Name: highly sensitive assay for measurement of arenavirus-cell attachment
Uploaded: 2016-03-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment at JoVE.com

我々は、助成金T32 AI055402（JK）、R21 AI088059（JB）、およびP20RR021905（JB）を介してこれらの研究をサポートするために役立つ議論や国立衛生研究所のためにマルクス・ターリー、ネイサンロイ、クリストファー・ツィーグラー、エミリーブルース、とベンジャミン王に感謝します。

注：記載されているプロトコルは、（前のPCR実験室とどのように良いプレPCR法を用いた実験を行うための設定方法についての優れた概要については28を参照のこと ）、厳格な事前-PCR法を用いて行うことが重要です。すべての試薬および装置は定量PCR標的配列を含む増幅されたDNAを含まないと、適切なコントロールは、このような汚染を検出するための場所にあることが肝要です。プロトコルの概要を図1に示されています。 1. 48ウェルプレート中のメディアや種子細胞を準備します<ol><li> 50 mlで添加することにより、10％ウシ胎児血清、1％ペニシリン - ストレプトマイシン、1％HEPES（N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N-2-エタンスルホン酸）を含有する完全ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を500mlの緩衝液を調製熱不活性化ウシ胎児血清、5mlのDMEM 500mlのボトルに100Xペニシリン - ストレプトマイシンおよび100X HEPES緩衝液の各々の。この試薬は4℃で保存することができます76;ヶ月間C。 </li><li>完全DMEM500μlの最終体積で48ウェル組織培養プレート中のウェル当たりの種子2.5×10 4のVero E6細胞。 10〜18時間、5％CO 2を含む加湿インキュベーター中、37℃でプレートをインキュベートします。 <ol><li>終業時にプレートをシード。いずれかの複製または三連のウェル中の各ウイルスのサンプルをテストします。 注：このアッセイのために48ウェルベースの​​プラットフォームが記載されているが、96または384ウェルプレート中でダウン使用するためのアッセイをスケーリングすることが可能であるべきです。 </li></ol></li></ol> 2.ウイルスの細胞アタッチメントを行います注：このプロトコルで使用されるウイルス、JUNV株率直＃1（C＃1）は、成功しJUNV病29の予防のための弱毒生ワクチンとして使用されてきました。 JUNV C＃1は、in vivoおよびin vitroの両方でシリアル通路を通って病原性JUNV株XJに由来し、12個のアミノ酸30による親XJ株と異なりました。 Becaus＃1は、バイオセーフティーレベル（BSL）-2-定格病原体である電子JUNV Cは、このセクションの説明作業は、適切なBSL-2プラクティス31を使用して行わなければなりません。これは、個人用保護具（ 例えば眼の保護、白衣、二重手袋）、クラスIIバイオセーフティキャビネットの使用を含む、すべての職員が制度的訓練と安全にこの生物を処理するために必要な承認を受けていることを保証します。 <ol><li>希望のPFUにテストされるJUNV C＃1のサンプル（複数可）を希釈するか、氷冷完全DMEMに形成単位を集中し、各ウェルに追加する直前まで、氷上で保存します。 注：完全DMEMで希釈したウイルスとの結合試験を実施する代わりに、低血清濃度（2％）、血清がウイルスの添付ファイルとの干渉を引き起こす可能性があるかどうかを確立するために、適切な緩衝液を用いてPBSを含む最小培地を使用しています。代替ウイルスの同様の添付ファイルプロトコルはbicarboないRPMI 1640培地を使用することを報告しています0.2％ウシ血清アルブミン、10mMの（2-（モルホリノ）エタンスルホン酸）、および10mM HEPES、pH6.8の32を含むネイト。この結合のメディアは、メディアがインキュベーターのCO 2 -environmentから削除されたときに発生する可能性のpHの変化を防ぐために優れていることがあります。 <ol><li>非生産添付イベントを制限するために、200から2000までの範囲のPFUでウェルを接種します。 図2に示すように、このアッセイは、わずか20 PFU（又は多くの6×10 2 PFUなど）を使用して添付ファイルを検出することができます。 </li><li>細胞に接種するためのウイルスのマスターミックスを作成します。各ウイルスサンプルは、ウェルあたり50μlの容量で二連のウェルに接種されます。したがって、ウェルあたりのウイルス2000のPFUの添加が望まれる場合には、氷の120μlの総容積に4800のPFUを希釈DMEMを完了コールド。 <ol><li>アッセイの特異性を制御するために、いずれかTfR1（TRVb）またはEXPを発現しないチャイニーズハムスター卵巣細胞株のペアを使用しRESS hTfR1（TRVb-1）これらの細胞にJUNVの添付ファイルとしてはどちらか減少かどうか、それぞれ13,33れるべきです。また、アレナウイルス添付ファイル34またはエントリ35を防止するために、このようなプロテイナーゼKなどのプロテアーゼで細胞を処理します。可溶性hTfR1またはhTfR1に特異的でありするモノクローナル抗体のch128.1は、また、それらが細胞13,36へJUNVの侵入を阻止することが知られているとみなすことができます。さらに、遊離マンノース14またはJUNV特異的中和抗体37を有する粒子のインキュベーションによる細胞の前処理は、ウイルス侵入を阻害することができます。 </li><li>しかし、これらの後者の試薬とアプローチすることを、JUNVエントリを遮断するにもかかわらず、これは可能性の高い説明であるが、添付ファイルをブロックすることが確認されていないのでご注意ください。ここで説明するプロトコルは、形式的に、これらの様々なアプローチの衝撃ビリオン付着するかどうかを決定するために使用することができます。 </li></ol></li></ol></li><li> 37℃のインキュベーターからプレートを取り外し、4℃の冷蔵庫中またはエンドサイトーシスを行うためにプレートされた細胞の能力を阻害するために15分間氷上に置きどちら。 </li><li>次に、各ウェルから完全DMEMを吸引し、急速に氷冷PBS（リン酸緩衝生理食塩水）pH7.4の100μlのを使用して二回各ウェルを洗浄します。その後、適切なウェルに（ステップ2.1で調製した）前希釈したウイルスサンプルの50μlを添加します。 </li><li>プラスチックラップでプレートを包み、すぐにウイルス添付ファイルが発生することを可能にするために1.5時間に1のために戻って氷の上または4℃の冷蔵庫内にどちらかに配置します。このステップを通して4℃で冷緩衝液を洗浄、プレートを維持し、ウイルスサンプル。 </li><li> 4℃でのインキュベーションの終了後、ウイル​​ス接種物を吸引し、氷冷したPBS200μlで各ウェルを3回洗浄します。 </li></ol> 3.ウイルスRNA抽出<ol><li> JUNVのC＃からウイルスRNAを精製市販のキット（ 例えば 、RNeasyミニキット）を用いて、単層に付着した1粒子アコー製造業者のプロトコルに鼎。具体的には、以下のとおり変更とのRNeasy Miniプロトコール（ 第 4版、2006年4月）内のページ23-28の「スピン技術のプロトコルを用いて動物細胞からの全RNAの精製」に従ってください。 <ol><li>溶解を各ウェルに直接溶解緩衝液RLT350μlのを追加することにより、ステップ1（b）に指示されるように細胞が。細胞溶解を確実にするために、バッファを数回混合します。細胞は簡単にこのバッファに溶解し、完全な溶解が倒立顕微鏡下で井戸を見ることによって確認することができることに注意してください。 </li><li>キットカラム（ステップ3a）に得られた細胞溶解液を移し、記載されているように、プロトコルの残りの部分に従います。プロトコルの残りのステップは、クラスIIバイオセーフティキャビネットの外で行うことができますので、この時点では、ウイルスは、溶解緩衝液によって中和されたキット管が感染性ウイルスで汚染されていなかった提供。 </li><li> ADDITある製造業者のプロトコルから任意のステップ9を含み、Buffer RPEのキャリーオーバーの可能性を排除するためのスピンカラムのional遠心分離。 </li><li>最後のステップでは、製造業者のプロトコール（ステップ10）は、ヌクレアーゼフリーのddH 2 O30μlのを使用してスピンカラムから精製されたRNAを溶出しますこの時点で-80℃で保存RNAまたは定量RT-PCRアッセイで直接使用します。ヌクレアーゼによって精製されたウイルスRNAサンプルの分解を防止するために、ヌクレアーゼフリーの試薬および機器を使用し、氷上で解凍したRNAサンプルを保ちます。 注：バッファーRLTとRW1はグアニジン塩を含んでいる漂白剤と混合しないでください。 Buffer RW1は、エタノールが含まれています。 </li></ol></li></ol> 4.ウイルスゲノムの定量RT-PCR測定<ol><li>その後の定量PCR用のcDNAにJUNV C＃1 SセグメントRNAを変換するには、総容量50μlでRTに（ステップ3.1.4で生成された）ウイルスRNAを施します。 <ol><li>ヌクレアーゼの6.75μlの：RT反応を設定するには、最初の反応あたり以下の試薬のそれぞれを含むマスターミックスを作成フリーのddH 2 O、SセグメントゲノムRNAのNPの領域に相補的である2075-へRTプライマーS 2098-2μMの株式の5μlの（5&#39;-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3 &#39;）、5μlの10X PCR緩衝液II、25のMgCl 2溶液、RT酵素の1.25μlの（62.5単位）、RNaseインヒビターの1μL（0.4単位）、およびdNTPの500μMのストックの10μlを11μlの。 注：アレナウイルス複製の過程で、4ウイルスSセグメントRNA種が生成されます。完全長ゲノムRNA（vRNAの）、全長アンチゲノムRNA（vcRNA）（つまり、vRNAのの逆相補体である）、および2つのサブゲノムmRNAをそれぞれ、NPおよびGP遺伝子をコードします。ここに記載されているRTプライマーはSセグメントのvRNAはなく、vcRNA、NPのmRNA、またはGPのmRNAに特異的です。 </li><li>ゆっくりRTマスターミックスを混合し、次いで、個々の0.2ミリリットルのPCRチューブに40μlずつ分注し。各チューブにウイルスRNAを10μlを加えます。含めるⅰ）鋳型なしコントロールチューブ（ 例えば 、。ヌクレアーゼフリーのddH 2 O 40にマスターミックスのμL）およびii）無RT酵素制御10μlのを（ 例えば受信しなかったマスターミックスの40μlに知られている陽性ウイルスRNAサンプルの10μlを添加する追加ウイルスの標的配列を含む増幅されたDNAを用いたRT試薬の汚染をスクリーニングするための任意のRT酵素）。細胞RNAの存在下でのアッセイ特異性を制御するための完全なRTマスターミックスと非感染細胞から抽出したRNAを含みます。 </li><li>また、RT試薬の品質を検証するための完全マスターミックスに知られている陽性ウイルスRNAサンプルが含まれます。必要であれば、RT反応の体積は25μlに減少させることができることに留意されたいです。 </li></ol></li><li> 5分間、10分間、30分間、48°C、95°C、25°C以下のサイクリング条件をRT管を施します。サンプルは4℃のステップを追加することで、この時点では、-20℃で保存するか、またはサーモサイクラー中で一晩放置することができることに注意してください。 </li><li> P総量25μlでerform定量PCR。 <ol><li>以下を組み合わせることにより、定量PCRマスターミックスを行います。各の（9μM株式の）2.5μlのフォワードPCRプライマーS1937 +（5&#39;-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3 &#39;）を1958+と1982にPCRプライマーS 2001-を逆にする（5 qPCRプローブS 1960+の「-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3 &#39;）、2μM株式の2.5μlの（）1975+（5&#39;-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3&#39;）、および2Xユニバーサル定量PCRマスター12.5μlのミックス。 JUNV C＃1に特異的である、ここで報告されたフォワードプライマーは、ntの病原性JUNV株ロメロを対象とし、元々報告プライマー配列38から1によって異なることに注意してください。 </li><li>溶液を穏やかに混合し、次いで、各ウェルのqPCRに20μlを添加します。適切な定量PCRウェルに各RT反応の5μlを添加します。試験した各サンプルについて3回定量PCRを実施します。必要に応じてPCR反応容積は、わずか12.5μlに減少させることができることに注意してください。 注：関連付けられているソフトウェア定量PCRマシンは、定量PCRプライマーの標的であるJUNV C＃1 NP遺伝子をコードするプラスミドの標準希釈系列に各未知試料の値とを比較することにより、JUNV C＃1 SセグメントゲノムRNAの絶対的なコピー数を生成しますおよびプローブセット。定量PCRアッセイは、標準曲線の範囲内に入る値の定量化を提供することができます。 5、50、×10 3 5、5×10 5、5×10 7コピーウェルあたり：このため、以下の（三連のウェル中）プラスミドの量が含まれます。 </li></ol></li><li> 1分15秒、60℃で10分間および95℃での40サイクル：95℃サーモサイクラーに定量PCRプレートをロードし、以下の反応条件を実行します。 <ol><li>製造業者のプロトコールに従って、各試料中のウイルスRNAの存在量を決定するためにデータを収集し、分析します。 </li></ol></li><li>定量PCRタールを含むプラスミドの新たに精製されたサンプルを使用して標準曲線を確立するために、シーケンスを取得し、最初にこの溶液中でのプラスミドのコピー数を決定します。 <ol><li>プラスミドの分子量を計算します。プラスミド全体の配列が知られている場合は、以下の式を使用して、これを計算する：MW =（[A * 312.2] + [G * 328.2] + [C * 288.2] + [T * 303.2] - 61.13）。二本鎖プラスミドの各鎖上に見出される特定のヌクレオチドの合計数を含めることを忘れないでください。 </li><li>プラスミドのサイズは知られているが、その正確な配列がない場合、各二本鎖DNAの塩基対は、600のMWを有するという仮定の下でMWを計算します。 注意：ここで使用したpCAGGS-JUNV C＃1 NPプラスミドは、4.2×10 6のMWを持っています。 </li><li>プラスミドのMWが決定されると、1μl当たりどのように多くのコピーを計算ストックプラスミド溶液中に存在します。 </li><li>最初のx 1 6.9その後、プラスミドの69μgのは、300μlの水に含まれている場合は、プラスミド（ 例えばのモル数にこれを変換した後、溶液中でのプラスミドの合計μgのを計算コピー数に変換することができるプラスミド* 1モルの0 -5グラム/プラスミドの4.2×10 6グラム =プラスミドの1.6×10 -11モル）、（ 例えば、プラスミドの1.6×10 -11モル* 6.022×10 23分子/モル= 9.8×10 12分子（またはコピー））。 </li><li> 1μl当たりのコピーを取得するために、その溶液の容積によってプラスミド溶液中のプラスミドの総コピーを分割し（ 例えば 9.8×10 12コピー/300μlの= 3.28×10 10コピー）。 </li><li> 5μlの容積は、標準曲線を確立するために必要なコピー数の範囲を提供するために、PCRプレートにロードすることができるように、適切にこの溶液を希釈します。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Childs, J. C., Peters, C. J., Salvato, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Arenaviridae. , 331-373 (1993).</li><li>Salazar-Bravo, J., Ruedas, L. A., Yates, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+reservoirs+of+arenaviruses.">Mammalian reservoirs of arenaviruses.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 25-63 (2002).</li><li>Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J., Knipe, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+50.">Ch. 50.</a> Fields Virology. 2, 1791-1827 (2007).</li><li>Parodi, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sobre+la+etiologia+del+brote+epidemico+de+Junin+(Nota+previa).">Sobre la etiologia del brote epidemico de Junin (Nota previa).</a> Dia Medico. 30, (1958).</li><li>Frame, J. D., Baldwin, J. M., Gocke, D. J., Troup, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lassa+fever,+a+new+virus+disease+of+man+from+West+Africa.+I.+Clinical+description+and+pathological+findings.">Lassa fever, a new virus disease of man from West Africa. I. Clinical description and pathological findings.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 19, 670-676 (1970).</li><li>Buchmeier, M. J., Zajac, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lymphocytic Choriomenigitis Virus. , (1999).</li><li>Barton, L. L., Mets, M. B., Beauchamp, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocytic+choriomeningitis+virus:+emerging+fetal+teratogen.">Lymphocytic choriomeningitis virus: emerging fetal teratogen.</a> Am. J. Obstet. Gynecol. 187, 1715-1716 (2002).</li><li>Fischer, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+lymphocytic+choriomeningitis+virus+by+organ+transplantation.">Transmission of lymphocytic choriomeningitis virus by organ transplantation.</a> N. Engl. J. Med. 354, 2235-2249 (2006).</li><li>Palacios, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+arenavirus+in+a+cluster+of+fatal+transplant-associated+diseases.">A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases.</a> N. Engl. J. Med. 358, 991-998 (2008).</li><li>Meyer, B. J., de la Torre, J. C., Southern, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arenaviruses:+genomic+RNAs,+transcription,+and+replication.">Arenaviruses: genomic RNAs, transcription, and replication.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 139-157 (2002).</li><li>Meyer, B. J., Southern, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+heterogeneity+in+the+termini+of+lymphocytic+choriomeningitis+virus+genomic+and+antigenomic+RNAs.">Sequence heterogeneity in the termini of lymphocytic choriomeningitis virus genomic and antigenomic RNAs.</a> J. Virol. 68, 7659-7664 (1994).</li><li>Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strand-Specific+Quantitative+Reverse+Transcription-Polymerase+Chain+Reaction+Assay+for+Measurement+of+Arenavirus+Genomic+and+Antigenomic+RNAs.">Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs.</a> PLoS One. 10, e0120043 (2015).</li><li>Radoshitzky, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transferrin+receptor+1+is+a+cellular+receptor+for+New+World+haemorrhagic+fever+arenaviruses.">Transferrin receptor 1 is a cellular receptor for New World haemorrhagic fever arenaviruses.</a> Nature. 446, 92-96 (2007).</li><li>Martinez, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilization+of+human+DC-SIGN+and+L-SIGN+for+entry+and+infection+of+host+cells+by+the+New+World+arenavirus,+Junin+virus.">Utilization of human DC-SIGN and L-SIGN for entry and infection of host cells by the New World arenavirus, Junin virus.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 441, 612-617 (2013).</li><li>Martinez, M. G., Cordo, S. M., Candurra, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Junin+arenavirus+cell+entry.">Characterization of Junin arenavirus cell entry.</a> J. Gen. Virol. 88, 1776-1784 (2007).</li><li>Martinez, M. G., Forlenza, M. B., Candurra, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+cellular+proteins+in+Junin+arenavirus+entry.">Involvement of cellular proteins in Junin arenavirus entry.</a> Biotechnol J. 4, 866-870 (2009).</li><li>Nunberg, J. H., York, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Curious+Case+of+Arenavirus+Entry,+and+Its+Inhibition.">The Curious Case of Arenavirus Entry, and Its Inhibition.</a> Viruses. 4, 83-101 (2012).</li><li>Botten, J., King, B., Klaus, J., Zielger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Viral Hemorrhagic Fevers. , 233-260 (2013).</li><li>Klaus, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intracellular+cargo+receptor+ERGIC-53+is+required+for+the+production+of+infectious+arenavirus,+coronavirus,+and+filovirus+particles.">The intracellular cargo receptor ERGIC-53 is required for the production of infectious arenavirus, coronavirus, and filovirus particles.</a> Cell Host Microbe. 14, 522-534 (2013).</li><li>Rojek, J. M., Perez, M., Kunz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+entry+of+lymphocytic+choriomeningitis+virus.">Cellular entry of lymphocytic choriomeningitis virus.</a> J. Virol. 82, 1505-1517 (2008).</li><li>Lavanya, M., Cuevas, C. D., Thomas, M., Cherry, S., Ross, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA+screen+for+genes+that+affect+Junin+virus+entry+uncovers+voltage-gated+calcium+channels+as+a+therapeutic+target.">siRNA screen for genes that affect Junin virus entry uncovers voltage-gated calcium channels as a therapeutic target.</a> Sci Transl Med. 5, 204ra131 (2013).</li><li>Ellenberg, P., Edreira, M., Scolaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+superinfection+of+Vero+cells+persistently+infected+with+Junin+virus.">Resistance to superinfection of Vero cells persistently infected with Junin virus.</a> Arch. Virol. 149, 507-522 (2004).</li><li>Brandenburg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+poliovirus+entry+in+live+cells.">Imaging poliovirus entry in live cells.</a> PLoS Biol. 5, e183 (2007).</li><li>Petersen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Major+Cellular+Sterol+Regulatory+Pathway+Is+Required+for+Andes+Virus+Infection.">The Major Cellular Sterol Regulatory Pathway Is Required for Andes Virus Infection.</a> PLoS pathogens. 10, e1003911 (2014).</li><li>Jonsson, N., Gullberg, M., Israelsson, S., Lindberg, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+for+studies+of+virus+interaction+at+the+host+cell+surface+using+enteroviruses+and+real-time+PCR.">A rapid and efficient method for studies of virus interaction at the host cell surface using enteroviruses and real-time PCR.</a> Virol J. 6, 217 (2009).</li><li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+attachment+mediated+by+apolipoprotein+E+binding+to+cell+surface+heparan+sulfate.">Hepatitis C virus attachment mediated by apolipoprotein E binding to cell surface heparan sulfate.</a> J. Virol. 86, 7256-7267 (2012).</li><li>Shannon-Lowe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epstein-Barr+virus-induced+B-cell+transformation:+quantitating+events+from+virus+binding+to+cell+outgrowth.">Epstein-Barr virus-induced B-cell transformation: quantitating events from virus binding to cell outgrowth.</a> J. Gen. Virol. 86, 3009-3019 (2005).</li><li>Mifflin, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setting+up+a+PCR+laboratory.">Setting up a PCR laboratory.</a> CSH Protoc. 2007, pdb top14 (2007).</li><li>Maiztegui, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+efficacy+of+a+live+attenuated+vaccine+against+Argentine+hemorrhagic+fever.+AHF+Study+Group.">Protective efficacy of a live attenuated vaccine against Argentine hemorrhagic fever. AHF Study Group.</a> J. Infect. Dis. 177, 277-283 (1998).</li><li>Goni, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+features+of+attenuated+Junin+virus+vaccine+strain+candidate.">Genomic features of attenuated Junin virus vaccine strain candidate.</a> Virus Genes. 32, 37-41 (2006).</li><li>Chosewood, L. C., Wilson, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. , (2009).</li><li>White, J., Matlin, K., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fusion+by+Semliki+Forest,+influenza,+and+vesicular+stomatitis+viruses.">Cell fusion by Semliki Forest, influenza, and vesicular stomatitis viruses.</a> J. Cell Biol. 89, 674-679 (1981).</li><li>McGraw, T. E., Greenfield, L., Maxfield, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+the+human+transferrin+receptor+cDNA+in+Chinese+hamster+ovary+cells+deficient+in+endogenous+transferrin+receptor.">Functional expression of the human transferrin receptor cDNA in Chinese hamster ovary cells deficient in endogenous transferrin receptor.</a> J. Cell Biol. 105, 207-214 (1987).</li><li>Borrow, P., Oldstone, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+lymphocytic+choriomeningitis+virus-binding+protein(s):+a+candidate+cellular+receptor+for+the+virus.">Characterization of lymphocytic choriomeningitis virus-binding protein(s): a candidate cellular receptor for the virus.</a> J. Virol. 66, 7270-7281 (1992).</li><li>Rojek, J. M., Spiropoulou, C. F., Kunz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+cellular+receptors+for+the+South+American+hemorrhagic+fever+viruses+Junin,+Guanarito,+and+Machupo.">Characterization of the cellular receptors for the South American hemorrhagic fever viruses Junin, Guanarito, and Machupo.</a> 346. , 476-491 (2006).</li><li>Helguera, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antibody+recognizing+the+apical+domain+of+human+transferrin+receptor+1+efficiently+inhibits+the+entry+of+all+new+world+hemorrhagic+Fever+arenaviruses.">An antibody recognizing the apical domain of human transferrin receptor 1 efficiently inhibits the entry of all new world hemorrhagic Fever arenaviruses.</a> J. Virol. 86, 4024-4028 (2012).</li><li>Sanchez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junin+virus+monoclonal+antibodies:+characterization+and+cross-reactivity+with+other+arenaviruses.">Junin virus monoclonal antibodies: characterization and cross-reactivity with other arenaviruses.</a> J. Gen. Virol. 70, 1125-1132 (1989).</li><li>Trombley, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+panel+of+real-time+TaqMan+polymerase+chain+reaction+assays+for+detection+and+absolute+quantification+of+filoviruses,+arenaviruses,+and+New+World+hantaviruses.">Comprehensive panel of real-time TaqMan polymerase chain reaction assays for detection and absolute quantification of filoviruses, arenaviruses, and New World hantaviruses.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 82, 954-960 (2010).</li><li>Helenius, A., Marsh, M., White, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Semliki+forest+virus+penetration+by+lysosomotropic+weak+bases.">Inhibition of Semliki forest virus penetration by lysosomotropic weak bases.</a> J. Gen. Virol. 58 (Pt 1), 47-61 (1982).</li><li>Nour, A. M., Li, Y., Wolenski, J., Modis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+membrane+fusion+and+nucleocapsid+delivery+into+the+cytoplasm+are+distinct+events+in+some+flaviviruses.">Viral membrane fusion and nucleocapsid delivery into the cytoplasm are distinct events in some flaviviruses.</a> PLoS pathogens. 9, e1003585 (2013).</li></ol>

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

私たちが説明するプロトコルは簡単であり、堅牢では、次の重要な考慮事項が観察されました。まず、厳格な事前-PCR法は、（優れたレビューのために28を参照） を使用しなければなりません。すべての試薬および装置は定量PCR標的配列を含む増幅されたDNAを含まないと、適切なコントロールは、このような汚染を検出するための場所にあることが肝要です。第二に、プロト?...

アレナウイルスは、自然界1-3のげっ歯類で主に維持されている包まれ、一本鎖RNAウイルスのファミリーです。これらのウイルスは、通常、齧歯類貯水池1,2に無症候性、持続感染を確立しているが、それらは、ヒト3に重篤な疾患を引き起こす可能性があります。重要な病原性の種は、新世界フニンウイルス（JUNV）4とそれぞれアルゼンチン南米出血熱、アフリカのラッサ熱の病因剤である旧世界ラッサウイルス5が含まれます。リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（LCMV）、家族6の原型ウイルスは、世界的な分布を持っており、免疫抑制における免疫応答性個体6で無菌性髄膜炎、胎児7に重篤な先天性欠損、または高い致死率を含む種々の疾患状態の原因であります固形臓器移植8,9を以下の個人。米国の欠如これらのウイルスに対抗するための食品医薬品局（FDA）が承認したワクチンや有効な抗ウイルス薬は、治療これらの新興/再新興病原体を標的とする新たな戦略を開発するための重要な必要性を強調しています。 アレナウイルスのゲノムは、2つの一本鎖RNAセグメント、大（L）（〜7.2キロバイト）と小（S）（〜3.6キロバイト）セグメント10から構成されています。 Lセグメントはウイルスポリメラーゼ（L）、およびマトリックスタンパク質（Z）をコードしながら、Sセグメントはウイルス核タンパク質（NP）およびエンベロープ糖タンパク質（GP）をコードします。 LとSのゲノムRNAセグメント（のvRNA）は、ビリオン10-12にパッケージ化されています。アレナウイルス感染の初期段階は、ウイルス粒子の付着はJUNVのために、ヒトトランスフェリン受容体1（hTfR1）13,14を含み、ウイルスGPとそれに対応する宿主細胞受容体との間の相互作用を介して細胞をホストすることです。添付ファイルの後、JUNV粒子はクラスリン依存性エンドサイトーシス15を介して細胞内に取り込まれます。その後、粒子このコンパートメントの低pHはGP 16,17の活性化を誘発後期エンドソームへのトラフィック。いったんウイルスおよびエンドソーム膜の融合を開始し、エンドソーム膜に、GP-コードされる融合ペプチド挿入を活性化しました。彼らは、ゲノムの複製および転写のための鋳型としての役割を果たす細胞質内へのビリオンにパッケージのvRNAのリリースで成功融合結果。ウイルス構造タンパク質とのvRNAの十分な量が生成されると、新しい粒子がライフサイクル18を完了するために感染細胞からアセンブルし芽。 治療的に病原性アレナウイルスを標的とするために新たな戦略の発見を容易にするために、当社グループは、ホスト用のウイルス増殖のために重要な、しかし必須では宿主因子の同定に焦点を当ててきました。この文脈において、そのような宿主因子によって制御されるウイルスのライフサイクルの正確なステージ（複数可）を定義する案内することが必要です抗ウイルス戦略の開発。ここで、我々は、選択された宿主タンパク質および/ ​​または抗ウイルス性分子がウイルス侵入19のこの初期の段階に影響を与えるかどうかを識別するためにアレナウイルス-細胞接着を測定するために使用することができる定量的（q）はRT-PCRに基づくアッセイを記載します。アレナウイルス-細胞付着を測定するための別のアプローチは、ビオチン20で標識されたビリオン、蛍光染料21、または放射性同位元素22を特色にしています。これらの方法の欠点は、入力されたウイルスの大量の要求（感染の例えば、高多重度（MOI））、放射能の使用、および/ ​​または入力ウイルスを調製するための追加の処理工程（ 例えば、濃度および/ ​​またはウイルスの標識）を含むことができます。特に、高いMOIを用いることが困難な非生産添付イベント15,23対生産性を区別することができます。ここに記載のqRT-PCRに基づくアッセイは、20プラークとしていくつかを使用して、添付イベントを検出することができます。48ウェルプレートのために0.0004のMOIに変換ウイルスの明単位（PFUの）、。したがって、アッセイの強い感度が高いMOIの要件だけでなく、任意のウイルス標識または濃縮工程を克服します。さらに、アッセイは、ⅰ）融合後のビリオンのエンドサイトーシスと同様に細胞質へのウイルスゲノムの放出を測定するように構成することができると、ii）参照、例のために（ウイルス特異的定量RT-PCR試薬の開発を通じて、他のウイルスで使用するために仕立て24-27）。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-163</td><td>100x</td></tr><tr><td>HEPES Buffer Solution</td><td>Life Technologies</td><td>15630-130</td><td>100x</td></tr><tr><td>PBS pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td>1x</td></tr><tr><td>Vero E6 cells</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-1586</td><td></td></tr><tr><td>Costar 48-well plate</td><td>Corning</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>do not mix buffers RLT or&amp;nbsp; RW1 with bleach</td></tr><tr><td>QIAshredder homogenizer</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Universal PCR Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4326614</td><td></td></tr><tr><td>Multiscribe Reverse Transcriptase (50U/&amp;micro;l)</td><td>Life Technologies</td><td>4311235</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Mixture (10 mM; 2.5 mM each dNTP)</td><td>Life Technologies</td><td>N808-0260</td><td></td></tr><tr><td>GeneAmp 10X PCR Buffer II and 25 mM MgCl2 solution</td><td>Life Technologies</td><td>N808-0010</td><td></td></tr><tr><td>RNase Inhibitor (5000U/100 &amp;micro;l)</td><td>Life Technologies</td><td>N808-0119</td><td></td></tr><tr><td>RT primer 5&amp;rsquo;-AAGGGTTTAAAAAT&lt;br/&gt;GGTAGCAGAC-3&amp;rsquo;</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>250 nmol DNA oligo</td><td>standard desalting</td></tr><tr><td>Forward qPCR primer&amp;nbsp; 5&amp;rsquo;-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3&amp;rsquo;</td><td>Life Technologies</td><td>4304971</td><td>standard desalting</td></tr><tr><td>Reverse qPCR primer 5&amp;rsquo;-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3&amp;rsquo;</td><td>Life Technologies</td><td>4304971</td><td>standard desalting</td></tr><tr><td>TaqMan Probe 5&amp;rsquo;-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3&amp;rsquo;</td><td>Life Technologies</td><td>4316033</td><td>HPLC purified</td></tr><tr><td>MicroAmp Fast Optical 96-well reaction plate (0.1 mL)</td><td>Life Technologies</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Real-Time PCR System</td><td>Life Technologies</td><td>4376598</td><td>or other qPCR instrument</td></tr></tbody></table>

highly sensitive assay for measurement of arenavirus-cell attachment

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. While virus-cell attachment can be measured through the use of virions labeled with biotin, radioactive isotopes, or fluorescent dyes, these approaches typically require high multiplicities of infection (MOI) to enable detection of bound virus. We describe a quantitative (q)RT-PCR-based assay that measures Junin virus strain Candid 1 attachment via quantitation of virion-packaged viral genomic RNA. This assay has several advantages including its extreme sensitivity and ability to measure attachment over a large dynamic range of MOIs without the need to purify or label input virus. Importantly, this approach can be easily tailored for use with other viruses through the use of virus-specific qRT-PCR reagents. Further, this assay can be modified to permit measurement of particle endocytosis and genome uncoating. In conclusion, we describe a simple, yet robust assay for highly sensitive measurement of arenavirus-cell attachment.

プロトコルの第4節で説明したように定量PCRアッセイの感度とダイナミックレンジを実証するために、JUNV C＃1（範囲5-5×10 7コピー）のNP遺伝子をコードするプラスミドの既知量を定量PCRに供しました。アッセイは敏感であり、確実に標的核酸の5コピー（ 図2）のようにいくつか検出することができます。さらに、アッセイのダイナミックレンジが?...

Watch this Scientific Journal Video about Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment at JoVE.com

Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment

The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.

アレナウイルス - 細胞付着の測定のための高感度アッセイ

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral ...

highly-sensitive-assay-for-measurement-of-arenavirus-cell-attachment

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.5K ビュー.  University of Vermont. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.

ビデオ: Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

すべてのインフルエンザA型の定量的な分析シンプルなスロットブロットアッセイでユニバーサル抗体を用いたウイルスHemagglutininsとノイラミニダーゼ

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

免疫・感染学

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

抗ウイルス化合物の同定および評価のための早期のウイルス侵入アッセイ

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

Measuring Attachment and Internalization of Influenza A Virus in A549 Cells by Flow Cytometry

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed protocol for measuring relative changes in the amount of viral particles that attach to A549 cells, a human lung epithelial cell line, as well as in the amount of particles that are internalized into the cell. We use biotinylated virus which can be easily detected following staining with Cy3-labeled streptavidin (STV-Cy3). We describe the growth, purification and biotinylation of A/WSN/33, a widely used IAV laboratory strain. Cold-bound biotinylated IAV particles on A549 cells are stained with STV-Cy3 and measured using flow cytometry. To investigate uptake of viral particles, cold-bound virus is allowed to internalize at 37 &#176;C. In order to differentiate between external and internalized viral particles, a blocking step is applied: Free binding spots on the biotin of attached virus on the cell surface are bound by unlabeled streptavidin (STV). Subsequent cell permeabilization and staining with STV-Cy3 then enables detection of internalized viral particles. We present a calculation to determine the relative amount of internalized virus. This assay is suitable to measure effects of drug-treatments or other manipulations on attachment or internalization of IAV.

We present a protocol describing a semi-quantitative method for measuring both, the attachment of influenza A virus to A549 cells, as well as the internalization of virus particles into the target cells by flow cytometry.

フローサイトメトリーによって、A549細胞におけるインフルエンザAウイルスの添付ファイルと内在化を測定

Attachment to target cells followed by internalization are the very first steps of the life cycle of influenza A virus (IAV). We provide here a detailed ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the natural reservoir for IAV, but IAV can cross the species barrier to poultry, swine, horses and humans. Avian viruses recognize sialic acid attached to a penultimate galactose by a &#945;2-3 linkage (avian-type receptors) whereas human viruses preferentially recognize sialic acid with a &#945;2-6 linkage (human-type receptors). To monitor if avian viruses are adapting to human type receptors, several methods can be used. Glycan microarrays with diverse libraries of synthetic sialosides are increasingly used to evaluate receptor specificity. However, this technique is not used for measuring avidities. Measurement of avidity is typically achieved by evaluating the binding of serially diluted hemagglutinin or virus to glycans adsorbed to conventional polypropylene 96-well plates. In this assay, glycans with &#945;2-3 or &#945;2-6 sialic acids are coupled to biotin and adsorbed to streptavidin plates, or are coupled to polyacrylamide (PAA) which directly adsorb to the plastic. We have significantly miniaturized this assay by directly printing PAA-linked sialosides and their non PAA-linked counterparts on micro-well glass slides. This set-up, with 48 arrays on a single slide, enables simultaneous assays of 6 glycan binding proteins at 8 dilutions, interrogating 6 different glycans, including two non-sialylated controls. This is equivalent to 18x 96-well plates in the traditional plate assay. The glycan array format decreases consumption of compounds and biologicals and thus greatly enhances efficiency.

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

インフルエンザA型ウイルスのヘマグルチニンの結合力および特異性を評価するための小型糖鎖マイクロアレイアッセイ

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine detection of the virus. The current detection and quantification techniques, which rely primarily on nucleic acid amplification, do not discriminate infectious from non-infectious viral particles. The purpose of this article is to present specific details on recent advances in techniques used together in order to acquire further information on the infectivity status of viral particles. One technique involves assessing binding of a norovirus ssDNA aptamer to capsids. Aptamers have the advantage of being easily synthesized and modified, and are inexpensive and stable. Another technique, dynamic light scattering (DLS), has the advantage of observing capsid behavior in solution. Electron microscopy allows for visualization of the structural integrity of the viral capsids. Although promising, there are some drawbacks to each technique, such as non-specific aptamer binding to positively-charged molecules from sample matrices, requirement of purified capsid for DLS, and poor sensitivity for electron microscopy. Nonetheless, when these techniques are used in combination, the body of data produced provides more comprehensive information on norovirus capsid integrity that can be used to infer infectivity, information which is essential for accurate evaluation of inactivation methods or interpretation of virus detection. This article provides protocols for using these methods to discriminate infectious human norovirus particles.

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Routine detection methods utilizing viral genome amplification are limited by their inability to discriminate infectious from non-infectious particles. The purpose of this article is to provide detailed protocols for alternative methods to aid in discrimination of infectious norovirus particles using aptamer binding, dynamic light scattering, and transmission electron microscopy.

代替体外ウイルスのカプシド構造健全性の定量方法

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine ...

Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known as quasispecies, owing to their high mutation rate. Here, we describe how to measure the specific growth rate and the cell-binding ability of rotavirus as its phenotypes. Rotavirus is treated with trypsin to recognize the cell receptor and then inoculated into MA104 cell culture. The supernatant, including viral progenies, is collected intermittently. The plaque assay is used to confirm the virus titer (plaque-forming unit: pfu) of each collected supernatant. The specific growth rate is estimated by fitting time-course data of pfu/mL to the modified Gompertz model. In the assay of cell-binding, MA104 cells in a 24-well plate are infected with rotavirus and incubated for 90 min at 4 &#176;C for rotavirus adsorption to cell receptors. A low temperature restrains rotavirus from invading the host cell. After washing to remove unbound virions, RNA is extracted from virions attached to cell receptors followed by cDNA synthesis and reverse-transcription quantitative PCR (RT-qPCR). These protocols can be applied for investigating the phenotypic differences among viral strains.

Here we present two protocols, one for measuring the specific growth rate and the other for the cell-binding ability of rotavirus using the plaque assay and RT-qPCR. These protocols are available for confirming the differences in phenotypes between rotavirus strains.

比増殖速度とロタウイルスのセル結合の能力のための試金

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known ...

A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus biology. In the latter respect, the recent discovery of a non-structural AAV protein, termed assembly-activating protein (AAP), has shed new light on the processes involved in assembly of the viral capsid VP proteins into a capsid. Although many AAV serotypes require AAP for assembly, we have recently reported that AAV4, 5, and 11 are exceptions to this rule. Furthermore, we demonstrated that AAPs and assembled capsids of different serotypes localize to different subcellular compartments. This unexpected heterogeneity in the biological properties and functional roles of AAPs among different AAV serotypes underscores the importance of studies on AAPs derived from diverse serotypes. This manuscript details a straightforward dot blot assay for AAV quantitation and its application to assess AAP dependency and serotype specificity in capsid assembly. To demonstrate the utility of this dot blot assay, we set out to characterize capsid assembly and AAP dependency of Snake AAV, a previously uncharacterized reptile AAV, as well as AAV5 and AAV9, which have previously been shown to be AAP-independent and AAP-dependent serotypes, respectively. The assay revealed that Snake AAV capsid assembly requires Snake AAP and cannot be promoted by AAPs from AAV5 and AAV9. The assay also showed that, unlike many of the common serotype AAPs that promote heterologous capsid assembly by cross-complementation, Snake AAP does not promote assembly of AAV9 capsids. In addition, we show that the choice of nuclease significantly affects the readout of the dot blot assay, and thus, choosing an optimal enzyme is critical for successful assessment of AAV titers.

This manuscript details a straightforward dot blot assay for quantitation of adeno-associated virus (AAV) titers and its application to study the role of assembly-activating proteins (AAPs), a novel class of non-structural viral proteins found in all AAV serotypes, in promoting the assembly of capsids derived from cognate and heterologous AAV serotypes.

AAV 滴定とそのアデノ随伴ウイルスのアセンブリ活性化機能の評価のための定量的ドットしみ試金蛋白質

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus ...

生物学

A Step-By-Step Method to Detect Neutralizing Antibodies Against AAV using a Colorimetric Cell-Based Assay

Recombinant adeno-associated viruses (rAAV) have proven to be a safe and successful vector for transferring genetic material to treat various health conditions in both the laboratory and the clinic. However, pre-existing neutralizing antibodies (NAbs) against AAV capsids pose an ongoing challenge for the successful administration of gene therapies in both large animal experimental models and human populations. Preliminary screening for host immunity against AAV is necessary to ensure the efficacy of AAV-based gene therapies as both a research tool and as a clinically viable therapeutic agent. This protocol describes a colorimetric in vitro assay to detect neutralizing factors against AAV serotype 6 (AAV6). The assay utilizes the reaction between an AAV encoding an alkaline phosphatase (AP) reporter gene and its substrate NBT/BCIP, which generates an insoluble quantifiable purple stain upon combination. 
In this protocol, serum samples are combined with an AAV expressing AP and incubated to permit potential neutralizing activity to occur. Virus serum mixture is subsequently added to cells to allow for viral transduction of any AAVs that have not been neutralized. The NBT/BCIP substrate is added and undergoes a chromogenic reaction, corresponding to viral transduction and neutralizing activity. The proportion of area colored is quantitated using a free software tool to generate neutralizing titers. This assay displays a strong positive correlation between coloration and viral concentration. Assessment of serum samples from sheep before and after administration of a recombinant AAV6 led to a dramatic increase in neutralizing activity (125 to &gt;10,000-fold increase). The assay displayed adequate sensitivity to detect neutralizing activity in &gt;1:32,000 serum dilutions. This assay provides a simple, rapid, and cost-effective method to detect NAbs against AAVs.

A comprehensive laboratory protocol and analysis workflow are described for a rapid, cost-effective, and straightforward colorimetric cell-based assay to detect neutralizing elements against AAV6.

比色細胞ベースのアッセイを用いてAAVに対する中和抗体を検出するためのステップバイステップ法

Recombinant adeno-associated viruses (rAAV) have proven to be a safe and successful vector for transferring genetic material to treat various health ...

An Assay to Evaluate the Effect of Test Compounds on Viral Entry and Fusion in Host Cells

Source: Tai, C., et al. <a href="https://app.jove.com/v/53124">Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds.</a> J. Vis. Exp. (2015).
This video demonstrates an assay to evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry into host cells and fusion with the endosome. The cells are incubated at a low temperature and then infected with HCV. The low temperature permits viral binding to host cells but inhibits internalization via endocytosis. The test antiviral compound is added, and the cells are incubated at physiological temperature. This shift to a higher temperature facilitates viral entry and allows assessment of the impact of the test compound on viral envelope fusion with endosomes.

宿主細胞へのウイルス侵入と融合に対する被験化合物の影響を評価するためのアッセイ

Note: Ensure that all procedures involving cell culture and virus infection are conducted in certified biosafety hoods that are appropriate for the ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

免疫学

免疫診断

特殊なアッセイ

Cell-Based AAV Neutralizing Antibody Assay: A Colorimetric Technique to Detect Neutralizing Antibodies Against Specific Adeno-Associated Viruses in Serum

Start plating HT1080 cells on day one by diluting the cells to a concentration of 1 x 105 cells/mL in pre-warmed complete DMEM media.
Then, seed 100 microliters of cells, per well, into clear 96-well flat-bottomed plates to the concentration of 1 x 104 cells per well. Incubate the plate at 37 degrees Celsius with 5% carbon dioxide overnight for 16 to 22 hours.
On day two, generate serial dilutions of the serum samples of interest in 1.5-milliliter microcentrifuge tubes using pre-warmed complete DMEM.
To each tube with diluted serum samples, add 66 microliters of the 7.5 x 106 viral genome per microliter virus working solution. Mix the virus/serum dilutions by pipetting, and then, place the tubes containing the virus/serum mixtures in an incubator at 37 degrees Celsius with 5% carbon dioxide for 30 minutes, to allow potential neutralization to occur.
After 30 minutes, pipette 100 microliters of the virus/serum mixture to each well on the 96-well plate containing 1 x 104 cells per well, then, wrap the plate in a foil to place in an incubator at 37 degrees Celsius with 5% carbon dioxide overnight for 16 to 24 hours.
On day three, aspirate the media from the wells of the 96-well plate using a fume hood vacuum without disrupting the adhered cells, and add 50 microliters of 4% paraformaldehyde to each well. After wrapping the plate in foil, leave it for 10 minutes at room temperature.
Later, wash and aspirate the cells twice with 200 microliters of PBS at room temperature. After the second wash, pipette 200 microliters of pre-warmed PBS into each well, and wrap the plate in foil followed by incubation at 65 degrees Celsius for 90 minutes to denature endogenous alkaline phosphatase activity.
Following incubation, add 50 microliters of the freshly prepared, dissolved BCIP/NBT into each well, and incubate the wrapped plates at room temperature for 2 to 24 hours. Later, take photos of each well using a 4x objective lens in a light microscope camera, ensuring the consistent use of the same exposure, white balancing, and light settings for all assays.