この研究は、ウィーン市、Österreichische 協会 für Laboratoriumsmedizin und Klinische Chemie の市長の医療科学基金によって支えられました。

ここで説明したすべてのメソッドは動物愛護とウィーンの医学大学の利用委員会によって承認され実施によると、連合の欧州研究所動物科学連合 (FELASA)。制度や政府の承認の後だけでなく、技術的に精通しているスタッフによってのみこのプロトコルで説明したすべての手順は実行されることに注意してください。
1. HFD 給電マウス
注: は、食料と水を無料で 12 h 光/暗いサイクルですべての c57bl/6 j マウスを保持します。
<ol><li>6 週齢、場所でマウス、肥満を誘発する、HFD (40-60% 脂肪カロリー) の 8-12 週の低脂肪ダイエット (LFD) リーン コントロール グループを供給しながら (10% 脂肪カロリー)。</li>
	<li>週単位でマウスの体重を決定します。ウェイト カーブ HFD 供給グループの高い斜面で、両方のグループで同じようなパターンが表示されます。</li>
</ol>2。 OGTT
注: 15 分毎、OGTT 中血液サンプリング タイム ポイントが選択されている場合実験対象となる最大並行して、15 匹のマウスのマウスあたり少なくとも 1 分処理時間を持つために。
<ol><li>OGTT の前日準備<ol>
<li>マウスに飲料水へのアクセスがあることを確保しながら新鮮な寝具と高速 (14 h) をテストする前に夜間にケージにマウスを転送 (例えば、18:00 次の朝 8:00 に開始時刻のために食べ物を削除) します。 メモ: 断食マウス一晩は標準的なアプローチが短く高速 (5 〜 6 時間) がより生理的マウス (詳細については説明を参照)。</li>
	</ol></li>
	<li>準備日に実験 (ただし実験開始前)<ol>
<li>20% ブドウ糖液 10 mL を準備 (溶解 d-(+)-グルコース蒸留水で)。 注: 動物に投与されるすべての試薬は、薬理学的グレードでなければならないと滅菌します。</li>
		<li>5 μ L で各サンプリング時点の各マウス 1 つの井戸を埋めることでプラズマ コレクションの 96 ウェル プレートを準備 NaEDTA (0.5 M EDTA、pH 8.0 で 0.9% 食塩水、常温保管)。実験では、氷にこのプレートを保存します。 注: は、補足図 1詳細なチェックリストを参照してください。</li>
	</ol></li>
	<li>すべてのマウスの体重を測定し、マウスは簡単に区別できる (例えばマウス 1 = 1 ダッシュ、マウス 2 = 2 ダッシュのなど) を作るために永久的なマーカーと彼らの尾をマークします。</li>
	<li>グルコース測定と採血 (図 2)<ol>
<li>慎重に鋭いはさみ("バリアント"図 2の A) を使用して尻尾の先端の 1-2 mm を切った。常に溶血または血糖値測定のための新しい血液サンプルを取る前に組織液の混入を避けるために血の最初の滴を拭き取ってください。基底血糖値 (= 0 の時点)、glucometer との測定のため、少量の血液サンプル (〜 3 μ L) を描画します。 注意: を確認し、glucometer のテスト ストリップの充満数を調整します。 注: 代替血液サンプリング方法として鋭いメスの刃 (図 2には"バリアント B") でマウスの外側尾静脈をニックします。外側尾静脈に多数のサンプル、尾の根元に向かって尻尾先端から尾の長さに沿って約 3 分の 1 は、通常します。局所麻酔クリームの使用をお勧めします。少なくとも 30 の軟部組織に指の圧力を適用することによって血流を停止 s 動物は檻に戻される前に。</li>
		<li>新鮮な毛細管 (キャピラリー チューブの水平維持) を使用して血液サンプル (約 30 μ L) を収集します。ピペットを用いたキャピラリー チューブの端の上部にピペット チップを入れて、慎重に空気の泡を回避しながら 96 ウェル プレートのウェルに集められた血を押すキャピラリー チューブを空にします。すべてのマウスの 1 つずつのこの手順を繰り返します。 注: キャピラリー チューブを介して血のコレクションのための代替血液を収集し、収集のドロップする (例えば、30 μ L) 適切なボリューム調整ピペットを使用して血液パラフィン フィルムとピペットで尻尾からは EDTA 溶液に。厳密にその後グルコースとインスリンの測定に影響を与える可能性があります血または glucometer テスト ストリップとゼリーに石油の接触を避けます。 注意: OGTT は非常にマウスのストレス: 無駄のないマウスを失うことが前後の体重の 15% 夜行高速で。さらに、別の時点で採血は血液のかなりの損失につながります。簡単に採血、ワセリンと mouse-tail を慎重にマッサージすることが可能です。 注: 制度のガイドラインは、一定期間内に集められた血の許容量を制限があります。サンプリング ボリュームと縦長に許可されている最大値を超えないように調整してください。マウスの体重の合計を計算に使用する血液の撤退を許可します。</li>
	</ol></li>
	<li>体重 (体重 1 g グルコース/kg; 3 g/kg まで増加するこのことができます) に基づくブドウ糖輸液の必要量を計算にすべてのマウスの経口投与による投与されます。たとえば、30 g の体重を持つマウスは、30 mg のグルコースを管理する 20% ブドウ糖溶液を 150 μ l 添加を必要があります。 注: マウスの重量を基にグルコースの投与量を標準的な手順です。OGTT を計算する必要がありますのブドウ糖の投与量が、リーンに基づく体組成データが利用可能な場合本体質量 (詳細については説明を参照)。</li>
	<li>グルコースの投与<ol>
<li>準備に関するすべてのことは、前もって全体の実験中に必要な (タイマー、実験記録シート、グルコース モニターとストリップ、毛細血管、注射器、グルコース溶液、96 ウェル プレート、メス、電卓、バランス、永久的なマーカー、ベンチのペーパー、ピペット チップ、そして手袋をして)。</li>
		<li>グルコース アプリケーションのしっかりと首筋を把握することによりマウスを抑制します。マウスの抑制からのねじれを防ぐために正しく戻って頭を傾けると首の周りの皮膚に十分な硬さを適用されます。また、マウスが正しく呼吸できることを確認します。 注: グルコースの投与を開始すると、良い時間管理は非常に重要です。</li>
		<li>慎重に餌針を使用して胃の中に直接 (2.5 のステップに基づいて) グルコース溶液を管理します。慎重に直接食道に向かって口から給餌針。針を飲み込むには、マウスを許可する: マウスの下の食道/胃に完全、針のシンクします。その後、グルコース溶液 (図 3 a) を挿入します。<ol>
<li>どんな抵抗が満たされる動物はすぐに戦う場合や、針を撤回し、それを移動します。最初の強制経口投与後すぐにタイマーを開始および他のすべてのマウスに 1 分間隔でブドウ糖を管理します。 注: それが舐めていると嚥下、餌針の簡単挿入容易に刺激するマウスの口に餌針から直接ブドウ糖溶液の一滴を適用するあります。これは真剣に動物を傷つける可能性があります、餌針を挿入する場合は、圧力は適用されません。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>15 分後、glucometer と血糖値を測定し、また採血 (〜 30 μ L) (ステップ 2.4 で説明されている詳細) として各マウスの同じ順序で彼らを注入したよう。 注: 時間管理は非常に重要です。強制経口投与と同じ時間間隔を使用して可能な限り、従ってください。結果を変更可能性があります、ストレスを軽減することと、全体の手順中に制限を最小限に抑制自由に移動マウスをしましょう。片方の手で尻尾を牛乳し、他の血液を収集します。</li>
	<li>(例えば30、45、60、90、120、150、およびグルコースの投与後 180 分で) 期待される結果によって選択した時点で 2.7 手順を繰り返します。選択した時間ポイントが 120 分を超える場合、マウスに飲料水へのアクセスがあることを確認します。マウス常に飲料水へのアクセスがあることを確認します。実験を完了したら、マウスを食料と水装備ホーム檻に返します。 注意: OGTT はマウスに非常に疲れるです。したがって、ITT など次の代謝テストを実行する前に、少なくとも 1 週を待ちます。</li>
	<li>2,500 × g、30 分、4 ° C での血液サンプルを遠心実験の後分析まで、-20 ° C でプレートの井戸を空にして保管して上清 (プラズマ) を転送します。<ol>
<li>存在する場合は、サンプルの溶血を記録 (セクション 3 を参照してください)。</li>
	</ol></li>
	<li>市販 elisa 法を用いた血漿インスリン キット (材料の表を参照) を決定するキットの製造元の指示に従います。 注: 空腹の状態に応じてだけでなく、調査のマウスの代謝には、この試金の時に困難が発生する: 夜間空腹時インスリン レベル (時点 0) が非常に低く、したがって検出限界の近くにあります。この問題を回避するには、推奨される血漿量の量を倍増し、ELISA アッセイの結果をそれに応じて半減します。一方でマウス HFD 与えられたマウスで特に OGTT、中にインスリンのピークに達すると場合、インスリン レベルは検出限界を超える可能性があります: サンプルを希釈 (例えば、10 倍 0.9 %nacl)、ELISA アッセイを繰り返します。血漿検体の溶血は、読み取り値の減少、インスリンの低下につながる可能性があります。劣化は、時間、温度、およびサンプルのヘモグロビン濃度に依存します。寒さやインスリンの低下を減らすために氷の上に、溶血サンプルを常に保ちます。</li>
</ol>3. ITT
注: OGTT (ワセリン使い glucometer、血マウスの取扱い) について同じ注意は ITT の実行時に適用するまたあります。たとえば、すべての注射行なう 15 分以内で 1 分間隔で並列で 15 匹のマウスをテストする場合。ITT、毛細管での採血の後に収集はオプションです。
<ol><li>実験前に、の準備<ol>
<li>マウスに飲料水へのアクセスがあることを確保しながら、インスリン注射の前に少なくとも 2 時間マウスを高速 (例えば、8:00 で食品を削除、マウスをテスト 2 5 h 後)。</li>
		<li>0.9% でインスリン縮尺を希薄 NaCl (株式: 100 U/mL インスリン; 作業濃度 0.1 U/mL) 20% ブドウ糖を準備 (d-(+)-グルコース溶液に溶解した蒸留水) マウスが低血糖になった場合に投与します。 注: 一晩で発生する可能性がありますそれ以外の場合、低血糖を避けるために短い高速動物を絶食後、ITT は、通常実行されます。動物に投与されるすべての試薬が薬理学的グレードでなければならないと滅菌します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>マウスの体重を測定、尾をマーク、鋭いはさみを使用して尻尾先端をカットし、ステップ 2.4 で OGTT は前述のように基底の血ブドウ糖のレベルを測定します。</li>
	<li>インスリン注射<ol>
<li>腹腔内にインスリンを注入する (0.75 U インスリン/kg 体重、事前計算)、首筋法によるマウスを抑制します。</li>
		<li>滅菌の 27 か 30 ゲージの針の不快感と、注射部位の感染のリスクを避けるために各動物のため、新鮮なを使用します。 注: 皮膚の殺菌インスリン投与の期間を延ばすことができる、動物に付加的な妨害を起こすことができます。したがって、それはお勧めしません。</li>
		<li>動物の腹側を公開するわずかな角度でマウスの頭を傾けてください。動物の腹部 (図 3 b) の右下の象限に滅菌針と 30 ° の角度で傾斜面を配置します。最初のマウスは、注入後すぐに、タイマーを開始します。 注: 低用量 ITTs (0.1 U/kg) が具体的には肝のインスリン感受性を評価するために行われます。投与量を基づかせている間標準的な手順は、体重に基づいて注入量の計算、OGTT は体組成データが利用可能な場合は無駄のない体の質量が最寄り。</li>
	</ol>
</li>
	<li>選択した時点で (例えば15、30、45、60、90 分後) に血糖値を測定します。 注: インスリン マウス13〜 10 分の短い半時間があり、(例えば2 h 後) インスリン投与後半違い表さない場合がありますインスリン作用の直接影響。マウスは低血糖になる場合に 20% ブドウ糖溶液を管理 (血糖値 35 mg/dL 以下) と死亡のリスクは、します。</li>
	<li>最終的な時間のポイントの後、食料と水をたっぷり用意してホーム ケージに戻ってマウスを配置します。</li>
</ol>

<ol>
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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+experiment+in+centralized+mouse+phenotyping:+the+Vanderbilt+experience+and+recommendations+for+evaluating+glucose+homeostasis+in+the+mouse.">NIH experiment in centralized mouse phenotyping: the Vanderbilt experience and recommendations for evaluating glucose homeostasis in the mouse.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 297 (4), E849-E855 (2009).</li><li>Pacini, G., Omar, B., Ahren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+and+models+for+metabolic+assessment+in+mice.">Methods and models for metabolic assessment in mice.</a> J Diabetes Res. 2013, 986906 (2013).</li><li>Polonsky, K. S., Rubenstein, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-peptide+as+a+measure+of+the+secretion+and+hepatic+extraction+of+insulin.+Pitfalls+and+limitations.">C-peptide as a measure of the secretion and hepatic extraction of insulin. Pitfalls and limitations.</a> Diabetes. 33 (5), 486-494 (1984).</li><li>Hughey, C. C., Wasserman, D. H., Lee-Young, R. S., Lantier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approach+to+assessing+determinants+of+glucose+homeostasis+in+the+conscious+mouse.">Approach to assessing determinants of glucose homeostasis in the conscious mouse.</a> Mamm Genome. 25 (9-10), 522-538 (2014).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

糖尿病および世界の人口に関連する疾患の有病率高がある分子メカニズム、予防、および19疾患の治療に対処研究強い要件。提案するプロトコルは、世代 HFD マウスの全身代謝変化の評価のための強力なツールは、OGTT と ITT、伝導と同様に代謝の研究に使用される堅牢な動物モデルの確立した方法をについて説明しますなどインスリン抵抗性。本稿で示される方法は、薬理学...

先進国の肥満や糖尿病は、物理的な不活動と加工食品の過剰な消費の急速な都市化、工業化、グローバル化によって駆動される効果による流行の寸法を達した。ただし、研究インスリン抵抗性およびそれの併存、高脂血症や動脈硬化、最後の十年の間に卓越性を得たが、健康および病気の代謝を調節する複雑な生物学的メカニズムのまま不完全理解、まだ防ぎ1これらの疾患を治療する新しい治療法のための緊急の必要性があります。
インスリン、およびそれの counter-regulatory ホルモンのグルカゴン細胞のエネルギー供給と栄養素のバランス、適切な全身血ブドウ糖濃度2をまた維持の主レギュレータとして役立ちます。インスリン分泌の主要な刺激の 1 つとして膵 β 細胞によるグルコース自体機能他栄養素、液性因子としてそれ以上の神経入力は、この応答を変更します。インスリンは、筋肉や脂肪細胞に余分な血中グルコースの拡散を促進し、解糖系と同様にタンパク質や脂肪酸合成をそれぞれさらに活性その結果供給状態の同化のプロセスをトリガーします。さらに、インスリンは、糖新生を抑制することによって肝糖放出を抑制します。慢性的な過剰なエネルギー消費やメタ炎症は障害の結果、下流のシグナル伝達経路の変化と同様に、インスリン受容体の発現のダウンレギュレーションにより末梢のインスリン抵抗性と高インスリン血につながる肝糖生産3,4,5,6の不十分な抑制と同様、インスリンを介したグルコース処理する感度。
病の遺伝、栄養、または実験的誘導と動物モデルの広い範囲は、その付随の病気7 と同様、糖尿病の様々 な形態およびインスリン抵抗性の分子機構を研究する優れたツールであると証明されています。.典型的な例は広く使われていると定評の HFD 誘発マウス モデルは、代謝効率が低下、インスリン抵抗8,の結果での組み合わせで食事摂取量増加による急速な体重増加によって特徴付けられる9しますよく使用するインスリン抵抗性の指標とグルコースの他の全身の変化は、グルコースの投与に対する障害耐性だけでなく、両方のモデル動物と人間、空腹時血中グルコースとインスリン濃度の上昇。代謝。したがって、基底状態で、または刺激に監視の血中グルコースとインスリン濃度、簡単にアクセス可能な読み出しです。
この議定書の概要 HFD 給電マウスとして経口ブドウ糖負荷試験 (OGTT) とインスリン抵抗性試験 (ITT)、代謝の表現型を特徴付けるそして調査するために役立つ 2 つの頻繁に使用されるメソッドの生成糖代謝の変化。詳細は、時間の経過とともに経口投与されたグルコース負荷とインスリン分泌の処分を評価で OGTT をについて説明します。さらに、インスリンのボーラスへの応答の血中グルコース濃度を監視することによって全身のインスリン作用を調査する ITT を実施する方法の指示を提供します。この資料で説明されているプロトコルは定評あり複数研究10、11,12で使用されています。成功を高めるを助けるかもしれないわずかな変更、に加えて、我々 は実験デザインとデータ解析と同様有用なヒント潜在的な落とし穴を避けるのためのガイドラインを提供します。ここ記載されているプロトコルは、全身糖代謝とインスリン抵抗性などの関連疾患、遺伝的、薬理学的、食物、および他の環境要因の影響を調査するための非常に強力なツールをすることができます。グルコースとインスリン刺激、他は、個々 の研究の目的によって刺激のためさまざまな他の化合物を使用すること。この原稿のスコープの範囲外が他の多くのダウン ストリーム アプリケーションの詳細なだけでなく、グルコースとインスリン (例えば、脂質およびリポタンパク質プロファイル) 以外の血液の値の分析など、描かれた血液サンプルで実行できます。代謝マーカー (例えば、量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応 (PCR)、西部のしみの分析、および酵素結合抗体法 (ELISA) による) の分析。さらにフローサイトメトリー、トランスクリプトーム、プロテオーム、メタボロームのアプローチについても、不特定多数に向けた分析のため利用されるかもしれない一方単一細胞集団の効果を調査する並べ替え蛍光活性化セル (FACS) を適用可能性があります。
全体的に、我々 は全身代謝の変化、分泌、ITT は、病気の発症を勉強するための便利なツールをすることができますを検討する 2 つの強力なアプローチをさらに説明しながら HFD 誘発マウス モデルを生成するための単純なプロトコルを提供し、インスリン抵抗性・糖尿病など代謝疾患の分野を中心に、新しい治療法を開発します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mouse strain: C57BL/6J</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>664</td>
			<td>LFD/HFD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accu Chek Performa - Glucometer</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6870228</td>
			<td>OGTT/ITT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accu Chek Performa - Strips</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6454038</td>
			<td>OGTT/ITT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8769</td>
			<td>OGTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actrapid - Insulin</td>
			<td>Novo Nordisk</td>
			<td>417642</td>
			<td>ITT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reusable Feeding Needles</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>#18061-22</td>
			<td>OGTT; 22 gauge (-24 gauge for young mice)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnifix-Fine dosing syringes</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9161406V</td>
			<td>OGTT/ITT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterican Insulin needle (30G x 1/3&#34;; &#248; 0.30 x 13 mm)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>304000</td>
			<td>ITT; lean mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterican (G 27 x 3/4&#34;; &#248; 0.40 x 20 mm)&#160;&#160;</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4657705</td>
			<td>ITT; mice on HFD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well PCR Plates, non-skirted, flexible</td>
			<td>Braintree Scientific, Inc.</td>
			<td>SP0016</td>
			<td>OGTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasensitive Mouse Insulin ELISA kit</td>
			<td>Crystam Chem</td>
			<td>90080</td>
			<td>OGTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent Diet with 60% kcal% fat</td>
			<td>Research Diets Inc</td>
			<td>D12492</td>
			<td>mice on HFD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent Diet with 10% kcal% fat.</td>
			<td>Research Diets Inc</td>
			<td>D12450B</td>
			<td>mice on LFD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND micro haematocrit capillary</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>BR749321</td>
			<td>OGTT/ITT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaseline - creme</td>
			<td>Riviera</td>
			<td>P1768677</td>
			<td>OGTT/ITT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

study of in vivo glucose metabolism in high-fat diet-fed mice using oral glucose tolerance test (ogtt) and insulin tolerance test (itt)

肥満は 2 型糖尿病、インスリン刺激によるグルコース吸収と全身糖代謝の総代償不全への抵抗によって特徴付けられる病気の発症に最も重要な危険因子を表します。グルコース代謝の理解にかなりの進歩にもかかわらず健康と病気その制御の分子機構に残る下調査間小説を防止し、糖尿病の治療への取り組みが急務します。派生のグルコース供給状態の間に細胞の同化プロセスの主レギュレータとして機能し、こうして血糖値のバランスをインスリンの膵臓の分泌を刺激するダイエットは、全身のエネルギー状態を維持するレベルします。慢性過食トリガー メタ-炎症、末梢インスリン受容体関連での変更につながるシグナルとインスリンを介したグルコース処理への感受性を削減します。これらのイベント最終的に結果減少と同様、高い絶食のブドウ糖とインスリン レベルの耐糖能のターンではインスリン抵抗性の重要な指標となります。ここでは、生成と高脂肪食 (HFD) の代謝特性のプロトコルを提案-食事療法誘導されたインシュリン抵抗性の頻繁に使用されるモデルとしてマウスを供給します。経口ブドウ糖負荷試験 (OGTT)、監視時間をかけて経口投与されたグルコース負荷とインスリン分泌の周辺機器の処分の詳細に示します。さらに、インスリン負荷試験 (ITT) 全身のインスリン作用を監視するためのプロトコルを提案する.一緒に、これらのメソッドとその下流の応用は、特に糖代謝の変化を評価するだけでなくマウスの一般的な代謝表現型を特徴付けるための強力なツールを表します。彼らはインスリン抵抗性、糖尿病および肥満治療介入の効果をテストとして同様の病態のより良い理解を提供する広範な研究分野で、特に便利。

図 1は、食事療法のマウスの代謝フェノタイピングのスケマティック タイム テーブルを示しています。約 6 週間の年齢で LFD グループは対照群として役立つかもしれない間、HFD のマウスを配置する必要があります。重要なは、体重は、体重増加が予想されるかを観察する毎週決定する必要があります。ストレス (例えば、ノイズまたは積?...

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経口ブドウ糖負荷試験 OGTT およびインスリン負荷試験 ITT を使用した、高脂肪食を与えたマウスにおける生体内ブドウ糖代謝の研究 |医学 |ビデオ

Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test OGTT and Insulin Tolerance Test ITT

経口ブドウ糖負荷試験 (OGTT) とインスリン負荷試験 (ITT) を使用して高脂肪食飼育マウスの生体内糖代謝の研究

現在の記事では、生成および食事療法誘導されたインシュリン抵抗性および肥満のモデルとして高脂肪食飼育マウスの代謝特性について説明します。さらに、経口ブドウ糖負荷試験、インスリン負荷試験、グルコース代謝体内の全身の変化の監視を実行する詳細なプロトコルを備えています。

Obesity represents the most important single risk factor in the pathogenesis of type 2 diabetes, a disease which is characterized by a resistance to ...

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Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and Insulin Tolerance Test (ITT)

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67.3K ビュー.  Medical University of Vienna. 現在の記事では、生成および食事療法誘導されたインシュリン抵抗性および肥満のモデルとして高脂肪食飼育マウスの代謝特性について説明します。さらに、経口ブドウ糖負荷試験、インスリン負荷試験、グルコース代謝体内の全身の変化の監視を実行する詳細なプロトコルを備えています。

ビデオ: Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test OGTT and Insulin Tolerance Test ITT

Making Sense of Listening: The IMAP Test Battery

The ability to hear is only the first step towards making sense of the range of information contained in an auditory signal. Of equal importance are the abilities to extract and use the information encoded in the auditory signal. We refer to these as listening skills (or auditory processing AP). Deficits in these skills are associated with delayed language and literacy development, though the nature of the relevant deficits and their causal connection with these delays is hotly debated.
When a child is referred to a health professional with normal hearing and unexplained difficulties in listening, or associated delays in language or literacy development, they should ideally be assessed with a combination of psychoacoustic (AP) tests, suitable for children and for use in a clinic, together with cognitive tests to measure attention, working memory, IQ, and language skills. Such a detailed examination needs to be relatively short and within the technical capability of any suitably qualified professional. Current tests for the presence of AP deficits tend to be poorly constructed and inadequately validated within the normal population. They have little or no reference to the presenting symptoms of the child, and typically include a linguistic component. Poor performance may thus reflect problems with language rather than with AP. To assist in the assessment of children with listening difficulties, pediatric audiologists need a single, standardized child-appropriate test battery based on the use of language-free stimuli.
We present the IMAP test battery which was developed at the MRC Institute of Hearing Research to supplement tests currently used to investigate cases of suspected AP deficits. IMAP assesses a range of relevant auditory and cognitive skills and takes about one hour to complete. It has been standardized in 1500 normally-hearing children from across the UK, aged 6-11 years. Since its development, it has been successfully used in a number of large scale studies both in the UK and the USA. IMAP provides measures for separating out sensory from cognitive contributions to hearing. It further limits confounds due to procedural effects by presenting tests in a child-friendly game-format. Stimulus-generation, management of test protocols and control of test presentation is mediated by the IHR-STAR software platform. This provides a standardized methodology for a range of applications and ensures replicable procedures across testers. IHR-STAR provides a flexible, user-programmable environment that currently has additional applications for hearing screening, mapping cochlear implant electrodes, and academic research or teaching.

A test battery (IMAP) for performing an in-depth assessment of auditory and cognitive abilities contributing to listening skills is described. It is quick to administer, child-friendly and free from linguistic confounds. Stimulus generation and protocol management are controlled via a software platform (IHR-STAR) to ensure replicable procedures.

IMAPのテストバッテリー：リスニングの意味を理解する

The ability to hear is only the first step towards making sense of the range of information contained in an auditory signal. Of equal importance are the ...

医学

The &alpha;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time and temperature restrictions, technical sophistication, and cost of reagents, in particular monoclonal antibodies to measure CD4 on blood cells, the only currently acceptable method. A commonly used cost-saving and time-saving laboratory strategy is to calculate, rather than measure certain blood values. For example, LDL levels are calculated using the measured levels of total cholesterol, HDL, and triglycerides1. Thus, identification of cell-free correlates that directly regulate the number of CD4+ T cells could provide an accurate method for calculating CD4 counts due to the physiological relevance of the correlates.
The number of stem cells that enter blood and are destined to become circulating CD4+ T cells is determined by the chemokine CXCL12 and its receptor CXCR4 due to their influence on locomotion2. The process of stem cell locomotion into blood is additionally regulated by cell surface human leukocyte elastase (HLECS) and the HLECS-reactive active &alpha;1proteinase inhibitor (&alpha;1PI, &alpha;1antitrypsin, SerpinA1)3. In HIV-1 disease, &alpha;1PI is inactivated due to disease processes 4. In the early asymptomatic categories of HIV-1 disease, active &alpha;1PI was found to be below normal in 100% of untreated HIV-1 patients (median=12 &mu;M, and to achieve normal levels during the symptomatic categories4, 5. This pattern has been attributed to immune inactivation, not to insufficient synthesis, proteolytic inactivation, or oxygenation. We observed that in HIV-1 subjects with &gt;220 CD4 cells/&mu;l, CD4 counts were correlated with serum levels of active &alpha;1PI (r2=0.93, p&lt;0.0001, n=26) and inactive &alpha;1PI (r2=0.91, p&lt;0.0001, n=26) 5. Administration of &alpha;1PI to HIV-1 infected and uninfected subjects resulted in dramatic increases in CD4 counts suggesting &alpha;1PI participates in regulating the number of CD4+ T cells in blood 3.
With stimulation, whole saliva contains sufficient serous exudate (plasma containing proteinaceous material that passes through blood vessel walls into saliva) to allow measurement of active &alpha;1PI and the correlation of this measurement is evidence that it is an accurate method for calculating CD4 counts. Briefly, sialogogues such as chewing gum or citric acid stimulate the exudation of serum into whole mouth saliva. After stimulating serum exudation, the activity of serum &alpha;1PI in saliva is measured by its capacity to inhibit elastase activity. Porcine pancreatic elastase (PPE) is a readily available inexpensive source of elastase. PPE binds to &alpha;1PI forming a one-to-one complex that prevents PPE from cleaving its specific substrates, one of which is the colorimetric peptide, succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide (SA3NA). Incubating saliva with a saturating concentration of PPE for 10 min at room temperature allows the binding of PPE to all the active &alpha;1PI in saliva. The resulting inhibition of PPE by active &alpha;1PI can be measured by adding the PPE substrate SA3NA. (Figure 1). Although CD4 counts are measured in terms of blood volume (CD4 cells/&mu;l), the concentration of &alpha;1PI in saliva is related to the concentration of serum in saliva, not to volume of saliva since volume can vary considerably during the day and person to person6. However, virtually all the protein in saliva is due to serum content, and the protein content of saliva is measurable7. Thus, active &alpha;1PI in saliva is calculated as a ratio to saliva protein content and is termed the &alpha;1PI Index. Results presented herein demonstrate that the &alpha;1PI Index provides an accurate and precise physiologic method for calculating CD4 counts.

The &#945;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

A CD4 enumeration method, the &#x03B1;-test, is described which uses whole saliva to provide rapid and accurate CD4 counts. The &alpha;-test costs pennies and eliminates the need for technical training, costly reagents such as monoclonal antibodies, instrumentation, refrigeration, transport of samples, as well as collection and handling of blood.

α-テスト：全唾液を用いた迅速な無細胞CD4列挙

There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time ...

Cardiac Stress Test Induced by Dobutamine and Monitored by Cardiac Catheterization in Mice

Dobutamine is a &beta;-adrenergic agonist with an affinity higher for receptor expressed in the heart (&beta;1) than for receptors expressed in the arteries (&beta;2). When systemically administered, it increases cardiac demand. Thus, dobutamine unmasks abnormal rhythm or ischemic areas potentially at risk of infarction. 
Monitoring of heart function during a cardiac stress test can be performed by either ecocardiography or cardiac catheterization. The latter is an invasive but more accurate and informative technique that the former.
Cardiac stress test induced by dobutamine and monitored by cardiac catheterization accomplished as described here allows, in a single experiment, the measurement of the following hemodynamic parameters: heart rate (HR), systolic pressure, diastolic pressure, end-diastolic pressure, maximal positive pressure development (dP/dtmax) and maximal negative pressure development (dP/dtmin), at baseline conditions and under increasing doses of dobutamine.
As expected, in normal mice we observed a dobutamine dose-related increase in HR, dP/dtmax and dP/dtmin. Moreover, at the highest dose tested (12 ng/g/min) the cardiac decompensation of high fat diet-induced obese mice was unmasked.

We describe the protocol to perform a cardiac stress test induced by dobutamine and monitored by cardiac catheterization in normal mice. Also we show its application to unmask subclinical cardiac disease in high fat diet-induced obese mice.

心臓ストレステストドブタミンによって誘導され、マウスにおける心臓カテーテル検査によって監視される

Dobutamine is a &beta;-adrenergic agonist with an affinity higher for receptor expressed in the heart (&beta;1) than for receptors expressed in the ...

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under physiologic conditions the endothelium is impermeable to albumin, so Evans blue bound albumin remains restricted within blood vessels. In pathologic conditions that promote increased vascular permeability endothelial cells partially lose their close contacts and the endothelium becomes permeable to small proteins such as albumin. This condition allows for extravasation of Evans Blue in tissues. A healthy endothelium prevents extravasation of the dye in the neighboring vascularized tissues. Organs with increased permeability will show significantly increased blue coloration compared to organs with intact endothelium. The level of vascular permeability can be assessed by simple visualization or by quantitative measurement of the dye incorporated per milligram of tissue of control versus experimental animal/tissue. Two powerful aspects of this assay are its simplicity and quantitative characteristics. Evans Blue dye can be extracted from tissues by incubating a specific amount of tissue in formamide. Evans Blue absorbance maximum is at 620 nm and absorbance minimum is at 740 nm. By using a standard curve for Evans Blue, optical density measurements can be converted into milligram dye captured per milligram of tissue. Statistical analysis should be used to assess significant differences in vascular permeability.

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

We are presenting an in vivo assay to test blood vessel permeability. This assay is based on intravenous injection of a dye and subsequent visualization of its diffusion into interstitial spaces.

アン<em生体内で&gt;</em血管透過性をテストする&gt;アッセイ

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

Assessment of Gastric Emptying in Non-obese Diabetic Mice Using a [13C]-octanoic Acid Breath Test

Gastric emptying studies in mice have been limited by the inability to follow gastric emptying changes in the same animal since the most commonly used techniques require killing of the animals and postmortem recovery of the meal1,2. This approach prevents longitudinal studies to determine changes in gastric emptying with age and progression of disease. The commonly used [13C]-octanoic acid breath test for humans3 has been modified for use in mice4-6 and rats7 and we previously showed that this test is reliable and responsive to changes in gastric emptying in response to drugs and during diabetic disease progression8. In this video presentation the principle and practical implementation of this modified test is explained. As in the previous study, NOD LtJ mice are used, a model of type 1 diabetes9. A proportion of these mice develop the symptoms of gastroparesis, a complication of diabetes characterized by delayed gastric emptying without mechanical obstruction of the stomach10.
This paper demonstrates how to train the mice for testing, how to prepare the test meal and obtain 4 hr gastric emptying data and how to analyze the obtained data. The carbon isotope analyzer used in the present study is suitable for the automatic sampling of the air samples from up to 12 mice at the same time. This technique allows the longitudinal follow-up of gastric emptying from larger groups of mice with diabetes or other long-standing diseases.

Assessment of Gastric Emptying in Non-obese Diabetic Mice Using a [13C]-octanoic Acid Breath Test

Determination of gastric emptying with a non-invasive [13C]-octanoic acid breath test for tracking gastroparesis in female NOD LtJ mice.

[を使用した非肥満糖尿病マウスにおける胃排出能の評価<sup&gt; 13</sup&gt; C] - オクタン酸呼気テスト

Gastric emptying studies in mice have been limited by the inability to follow gastric emptying changes in the same animal since the most commonly used ...

Characterization of Metabolic Status in Nonhuman Primates with the Intravenous Glucose Tolerance Test

The intravenous glucose tolerance test (IVGTT) plays a key role in the characterization of glucose homeostasis. When taken together with serum biochemical profiles, inclusive of blood glucose levels in both the fed and fasted state, HbA1c, insulin levels, clinical history of diet, body composition, and body weight status, an assessment of normal and abnormal glycemic control can be made. Interpretation of an IVGTT is done through measurement of changes in glucose and insulin levels over time in relation to the dextrose challenge. Critical components to be considered are: peak glucose and insulin levels reached in relation to T0 (end of glucose infusion), the glucose clearance rate K derived from the slope of rapid glucose clearance in the first 20 min (T1 to T20), the time to return to glucose baseline, and the area under the curve (AUC). These IVGTT measures will show characteristic changes as glucose homeostasis moves from a healthy to a diseased metabolic state5. Herein we will describe the characterization of nonhuman primates (Rhesus and Cynomolgus macaques), which are the most relevant animal model of Type II diabetes (T2D) in humans and the IVGTT and clinical profiles of these animals from a lean healthy, to obese dysmetabolic, and T2D state 8, 10, 11.

The goal of this protocol is to present a standard method to perform intravenous glucose tolerance tests (IVGTTs) to assess glycemic control in nonhuman primates and assess their metabolic status from healthy to dysmetabolic.

静脈内グルコース負荷試験とヒト以外の霊長類における代謝状態のキャラクタリゼーション

The intravenous glucose tolerance test (IVGTT) plays a key role in the characterization of glucose homeostasis. When taken together with serum biochemical ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

ヒト腫瘍異種移植片からマウス細胞の枯渇は大幅に標的細胞の下流分析を向上させます

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Determining Glucose Metabolism Kinetics Using 18F-FDG Micro-PET/CT

This paper describes the use of 18F-FDG and micro-PET/CT imaging to determine in vivo glucose metabolism kinetics in mice (and is transferable to rats). Impaired uptake and metabolism of glucose in multiple organ systems due to insulin resistance is a hallmark of type 2 diabetes. The ability of this technique to extract an image-derived input function from the vena cava using an iterative deconvolution method eliminates the requirement of the collection of arterial blood samples. Fitting of tissue and vena cava time activity curves to a two-tissue, three compartment model permits the estimation of kinetic micro-parameters related to the 18F-FDG uptake from the plasma to the intracellular space, the rate of transport from intracellular space to plasma and the rate of 18F-FDG phosphorylation. This methodology allows for multiple measures of glucose uptake and metabolism kinetics in the context of longitudinal studies and also provides insights into the efficacy of therapeutic interventions.

Determining Glucose Metabolism Kinetics Using 18F-FDG Micro-PET/CT

This study describes a protocol that uses 18F-FDG and positron emission tomography/computed tomography (PET/CT) imaging, together with kinetic modelling, to quantify the in vivo, real-time uptake of 18F-FDG into tissues.

使用するグルコース代謝動態を決定します<sup&gt; 18</sup&gt; F-FDGマイクロPET / CT

This paper describes the use of 18F-FDG and micro-PET/CT imaging to determine in vivo glucose metabolism kinetics in mice (and is transferable to rats). ...

Improving Strength, Power, Muscle Aerobic Capacity, and Glucose Tolerance through Short-term Progressive Strength Training Among Elderly People

This protocol describes the simultaneous use of a broad span of methods to examine muscle aerobic capacity, glucose tolerance, strength, and power in elderly people performing short-term resistance training (RET). Supervised progressive resistance training for 1 h three times a week over 8 weeks was performed by RET participants (71&#177;1 years, range 65-80). Compared to a control group without training, the RET showed improvements on the measures used to indicate strength, power, glucose tolerance, and several parameters of muscle aerobic capacity. Strength training was performed in a gym with only robust fitness equipment. An isokinetic dynamometer for knee extensor strength permitted the measurement of concentric, eccentric, and static strength, which increased for the RET group (8-12% post- versus pre-test). The power (rate of force development, RFD) at the initial 0-30 ms also showed an increase for the RET group (52%). A glucose tolerance test with frequent blood glucose measurements showed improvements only for the RET group in terms of blood glucose values after 2 h (14%) and the area under the curve (21%). The blood lipid profile also improved (8%). From muscle biopsy samples prepared using histochemistry, the amount of fiber type IIa increased, and a trend towards a decrease in IIx in the RET group reflected a change to a more oxidative profile in terms of fiber composition. Western blot (to determine the protein content related to the signaling for muscle protein synthesis) showed a rise of 69% in both Akt and mTOR in the RET group; this also showed an increase in mitochondrial proteins for OXPHOS complex II and citrate synthase (both ~30%) and for complex IV (90%), in only the RET group. We demonstrate that this type of progressive resistance training offers various improvements (e.g., strength, power, aerobic capacity, glucose tolerance, and plasma lipid profile).

The effect of short-term resistance training on elderly people was investigated through the simultaneous use of several methods. Compared to a control group, many improvements were seen, including on muscle aerobic capacity, glucose tolerance, strength, power, and muscle quality (i.e., protein involved in cell signaling and muscle fiber type composition).

高齢者の短期漸進的筋力トレーニングによる筋力・筋力・筋弛緩力の改善

This protocol describes the simultaneous use of a broad span of methods to examine muscle aerobic capacity, glucose tolerance, strength, and power in ...

Studying the Hypothalamic Insulin Signal to Peripheral Glucose Intolerance with a Continuous Drug Infusion System into the Mouse Brain

Insulin regulates systematic metabolism in the hypothalamus and the peripheral insulin response. An inflammatory reaction in peripheral adipose tissues contributes to type 2 diabetes mellitus (T2DM) development and appetite regulation in the hypothalamus. Chemokine CCL5 and C-C chemokine receptor type 5 (CCR5) levels have been suggested to mediate arteriosclerosis and glucose intolerance in type 2 diabetes mellitus (T2DM). In addition, CCL5 plays a neuroendocrine role in the hypothalamus by regulating food intake and body temperature, thus, prompting us to investigate its function in hypothalamic insulin signaling and the regulation of peripheral glucose metabolism.
The micro-osmotic pump brain infusion system is a quick and precise way to manipulate CCL5 function and study its effect in the brain. It also provides a convenient alternative approach to generating a transgenic knockout animal. In this system, CCL5 signaling was blocked by intracerebroventricular (ICV) infusion of its antagonist, MetCCL5, using a micro-osmotic pump. The peripheral glucose metabolism and insulin responsiveness was detected by the Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and Insulin Tolerance Test (ITT). Insulin signaling activity was then analyzed by protein blot from tissue samples derived from the animals.
After 7-14 days of MetCCL5 infusion, the glucose metabolism and insulin responsiveness was impaired in mice, as seen in the results of the OGTT and ITT. The IRS-1 serine302 phosphorylation was increased and the Akt activity was reduced in mice hypothalamic neurons following CCL5 inhibition. Altogether, our data suggest that blocking CCL5 in the mouse brain increases the phosphorylation of IRS-1 S302 and interrupts hypothalamic insulin signaling, leading to a decrease in insulin function in peripheral tissues as well as the impairment of glucose metabolism.

This protocol studies the role of chemokine (C-C motif) ligand 5 (CCL5) in the hypothalamus by delivering an antagonist, MetCCL5, into the mouse brain using a micro-osmotic pump brain infusion system. This transient inhibition of CCL5 activity interrupted hypothalamic insulin signaling, leading to glucose intolerance and peripheral systemic insulin sensitivity.

マウスの脳内へ連続的な薬剤注入システムと末梢グルコース不耐症に視床下部のインスリン シグナルを勉強

Insulin regulates systematic metabolism in the hypothalamus and the peripheral insulin response. An inflammatory reaction in peripheral adipose tissues ...