著者らは、このプロトコルを微調整するにグレッグスミス、リサPomeranz、マットライマン、マルリースエルドリッジ、ハリナStaniszewska Goraczniak、およびEnquistラボのメンバーの貢献を感謝しています。

1。一日目：ウイルス感染とバッファーの調製<ol><li>感染の組織培養細胞の5-10皿（15cmの直径を）準備、仮性狂犬病ウイルス（PRV）またはヘルペスのためのVero細胞用例：PK - 15細胞（HSV）ウイルス単純。 </li><li>細胞が95である場合 - 100％コンフルエント、（MOI）50から10の時にそれらを感染させる。これを行うには、プレート当たり4 mlの全体積にウイルスストックを用いて各プレートに接種し、37℃で1時間プレートをインキュベート℃に軽くロックプレート細胞単層はウイルス接種によって完全に被覆されたままであることを保証するために15分ごと。一方、次のステップのための培地を温める。 </li><li>感染症の1時間後には、プレートからウイルス接種物を吸引除去暖かい培地15mlを追加し、37℃の加湿インキュベーター中、12〜20時間のために。 </li><li> LCMバッファ（表1参照）と° C完全に混合するための一晩4石を準備します。ウイルスDNAの再懸濁するためのTNEを準備する（表2参照）。 </li></ol> 2。第二日目、フェーズ1：細胞の溶解および超遠心法<ol><li>視覚的にその細胞の感染は、均一な細胞変性効果（CPE）を起こしていることを確認します。すべての細胞が切り上げているが、プレートから持ち上げていないまで、感染が進行することができます。 </li><li>培地中に感染した細胞をこすり、および50 mlコニカルチューブに細胞や培地を組み合わせる。このステップに必要なコニカルチューブの数が上記のステップ1.2での感染のために使用される料理の数に依存する、 例えば、1つ50 mlコニカルチューブにペレットを15 mlの培地それぞれの3皿の最大を使用することができるオプション：。リンス10ミリリットルPBSでプレートは、細胞と培地との組み合わせ。 </li><li>室温で2000年の相対centifugal力（RCF）で10分間、細胞と培地を遠心し、上清を吸引し、PBSの10mlにそれぞれのペレットを再懸濁します。つのウイルス感染からペレットをステップ2.2で複数のコニカルチューブに広がっていた場合、これらはこのステップに一つコニカルチューブに再結合することができます。遠心分離や吸引を繰り返して、 オプション：このペレットを-20℃で保存し、プロトコルは、後で継続することができる。 </li></ol> 3。第二日目、フェーズ2：超遠心法 次の手順中に、可能な限り氷の上で細胞ペレットとLCMのバッファを保持します。 <ol><li> 0％グリセロールにβ-メルカプトエタノールを追加 - LCMバッファ。に設定することによって超遠心機を（下のステップ3.9の）冷却開始4℃、真空をオンにする。 </li><li> 0％グリセロール5mlの細胞ペレットを - LCMのバッファを、それがこんもり茂ったれなくなるまで。必要に応じて、ボルテックスチューブはどんな溶解していない細胞ペレットを分割する。 </li><li> 1.5 mlのフロン（1,1,2 - トリクロロ-1,2,2 - トリフルオロエタン）を加えて激しくボルテックスで抽出する。すぐに4℃の温度で2000 RCFで10分間遠心操作ワイドボアピペットチップ（インタフェースを避ける）で最上位層を収集し、新しいチューブに移すオプション：。ペレットは、ゼラチン状の固体である場合は、すぐに新しいチューブに最上層を注ぐことができる。 </li><li>再びフロンの抽出と遠心を繰り返します。 </li><li>最上層（〜5 ml）を収集し、新しいポリアロマー超遠心チューブに移す。 LCMバッファ - 残りの2つのグリセロールにβ-メルカプトエタノールを追加。 </li><li> LCM（中間層）し、45％グリセロール2.5 mlで再び基礎となる - - LCM（底層）5％グリセロール3mlでフロンのエキス（最上層）の基礎となることによってポリアロマーの遠心管に勾配を準備します。試験管の内容のオーバーフローを避けるために、細いピペットを使用してください。 </li><li>必要に応じて、LCMバッファの同じ比率を使用して同等のバランスチューブを準備する。 </li><li>超遠心バケットにチューブを移す。最上位層（一度に〜50から100μL）にLCMバッファ - 優しく余分な0％のグリセロールを添加することにより、お互いに0.1gの内にバケツのバランスをとります。 </li><li>水平またはスイングバケットローターで冷たい超遠心機を使用して、4℃の温度で77000 RCF（SW41Tiのローター用など25000 rpm）で1時間のバランスサンプルをスピン</li><li>超遠心分離中に、エタノール沈殿のステップ（下記4.6）に浮遊DNAを捕捉するためにガラスのフックを作る。ガラスパスツールピペットの両端を持ち、火炎上中央のセクションを中断。ガラスのセクションはほとんど溶融の場合は、しっかりと直角フック（&lt;90 °）を作成し、そして終了を封印するために急激に引っ張って軽く曲げ、ガラスを伸ばすために慎重に引き抜いてください。ガラスのフックの先端が開いている場合、ガラスはそれを閉じるのに十分な溶けように炎を介して先端を保持する。 </li><li>超遠心分離した後、中央のダークスポットと薄い不透明なペレットが表示されるはずです。慎重に両側に沿っ余滴を含めて、チューブから液体を吸引除去するが、チューブの底にペレットを避ける。 </li><li>室温で0.5 mlのTNEを追加。 </li><li>ペレットは、ペレットの水和を可能にするために少なくとも10分間放置します。Optional：4で守ればペレットはまた、一晩TNEで再懸濁ができる℃の</li></ol> 4。第三日目：&quot;ゴースト&quot;DNAの沈殿<ol><li>小口径のピペットチップ（ 例えば、P200のピペットチップ）でピペッティングしてペレットを破る。ウイルスのDNAがまだこの時点でキャプシドに含まれているため、このステップでせん断を心配しないでください。キャプシドを破壊するために、室温で、ウイルスのペレットを含むチューブに以下の試薬を追加します。 <ul><li> 4.25ミリリットルTNE </li><li> 0.25ミリリットル10％SDS </li><li> 2mgのプロティナーゼK </li></ul>優しくこれらの試薬を混合して揺らし。粘度のわずかな増加があるはずです。 </li></ol> ここからはせん断用心、例えば大口径のピペットを使用してウイルスの材料にボルテックスしないでください <ol start="2"><li>フェノール - クロロホルム5mlを加えることによってウイルスタンパク質を抽出し、即座にエマルジョンを維持するために反転またはボルテックスを開始。室温で2000 rcfで5分間乳化物を遠心分離し、10秒間混ぜる。インタフェースを避け、ワイドボアピペットの先端と上部層を収集し、新しいチューブに移すオプション：使用する位相ロックゲル（PLG）チューブをこの段階でインターフェイスからの汚染を避けるために。 </li><li>再びフェノール - クロロホルム抽出し、遠心を繰り返します。 </li><li>第二フェノール - クロロホルム抽出後、30ミリリットルのガラスCorexチューブに最上層を回収し、10〜15分は-20℃でチューブを冷やし、それが凍結しないように気をつける。 </li><li> 、氷冷エタノール10mlを加え、チューブを（上からパラフィルムMの部分をストレッチするなど ）カバー、そしてすぐに混在させる反転。細い縄状の沈殿物で構成されて表示されるようにDNA&quot;ゴースト&quot;、待ってください。さらにミックスし、粘着性DNAが一緒にクラスタに沈殿させるために軽くチューブを反転。 </li><li> DNAのゴースト（s）をキャプチャするためにガラスのフックを使用してください。慎重に余分な液体を除去するためにDNAをブロット、その後、1.5 mlチューブにフックを（下に傾ける）に置き、乾燥させます。 0.25を追加 - TEの0.5 mlをDNAのゴーストを溶解する。少なくとも1時間進行するDNAの再懸濁を許可する。 4℃店舗のDNA℃のオプション：1.5 mlチューブにガラスのフックを切り離し、DNAの収量を最大にするには、ガラスの破片からなるよう再懸濁は、時間をかけ続けることができます。 </li></ol> 5。代表的な結果 MOI十分に高いと、細胞は野生型PRV株のために〜18時間の感染後（HPI）の中で完全なCPEを達成すべきである、と野生型HSV - 1株（図1）〜24 HPI。一度感染した細胞ペレットが収穫され、残りのプロトコルのステップは長い1日で完全になるか、2日間（図2）を介して実施することができます。 DNAのゴーストをキャプチャするためにガラスのフックを準備するとき、それは後には1.5 mlチューブ（図3）のベースに収まることができるように、90度未満となるフックの角度を作ることが重要です。このフックの先端部をシールするピペット内のDN​​Aの損失を防ぎます。 DNAの幽霊は、沈殿工程中に形成し、白、粘着性の糸（図4）として表示されます。これらの集計とスティック相互に、かつ/またはDNAを捕捉するために使用されるガラスのフック。したがって、同一のガラスのフックは、降水量のソリューションの中から、DNAの複数のスレッドを収集するために使用することができます。 <table border="1"><tbody><tr><td> 希望のボリュームに基づいて列を選択してください。 </td><td> 10ミリリットル </td><td> 15ミリリットル </td><td> 20ミリリットル </td><td> 40ミリリットル </td></tr><tr><td> 1MのKCl </td><td> 1.3ミリリットル</td><td> 1.9ミリリットル</td><td> 2.5ミリリットル</td><td> 5ミリリットル</td></tr><tr><td> 1Mトリス（pH 7.4） </td><td> 300μlの</td><td> 450μlの</td><td> 600μlの</td><td> 1.2ミリリットル</td></tr><tr><td> 1M MgCl 2の </td><td> 50μlの</td><td> 75μlの</td><td> 100μlの</td><td> 200μlの</td></tr><tr><td> 0.5 EDTA </td><td> 10μlの</td><td> 15μlの</td><td> 20μlの</td><td> 40μlの</td></tr><tr><td> NP40/IGEPAL </td><td> 50μlの</td><td> 75μlの</td><td> 100μlの</td><td> 200μlの</td></tr><tr><td> β-メルカプトエタノール（使用直前に追加） </td><td> 4.3μL </td><td> 6.5μL </td><td> 8.6μL </td><td> 17.2μL </td></tr><tr><td colspan="5"></td></tr><tr><td colspan="5"> 希望するパーセントのグリセロール（0,5、または45％）の割合を使用 </td></tr><tr><td> 0％のグリセロール</td><td>なし</td><td>なし</td><td>なし</td><td>なし</td></tr><tr><td>水を</td><td> 8.3ミリリットル</td><td> 12.5ミリリットル</td><td> 16.7ミリリットル</td><td> 33.4ミリリットル</td></tr><tr><td> 5％のグリセロール</td><td> 0.5ミリリットル</td><td> 0.8ミリリットル</td><td> 1.0ミリリットル</td><td> 2.0ミリリットル</td></tr><tr><td>水を</td><td> 7.8ミリリットル</td><td> 11.7ミリリットル</td><td> 15.7ミリリットル</td><td> 31.4ミリリットル</td></tr><tr><td> 45％のグラムlycerol </td><td> 4.5ミリリットル</td><td> 6.8ミリリットル</td><td> 9.0ミリリットル</td><td> 18.0ミリリットル</td></tr><tr><td>水を</td><td> 3.8ミリリットル</td><td> 5.7ミリリットル</td><td> 7.7ミリリットル</td><td> 15.4ミリリットル</td></tr></tbody></table> 表1。 LCMバッファーの調製のためのレシピ <table border="1"><tbody><tr><td> 50mlの容積のための </td></tr><tr><td> 5ミリリットル1MのNaCl </td></tr><tr><td> 2.5ミリリットル1Mトリス、pH7.5の</td></tr><tr><td> 1ミリリットル0.5 EDTA </td></tr><tr><td> 41.5ミリリットルH 2 O </td></tr></tbody></table> 表2。 TNEの準備 （0.1MのNaCl、50mMトリス、pH7.5の、10mMのEDTA） <table border="1"><tbody><tr><td> 1リットルの容積のための </td></tr><tr><td> 0.2グラムのKCl </td></tr><tr><td> 0.2グラムのKH 2 PO 4 </td></tr><tr><td> 8グラムのNaCl </td></tr><tr><td> 1.15グラムのNa 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> 1LのH 2 O </td></tr></tbody></table> 表3。 PBSの調製 （2.7 mMの塩化カリウム、1.5mMのKH 2 PO 4、137 mMのNaCl、8.1 mMののNa 2 HPO 4、pH7.0）で<img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig1.jpg" /> 図感染を介して感染前に1。PK15細胞（）、（B）の中間、および（C）細胞変性効果（CPE）で、感染の高い多重度の後。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig2.jpg" /> 図2プロトコルの概要。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig3.jpg" /> 図3：ガラスの3つの代表例はウイルスDNAの幽霊を収集するために使用されるフック。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig4.jpg" /> 図4。整形式と豊富なDNA&quot;ゴースト&quot;の代表例。

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	<li>Szpara, M. L., Parsons, L., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+variability+in+clinical+and+laboratory+isolates+of+herpes+simplex+virus+1+reveals+new+mutations.">Sequence variability in clinical and laboratory isolates of herpes simplex virus 1 reveals new mutations.</a> J Virol. 84, 5303-5313 (2010).</li><li>Banfield, B. W., Kaufman, J. D., Randall, J. A., Pickard, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+pseudorabies+virus+strains+expressing+red+fluorescent+proteins:+new+tools+for+multisynaptic+labeling+applications.">Development of pseudorabies virus strains expressing red fluorescent proteins: new tools for multisynaptic labeling applications.</a> J Virol. 77, 10106-10112 (2003).</li><li>Kobiler, O., Lipman, Y., Therkelsen, K., Daubechies, I., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpesviruses+carrying+a+Brainbow+cassette+reveal+replication+and+expression+of+limited+numbers+of+incoming+genomes.">Herpesviruses carrying a Brainbow cassette reveal replication and expression of limited numbers of incoming genomes.</a> Nat Commun. 1, 146-146 (2010).</li><li>Enquist, L. W., Madden, M. J., Schiop-Stanley, P., Vande Woude, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+herpes+simplex+type+1+DNA+fragments+in+a+bacteriophage+lambda+vector.">Cloning of herpes simplex type 1 DNA fragments in a bacteriophage lambda vector.</a> Science. 203, 541-544 (1979).</li><li>Smith, G. A., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+transposon+mutagenesis+in+Escherichia+coli+of+a+full-length+infectious+clone+of+pseudorabies+virus,+an+alphaherpesvirus.">Construction and transposon mutagenesis in Escherichia coli of a full-length infectious clone of pseudorabies virus, an alphaherpesvirus.</a> J Virol. 73, 6405-6414 (1999).</li><li>Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of virology. , (2008).</li><li>Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+pseudorabies+virus:+impact+on+neurovirology+and+veterinary+medicine.">Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 69, 462-500 (2005).</li><li>Roizman, B., Pellett, P. E., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fields Virology. , 2381-2397 (2001).</li><li>Mendez, I. I., Hermann, L. L., Hazelton, P. R., Coombs, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+analysis+of+freon+substitutes+in+the+purification+of+reovirus+and+calicivirus.">A comparative analysis of freon substitutes in the purification of reovirus and calicivirus.</a> J Virol Methods. 90, 59-67 (2000).</li><li>Gharabaghi, F., Aymard, M., Trotemann, P., Gerdil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+simplified+micromethod+for+subtyping+varicella-zoster+virus.">A rapid and simplified micromethod for subtyping varicella-zoster virus.</a> J Med Virol. 31, 129-134 (1990).</li><li>Granstedt, A. E., Szpara, M. L., Kuhn, B., Wang, S. S., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+monitoring+of+in+vivo+neural+activity+using+a+circuit-tracing+pseudorabies+virus.">Fluorescence-based monitoring of in vivo neural activity using a circuit-tracing pseudorabies virus.</a> PLoS One. 4, e6923-e6923 (2009).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

このプロトコルの一部は、もともとBSL4条件におけるウイルスDNAの分離のために開発されたが、それは非BSL条件にも同様に適応された4我々は一般的にDNAゲノムを有するα-ヘルペスウイルスPRVおよびHSV - 1、からDNAを単離するためにこのプロトコルを使用キャプシドと脂質エンベロープに囲まれたタンパク質で囲みます。7,8しかし、それが含むβ-およびγ-ヘルペスウイルスやアデ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>フロン（1,1,2 - トリクロロ-1,2,2 - トリフルオロエタン） </td><td>フィッシャー</td><td> T178 - 4 </td><td>フロン含有廃棄物の適正処理に関するガイドラインについては、貴機関に確認し、またはメンデスらを参照してください。潜在的なフロン代替用。9 </td></tr><tr><td>位相ロックゲルチューブ、ヘビー15ミリリットル容量</td><td> 5 PRIME </td><td> 2302850 </td><td>オプション</td></tr><tr><td>ポリアロマー超遠心管</td><td>ベックマン* </td><td> 331372 * </td><td> *あなた自身の超遠心分離に適したチューブを選択し、これらは例としてのみ含まれています。 </td></tr><tr><td> NP - 40 / IGEPAL </td><td>シグマ</td><td> I - 3021 </td><td></td></tr><tr><td> PK - 15細胞</td><td> ATCC </td><td> CCL - 33 </td><td></td></tr><tr><td> Vero細胞</td><td> ATCC </td><td> CCL - 81 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> HyClone </td><td> SH30028.03 </td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of viral dna from nucleocapsids

ウイルスは絶対携帯寄生虫であり、そのため、DNAの研究では、離れて宿主細胞の汚染物質とDNAからのウイルス材料を分離する必要があります。いくつかの下流のアプリケーションでは、このプロトコルによって提供される純粋なウイルスDNA、大量のを必要とする。これらのアプリケーションは、ウイルスゲノムの宿主DNAの除去は、ウイルス配列のデータ出力を最適化するために重要であるシーケンシング、および新たなウイルスの組換え株の生産、プラスミドおよびリニアウイルスDNAの組換えを容易に精製されたの共トランスフェクション。1,2を、含まれています3 この手順では、感染細胞からリニアヘルペスウイルスヌクレオキャプシドのDNAを精製単離するために抽出し、密度ベースの遠心分離の組み合わせを採用しています。4,5初期精製ステップは、抽出と遠心操作中に含まれているとウイルスDNAを保護するウイルスキャプシドを、精製分離することを目指すことは、細胞タンパク質およびDNAを除去。ヌクレオカプシドの溶解は、ウイルスDNAを解放し、最後に2つのフェノール - クロロホルムの手順では、残りのタンパク質を除去。ソリューションから取り込んだ最後のDNAは1.90の平均OD 280分の260と、高濃度および純粋です。使用されて感染細胞の量に応じて、150から800μgの以上からウイルスDNAの範囲の収量。このDNAの純度は、4Cでの長期保管中にそれが安定したものになります。このDNAは、このように理想的にハイスループットシーケンシング、高忠実度PCR反応、およびトランスフェクションに適しています。 プロトコルを開始する前に、それは、ディッシュあたりの細胞（コンフルエント15cmの皿に8 × 10 6 PK - 15細胞の平均など）の平均数を知ることは重要です、そして、使用するウイルスストックの力価（例えば、ml当たり1 × 10 8プラーク形成単位を）。これらのプロトコルのために感染症の適切な多重度（MOI）を計算するために必要な。例えば6、上記のウイルスストックとPK - 15細胞の一つ15cmの皿に感染する、MOI 5の時には、400μlのを使用します。ウイルスストックと培地の3.6ミリリットル（一15cmのプレートに4 mlの総接種量）とそれを希釈する。 複数のウイルスDNAの調製物は、同時に調製することができる。同時の準備の数は、超遠心ローターで開催された管の数によって制限されます（ウイルスごとに、下記のステップ3.9を参照してください）​​。ここでは、つのウイルスのために行われているかのように手順を説明します。

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Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

我々は、感染細胞から高純度のヘルペスウイルスヌクレオカプシドDNAを単離するプロセスを説明します。ソリューションから取り込んだ最終的なDNAは、それが理想的にハイスループットシーケンシング、高忠実度PCR反応、および新たなウイルスの組換え体を生産するトランスフェクションに最適です、高濃度および純度である。

ヌクレオカプシドからウイルスDNAの調製

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

20.8K ビュー.  Princeton University. 我々は、感染細胞から高純度のヘルペスウイルスヌクレオカプシドDNAを単離するプロセスを説明します。ソリューションから取り込んだ最終的なDNAは、それが理想的にハイスループットシーケンシング、高忠実度PCR反応、および新たなウイルスの組換え体を生産するトランスフェクションに最適です、高濃度および純度である。

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Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

プラスミドDNAの組換えインフルエンザウイルスの生成

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

免疫・感染学

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

ウイルス性病原体のために臨床サンプルをスクリーニングするためにパンウイルスマイクロアレイアッセイ（Virochip）を使用して、

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the generation of extreme population diversity that facilitates virus adaptation and evolution. Increasing evidence shows that the intrinsic error rates, and the resulting mutation frequencies, of RNA viruses can be modulated by subtle amino acid changes to the viral polymerase. Although biochemical assays exist for some viral RNA polymerases that permit quantitative measure of incorporation fidelity, here we describe a simple method of measuring mutation frequencies of RNA viruses that has proven to be as accurate as biochemical approaches in identifying fidelity altering mutations. The approach uses conventional virological and sequencing techniques that can be performed in most biology laboratories. Based on our experience with a number of different viruses, we have identified the key steps that must be optimized to increase the likelihood of isolating fidelity variants and generating data of statistical significance. The isolation and characterization of fidelity altering mutations can provide new insights into polymerase structure and function1-3. Furthermore, these fidelity variants can be useful tools in characterizing mechanisms of virus adaptation and evolution4-7.

The present article describes the steps required to isolate and characterize RNA polymerase fidelity variants of RNA viruses and how to use mutation frequency data to confirm fidelity changes in tissue culture.

ウイルスの変異頻度のRNAウイルスと特性の忠実性の変異の分離

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2. Viruses modulate host cell abundance and diversity, contribute to the cycling of nutrients, alter host cell phenotype, and influence the evolution of both host cell and viral communities through the lateral transfer of genes 3. Numerous studies have highlighted the staggering genetic diversity of viruses and their functional potential in a variety of natural environments. 
Metagenomic techniques have been used to study the taxonomic diversity and functional potential of complex viral assemblages whose members contain single-stranded DNA (ssDNA), double-stranded DNA (dsDNA) and RNA genotypes 4-9. Current library construction protocols used to study environmental DNA-containing or RNA-containing viruses require an initial nuclease treatment in order to remove nontargeted templates 10. However, a comprehensive understanding of the collective gene complement of the virus community and virus diversity requires knowledge of all members regardless of genome composition. Fractionation of purified nucleic acid subtypes provides an effective mechanism by which to study viral assemblages without sacrificing a subset of the community&#x2019;s genetic signature. 
Hydroxyapatite, a crystalline form of calcium phosphate, has been employed in the separation of nucleic acids, as well as proteins and microbes, since the 1960s11. By exploiting the charge interaction between the positively-charged Ca2+ ions of the hydroxyapatite and the negatively charged phosphate backbone of the nucleic acid subtypes, it is possible to preferentially elute each nucleic acid subtype independent of the others. We recently employed this strategy to independently fractionate the genomes of ssDNA, dsDNA and RNA-containing viruses in preparation of DNA sequencing 12. Here, we present a method for the fractionation and recovery of ssDNA, dsDNA and RNA viral nucleic acids from mixed viral assemblages using hydroxyapatite chromotography.

We describe an efficient method to separate single-stranded DNA, double-stranded DNA and RNA molecules from environmental viral communities. Nucleic acids are fractionated using hydroxyapatite chromatography with increasing concentrations of phosphate-containing buffers. This method permits the isolation of all viral nucleic acid types from environmental samples.

ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いた環境ウイルスのコミュニティから一本鎖DNA、二本鎖DNAとRNAの分離

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

からのDNA抽出のためのシンプルなChelexプロトコル<em&gt;ハマダラカ</em&gt;属。

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

呼吸器病原体に対する宿主細胞応答を研究するために偏ヒト気道上皮Calu-3細胞の液体に覆われた文化の確立<em&gt;インビトロ</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these glycoprotein &#8216;spikes&#8217; is often technically challenging but important for understanding viral pathogenesis and in drug design. Here, a protocol is presented for viral spike structure determination through computational averaging of electron cryo-tomography data. Electron cryo-tomography is a technique in electron microscopy used to derive three-dimensional tomographic volume reconstructions, or tomograms, of pleomorphic biological specimens such as membrane viruses in a near-native, frozen-hydrated state. These tomograms reveal structures of interest in three dimensions, albeit at low resolution. Computational averaging of sub-volumes, or sub-tomograms, is necessary to obtain higher resolution detail of repeating structural motifs, such as viral glycoprotein spikes. A detailed computational approach for aligning and averaging sub-tomograms using the Jsubtomo software package is outlined. This approach enables visualization of the structure of viral glycoprotein spikes to a resolution in the range of 20-40 &#197; and study of the study of higher order spike-to-spike interactions on the virion membrane. Typical results are presented for Bunyamwera virus, an enveloped virus from the family Bunyaviridae. This family is a structurally diverse group of pathogens posing a threat to human and animal health.

An approach is presented for determining structures of viral membrane glycoprotein complexes using a combination of electron cryo-tomography and sub-tomogram averaging with the computational package Jsubtomo.

Jsubtomoを用いた電子Cryotomography再建からのウイルスのエンベロープ糖タンパク質スパイクの平均化

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these ...

Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments through the recruitment of viral and cellular proteins to sites occupied by the viral genome. These sites, called replication compartments (RC), can be considered viral-induced nuclear domains where the viral genome is localized and viral and cellular proteins that participate in replication, transcription and post-transcriptional processing are recruited. Moreover, cellular proteins involved in the antiviral response, such as tumor suppressor proteins, DNA damage response (DDR) components and innate immune response factors are also co-opted to RC. Although RC seem to play a crucial role to promote an efficient and productive replication cycle, a detailed analysis of their composition and associated activities has not been made. To facilitate the study of adenoviral RC and potentially those from other DNA viruses that replicate in the cell nucleus, we adapted a simple procedure based on velocity gradients to isolate Ad RC and established a cell-free system amenable to conduct morphological, functional and compositional studies of these virus-induced subnuclear structures, as well as to study their impact on host-cell interactions.

We provide a novel strategy to isolate viral replication compartments (RC) from adenovirus (Ad)-infected human cells. This approach represents a cell-free system that can help to elucidate the molecular mechanisms regulating viral genome replication and expression as well as regulation of viral-host interactions established at the RC.

アデノウイルスに感染したヒト正常細胞からのウイルス複製コンパートメントに富むサブ核画分の単離

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

の検出のための凍結乾燥LAMP法試薬の開発<em&gt; Q熱リケッチア</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

酵素結合レクチンアッセイによってインフルエンザノイラミニダーゼ阻害抗体価を測定します

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...