clone 13 (CL13), a chronic strain of LCMV. Treg cells isolated from the spleen of LCMV CL13-infected mice exhibited both the activated phenotype and enhanced suppressive activity compared with resting Treg cells isolated from na&#239;ve mice. Here, we describe the basic protocol for ex vivo phenotype analysis to distinguish activated Treg cells from resting Treg cells. Furthermore, we describe a protocol for the measurement of the suppressive activity of fully activated Treg cells.

Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from na&#239;ve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.

表現型および慢性リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスに感染したマウスから単離された活性化制御性T細胞の機能解析

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new transgenic reporter mouse model. We chose to visualize interleukin (IL) 22 gene expression because this cytokine has important activities in the intestine, where it contributes to repair tissues damaged by inflammation. Reporter systems offer considerable advantages over other methods of identifying products in vivo. In the case of IL-22, other studies had first isolated cells from tissues and then re-stimulated the cells in vitro. IL-22, which is normally secreted, was trapped inside cells using a drug, and intracellular staining was used to visualize it. This method identifies cells capable of producing IL-22, but it does not determine whether they were doing so in vivo. The reporter design includes inserting a gene for a fluorescent protein (tdTomato) into the IL-22 gene in such a way that the fluorescent protein cannot be secreted and therefore remains trapped inside the producing cells in vivo. Fluorescent producers can then be visualized in tissue sections or by ex vivo analysis through flow cytometry. The actual construction process for the reporter included recombineering a bacterial artificial chromosome that contained the IL-22 gene. This engineered chromosome was then introduced into the mouse genome. Homeostatic IL-22 reporter expression was observed in different mouse tissues, including the spleen, thymus, lymph nodes, Peyer&#39;s patch, and intestine, by flow cytometry analysis. Colitis was induced by T-cell (CD4+CD45RBhigh) transfer, and reporter expression was visualized. Positive T cells were first present in the mesenteric lymph nodes, and then they accumulated inside the lamina propria of the distal small intestine and colon tissues. The strategy using BACs gave good-fidelity reporter expression compared to IL-22 expression, and it is simpler than knock-in procedures.

We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.

レポーターマウスを用いたIL-22を発現するリンパ球の可視化

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of cytokines is their pleiotropism, as they are produced by and can affect a multitude of cell types. As such, it is important to understand not only which cells are producing cytokines, but also in which environment they do so, in order to define more specific therapeutics. Here, we describe a method to visualize cytokine production in situ following bacterial infection. This technique relies on imaging cytokine-producing cells in their native environment by confocal microscopy. To do so, tissue sections are stained for markers of multiple cell types together with a cytokine stain. Key to this method, cytokine secretion is blocked directly in vivo before harvesting the tissue of interest, allowing for detection of the cytokine that accumulated inside the producing cells. The advantages of this method are multiple. First, the microenvironment in which cytokines are produced is preserved, which could ultimately inform on the signals required for cytokine production and the cells affected by those cytokines. In addition, this method gives an indication of the location of the cytokine production in vivo, as it does not rely on artificial in vitro re-stimulation of the producing cells. However, it is not possible to simultaneously analyze cytokine downstream signaling in cells that receive the cytokine. Similarly, the cytokine signals observed correspond&#160;only to the time-window during which cytokine secretion was blocked. While we describe the visualization of the cytokine Interferon (IFN) gamma in the spleen following mouse infection by the intracellular bacteria Listeria monocytogenes, this method could potentially be adapted to the visualization of any cytokine in most organs.

Imaging of In Situ Interferon Gamma Production in the Mouse Spleen following Listeria monocytogenes Infection

Here, we describe a simple confocal imaging method to visualize the in situ localization of cells secreting the cytokine Interferon gamma in murine secondary lymphoid organs. This protocol can be extended for the visualization of other cytokines in diverse tissues.

リステリア単球遺伝子感染症後のマウス脾臓におけるインシチュインターフェロンガンマ産生のイメージング

Cytokines are small proteins secreted by cells, mediating cell-cell communications that are crucial for effective immune responses. One characteristic of ...

Isolation of Group 2 Innate Lymphoid Cells from Mouse Nasal Mucosa to Detect the Expression of CD226

With abundant research on group 2 innate lymphoid cells (ILC2s) published over the years, ILC2s are widely known to be implicated in regulating various pathological processes, including anti-helminth immunity, tissue repair, thermogenesis, and autoimmune diseases such as asthma and allergic rhinitis (AR). ILC2s permanently reside in peripheral tissues such as the skin, gut, lungs, and nasal cavity; however, there is limited information about their exact functions in nasal mucosal immunity. CD226 is an activating costimulatory molecule, mainly expressed on natural killer (NK) cells, T cells, and inflammatory monocytes. However, whether ILC2s express CD226 or play a role in the pathogenesis of ILC2s-related diseases remains unknown. Here, we established a method to isolate and identify ILC2s from the nasal mucosa and detected CD226 expression on ILC2s obtained from healthy and AR mice. Herein, we describe this protocol for the isolation and identification of ILC2s from mouse nasal mucosa, which will help explore the internal pathological mechanism of immunological disorders in nasal mucosal diseases.

Group 2 innate lymphoid cells (ILC2s), implicated in type 2 inflammation, mainly participate in response to helminth infection, allergic diseases, metabolic homeostasis, and tissue repair. In this study, a procedure to isolate ILC2s from murine nasal mucosa and detect the expression of CD226 is demonstrated.

CD226の発現を検出するためのマウス鼻粘膜からのグループ2自然リンパ系細胞の単離

With abundant research on group 2 innate lymphoid cells (ILC2s) published over the years, ILC2s are widely known to be implicated in regulating various ...

急性LCMV感染における早期濾胞性ヘルパーT細胞コミットメントの解読

Accessing Early Differentiation of Virus-Specific Follicular Helper CD4+ T Cell in Acute LCMV-Infected Mice

Follicular Helper T (TFH) cells are perceived as an independent CD4+ T cell lineage that assists cognate B cells in producing high-affinity antibodies, thus establishing long-term humoral immunity. During acute viral infection, the fate commitment of virus-specific TFH cells is determined in the early infection phase, and investigations of the early-differentiated TFH cells are crucial in understanding T cell-dependent humoral immunity and optimizing vaccine design. In the study, using a mouse model of acute lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) infection and the TCR-transgenic SMARTA (SM) mouse with CD4+ T cells specifically recognizing LCMV glycoprotein epitope I-AbGP66-77, we described procedures to access the early fate commitment of virus-specific TFH cells based on flow cytometry stainings. Furthermore, by exploiting retroviral transduction of SM CD4+ T cells, methods to manipulate gene expression in early-differentiated virus-specific TFH cells are also provided. Hence, these methods will help in studies exploring the mechanism(s) underlying the early commitment of virus-specific TFH cells.

著者スポットライト:急性LCMVの課題におけるTFH細胞分化の経路の解明

The current study showcases protocols for assessing the early fate commitment of virus-specific TFH cells and manipulating gene expression in these cells.

急性LCMV感染マウスにおけるウイルス特異的濾胞性ヘルパーCD4+ T細胞の早期分化へのアクセス

Follicular Helper T (TFH) cells are perceived as an independent CD4+ T cell lineage that assists cognate B cells in producing high-affinity antibodies, ...

生存マウスIL - 17分泌T細胞の検出と分離

文字起こし

要約

さらに動画を探す

この動画の章

離とナイーブCD4 Tリンパ球のTh17分化

真のIgE発現するマウスB系統細胞の検出

マウスの樹状細胞サブセットの単離のための効率的かつ高収率方法

表現型および慢性リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスに感染したマウスから単離された活性化制御性T細胞の機能解析

レポーターマウスを用いたIL-22を発現するリンパ球の可視化

リステリア単球遺伝子感染症後のマウス脾臓におけるインシチュインターフェロンガンマ産生のイメージング

CD226の発現を検出するためのマウス鼻粘膜からのグループ2自然リンパ系細胞の単離

急性LCMV感染マウスにおけるウイルス特異的濾胞性ヘルパーCD4⁺ T細胞の早期分化へのアクセス

急性LCMV感染マウスにおけるウイルス特異的濾胞性ヘルパーCD4⁺ T細胞の早期分化へのアクセス

急性LCMV感染マウスにおけるウイルス特異的濾胞性ヘルパーCD4⁺ T細胞の早期分化へのアクセス