著者らは、agroinfiltrationの開発およびin vitroアセンブリアッセイにおけるそれらの貴重な提案のための研究室のいくつかのメンバーに感謝したいと思います。この作品は、カリフォルニア大学からの助成金によって賄われていた。本研究では、国立科学財団（CBET-1144237）からの助成金によって部分でサポートされていました。

1。植物性の素材<ol><li>キャプシドアッセイで使用されるタバコベンサミ植物は、4葉期（約3-4週齢の植物）であるべきである。 </li></ol> 2。 agroinfiltrationによる植物細胞への機能的なウイルスゲノムのコンポーネントの配信と表現<ol><li> 1日目：アグロバクテリウム株（例えば、EH 105またはGV 3101）pCass-BMV RNA 1、BMV RNA 2とBMV RNA 3 1,2を保有する 50のカナマイシンmg / mlのを補ったLB寒天プレート上で増殖されている（ために選択します。 pCASSベクトル）とリファンピシンの100mg/ml（）は、アグロバクテリウムのために選択します。インキュベーションは、二日間28℃で実施されています。 </li><li> 3日目：カナマイシン50 mg / mlおよび28℃で1日リファンピシン100 mg / mlの250℃RPMに設定オービタルシェーカーでCを含有するLB培地2 mlのLB寒天プレートから単一コロニーを接種。 </li><li> 4日目：LBブロスサプリメントの50ミリリットルを接種カナマイシン50 mg / mlおよびリファンピシン、10mMのMES pHは5.6と28で16時間の三角フラスコ250mlの文化の1ミリリットル〜250 RPMでオービタルシェーカー上でCと100mMのアセトシリンゴンの100 mg / mlのとED 。 </li><li> 5日目：4℃で5000rpmで10分間オークリッジ管または滅菌ファルコンチューブと遠心分離機に（OD 600が 1.0に達したとき）文化を転送</li><li>このステップの抗生物質の完全な除去を確実にする1つのより多くの時間を繰り返して、4℃で5000rpmで10分間、10mMのMgCl 2、遠心10mlにペレットを溶解する。 </li><li> 10mMのMgCl 2および10mM MES（pHは5.6）を含む10 mlのバッファーでペレットを一時停止します。 </li><li> BMV RNA 1、2、RNA RNA 3の各カルチャのOD 600を測定し、10mMのMgCl 2と10mMのMESを液（pH 5.6）を使用して、0.1 OD 600に調整します。 </li><li>各3つのすべての0.1 OD 600の培養懸濁液1ミリリットルを混ぜる。 </li><li>アセトシリンゴン、ミックスゲント100mMのを追加します。LY、3時間室温で混合物が邪魔されずに保持します。 </li><li> 1mlに培養懸濁液を描画します。針なしの注射器。 </li><li> N. 2-3よく展開葉の背軸側に上記培養懸濁液を浸透させるそっと葉の背軸面の半分に注射器を押すことによって、 ベンサミ （5葉期、3から4週齢の植物）。 </li><li>他の葉に浸潤この手順を繰り返します。 </li><li> 24℃で緑色の家に浸透植物を保つ</li><li>浸透の収穫は3から4日後の浸潤を（dpi）のままになります。 </li></ol> 3。 BMVビリオンの精製<ol><li> Nを収集するベンサミはすべての 3つの野生型BMVのagrotransformantsを含む混合物でagroinfiltrated残します。 </li><li> 0.08 M MgAc、使用直前に追加されるβ-メルカプトエタノールのpHは4.5と1/100量、BMV抽出バッファー（0.5 M NAAC等量の（w / v）の滅菌乳鉢と乳棒の葉を挽く3）。ウイルス収量を最大にするために、それは研削容易かつ効率的に細胞破壊を促進する酸洗浄した砂（〜0.5〜1グラム）を追加することをお勧めします。 </li><li>モスリン布の2-3層を介して葉エキスをフィルタリングし、突風を収集します。 </li><li>再び葉材の初期重量にBMV抽出緩衝液と等量のモスリン布上に保持された部分を挽く。 </li><li>モスリン布を使用してろ過手順を繰り返します。これらのステップは4℃で行われるべきである</li><li>遠心管にろ液を移し、懸濁液の色はライトグリーンに変わりまで室温で5分間予備冷却し、クロロホルムと渦の等量（またはシェイク）を追加します。 </li><li> 4℃、12,000 rpmで15分間乳化した溶液を遠心分離℃に</li><li>水相を収集し、残留クロロホルムを除去するためにマグネチックスターラーで30分間攪拌する。 </li><li>滅菌遠心チューブに懸濁液を移す。 </li><li&gt;アンダー1ミリリットル。クッションの3として10％ショ糖（ウイルス抽出用緩衝液で調製）。 </li><li> 4でベックマン超遠心機で3時間、30,000 rpmで遠心分離℃、 </li><li>上清を捨て、（滅菌蒸留水で1/10に懸濁バッファー希釈BMV抽出緩衝液を調製するために）BMV懸濁バッファーの目的のボリュームでペレットを中断します。 </li><li>上記の手順から部分的に精製されたビリオンの準備は、4℃で28000 rpmで150分間百分の10から40のショ糖密度勾配遠心分離に供される</li><li>手動で、または分留によるウイルスバンドを収集します。ウイルスバンドは白色光照明の下で青で表示されます。 </li><li>ウイルス懸濁液バッファを持つウイルスのサンプルを少なくとも50％を含むショ糖溶液を希釈します。 </li><li> 4でベックマン超遠心で30,000 rpmで3時間のショ糖溶液を含む希釈ウイルス℃を遠心分離</li><li>最後に、VIRの所望の量で高度に精製されたウイルスペレットを一時停止する私達は、懸濁バッファーを。 </li><li> OD 260で分光光度計を用いてビリオン（mg / ml）の濃度を測定します。 </li></ol><img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/3645/3645eq1.jpg" />注意：RNAの内容に基づいて、BMVの吸光係数は5 4です。 <ol start="19"><li> TEM下に表示することにより、ウイルス粒子の純度を確認します（図A） </li></ol> 4。 in vitroでアセンブリのためのキャプシドタンパク質サブユニットの準備<ol><li> 5 1Xウイルス解離バッファー（; 50mMトリスHCl、pH7.5で; 1.0mMのEDTA 1.0mMのDTTおよび0.5mM PMSF、0.5MのCaCl 2）の1リットルを準備します。 </li><li> Sambrook ら 6に記載の透析膜を準備します。 </li><li>透析バッグにウイルスの精製に必要な濃度を分注する。 </li><li> 1Xウイルス解離緩衝液を含むビーカーにウイルスを含む透析バッグを置きます。 </li><li> 4°C薬用で24時間透析eは、攪拌した。 </li><li> 4℃で15分間12,000 xgで24時間遠心した後、透析バッグから溶液を回収℃にこれは解離ビリオンからBMV RNAを分離します。 </li><li> 4ペレット°Cの任意の非解離ウイルス粒子で3時間ベックマン遠心機で35,000 rpmで遠心上清を収集します。 </li><li>上清を収集します。 </li><li>この段階では、解離したキャプシドタンパク質のサブユニットから任意の汚染ビリオンRNAを除去するために不可欠です。これを行うには、ステップ8から上清を高速遠心（3時間で30,000 rpmで、続いて任意のRNAを（RNA 1Xアセンブリバッファには、以下を参照してください）​​を加えることなく、キャプシドタンパク質サブユニットの再構築上の夜の別のラウンドを行うべきである4℃）、ペレット、任意の組み立てビリオンへ。この再構築ステップの後、上清を含有するコ​​ートタンパク質のサブユニットは、任意の残留汚染RNAの自由でしょう。しかし、これを確実にするためには、vで、追加を実行することをお勧めしますRNA 1Xアセンブリバッファを使用した場合にのみコートタンパク質サブユニットと再構築itro。再構築上の夜の後、準備が（TEMを使用して確認）組み立てられたビリオンの自由でなければなりません。 </li><li> OD 254および280 nmで測定することにより、またはそのようなブラッドフォードアッセイのような他の方法により、キャプシドタンパク質サブユニットの濃度を決定します。 </li><li> 12から15パーセント解離キャプシドタンパク質サブユニットの整合性を決定するためにウェスタンブロット、続いてSDS-PAGEを行います。 </li></ol> （5）RNA の in vitroアセンブリでビリオンを含む<ol><li>ビリオンに再組み立てするRNA転写物を調製し、濃度7を計算します。 </li><li>カプシドタンパク質のサブユニットを混在させると1:5（wt / wt）の5の比率で転写RNAの。 </li><li>透析バッグと、任意のリークを防ぐため、適切にセキュリティで保護された上記混合物を分注する。 </li><li>千ミリリットルを準備します。 5 RNA 1Xアセンブリバッファ（; 50mMトリス-HCl、pH7.2で; 10mMのKClを5mMのMgCl 2、1.0mMのDTT 50mMのNaCl）の。 </li><li>ビーカーに1Xアセンブリ緩衝液に対して反応混合物を含有する透析バッグを置いて、かき混ぜる。 </li><li>穏やかに撹拌により24時間4℃で再アセンブリ反応を透析。 </li><li> 24時間後に透析バッグから物を収集し、RNAアセンブリバッファの1.5ミリリットルを追加します。 </li><li> 30分間低速（2,000×g）で遠心分離することによってセントリコン-100カラムを介して、この混合物を渡します。 </li><li> 30分間、4℃でアセンブリバッファの1.5ミリリットルで一回カラムを洗浄します。 </li><li>二回上記洗浄工程を繰り返します。 </li><li>最後に、4℃で10,000 gで遠心分離して再組み立てビリオンを溶出℃を5分間。 </li><li> OD 260 nmでビリオン濃度を推定する。 </li></ol> 6。光学ウイルスゴーストの作製（OVGs） <ol><li>所望の濃度比で精製されたキャプシドタンパク質（このレポートで使用されているインドシアニングリーンとキャプシドタンパク質の重量比が1:10であった）にグリーン（ICG）8インドシアニン追加<html> dは、ピペッティングにより混和します。 </li><li>キャプシドタンパク質を透析とOVGアセンブリバッファ（1 M NaCl及び1mMのDTT、pH4.8、50 mMのNAAC; 1mMのEDTA）に対してソリューションをICGの4℃で2​​4時間C。 </li><li> 24時間後、4℃で1時間90,000 rpmで透析バッグ（12 kDaの孔の大きさ）と、遠心機から溶液を回収°C（図B） </li><li> 4℃でボルテックスまたはそれが一晩BMVの懸濁緩衝液中でそれ自体で中断することにより、上清を除去し、BMV懸濁バッファーに懸濁し</li><li> TEMによるOVGs（図C）の形態を確認します。 </li><li> 240 nmから分光光度計（ローリー50、バリアン社製）を用いて950 nmの吸光度を測定し、ICGの存在は、700 nmと790 nmの約8署名の吸光度のピークが確認された。 （図D） </li><li> 〜700 nmと〜800 nmでの典型的なICG蛍光ピークは、分光光度計を使用してOVG液の620 nmの励起（図D）（Fluorolog 3、ジョバンイボン - ）に見ることができます。 </li></ol>_title &quot;&gt; 7。代表的な結果<img alt="図" src="/files/ftp_upload/3645/3645figA.jpg" /> N.から精製されたネガティブ染色BMVビリオンの図A. TEM像ベンサミ植物は、すべての3つの野生型BMVのagroconstructs（スケールバー= 100 nm）の混合物でagroinfiltrated。 <img alt="図B" src="/files/ftp_upload/3645/3645figB.jpg" /> in vitroでの図Bペレットは、高速遠心分離後に含むOVGs ICGの組み立て。 <img alt="図C" src="/files/ftp_upload/3645/3645figC.jpg" /> ネガティブ染色ICGの含むOVGsの図CのTEM像（スケールバー= 100 nm）を。 <img alt="図D" src="/files/ftp_upload/3645/3645figD.jpg" /> OVGs 図D.吸光度（上）および蛍光（下）スペクトル。 OVG放出wに対して使用される励起波長620 nmの。

<ol>
	<li>Annamalai, P., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-independent+expression+of+genome+components+and+capsid+protein+of+brome+mosaic+virus+in+planta:+a+functional+role+for+viral+replicase+in+RNA+packaging.">Replication-independent expression of genome components and capsid protein of brome mosaic virus in planta: a functional role for viral replicase in RNA packaging.</a> Virology. 338, 96-111 (2005).</li><li>Annamalai, P., Rofail, F., Demason, D. A., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication-coupled+packaging+mechanism+in+positive-strand+RNA+viruses:+synchronized+coexpression+of+functional+multigenome+RNA+components+of+an+animal+and+a+plant+virus+in+Nicotiana+benthamiana+cells+by+agroinfiltration.">Replication-coupled packaging mechanism in positive-strand RNA viruses: synchronized coexpression of functional multigenome RNA components of an animal and a plant virus in Nicotiana benthamiana cells by agroinfiltration.</a> J. Virol. 82, 1484-1495 (2008).</li><li>Annamalai, P., Rao, A. L., Foster, N., Johansen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plant Virology Protocols. 451, 251-264 (2008).</li><li>Lane, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bromoviruses.">The bromoviruses.</a> Adv. Virus Res. 19, 151-220 (1974).</li><li>Choi, Y. G., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+studies+on+bromovirus+capsid+protein.+VII.+Selective+packaging+on+BMV+RNA4+by+specific+N-terminal+arginine+residuals.">Molecular studies on bromovirus capsid protein. VII. Selective packaging on BMV RNA4 by specific N-terminal arginine residuals.</a> Virology. 275, 207-217 (2000).</li><li>Sambrrok, J., Russel, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. A Laboratory Manual. , (2001).</li><li>Dreher, T. W., Rao, A. L., Hall, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+in+vivo+of+mutant+brome+mosaic+virus+RNAs+defective+in+aminoacylation.">Replication in vivo of mutant brome mosaic virus RNAs defective in aminoacylation.</a> J. Mol. Biol. 206, 425-438 (1989).</li><li>Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+nano-constructs+composed+of+genome-depleted+brome+mosaic+virus+doped+with+a+near+infrared+chromophore+for+potential+biomedical+applications.">Optical nano-constructs composed of genome-depleted brome mosaic virus doped with a near infrared chromophore for potential biomedical applications.</a> A.C.S. Nano. 5, 1243-1252 (2011).</li><li>Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+viral+movement+protein+prevents+spread+of+the+gene+silencing+signal+in+Nicotiana+benthamiana.">A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana.</a> Cell. 103, 157-167 (2000).</li><li>Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Agrobacterium-mediated+transient+assays+of+gene+expression+in+lettuce,+tomato+and+Arabidopsis.">Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis.</a> Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).</li></ol>

我々は、開示することは何もありません。

ここに提示Agroinfiltrationのアプローチは、広く植物ウイルスの広い範囲に適用することができます。このアプローチの特徴機能は同じ細胞一般に植物ウイルスの日常的に使用される機械的な接種に関連付けられている主な欠点に複数のagroconstructの配信を同期化されています。in vivoおよび in vitroのアセンブリの研究ではモデルとしてブロムモザイクウイルスを用いて効率的?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> MESのナトリウム塩</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> M2993 </td></tr><tr><td>インドシアニングリーン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> I2633 </td></tr><tr><td>ベックマン超遠心</td><td>ベックマン·コールター</td><td>モデル：L8-70M </td></tr><tr><td>セントリコン-100カラム</td><td>ミリポア</td><td> YM-100 </td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>キャリー50、バリアン社</td><td>部品番号 10068900 </td></tr><tr><td>蛍光光度計</td><td> Fluorolog 3、ジョバンイボン - 。 </td><td>部品番号FL3-21 </td></tr></tbody></table>

simple and robust in vivo and in vitro approach for studying virus assembly

ヒト、動物や植物、子孫カプシド成熟し安定したウイルス粒子へのプラスセンスRNAゲノム病原性のウイルスで、特定のホストの感染の確立時に基本的な位相である。したがって、キャプシドの研究では、ノウハウ感染性ウイルス粒子を形成するためにウイルスのアセンブリを制御するメカニズムのに関する情報を解読する。このような情報はウイルスの拡散や病気のコントロールを抑制する新規の方法を定式化する際に不可欠である。ウイルスのキャプシドは 、in vivo および in vitro で研究することができる。 in vivoでのゲノムのカプシドは、巨大分子の相互作用と細胞内局在を含む高度に調節の選択のプロセスです。したがって、in vivoでのウイルスのキャプシドを包含するイベントを分析するために主要な研究は、ウイルスが増殖し、組み立てる方法を理解する基本的な知識を提供するであろう。最近のin vitroカプシドに医学IMAの分野で研究のために利用されていますパトンと治療への応用。非エンベロープ植物ウイルスは、負に帯電した異物の in vitro でのキャプシドでの合弁会社ではるかに先に立っている。ブロムモザイクウイルス（BMV）、植物への非エンベロープ多RNAウイルスの病原性は、in vivoおよび in vitro におけるゲノムパッケージングを研究するためのモデル系として使用されています。 ニコチアナベンサミプラントのカプシド形成アッセイのために、 アグロバクテリウム媒介一過性の発現は、agroinfiltrationなどを参照して同じセルに複数のコンポーネントの同期配信および発現のための効率的で堅牢な技術です。このアプローチでは、desiredviral mRNAのcDNAを運ぶバイナリープラスミドベクターを有するアグロバクテリウムツメファシエンスの細胞の懸濁液を1 mlの使い捨て注射器（針なし）よりも洗練されたものを使用していない間隙withina葉に浸透されています。植物細胞へのDNA挿入物の転送では、このプロセスの結果、T-DNAインサートは、核内に一時的に留まり、その後ホストポリメラーゼIIによって転写される、一過性の発現につながる。得られたmRNA転写物は（キャップ​​とポリアデニル化）し、翻訳の質に輸出されています。インキュベーションは、約24から48時間後、浸潤葉のセクションはmicroscopyor生化学分析のためにサンプリングすることができます。 Agroinfiltration同時にトランスフェクトされる細胞の大量（数百から数千個）を許可します。 in vitroでのキャプシドのために、BMVの精製ウイルス粒子を遠心分離によりRNAを除去すると非解離のビリオンに続く解離緩衝液を含む塩化カルシウムに対して透析によってキャプシドタンパク質に解離しています。ゲノム枯渇キャプシドタンパク質のサブユニットは、希望するウイルスゲノムのコンポーネントまたはそのような色素インドシアニンなどの非ウイルス性のコンポーネントで組み立てられます。

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Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

を経由して植物細胞に複数のウイルス成分の配信を同期化する、シンプルで効率的かつ強力な方法<em&gt;アグロバクテリウム</em&gt;媒介一過性の発現が記載されている。このアプローチは、レプリケーションを研究するための従順で、カプシドは続く<em&gt; in vitroで</em&gt;再構築の非ウイルス性成分のゲノムには、生物医学アプリケーションに適した光学ウイルスの幽霊を枯渇。

シンプルで堅牢な<emin vivoでの>と in vitroで</emウイルスの組み立てを学ぶための>アプローチ

In viruses with positive-sense RNA genomes pathogenic to humans, animals and plants, progeny encapsidation into mature and stable virions is a cardinal ...

simple-robust-vivo-vitro-approach-for-studying-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

12.1K ビュー.  University of California, Riverside. を経由して植物細胞に複数のウイルス成分の配信を同期化する、シンプルで効率的かつ強力な方法アグロバクテリウム媒介一過性の発現が記載されている。このアプローチは、レプリケーションを研究するための従順で、カプシドは続く in vitroで再構築の非ウイルス性成分のゲノムには、生物医学アプリケーションに適した光学ウ?...

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Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that influence this interaction could lead to improved understanding of disease pathogenesis and thus influence vaccine or therapeutic design. Hence, the development 
of methods to probe this interaction would be useful. Recent advancements in fluorophores development1-3 and imaging technology4 can be exploited to 
improve our current knowledge on dengue pathogenesis and thus pave the way to reduce the millions of dengue infections occurring annually.

The enveloped dengue virus has an external scaffold consisting of 90 envelope glycoprotein (E) dimers protecting the nucleocapsid shell, 
which contains a single positive strand RNA genome5. The identical protein subunits on the virus surface can thus be labeled with an amine reactive dye and visualized 
through immunofluorescent microscopy. Here, we present a simple method of labeling of dengue virus with Alexa Fluor succinimidyl ester dye dissolved directly in a sodium 
bicarbonate buffer that yielded highly viable virus after labeling. There is no standardized procedure for the labeling of live virus and existing manufacturer&#x2019;s protocol 
for protein labeling usually requires the reconstitution of dye in dimethyl sulfoxide. The presence of dimethyl sulfoxide, even in minute quantities, can block 
productive infection of virus and also induce cell cytotoxicity6. The exclusion of the use of dimethyl sulfoxide in this protocol thus reduced this possibility. 
Alexa Fluor dyes have superior photostability and are less pH-sensitive than the common dyes, such as fluorescein and rhodamine2, making them ideal for 
studies on cellular uptake and endosomal transport of the virus. The conjugation of Alexa Fluor dye did not affect the recognition of labeled dengue 
virus by virus-specific antibody and its putative receptors in host cells7. This method could have useful applications in virological studies.

Taking advantage of the advancements in fluorophore development and imaging technology, a simple method of Alexa Fluor labeling of dengue virus was devised to visualize the early interactions between virus and cell.

のAlexa Fluor ®標識を通じてデング熱ウイルスの可視化

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

免疫・感染学

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by Russel and Burch in Hume's 3Rs (replacement, reduction, refinement), the utilization of animal models in scientific research is under constant pressure to identify new methodologies to reduce animal usage while improving scientific accuracy and speed. A major challenge to Hume's principals however, is how to ensure the studies are statistically accurate while reducing animal disease morbidity and overall numbers. Vaccine efficacy studies currently require a large number of animals in order to be considered statistically significant and often result in high morbidity and mortality endpoints for identification of immune protection. We utilized in vivo imaging systems (IVIS) in conjunction with a firefly bioluminescent enzyme to progressively track the invasion of the central nervous system (CNS) by an encephalitic virus in a murine model. Typically, the disease progresses relatively slowly, however virus replication is rapid, especially within the CNS, and can lead to an often, lethal outcome. Following intranasal infection of the mice with TC83-Luc, an attenuated Venezuelan equine encephalitis virus strain modified to expresses a luciferase gene; we are able to visualize virus replication within the brain at least three days before the development of clinical disease symptoms. Utilizing CNS invasion as a key encephalitic disease development endpoint we are able to quickly identify therapeutic and vaccine protection against TC83-Luc infection before clinical symptoms develop. With IVIS technology we are able to demonstrate the rapid and accurate testing of drug therapeutics and vaccines while reducing animal numbers and morbidity.

In Vivo Imaging Systems IVIS Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Utilizing luciferase and in vivo imaging systems (IVIS) as a novel means to identify disease endpoints before clinical developments occur. IVIS has allowed us to visualize in real time the invasion of encephalitic viruses over multiple days, providing a more accurate disease model for future study. It has also allowed us to identify the potential protective features of antivirals and vaccines faster than currently utilized animal models. The capability to utilize individual animals over multiple time points ensures reduced animal requirements, costs, and overall morbidity to the animals utilized ensuring a more humane and more scientific means of disease study.

神経侵襲性脳炎ウイルスのin vivoイメージングシステム（IVIS）検出で

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by ...

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways activated during cardiovascular pathologies are, however, limited by the lack of robust and physiologically relevant methods. In order to model pathological vascular events we have developed an in vitro assay for studying the interaction between endothelium and whole blood. The assay consists of primary human endothelial cells, which are placed in contact with human whole blood. The method utilizes native blood with no or very little anticoagulant, enabling study of delicate interactions between molecular and cellular components present in a blood vessel.
We investigated functionality of the assay by comparing activation of coagulation by different blood volumes incubated with or without human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Whereas a larger blood volume contributed to an increase in the formation of thrombin antithrombin (TAT) complexes, presence of HUVEC resulted in reduced activation of coagulation. Furthermore, we applied image analysis of leukocyte attachment to HUVEC stimulated with tumor necrosis factor (TNF&#945;) and found the presence of CD16+ cells to be significantly higher on TNF&#945; stimulated cells as compared to unstimulated cells after blood contact. In conclusion, the assay may be applied to study vascular pathologies, where interactions between the endothelium and the blood compartment are perturbed.

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).

小説<em&gt;インビトロ</em&gt;ヒト全血と内皮の間の相互作用を研究するためのモデル

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

西ナイルウイルス変異株の感染に対するMyD88非介在細胞性免疫応答のインビトロ分析

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

治療薬にリンパ腫細胞の感度での役割を決定するために、好中球の単離と解析

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

勾配遠心によるインフルエンザAウイルスキャプシドのインビトロ分解で

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

突然変異体ワクシニアウイルスベクターを構築するためのシンプルで効率的なアプローチ

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by pharmaceutical companies is a market opportunity, but it is also a strategy to increase drug accessibility and reduce therapy-associated costs. The protocols detailed here describe the evaluation of target binding and CDC induction by rituximab in Daudi cells. These two functions require different structural regions of the antibody and are relevant to the clinical effect induced by rituximab. The protocols allow the side-to-side comparison of a reference rituximab and a marketed rituximab biosimilar. The evaluated products showed differences both in target binding and CDC induction, suggesting that there are underlying physicochemical differences and highlighting the need to analyze the impact of those differences in the clinical setting. The methods reported here constitute simple and inexpensive in vitro models for the evaluation of the activity of rituximab biosimilars. Thus, they can be useful during biosimilar development, as well as for quality control in biosimilar production. Furthermore, the presented methods can be extrapolated to other therapeutic mAbs.

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

This protocol describes the in vitro comparison of two key functional characteristics of rituximab: target binding and complement-dependent cytotoxicity (CDC) induction. The methods were employed for a side-to-side comparison between reference rituximab and a rituximab biosimilar. These assays can be employed during biosimilar development or as a quality control in their production.

治療抗体間の標的結合およびCDC誘導を比較するためのインビトロ法：Biosimilarity Analysisにおける応用

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed feeder cells, purified NK or T cells with as much as 10 mL of blood, or a high-dose of IL-2. This study presents a new method with a powerful and simple strategy to establish NK and T cell lines by culturing the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) with the addition of recombinant human IL-2 (rhIL-2), and uses as little as 2 mL of whole blood. The cells can proliferate quickly in two weeks and be maintained for more than 3 months. With this method, 7 NK or T cell lines have been established with a high success rate. This method is simple, reliable, and applicable to establishing cell lines from more cases of CAEBV or NK/T cell lymphoma.

A simple method for obtaining NK and T cell clones from CAEBV patients was developed with high efficiency, a small amount of peripheral blood, and a low-dose of IL-2.

NK と慢性的なアクティブなエプスタイン ‐ バーウイルス感染症から T 細胞株を確立する効率的かつ簡単な方法

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity of antibodies or serum to enhance infection in impermissible cell lines have relied on using viral output in the media followed by plaque assays to quantify infection. More recently, these assays have examined Dengue virus (DENV) infection in the cell lines using fluorescently labeled antibodies. Both these approaches have limitations that restrict the widespread use of these techniques. Here, we describe a simple in vitro assay using Dengue virus reporter viral particles (RVPs) that express green fluorescent protein and K562 cells to examine antibody dependent enhancement (ADE) of DENV infection using serum that was obtained from rhesus macaques 16 weeks after infection with Zika virus (ZIKV). This technique is reliable, involves minimal manipulation of cells, does not involve the use of live replication competent virus, and can be performed in a high throughput format to get a quantitative readout using flow cytometry. Additionally, this assay can be easily adapted to examine antibody dependent enhancement (ADE) of other flavivirus infections such as Yellow Fever virus (YFV), Japanese Equine Encephalitis virus (JEEV), West Nile virus (WNV) etc. where RVPs are available. The ease of setting up the assay, analyzing the data, and interpreting results makes it highly amenable to most laboratory settings.

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

We describe a simple and easy protocol for measuring antibody dependent enhancement of infection by Zika virus convalescent serum using Dengue virus Reporter Viral Particles.

単純なフローサイトメトリーによるジカ回復期血清を用いたデング ウイルスのIn Vitro抗体依存強化測定法

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

シンプルで堅牢なと in vitroでアプローチ