Name: simultaneous distinction of monospecific and mixed dfs70 patterns during ana screening with a novel hep-2 elite/dfs70 knockout substrate
Uploaded: 2018-01-17T10:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Distinction of Monospecific and Mixed DFS70 Patterns During ANA Screening with a Novel HEp-2 ELITE/DFS70 Knockout Substrate at JoVE.com

ありがとうアンドリュー Zenger IIF 実験を行い、画像を収集します。

プロトコル三位一体のバイオ テクノロジー機関人間研究倫理委員会のガイドラインに従います。
1. サンプルと基板の準備
<ol><li>基板スライドを含む袋を許可 (HEp2 や HEp のいずれかが含まれているスライドごとに 12 の井戸をスライド ガラス-2 + KO HEp2 細胞混合) する前に、スライドの表面に水分が凝縮を防ぎ最適なパフォーマンスのための部屋の温度を平衡させ、サンプルの追加。これは約 10-15 分の間に取る必要があります。</li>
	<li>部屋の温度平衡、一度、袋の側面に触れることがなく指を使って基板のスライドを慎重に取り外します。</li>
	<li>スライドのラベル、サンプルおよび共役潜伏中にスライドの乾燥を防ぐために水で湿らせたペーパー タオルで並ぶ (常温) インキュベーション室に配置。 注: は、ドライ井に生じる非特異染色培養チャンバー内湿紙タオルは、湿度を提供し、よく乾燥を防ぎます。</li>
</ol>2. コントロールとサンプルの追加
<ol><li>この研究、または個々 のスライドの井戸に患者血清サンプルで説明されているように DFS70 ANA 陽性血清の組み合わせ、正/負コントロールの約 50 μ L を調剤します。</li>
	<li>スライドの各ウェルにコントロールとサンプルを調剤します。</li>
	<li>よくクロス汚染を防ぐためには、井戸をオーバフィ リングを避けます。ないオーバフィ リング井戸、井戸の表面の完全なカバレッジを確保する、気泡を避けるため。 注: 推奨されるボリュームはステップ 2.1 あたり 50 μ L です。</li>
	<li>培養チャンバーのふたを閉めて室温で 30 分間スライドを孵化させなさい。患者の血清中に任意のアナ、この潜伏期間中に各ウェルの現在のセルにバインドします。</li>
	<li>潜伏期間が終われば、培養室からスライドを削除します。タブ端にスライドを保持するおよび約 10 mL リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 洗浄バッファー ピペットを使用して、キットに付属で優しく洗い流してくださいまたは 10-15 s. の PBS が入ったビーカーに PBS 洗浄バッファーと洗浄 (Coplin jar にすぐにスライドを転送ソーク) 10 分すべて残りのスライドで処理を繰り返します。 注: これになりますとスライドの携帯側が別のスライドを接触しないように Coplin jar ファイルに複数のスライドを配置する場合に、スライド ガラスに付着、細胞の損傷します。</li>
</ol>3. 添加蛍光灯共役
<ol><li>Coplin jar ファイルから一度に 1 つだけのスライドを削除します。優しく、スライドから余分な PBS 洗浄バッファーを削除するには、] をタップまたはペーパー タオルの上のスライドのしみ。各キットは、FITC 標識抗ひと IgG 蛍光共役で提供されます。各ウェルにそっと 1 滴 (約 50 μ L) 提供の共役を適用します。</li>
	<li>30 分間閉じた染色培養室でスライドを孵化させなさい。 注: Fc 特定 IgG 複合体の使用をお勧めします。患者の血清中に任意のアナ、共役は井戸の存在の細胞の特定の蛍光性の結果この潜伏期間中に各ウェルに存在のセルにバインドします。共役は、光に敏感です。閉じたインキュベーション室は、各ウェルに存在の細胞の共役反応を光の干渉を防ぐために役立ちます。</li>
	<li>潜伏期間が終われば、培養室からスライドを削除します。タブ端にスライドを保持して、ピペットを使用して、キットまたは PBS が入ったビーカーに約 10 mL の PBS 洗浄バッファーで軽くすすいでください。10 分は残りのすべてのスライドのプロセスを繰り返すために、スライドを PBS 洗浄バッファーと洗浄 (浸漬) Coplin jar にすぐに転送します。 注: これになりますとスライドの携帯側が別のスライドを接触しないように Coplin jar ファイルに複数のスライドを配置する場合に、スライド ガラスに付着、細胞の損傷します。</li>
	<li>場所 coverslips 乾燥したペーパー タオルの上にキットで提供されています。メディアをマウント キットで提供されます。Coverslip の下端行のメディアをマウントの 3-4 滴の間適用します。</li>
	<li>洗浄バッファーを含む Coplin jar から一度に 1 つのスライドを取り出します。優しく、過剰な洗浄バッファーを削除するには、] をタップまたはペーパー タオルの上のスライドのしみ。</li>
	<li>カバーガラスの端にスライドの下端を配置することによって、coverslip に優しくスライドを下げます。これはスライドの上端に流れる低いエッジ coverslip の現在のメディアをマウントできスライドの各ウェルの読み取りを妨げていることがあります空気の泡の形成を最小限に抑えます。 注: スライドにカバー スライドをマウントする最小限の圧力を使用ください。任意の余分な圧力は、カバー スリップの横方向の動きを引き起こす可能性が。これは歪みの結果のセルの単分子膜作製への損傷を引き起こします。</li>
	<li>2-8 ° C で暗闇の中でスライドを保存します。すぐにマウントされている、または 48 時間以内は、スライドを確認します。 注: パターンと蛍光信号の劣化で長期保管があります。</li>
</ol>4. 肯定的な、否定的な結果の識別
<ol><li>暗い部屋にある FITC フィルター セットを使用して蛍光顕微鏡でスライドを表示します。</li>
	<li>200 陽性に関する最終的な解釈をして、パターンに倍以上の倍率で蛍光顕微鏡下で特定の明るい緑の蛍光性を調べます。正と負のコントロールを確認します。 注: (図 2 a均質) 核に明るい蛍光グリーンは、肯定的なコントロールが表示されます。ネガティブ コントロールには、蛍光顕微鏡下で特定の緑の蛍光性が表示されません。</li>
	<li>各ウェルの正/負の結果を記録し、陽性例でアナのパターンが含まれます。</li>
</ol>

<ol>
	<li>. Position Statement. Methodology of testing for antinuclear antibodies Available from: <a target="_blank" href="https://www.rheumatology.org/Portals/0/Files/Methodology%20of%20Testing%20Antinuclear%20Antibodies%20Position%20Statement.pdf">https://www.rheumatology.org/Portals/0/Files/Methodology%20of%20Testing%20Antinuclear%20Antibodies%20Position%20Statement.pdf</a> (2011)</li><li>Meroni, P. L., Schur, P. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+of+the+First+International+Consensus+on+Standardized+Nomenclature+of+Antinuclear+Antibody+HEp-2+Cell+Patterns+2014-2015.">Report of the First International Consensus on Standardized Nomenclature of Antinuclear Antibody HEp-2 Cell Patterns 2014-2015.</a> Front Immunol. 6, 412 (2015).</li><li>Malyavantham, K., Suresh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+DFS70+pattern+and+impact+on+ANA+screening+using+a+novel+HEp-2+ELITE/DFS70+knockout+substrate.">Analysis of DFS70 pattern and impact on ANA screening using a novel HEp-2 ELITE/DFS70 knockout substrate.</a> Auto Immun Highlights. 8 (1), 3 (2017).</li><li>Sperotto, F., Seguso, M., Gallo, N., Plebani, M., Zulian, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-DFS70+antibodies+in+healthy+schoolchildren:+A+follow-up+analysis.">Anti-DFS70 antibodies in healthy schoolchildren: A follow-up analysis.</a> Autoimmun Rev. , (2017).</li><li>Ayaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+cytotoxic+anti-LEDGF+autoantibodies+in+atopic+dermatitis.">Detection of cytotoxic anti-LEDGF autoantibodies in atopic dermatitis.</a> Autoimmunity. 35 (5), 319-327 (2002).</li><li>Ochs, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibodies+to+DFS+70+kd/transcription+coactivator+p75+in+atopic+dermatitis+and+other+conditions.">Autoantibodies to DFS 70 kd/transcription coactivator p75 in atopic dermatitis and other conditions.</a> J Allergy Clin Immunol. 105 (6 Pt 1), 1211-1220 (2000).</li><li>Watanabe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-DFS70+antibodies+in+597+healthy+hospital+workers.">Anti-DFS70 antibodies in 597 healthy hospital workers.</a> Arthritis Rheum. 50 (3), 892-900 (2004).</li><li>Yamada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humoral+immune+response+directed+against+LEDGF+in+patients+with+VKH.">Humoral immune response directed against LEDGF in patients with VKH.</a> Immunol Lett. 78 (3), 161-168 (2001).</li><li>Seelig, C. 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Comment on the article by Mariz et al.</a> Arthritis Rheum. 63 (12), 4036-4037 (2011).</li></ol>

著者キショール Malyavantham と Lakshmanan Suresh トリニティ バイオ テクノロジー、米国の従業員であります。

核と細胞質の抗原に対する自己抗体は、全身性自己免疫疾患における非常に普及しています。IIF HEp 2 では全身性の自己免疫疾患2,3,4高感度・低コストのスクリーニング法として広くみなされる単一のアッセイは、最高の可能な感度と特異性を提供しないが.にもかかわらず、50 年以上の IIF プロトコルの普及により、IIF アッセイの精度はプロトコルの個々 のステップと手入れの行き届いたを使用して結果の正確な解釈を慎重に実行、技術者のスキルに大きく依存蛍光顕微鏡。HEp 2 によって基づくべき全身性の自己免疫疾患の診断は IIF など単一の血清学的テストの結果ありません。
高品質の試薬の溶解 (蒸留/脱イオン) 水、標準化されたキット コンポーネント (HEp 2 細胞膜、サンプル希釈液、正と負のコントロール、希釈最適化 FITC 共役、メディアをマウントとスライド) の使用結果に肯定的な影響があります。井戸のコントロールやサンプルの追加をスキップして偽否定的な解釈を促すことができます。サンプルやコントロールを追加することができます人工偽陽性反応および/または不適切なパターンの結果後、任意の時点でスライドの乾燥。スライド左側にあまりにも多くの洗浄バッファーや成果物につながるメディアをマウントの摂理の前にスライドの井戸の乾燥します。ぼやけているか顕微鏡下で観察すると焦点が合っていないを見て反応で起因できる媒体をマウントまたは観察を配置する前にスライドの表面に泡の生成の不足数量を追加します。マウント スライドを 2-8 ° C で保存し、偽否定的または人工の結果を最小限に抑える時間の推奨ウィンドウ内で解析する必要があります。
適切な LED/Hg/キセノン光源ときれいな光学部品は破損していない刺激および放出のフィルターを含むがある手入れの行き届いたエピ蛍光顕微鏡を用いた IIF の正確な結果を得るために重要です。エンド ユーザー識別の正/負の反応強度とパターンの解釈のトレーニングが重要です。HEp 2 IIF 試金プロシージャ、顕微鏡構成では、エンドユーザーのトレーニングやスキルの標準化の欠如に対して脆弱です。コンセンサス名称及び代表パターンと様々 なメーカーを使用して取得した画像の例は、ICAP で利用可能 (< www.ANApatterns.org>) 教育目的4。核、細胞質、細胞分裂の様々 なパターンの ICAP によって提供される HEp 2 セル パターン分類ツリーは未熟な目4に似て見えるかもしれませんが様々 なパターンの微妙な違いを学ぶ貴重なリソースです。挑戦的なパターンの主な例の 1 つはまた自己免疫の条件と異なる協会が不足している DFS70 と、このパターンは非常に健康的な集団5で普及し、前のセクションで説明したよう。
研究では、抗 DFS70 抗体の有病率は異なります健康コホート間 ANA スクリーニング集団と ANA 陽性の個体全身性自己免疫疾患9,16,20 の証拠と ,,3031。DFS70 抗体は、分離だけでなく、他の病気に関連する ANA パターンと発生すること報告されています。分離または抗 DFS70 パターンは健常者の 2-22% が自己免疫リウマチ性疾患32例の 1% 未満で報告されます。これらの傾向に基づき、DFS70 モノラル肯定的なパターンは、ICAP 委員会3,31,32により自己免疫リウマチ性疾患から除外する条件として提案されました。自己抗体テスト命名法の調和と ANA 報告 DFS70 陽性の報告推奨 HEp 2 IIF 結果の解釈を促進するために確立された ICAP の委員会審査結果4。
DFS70 モノラル陽性に基づく全身性自己免疫疾患を排除前、現在スクリーニングと確認方法 (特に DFS70 のそれらの特定) の状態を確認することが重要です。様々 な研究13,22,25,33 間様々 DFS70 HEp 2 iif 関数と固相験試金すなわち ELISA で陽性、CLIA、line イムノアッセイ/ドットしみメソッドと一致).この意見の相違に貢献するパラメーターがされている IIF 解釈および確証的アッセイ5,13,34は前述。抗 DFS70 抗体の確認のための提案された免疫吸着アプローチ (DFS70) のアドレスを現在の固相の試金の欠陥のいくつかが疑いのあるサンプルに IIF 手順の追加の手順を実行するラボを必要とします。結果13を報告するためのコストと所要時間が増加します。ANA のルーチンのスクリーニングに HEp 2 エリート/DFS70 島細胞を使用する場合、この追加の手順は必要ありません。これは、全体的なコストを削減、さらに納期への影響 DFS70 パターンを最初のスクリーニングの洞察としてステップない27があります。従来の HEp 2 IIF メソッドを使用して追加の欠点が共起する他の ANA パターン スクリーニング段階で DFS70 パターンを区別することです。しかし、HEp 2 エリート/DFS70 島細胞27の使用によってこの欠点を克服します。
従来 HEp 2 と新しい設計 HEp-2 (HEp 2 エリート/DFS70 KO) モノラル正 DFS70 コントロールと ANA 陽性コントロールおよびそれらの組合せを使用しての比較評価は同時に新しい基板の能力の有用性を示す画面の ANAs DFS70 パターン (図 1) を確認してください。新しい基板の IIF プロトコルは、従来の HEp 2 IIF 法と同じです。ANA パターンのすべての疾患に関連する解釈方式は DFS70 パターン (表 1) を除いて同じです。モノラル正と混合の DFS70 パターンの解釈は比較的簡単に新しいメソッドを使用して、追加の試金 (図 1 b) を保証しません。臨床実習でこの新しいメソッドの実装 DFS70 パターンの解釈に関連する課題を簡素化し、全日空 ANA 以前によって隠されているパターンの病気に関連するさらに明らかにしてスクリーニングの全体的な精度を向上DFS70 (混合パターン)。

ANAs は、自己免疫の仲介された全身性結合組織疾患1の特徴です。いくつかの方法は、スクリーニングと ANAs の確認に用いられます。Iif 関数を用いた HEp 2 基板のままは、最も広く使用される、頻繁 ANAs1,2のスクリーニング法を推奨します。酵素結合抗体法 (ELISA)、酵素免疫測定法 (EIA)、化学発光免疫測定法 (CLIA) ビーズ ベース マルチプレックスアッセイなど固相診断アッセイ方法論の進歩にもかかわらず、HEp 2 IIF は最も一般的なスクリーニングその診断の有用性とコスト有効性1,2,3のためのメソッドです。上記の試金技術が精製されたネイティブの限定セットに依存または組換え抗原ガラス スライド井戸に HEp 2 セル単分子膜の準備が自然な形で自己抗原の広範な配列を提示に対し分散核と細胞質、患者血清やポジティブ コントロールは、さまざまな自己免疫疾患に関連付けられているパターンの多数の結果から自己抗体と反応しています。これらのパターンは、細胞内抗原の位置に基づいて核、細胞質、細胞分裂のパターンに分類されます。各パターンと関連付けられた抗原・抗原および病気の状態は、よく特徴付けられて4です。IIF 法の存在は自然な構成の自己抗原の多数を維持するために適切に固定 HEp 2 細胞の単層培養ガラス スライドの井戸で患者とコントロール血清を孵化します。患者の血清やポジティブ コントロール抗体は、潜伏中に基板 (ガラス スライドも) HEp 2 細胞によって提示された抗原にバインドが許可されます。ポスト インキュベーション、非連結の抗体が洗浄し、フルオレセイン/フルオレセイン イソチオ シアン酸 (FITC) 共役抗ひと igg 抗体試薬と結合した IgG クラスの抗体が検出されました。非連結報告共役で流されている、ガラス coverslips は、反応を保持し、蛍光顕微鏡下で観察できるメディアをマウントを使用してスライド上にマウントされます。反応が使用されるレポーターに従って構成されている適切な励起蛍光フィルターの組み合わせを搭載した蛍光顕微鏡下で観察される (FITC 記者診断顕微鏡通常を使用してフィルター 467 の加振範囲-498 nm、513-556 nm の発光範囲)。アナの存在は、細胞内の特定の構造の明るい緑の蛍光性によって示されています。自動分析プラットフォームとは異なり、IIF 方法論はシリアル希釈血清と重要なユーザーの専門知識5,6を必要とする染色パターンの視覚的肯定的な決定の困難なプロセスに依存します。これらの制限にもかかわらず HEp 2 iif 関数は最も広く使用されている残っているし、パターン (ICAP) の委員会、ANA に国際的なコンセンサスが ANAs のパターン解釈と命名に向けて標準化の努力のためのスクリーニング法を推奨IIF スライド処理、および結果の解釈3のオートメーション ソリューションの可用性の向上。
HEp 2 IIF 法、 psip1遺伝子産物 (LEDGF/p75/DFS70 とも呼ばれる) を対象とする自己抗体によって検出されたパターンの多数の間で、近年いくつかの理由4,5 に大きな関心を集めています。 ,6,7,8,9,10。DFS70 抗体は健常者、高価であるし、研究はこれまで DFS70 抗体7,8,9 の存在を明瞭な臨床協会を示すため失敗しています。、10、11,12,13。様々 な病気の状態と健康コホート研究6,8,9,10,14 の間で広く変化 DFS70 抗体の肯定的な結果を報告された率 ,,1516,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26,,2728。混合均質な斑点パターンの解釈が均一または斑点パターンと抗 DFS70 パターンを区別しても、他の ANAs と共起する抗 DFS70 抗体は専門家の読者のためにも挑戦。IIF スクリーニング方法と DFS70 特定の固相試金の現在の世代は抗 DFS70 反応混合パターン (図 1 aアルゴリズムの黄色の斜線部分) からの差別化を図ることが可能ではありません。均一、まだら、DFS70 パターンまたは混合パターン、またはその逆誤解は、患者ケアに深刻な影響があります。現在一般的に使用されるプロトコルは以下のとおりです: ANAs の疾患に関連する臨床検査室採用固相確証的なテストの数および/または DFS70/LEDGF 高密度微細斑点 (AC-2) パターン時の免疫吸着法 (図の疑いがあります。1 a)4,5。
このプロトコルの目標は小説のユーティリティ設計 HEp 2 IIF 基板を示す、(HEp 2 エリート/DFS70 ノックアウト (KO) は HEp 2 エリートにいいますが) 同時 ANAs をスクリーニングするため従来 HEp 2 のすべての利点を保持します。抗と混合 ANA 陽性例 (図 1 bアルゴリズムの黄色の斜線部分)5の両方で信頼性の高さが DFS70 パターンと区別します。HEp 2 エリート基板は、1:9 の比率の5LEDGF/p75/DFS70 抗原を欠いてそのまま従来 HEp 2 細胞とエンジニア リングのおおよその混合で構成されます。HEp 2 エリートの iif 関数プロシージャは HEp 2 従来と同じです。HEp 2 エリート基板の固有の構成だけでなく従来の HEp2 のすべての利点を保持、初期スクリーニングまたはサンプル (図 1 b のテストで DFS70 パターンから均質な斑点、および混合反応パターンを区別できます。)5。HEp 2 IIF 基板をスライドに反応する患者血清希釈 1:40 で希釈を審査または個々 の臨床基準に従ってをする必要があります。1:40 またはより高い力価で特定の反応は、正と見なされます。
この研究では均一、まだら、セントロメア、核小体、細胞質網状/海部、スクリーニングで (相対的なネガティブ コントロールと正アナ コントロール キットによって提供される) 中程度の肯定的な信号を生産 DFS70 パターンに陽性血清1:40 の希釈は、HEp 2 基板上にモノラル固有および混合パターンをシミュレートするため選ばれた (従来、HEp 2 エリート)。1:40 1:40 と混合希釈 DFS70 陽性血清個々 の疾患に関連する ANA の希釈パターン様々 な比率 (コントロール: 正立単、試しました、50: 50、DFS70 のコントロール (同質なまだら、動原体、核小体、細胞質網状海部)20: 80、および 0:100)、従来の評価と HEp 2 エリート基板次標準 IIF 手順は以下の通り。

<table><tbody><tr><td>HEp-2 ELITE / DFS70-KO 12 Well Slide sealed individually in pouch</td><td>Trinity Biotech</td><td>part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240</td><td></td></tr><tr><td>ANA positive control</td><td>Trinity Biotech&amp;nbsp;</td><td>part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240</td><td></td></tr><tr><td>DFS70 antibody positive control</td><td>Trinity Biotech</td><td>part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240</td><td></td></tr><tr><td>Negative control</td><td>Trinity Biotech</td><td>part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human IgG FITC conjugate containing Evan&#039;s blue counterstain</td><td>Trinity Biotech</td><td>part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240</td><td></td></tr><tr><td>Buffer diluent for serum</td><td>Trinity Biotech</td><td>part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Trinity Biotech</td><td>part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240</td><td></td></tr><tr><td>Mounting medium</td><td>Trinity Biotech</td><td>part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips&amp;nbsp;</td><td>Trinity Biotech</td><td>part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240</td><td></td></tr><tr><td>ImmuGlo ANA HEp-2 Cells 12 well slide sealed individually in pouch</td><td>Trinity Biotech</td><td>part of kit# 1103, 1103-240</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials used in the study but not provided by the kits&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diagnostic fluorescent microscope</td><td>Nikon Eclipse 50i</td><td></td><td>Equipped with a spot dignostic camera, model 2.2.1</td></tr><tr><td>Incubation chamber</td><td>Trinity Biotech</td><td></td><td>provided for customers (no catalog #)</td></tr><tr><td>Coplin jar</td><td>n/a</td><td></td><td>General labware</td></tr><tr><td>Paper towels</td><td>n/a</td><td></td><td>General lab supplies</td></tr><tr><td>distilled/deionized water</td><td>n/a</td><td></td><td>General lab supplies</td></tr></tbody></table>

simultaneous distinction of monospecific and mixed dfs70 patterns during ana screening with a novel hep-2 elite/dfs70 knockout substrate

全身の自己免疫の結合組織疾患は抗核抗体 (ANA) を循環させることにより特徴付けられます。スクリーニング アナは、いくつかの技術がありますが、優れた感度のためプライマリで推奨される方法のままひと上皮細胞 2 (HEp 2) 基板を用いた間接蛍光抗体 (IIF) です。HEp 2 基板は、多数の様々 なタンパク質や核酸自己抗原核と細胞の細胞質全体に分散する自己抗体の結合から生じるパターンを検出できます。抗とまた HEp 2 基板に対するポジティブな反応から生じる混合パターンの偉大な多様性では、解釈と報告の正確性を複雑にします。細心の注意を最近受け取った 1 つ具体的な例高密度微細斑点 70 (DFS70) パターンですレンズ由来上皮成長因子 (LEDGF) と呼ばれる蛋白質にとりわけ結合する自己抗体に起因。特定の全身性自己免疫疾患と健康的な集団での高い有病率に明確な関連付けの欠如重要な DFS70 パターンの正確な解釈をしました。従来の HEp 2 基板を用いた疾患関連のパターンから DFS70 パターンの正確な区別は困難です。また、均質、斑点、および混合均質な斑点パターンなどの疾患に関連するパターンと DFS70 パターンの共起関係を頻繁には、IIF 解釈を複雑にします。本稿の目的小説のユーティリティは同時に両方で高い信頼性と DFS70 パターンを区別するための能力を提供しながら従来の HEp 2 基板のすべての利点を保持する HEp 2 IIF 基板設計を示すことです。抗と混合のアナの肯定的な例。新しい基板は以前 DFS70 パターンによって隠された疾患関連アナ パターンのマスクを解除することができるさらに。

HEp 2 エリート/DFS70 KO 基板し古典的なアナのパターンを保持し DFS70 パターンの明確な区別が容易になります。
HEp 2 エリート/DFS70 島基板上従来と設計された細胞は、同一 LEDGF/p75 を除いてすべて自己抗原を維持します。キットによって提供される否定的な制御は、ベースラインの蛍光信号を確立します。HEp 2 エリートに均一、まだら、セントロメア、核小体およびミトコンドリアのパターンの肯定的なコントロールは、従来の IIF HEp 2 基板 (図 2 a) 上想定されるパターンと同じパターンを生成します。これらの参照パターンは、各パターンの抗原病協会とともに詳細に記載されている以前4,29。表 1に図 2 aで見られるパターンの簡単な説明があります。
HEp 2 エリート DFS70 パターン:
それぞれのセルの約 10% はよく高密度微細斑点パターンを示す (ICAP 名称を割り当てられる: AC 2)、核のクロマチン上で観察できるし、の分裂核 (図 2 b) を見る関連するクロマチン染色します。従来の HEp 2 基板のすべてのセルはこのパターン DFS70 肯定的なサンプルと反応があります。HEp 2 セルの残りの ~ 90% はノックアウト LEDGF 抗原をコードするpsip1遺伝子がある、したがって信号または抗 DFS70 陽性血清 (図 2 b) と反応のパターンは生成されません。HEp 2 細胞の 10% がある明るい蛍光 DFS70 パターンとセル現在追加パターン (例えば、細かい斑点または核小体) の残りの部分に対応する、混合パターンの存在を示します。このようなパターンを綿密に検討は DFS70 パターンだけでなく存在しているすべての自己抗体の特異性を確認するために不可欠です。HEp 2 エリート基板、血清サンプルで作成されたパネルの能力を実証するには、各種濃度の DFS70 および ANA 陽性血清を制御し、従来の両方でテストおよび HEp 2 エリート基板標準 IIF を使用するプロトコル (図 3、図 4、図 5、図 6、図 7)。
DFS70 抗と従来と HEp 2 エリート基板上に混合反応の解釈:
パターンごとに特定疾患関連アナ (図 3、図 4、図 5、図 6、図 7)、抗アナはほとんど列左のパターンおよび抗 DFS70 柄右側列観察することができます。途中で 3 つの列は、様々 な疾患関連の比率と DFS70 パターンのポジティブ コントロールを表します。結果として得られる混合パターンは従来の HEp 2 基板 (図 3図 4図 5図 6図 7の一番上の行) で識別し挑戦しています。しかし、サンプルのほとんどの小説の Hep 2 エリート基板変更されていないし、設計したセルの強度の違いは異なる (以下の明るい細胞に明るいの比がある場合だけではなく DFS70 自己抗体の存在を確認します。1:9) が、またセカンダリ アナ パターンを明らかにします。均質な DFS70 や斑点 DFS70 混合反応の場合、自信を持って追加の試金 (図 1 a) の数を実行することを選択 labs につながる正しいパターンを予測することはにくい。セントロメア DFS70 と核小体 DFS70 の場合混合の反応、DFS70 陽性は非常に挑戦的な疑い (図 5図 6) を実行します。DFS70 パターンは、核小体および細胞質網状/海部反応血清比 50% に達するまでない支配的です。すべての例で DFS70 パターンを提示することができます HEp 2 エリート基板と強度の広い範囲の基になるセカンダリ パターン レベルおよびこうしてより正確なアナの解釈が容易になります。
密接に混合パターン、アナとコントロールされ拡大 (図 8) 従来の HEp 2 エリート基板肯定的な DFS70 の様々 な 50: 50 の組み合わせの結果を観察。中間期および有糸分裂染色解釈と報告されたパターンの精度を向上する HEp 2 基板上への DFS70 を含むすべての ANA パターンを観察することをお勧めします。ただし、混合パターンの細胞核を分割によって提示された差分パターンは可能性があります正確な解釈を容易にするための十分なできません。赤い矢印 (図 8) は、従来、設計された細胞の分裂核を示します。それは、混合 DFS70 細胞分裂反応が準拠していない疾患関連の解釈のためのルールの設定と ANA パターン観察できます。黄色と青の矢印は変更されていないし、設計した (DFS70 島) HEp 2 細胞核をそれぞれ示します。同時上映ができます、同じ顕微鏡の視野の変更されていない細胞核染色 (~ 10%) と人工細胞核 (~ 90%) パターンの明確な強度の違いが観察されるすべての組み合わせは、(図 8) で、DFS70 パターンの確認。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig1.jpg"> 図 1: 従来 HEp 2 と HEp 2 エリート/DFS70 島 IIF を使用してアルゴリズムをスクリーニング アナ。(A) 回路図解くスクリーニング段階 (黄色の斜線部分) で抗と混合 DFS70 肯定的なパターンを識別するに従来の HEp 2 IIF の欠乏と ANA パターンを使用する疾患に関連するセカンダリを排除できない可能性がありますDFS70 パターンによって隠されます。さらに、現在の世代の DFS70 特定の固相験試金は ANAs の追加テストにつながる抗 DFS70 陽性を確認することがないです。(B) 回路図 ANAs、抗と混合の DFS70 反応の同時の区別のスクリーニングのため HEp 2 エリートの機能を明らかにし、確認を試金する固相 DFS70 の必要性を排除すること。大幅 HEp 2 エリートを使用してアルゴリズムとスクリーニング アナを簡単確認試金の必要数が減る。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig2.jpg"> 図 2: 古典的なアナと DFS70 HEp 2 エリート/DFS70 島の基板パターン。(A) HEp 2 エリート/DFS70 島基板古典的なアナ パターンが保持されます。古典的な均一反応と DFS70 の肯定的な反応は、キットによって提供される肯定的なコントロールを使用して作り出されました。他の反応は、核小体および細胞質網状/海部反応5まだら、セントロメアの以前に確立された陽性コントロール血清を使用して作り出されました。(B) 基板の HEp 2 エリート/DFS70 島 DFS70 パターンの簡単な区別を容易にする従来設計の細胞を提供しています。その結果、DFS70 抗反応界面上のパターンを汚すと従来と設計 (DFS70-KO) 細胞の細胞核を分割回路図を示しています。設計の HEp 2 細胞は通常従来の HEp 2 基板上 DFS70 自己抗体反応によって隠されているセカンダリのパターンの同時検出を可能にする LEDGF/p75/DFS70 抗原を欠いています。矢印 (黄色) は、有糸分裂細胞核の例を示します。スケール バーを表す 20 μ m.<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig3.jpg"> 図 3: DFS70 との組み合わせで均一な血清。DFS70 抗血清は様々 な比率 (正立単、試しました、50: 50、20: 80、および 0:100) の肯定的な均一パターン制御と併用され、従来と設計 (DFS70-KO) HEp 2 基板上でテストします。スケール バーを表す 20 μ m.<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig4.jpg"> 図 4: DFS70 の組み合わせで血清を斑点と。DFS70 抗血清は様々 な比率 (正立単、試しました、50: 50、20: 80、および 0:100) の肯定的な斑点パターン制御と併用され、従来と設計 (DFS70-KO) HEp 2 基板上でテストします。スケール バーを表す 20 μ m.<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig5.jpg"> 図 5: DFS70 と動原体血清の組み合わせ。DFS 70 抗血清は様々 な比率 (正立単、試しました、50: 50、20: 80、および 0:100) の肯定的なセントロメア パターン制御と併用され、従来と設計 (DFS70-KO) HEp 2 基板上でテストします。スケール バーを表す 20 μ m.<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig6.jpg"> 図 6: DFS70 との組み合わせで核小体血清。DFS 70 抗血清は様々 な比率 (正立単、試しました、50: 50、20: 80、および 0:100) の肯定的な核小体パターン制御と併用され、従来と設計 (DFS70-KO) HEp 2 基板上でテストします。スケール バーを表す 20 μ m.<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig7.jpg"> 図 7: DFS70 との組み合わせで細胞質網状/海部血清。DFS70 抗血清は様々 な比率 (正立単、試しました、50: 50、20: 80、および 0:100) の肯定的なミトコンドリア パターン制御と併用され、従来と設計 (DFS70-KO) HEp 2 基板上でテストします。スケール バーを表す 20 μ m.<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig8.jpg"> 図 8: 混在パターン (50: 50 の比率) 従来の生産と HEp 2 エリート基板。2 枚の基板間の相違点を明らかにしました。赤い矢印は、両方の基板上に設計された従来の細胞の分裂核を示します。これらの組み合わせの従来の HEp 2 基板上の細胞核を割って提示差分パターンは混合パターンの正確な解釈のために十分ではありません。それは、細胞分裂の混合の DFS70 反応することができます摂動疾患関連の解釈のためのルールの設定 ANA パターン観察できます。黄色と青の矢印は変更されていないし、設計した (DFS70 島) HEp 2 細胞核をそれぞれ示します。すべての組み合わせの結果が設計された基板上テスト: 明確な強度差に属する間期核パターン (~ 10%) のセルをそのまま、設計の細胞 (~ 90%) を認めた有効に同時検出と DFS70 パターンの確認。スケール バーを表す 20 μ m.<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ANA パターン</td>
			<td colspan="2">説明</td>
		</tr>
<tr>
<td>均一</td>
			<td colspan="2">全体の核は、びまん性の染色パターンと均等に蛍光を発する。</td>
		</tr>
<tr>
<td>斑点</td>
			<td colspan="2">離散の斑点をもつ核全体で蛍光を発する。 微細な斑点と粗い斑点パターンが記載されています。</td>
		</tr>
<tr>
<td>核小体</td>
			<td colspan="2">核小体は核内で複数の固体または斑点のボディとして染色します。サブタイプは、以前に記載されています。</td>
		</tr>
<tr>
<td>セントロメア</td>
			<td colspan="2">有限数の大きな斑点。凝縮染色体細胞有糸分裂を経る反応性抗原を分離します。</td>
		</tr>
<tr>
<td>細胞質網状/海部</td>
			<td colspan="2">細胞質とミトコンドリアの染色陽性顆粒が表示されます。</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">DFS70</td>
			<td colspan="2">ありきたり HEp 2 細胞: 細胞分裂核で見られる染色間期核のクロマチン関連高密度微細斑点パターンが観察されます。</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">•Engineered DFS70 島細胞: 抗 DFS70 抗体を作り出す否定的な汚損</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">HEp 2 エリート/約 1:9 比で従来と設計 (DFS70 島) セルには DFS70 島します。従来の細胞を作り出す典型的な DFS70 パターンと設計の細胞を作り出す負のパターン DFS70 抗/分離陽性反応と反応。</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: ANA パターンの説明。

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Simultaneous Distinction of Monospecific and Mixed DFS70 Patterns During ANA Screening with a Novel HEp-2 ELITE/DFS70 Knockout Substrate

DFS70 抗体は、従来 HEp 2 基板を使用して、正確な解釈を挑戦的な共通の抗核抗体の病気に関連するパターンを模倣します。プロトコルでは、スクリーニングと抗と混合 ANA 陽性で高信頼の DFS70 パターンを区別するアナに従来 HEp 2 に新規設計された HEp 2 基の利点について説明します。

抗と新規 HEp 2 エリート/DFS70 ノックアウト基板アナ選考において混合 DFS70 パターンの同時の区別

Systemic autoimmune connective tissue disorders are characterized by circulating antinuclear antibodies (ANA). Although there are several technologies ...

simultaneous-distinction-monospecific-mixed-dfs70-patterns-during-ana

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

35.5K ビュー.  A Trinity Biotech Company. DFS70 抗体は、従来 HEp 2 基板を使用して、正確な解釈を挑戦的な共通の抗核抗体の病気に関連するパターンを模倣します。プロトコルでは、スクリーニングと抗と混合 ANA 陽性で高信頼の DFS70 パターンを区別するアナに従来 HEp 2 に新規設計された HEp 2 基の利点について説明します。

ビデオ: Simultaneous Distinction of Monospecific and Mixed DFS70 Patterns During ANA Screening with a Novel HEp-2 ELITE/DFS70 Knockout Substrate

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated HF183 marker. The EntHF183 duplex dPCR (referred as EntHF183 dPCR hereon) assay uses the same primer and probe sequences as its published individual quantitative PCR (qPCR) counterparts. Likewise, the same water filtration and DNA extraction procedures as performed prior to qPCR are followed prior to running dPCR. However, the duplex dPCR assay has several advantages over the qPCR assays. Most important, the dPCR assay eliminates the need for running a standard curve and hence, the associated bias and variability, by direct quantification of its targets. In addition, while duplexing (i.e. simultaneous quantification) Enterococcus and HF183 in qPCR often leads to severe underestimation of the less abundant target in a sample, dPCR provides consistent quantification of both targets, whether quantified individually or simultaneously in the same reaction. The dPCR assay is also able to tolerate PCR inhibitor concentrations that are one to two orders of magnitude higher than those tolerated by qPCR. These advantages make the EntHF183 dPCR assay particularly attractive because it simultaneously provides accurate and repeatable information on both general and human-associated fecal contamination in environmental waters without the need to run two separate qPCR assays. Despite its advantages over qPCR, the upper quantification limit of the dPCR assay with currently available instrumentation is approximately four orders of magnitude lower than that achievable by qPCR. Consequently, dilution is needed for measurement of high concentrations of target organisms such as those typically observed following sewage spills.

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay that can be used to simultaneously quantify Enterococcus spp. and the HF183 genetic markers as indicators of general and human-associated fecal contamination in recreational waters.

の同時定量のための二重デジタルPCRアッセイ<em&gt;エンテロコッカス属。</em&gt;およびWatersにおけるヒトの糞便関連HF183マーカー

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

環境学

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our entire society's ability to treat systemic infections. In the United States alone, antibiotic-resistant infections kill approximately 23,000 people a year and cost around 20 billion USD in additional healthcare. One approach to combat antimicrobial resistance is combination therapy, which is particularly useful in the critical early stage of infection, before the infecting organism and its drug resistance profile have been identified. Many antimicrobial treatments use combination therapies. However, most of these combinations are additive, meaning that the combined efficacy is the same as the sum of the individual antibiotic efficacy. Some combination therapies are synergistic: the combined efficacy is much greater than additive. Synergistic combinations are particularly useful because they can inhibit the growth of antimicrobial drug resistant strains. However, these combinations are rare and difficult to identify. This is due to the sheer number of molecules needed to be tested in a pairwise manner: a library of 1,000 molecules has 1 million potential combinations. Thus, efforts have been made to predict molecules for synergy. This article describes our high-throughput method for predicting synergistic small molecule pairs known as the Overlap2 Method (O2M). O2M uses patterns from chemical-genetic datasets to identify mutants that are hypersensitive to each molecule in a synergistic pair but not to other molecules. The Brown lab exploits this growth difference by performing a high-throughput screen for molecules that inhibit the growth of mutant but not wild-type cells. The lab's work previously identified molecules that synergize with the antibiotic trimethoprim and the antifungal drug fluconazole using this strategy. Here, the authors present a method to screen for novel synergistic combinations, which can be altered for multiple microorganisms.

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Synergistic drug combinations are difficult and time-consuming to identify empirically. Here, we describe a method for identifying and validating synergistic small molecules.

重複2法による相乗効果の薬剤の組合せの高スループット識別

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

遺伝学

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are expressed in spatial relation to each other in situ. Multi-target chromogenic whole-mount in situ hybridization (MC-WISH) greatly facilitates the instant comparison of gene expression patterns, as it allows distinctive visualization of different mRNA species in contrasting colors in the same sample specimen. This provides the possibility to relate gene expression domains topographically to each other with high accuracy and to define unique and overlapping expression sites. In the presented protocol, we describe a MC-WISH procedure for comparing mRNA expression patterns of different genes in Drosophila embryos. Up to three RNA probes, each specific for another gene and labeled by a different hapten, are simultaneously hybridized to the embryo samples and subsequently detected by alkaline phosphatase-based colorimetric immunohistochemistry. The described procedure is detailed here for Drosophila, but works equally well with zebrafish embryos.

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

We describe a multi-target chromogenic whole-mount in situ hybridization (MC-WISH) procedure in intact Drosophila embryos allowing simultaneous and specific detection of three different mRNA distribution patterns by contrasting color precipitates.

マルチターゲット発色ホールマウント<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーションにおける遺伝子発現のドメインを比較します<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

発生生物学

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

からのDNA抽出のためのシンプルなChelexプロトコル<em&gt;ハマダラカ</em&gt;属。

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

免疫・感染学

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation into thousands of nano-sized water-in-oil individual reactions. Recently, ddPCR has become one of the most accurate and sensitive tools for circulating tumor DNA (ctDNA) detection. One of the major limitations of the standard ddPCR technique is the restricted number of mutations that can be screened per reaction, as specific hydrolysis probes recognizing each possible allelic version are required. An alternative methodology, the drop-off ddPCR, increases throughput, since it requires only a single pair of probes to detect and quantify potentially all genetic alterations in the targeted region. Drop-off ddPCR displays comparable sensitivity to conventional ddPCR assays with the advantage of detecting a greater number of mutations in a single reaction. It is cost-effective, conserves precious sample material, and can also be used as a discovery tool when mutations are not known a priori.

Here, we present a protocol to accurately quantify multiple genetic alterations of a target region in a single reaction using drop-off ddPCR and a unique pair of hydrolysis probes.

ホット スポット領域の変異の包括的かつ同時検出のための単一液滴デジタル ポリメラーゼの連鎖反応

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Digital-Droplet PCR to Detect Indels Mutations in Genetically Modified Anopheline Mosquito Populations

Recent advances in mosquito genomics and genetic engineering technologies have fostered a need for quick and efficient methods for detecting targeted DNA sequence variation on a large scale. Specifically, detecting insertions and deletions (indels) at gene-edited sites generated by CRISPR guide RNA (gRNA)/Cas9-mediated non-homologous end-joining (NHEJ) is important for assessing the fidelity of the mutagenesis and the frequency of unintended changes. We describe here a protocol for digital-droplet PCR (ddPCR) that is well-suited for high-throughput NHEJ analysis. While this method does not produce data that identifies individual sequence variation, it provides a quantitative estimate of the sequence variation within a population. Additionally, with appropriate resources, this protocol can be implemented in a field-site laboratory setting more easily than next-generation or Sanger sequencing. ddPCR also has a faster turn-around time for results than either of those methods, which allows a more quick and complete analysis of genetic variation in wild populations during field trials of genetically-engineered organisms.

This protocol provides the steps from DNA extraction to experimental set-up for digital droplet PCR (ddPCR), including analysis for the identification and quantification of non-homologous end-joining (NHEJ) events at target sites following gRNA-induced Cas9 cleavage and DNA repair. Other uses of this method include applications such as polymorphism detection and gene-editing variant verification.

遺伝子組み換えアノフェリン蚊集団におけるインデル変異を検出するデジタル液滴PCR

Recent advances in mosquito genomics and genetic engineering technologies have fostered a need for quick and efficient methods for detecting targeted DNA ...

An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in sub-Saharan Africa continue to expand, individuals on ART should be closely monitored for the emergence of drug resistance. Surveillance of transmitted drug resistance to track transmission of viral strains already resistant to ART is also critical. Unfortunately, drug resistance testing is still not readily accessible in resource limited settings, because genotyping is expensive and requires sophisticated laboratory and data management infrastructure. An open access genotypic drug resistance monitoring method to manage individuals and assess transmitted drug resistance is described. The method uses free open source software for the interpretation of drug resistance patterns and the generation of individual patient reports. The genotyping protocol has an amplification rate of greater than 95% for plasma samples with a viral load &#62;1,000 HIV-1 RNA copies/ml. The sensitivity decreases significantly for viral loads &#60;1,000 HIV-1 RNA copies/ml. The method described here was validated against a method of HIV-1 drug resistance testing approved by the United States Food and Drug Administration (FDA), the Viroseq genotyping method. Limitations of the method described here include the fact that it is not automated and that it also failed to amplify the circulating recombinant form CRF02_AG from a validation panel of samples, although it amplified subtypes A and B from the same panel.

Drug resistance testing for HIV-1 infected individuals failing antiretroviral therapy (ART) can guide future therapies and improve treatment outcomes. Optimizing individual and population health outcomes in high HIV prevalence but resource-limited settings will ultimately require affordable and accessible drug resistance genotyping and interpretation methods.

リソースの限定された設定のための手ごろな価格の、HIV-1薬剤耐性監視方法

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in ...

医学

Single Nucleotide Polymorphism-sensitive FISH Detection of Locus-specific Ribosomal RNA Transcription in Drosophila melanogaster

In order to ensure sufficient ribosomal RNA (rRNA) is transcribed for ribosome function, genomes contain hundreds of tandem duplications of the sequences that encode rRNAs, composing regions called ribosomal DNA (rDNA) loci. Many organisms' genomes contain more than one rDNA locus distributed across different chromosomes, and rRNA may be transcribed from multiple rDNA loci or only a single locus. Changes in rRNA transcription sources often indicate ribosomal distress. However, the homogeneity of rRNA obstructs distinguishing if rRNA is transcribed from multiple or a single rDNA locus. Here, we describe a method that uses single nucleotide polymorphism-sensitive fluorescence in situ hybridization (SNP-FISH) to distinguish rRNA transcription between Drosophila melanogaster rDNA loci on the X and Y chromosomes. This method leverages locus-specific rRNA variants to enable easy detection of the source of rRNA transcription with single-cell resolution. This assay can be applied to any Drosophila cell type and may be adapted for use in other systems.

The protocol describes single nucleotide polymorphisms-sensitive fluorescence in situ hybridization (SNP-FISH) method to distinguish ribosomal RNA transcripts derived from the X or Y chromosome ribosomal DNA locus in Drosophila melanogaster.

Drosophila melanogasterにおける遺伝子座特異的リボソームRNA転写の一塩基多型感受性FISH検出

In order to ensure sufficient ribosomal RNA (rRNA) is transcribed for ribosome function, genomes contain hundreds of tandem duplications of the sequences ...

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that allows for the glycosylation profiling of specific proteins. Glycosylation of proteins is the most prevalent post-translational modification found on proteins, and leads diversified modifications of the physical, chemical, and biological properties of proteins. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases. However, current methods to study protein glycosylation typically are too complicated or expensive for use in most normal laboratory or clinical settings and a more practical method to study protein glycosylation is needed. The new protocol described in this study makes use of a chemically blocked antibody microarray with glycan-binding protein (GBP) detection and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements needed to study protein glycosylation. In this method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies are printed directly onto the microarray slides and the N-glycans on the antibodies are blocked. The blocked, immobilized glycoprotein-specific antibodies are able to capture and isolate glycoproteins from a complex sample that is applied directly onto the microarray slides. Glycan detection then can be performed by the application of biotinylated lectins and other GBPs to the microarray slide, while binding levels can be determined using Dylight 549-Streptavidin. Through the use of an antibody panel and probing with multiple biotinylated lectins, this method allows for an effective glycosylation profile of the different proteins found in a given human or animal sample to be developed.
Introduction
Glycosylation of protein, which is the most ubiquitous post-translational modification on proteins, modifies the physical, chemical, and biological properties of a protein, and plays a fundamental role in various biological processes1-6. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases 7-12. In fact, most current cancer biomarkers, such as the L3 fraction of &alpha;-1 fetoprotein (AFP) for hepatocellular carcinoma 13-15, and CA199 for pancreatic cancer 16, 17 are all aberrant glycan moieties on glycoproteins. However, methods to study protein glycosylation have been complicated, and not suitable for routine laboratory and clinical settings. Chen et al. has recently invented a chemically blocked antibody microarray with a glycan-binding protein (GBP) detection method for high-throughput and multiplexed profile glycosylation of native glycoproteins in a complex sample 18. In this affinity based microarray method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies capture and isolate glycoproteins from the complex mixture directly on the microarray slide, and the glycans on each individual captured protein are measured by GBPs. Because all normal antibodies contain N-glycans which could be recognized by most GBPs, the critical step of this method is to chemically block the glycans on the antibodies from binding to GBP. In the procedure, the cis-diol groups of the glycans on the antibodies were first oxidized to aldehyde groups by using NaIO4 in sodium acetate buffer avoiding light. The aldehyde groups were then conjugated to the hydrazide group of a cross-linker, 4-(4-N-MaleimidoPhenyl)butyric acid Hydrazide HCl (MPBH), followed by the conjugation of a dipeptide, Cys-Gly, to the maleimide group of the MPBH. Thus, the cis-diol groups on glycans of antibodies were converted into bulky none hydroxyl groups, which hindered the lectins and other GBPs bindings to the capture antibodies. This blocking procedure makes the GBPs and lectins bind only to the glycans of captured proteins. After this chemically blocking, serum samples were incubated with the antibody microarray, followed by the glycans detection by using different biotinylated lectins and GBPs, and visualized with Cy3-streptavidin. The parallel use of an antibody panel and multiple lectin probing provides discrete glycosylation profiles of multiple proteins in a given sample 18-20. This method has been used successfully in multiple different labs 1, 7, 13, 19-31. However, stability of MPBH and Cys-Gly, complicated and extended procedure in this method affect the reproducibility, effectiveness and efficiency of the method. In this new protocol, we replaced both MPBH and Cys-Gly with one much more stable reagent glutamic acid hydrazide (Glu-hydrazide), which significantly improved the reproducibility of the method, simplified and shorten the whole procedure so that the it can be completed within one working day. In this new protocol, we describe the detailed procedure of the protocol which can be readily adopted by normal labs for routine protein glycosylation study and techniques which are necessary to obtain reproducible and repeatable results.

In this study, we describe an improved protocol for a multiplexed high-throughput antibody microarray with lectin detection method that can be used in glycosylation profiling of specific proteins. This protocol features new reliable reagents and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements as compared to the previous procedure.

複雑なサンプル中の特定のタンパク質のグリコシル化の多重化ハイスループットプロファイリングのための化学的にブロックされた抗体マイクロアレイ

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

生物学

Anti-Nuclear Antibody Screening Using HEp-2 Cells

The American College of Rheumatology position statement on ANA testing stipulates the use of IIF as the gold standard method for ANA screening1. Although IIF is an excellent screening test in expert hands, the technical difficulties of processing and reading IIF slides &#8211; such as the labor intensive slide processing, manual reading, the need for experienced, trained technologists and the use of dark room &#8211; make the IIF method difficult to fit in the workflow of modern, automated laboratories.
The first and crucial step towards high quality ANA screening is careful slide processing. This procedure is labor intensive, and requires full understanding of the process, as well as attention to details and experience.
Slide reading is performed by fluorescent microscopy in dark rooms, and is done by trained technologists who are familiar with the various patterns, in the context of cell cycle and the morphology of interphase and dividing cells. Provided that IIF is the first line screening tool for SARD, understanding the steps to correctly perform this technique is critical.
Recently, digital imaging systems have been developed for the automated reading of IIF slides. These systems, such as the NOVA View Automated Fluorescent Microscope, are designed to streamline the routine IIF workflow. NOVA View acquires and stores high resolution digital images of the wells, thereby separating image acquisition from interpretation; images are viewed an interpreted on high resolution computer monitors. It stores images for future reference and supports the operator&#8217;s interpretation by providing fluorescent light intensity data on the images. It also preliminarily categorizes results as positive or negative, and provides pattern recognition for positive samples. In summary, it eliminates the need for darkroom, and automates and streamlines the IIF reading/interpretation workflow. Most importantly, it increases consistency between readers and readings. Moreover, with the use of barcoded slides, transcription errors are eliminated by providing sample traceability and positive patient identification. This results in increased patient data integrity and safety.
The overall goal of this video is to demonstrate the IIF procedure, including slide processing, identification of common IIF patterns, and the introduction of new advancements to simplify and harmonize this technique.

Indirect immunofluorescent (IIF) assays have traditionally been used for the detection of antinuclear antibodies (ANA) in human serum. The presence of these antibodies can aid in the diagnosis of systemic autoimmune rheumatic diseases (SARD). This protocol demonstrates how to effectively perform the IIF technique to accurately detect these autoantibodies.

抗核抗体のHE​​p-2細胞を用いたスクリーニング

The American College of Rheumatology position statement on ANA testing stipulates the use of IIF as the gold standard method for ANA screening1. Although ...

抗と新規 HEp 2 エリート/DFS70 ノックアウト基板アナ選考において混合 DFS70 パターンの同時の区別

要約

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この動画の章

の同時定量のための二重デジタルPCRアッセイ

重複²法による相乗効果の薬剤の組合せの高スループット識別

マルチターゲット発色ホールマウント

からのDNA抽出のためのシンプルなChelexプロトコル

ホットスポット領域の変異の包括的かつ同時検出のための単一液滴デジタルポリメラーゼの連鎖反応

遺伝子組み換えアノフェリン蚊集団におけるインデル変異を検出するデジタル液滴PCR

リソースの限定された設定のための手ごろな価格の、HIV-1薬剤耐性監視方法

Drosophila melanogasterにおける遺伝子座特異的リボソームRNA転写の一塩基多型感受性FISH検出

複雑なサンプル中の特定のタンパク質のグリコシル化の多重化ハイスループットプロファイリングのための化学的にブロックされた抗体マイクロアレイ

抗核抗体のHEp-2細胞を用いたスクリーニング

抗と新規 HEp 2 エリート/DFS70 ノックアウト基板アナ選考において混合 DFS70 パターンの同時の区別

要約

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の同時定量のための二重デジタルPCRアッセイ

重複2法による相乗効果の薬剤の組合せの高スループット識別

マルチターゲット発色ホールマウント

からのDNA抽出のためのシンプルなChelexプロトコル

ホット スポット領域の変異の包括的かつ同時検出のための単一液滴デジタル ポリメラーゼの連鎖反応

遺伝子組み換えアノフェリン蚊集団におけるインデル変異を検出するデジタル液滴PCR

リソースの限定された設定のための手ごろな価格の、HIV-1薬剤耐性監視方法

Drosophila melanogasterにおける遺伝子座特異的リボソームRNA転写の一塩基多型感受性FISH検出

複雑なサンプル中の特定のタンパク質のグリコシル化の多重化ハイスループットプロファイリングのための化学的にブロックされた抗体マイクロアレイ

抗核抗体のHE​​p-2細胞を用いたスクリーニング

重複²法による相乗効果の薬剤の組合せの高スループット識別

ホットスポット領域の変異の包括的かつ同時検出のための単一液滴デジタルポリメラーゼの連鎖反応

抗核抗体のHEp-2細胞を用いたスクリーニング