ありがとうアンドリュー Zenger IIF 実験を行い、画像を収集します。

プロトコル三位一体のバイオ テクノロジー機関人間研究倫理委員会のガイドラインに従います。
1. サンプルと基板の準備
<ol><li>基板スライドを含む袋を許可 (HEp2 や HEp のいずれかが含まれているスライドごとに 12 の井戸をスライド ガラス-2 + KO HEp2 細胞混合) する前に、スライドの表面に水分が凝縮を防ぎ最適なパフォーマンスのための部屋の温度を平衡させ、サンプルの追加。これは約 10-15 分の間に取る必要があります。</li>
	<li>部屋の温度平衡、一度、袋の側面に触れることがなく指を使って基板のスライドを慎重に取り外します。</li>
	<li>スライドのラベル、サンプルおよび共役潜伏中にスライドの乾燥を防ぐために水で湿らせたペーパー タオルで並ぶ (常温) インキュベーション室に配置。 注: は、ドライ井に生じる非特異染色培養チャンバー内湿紙タオルは、湿度を提供し、よく乾燥を防ぎます。</li>
</ol>2. コントロールとサンプルの追加
<ol><li>この研究、または個々 のスライドの井戸に患者血清サンプルで説明されているように DFS70 ANA 陽性血清の組み合わせ、正/負コントロールの約 50 μ L を調剤します。</li>
	<li>スライドの各ウェルにコントロールとサンプルを調剤します。</li>
	<li>よくクロス汚染を防ぐためには、井戸をオーバフィ リングを避けます。ないオーバフィ リング井戸、井戸の表面の完全なカバレッジを確保する、気泡を避けるため。 注: 推奨されるボリュームはステップ 2.1 あたり 50 μ L です。</li>
	<li>培養チャンバーのふたを閉めて室温で 30 分間スライドを孵化させなさい。患者の血清中に任意のアナ、この潜伏期間中に各ウェルの現在のセルにバインドします。</li>
	<li>潜伏期間が終われば、培養室からスライドを削除します。タブ端にスライドを保持するおよび約 10 mL リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 洗浄バッファー ピペットを使用して、キットに付属で優しく洗い流してくださいまたは 10-15 s. の PBS が入ったビーカーに PBS 洗浄バッファーと洗浄 (Coplin jar にすぐにスライドを転送ソーク) 10 分すべて残りのスライドで処理を繰り返します。 注: これになりますとスライドの携帯側が別のスライドを接触しないように Coplin jar ファイルに複数のスライドを配置する場合に、スライド ガラスに付着、細胞の損傷します。</li>
</ol>3. 添加蛍光灯共役
<ol><li>Coplin jar ファイルから一度に 1 つだけのスライドを削除します。優しく、スライドから余分な PBS 洗浄バッファーを削除するには、] をタップまたはペーパー タオルの上のスライドのしみ。各キットは、FITC 標識抗ひと IgG 蛍光共役で提供されます。各ウェルにそっと 1 滴 (約 50 μ L) 提供の共役を適用します。</li>
	<li>30 分間閉じた染色培養室でスライドを孵化させなさい。 注: Fc 特定 IgG 複合体の使用をお勧めします。患者の血清中に任意のアナ、共役は井戸の存在の細胞の特定の蛍光性の結果この潜伏期間中に各ウェルに存在のセルにバインドします。共役は、光に敏感です。閉じたインキュベーション室は、各ウェルに存在の細胞の共役反応を光の干渉を防ぐために役立ちます。</li>
	<li>潜伏期間が終われば、培養室からスライドを削除します。タブ端にスライドを保持して、ピペットを使用して、キットまたは PBS が入ったビーカーに約 10 mL の PBS 洗浄バッファーで軽くすすいでください。10 分は残りのすべてのスライドのプロセスを繰り返すために、スライドを PBS 洗浄バッファーと洗浄 (浸漬) Coplin jar にすぐに転送します。 注: これになりますとスライドの携帯側が別のスライドを接触しないように Coplin jar ファイルに複数のスライドを配置する場合に、スライド ガラスに付着、細胞の損傷します。</li>
	<li>場所 coverslips 乾燥したペーパー タオルの上にキットで提供されています。メディアをマウント キットで提供されます。Coverslip の下端行のメディアをマウントの 3-4 滴の間適用します。</li>
	<li>洗浄バッファーを含む Coplin jar から一度に 1 つのスライドを取り出します。優しく、過剰な洗浄バッファーを削除するには、] をタップまたはペーパー タオルの上のスライドのしみ。</li>
	<li>カバーガラスの端にスライドの下端を配置することによって、coverslip に優しくスライドを下げます。これはスライドの上端に流れる低いエッジ coverslip の現在のメディアをマウントできスライドの各ウェルの読み取りを妨げていることがあります空気の泡の形成を最小限に抑えます。 注: スライドにカバー スライドをマウントする最小限の圧力を使用ください。任意の余分な圧力は、カバー スリップの横方向の動きを引き起こす可能性が。これは歪みの結果のセルの単分子膜作製への損傷を引き起こします。</li>
	<li>2-8 ° C で暗闇の中でスライドを保存します。すぐにマウントされている、または 48 時間以内は、スライドを確認します。 注: パターンと蛍光信号の劣化で長期保管があります。</li>
</ol>4. 肯定的な、否定的な結果の識別
<ol><li>暗い部屋にある FITC フィルター セットを使用して蛍光顕微鏡でスライドを表示します。</li>
	<li>200 陽性に関する最終的な解釈をして、パターンに倍以上の倍率で蛍光顕微鏡下で特定の明るい緑の蛍光性を調べます。正と負のコントロールを確認します。 注: (図 2 a均質) 核に明るい蛍光グリーンは、肯定的なコントロールが表示されます。ネガティブ コントロールには、蛍光顕微鏡下で特定の緑の蛍光性が表示されません。</li>
	<li>各ウェルの正/負の結果を記録し、陽性例でアナのパターンが含まれます。</li>
</ol>

<ol>
	<li>. Position Statement. Methodology of testing for antinuclear antibodies Available from: <a target="_blank" href="https://www.rheumatology.org/Portals/0/Files/Methodology%20of%20Testing%20Antinuclear%20Antibodies%20Position%20Statement.pdf">https://www.rheumatology.org/Portals/0/Files/Methodology%20of%20Testing%20Antinuclear%20Antibodies%20Position%20Statement.pdf</a> (2011)</li><li>Meroni, P. L., Schur, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ANA+screening:+an+old+test+with+new+recommendations.">ANA screening: an old test with new recommendations.</a> Ann Rheum Dis. 69 (8), 1420-1422 (2010).</li><li>Agmon-Levin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+recommendations+for+the+assessment+of+autoantibodies+to+cellular+antigens+referred+to+as+anti-nuclear+antibodies.">International recommendations for the assessment of autoantibodies to cellular antigens referred to as anti-nuclear antibodies.</a> Ann Rheum Dis. 73 (1), 17-23 (2014).</li><li>Chan, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+of+the+First+International+Consensus+on+Standardized+Nomenclature+of+Antinuclear+Antibody+HEp-2+Cell+Patterns+2014-2015.">Report of the First International Consensus on Standardized Nomenclature of Antinuclear Antibody HEp-2 Cell Patterns 2014-2015.</a> Front Immunol. 6, 412 (2015).</li><li>Malyavantham, K., Suresh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+DFS70+pattern+and+impact+on+ANA+screening+using+a+novel+HEp-2+ELITE/DFS70+knockout+substrate.">Analysis of DFS70 pattern and impact on ANA screening using a novel HEp-2 ELITE/DFS70 knockout substrate.</a> Auto Immun Highlights. 8 (1), 3 (2017).</li><li>Sperotto, F., Seguso, M., Gallo, N., Plebani, M., Zulian, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-DFS70+antibodies+in+healthy+schoolchildren:+A+follow-up+analysis.">Anti-DFS70 antibodies in healthy schoolchildren: A follow-up analysis.</a> Autoimmun Rev. , (2017).</li><li>Ayaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+cytotoxic+anti-LEDGF+autoantibodies+in+atopic+dermatitis.">Detection of cytotoxic anti-LEDGF autoantibodies in atopic dermatitis.</a> Autoimmunity. 35 (5), 319-327 (2002).</li><li>Ochs, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibodies+to+DFS+70+kd/transcription+coactivator+p75+in+atopic+dermatitis+and+other+conditions.">Autoantibodies to DFS 70 kd/transcription coactivator p75 in atopic dermatitis and other conditions.</a> J Allergy Clin Immunol. 105 (6 Pt 1), 1211-1220 (2000).</li><li>Watanabe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-DFS70+antibodies+in+597+healthy+hospital+workers.">Anti-DFS70 antibodies in 597 healthy hospital workers.</a> Arthritis Rheum. 50 (3), 892-900 (2004).</li><li>Yamada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humoral+immune+response+directed+against+LEDGF+in+patients+with+VKH.">Humoral immune response directed against LEDGF in patients with VKH.</a> Immunol Lett. 78 (3), 161-168 (2001).</li><li>Seelig, C. A., Bauer, O., Seelig, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibodies+Against+DFS70/LEDGF+Exclusion+Markers+for+Systemic+Autoimmune+Rheumatic+Diseases+(SARD).">Autoantibodies Against DFS70/LEDGF Exclusion Markers for Systemic Autoimmune Rheumatic Diseases (SARD).</a> Clin Lab. 62 (4), 499-517 (2016).</li><li>Ochs, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+significance+of+autoantibodies+to+DFS70/LEDGFp75+in+health+and+disease:+integrating+basic+science+with+clinical+understanding.">The significance of autoantibodies to DFS70/LEDGFp75 in health and disease: integrating basic science with clinical understanding.</a> Clin Exp Med. 16 (3), 273-293 (2016).</li><li>Bizzaro, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+chemoluminescence+and+immunoasdorption+tests+for+anti-DFS70+antibodies+avoid+false+positive+results+by+indirect+immunofluorescence.">Specific chemoluminescence and immunoasdorption tests for anti-DFS70 antibodies avoid false positive results by indirect immunofluorescence.</a> Clin Chim Acta. 451 (Pt B), 271-277 (2015).</li><li>Bizzaro, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+the+lens+and+cornea+in+anti-DFS70-positive+subjects.">Antibodies to the lens and cornea in anti-DFS70-positive subjects.</a> Ann N Y Acad Sci. 1107, 174-183 (2007).</li><li>Daniels, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antinuclear+autoantibodies+in+prostate+cancer:+immunity+to+LEDGF/p75,+a+survival+protein+highly+expressed+in+prostate+tumors+and+cleaved+during+apoptosis.">Antinuclear autoantibodies in prostate cancer: immunity to LEDGF/p75, a survival protein highly expressed in prostate tumors and cleaved during apoptosis.</a> Prostate. 62 (1), 14-26 (2005).</li><li>Dellavance, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+spectrum+of+antinuclear+antibodies+associated+with+the+nuclear+dense+fine+speckled+immunofluorescence+pattern.">The clinical spectrum of antinuclear antibodies associated with the nuclear dense fine speckled immunofluorescence pattern.</a> J Rheumatol. 32 (11), 2144-2149 (2005).</li><li>Gundin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+anti-DFS70+antibodies+in+patients+with+ANA-associated+autoimmune+rheumatic+diseases+suspicion+is+cost-effective.">Measurement of anti-DFS70 antibodies in patients with ANA-associated autoimmune rheumatic diseases suspicion is cost-effective.</a> Auto Immun Highlights. 7 (1), 10 (2016).</li><li>Kang, S. Y., Lee, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+significance+of+dense+fine+speckled+pattern+in+anti-nuclear+antibody+test+using+indirect+immunofluorescence+method.">Clinical significance of dense fine speckled pattern in anti-nuclear antibody test using indirect immunofluorescence method.</a> Korean J Lab Med. 29 (2), 145-151 (2009).</li><li>Lee, H., Kim, Y., Han, K., Oh, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+anti-DFS70+antibody+and+specific+autoantibody+test+algorithms+to+patients+with+the+dense+fine+speckled+pattern+on+HEp-2+cells.">Application of anti-DFS70 antibody and specific autoantibody test algorithms to patients with the dense fine speckled pattern on HEp-2 cells.</a> Scand J Rheumatol. 45 (2), 122-128 (2016).</li><li>Mariz, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+on+the+antinuclear+antibody-HEp-2+test+is+a+critical+parameter+for+discriminating+antinuclear+antibody-positive+healthy+individuals+and+patients+with+autoimmune+rheumatic+diseases.">Pattern on the antinuclear antibody-HEp-2 test is a critical parameter for discriminating antinuclear antibody-positive healthy individuals and patients with autoimmune rheumatic diseases.</a> Arthritis Rheum. 63 (1), 191-200 (2011).</li><li>Marlet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombophilia+Associated+with+Anti-DFS70+Autoantibodies.">Thrombophilia Associated with Anti-DFS70 Autoantibodies.</a> PLoS One. 10 (9), e0138671 (2015).</li><li>Mercado, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+autoantibodies+to+DSF70/LEDGFp75+in+Mexican+Hispanics+using+multiple+complementary+assay+platforms.">Detection of autoantibodies to DSF70/LEDGFp75 in Mexican Hispanics using multiple complementary assay platforms.</a> Auto Immun Highlights. 8 (1), 1 (2017).</li><li>Muro, Y., Sugiura, K., Morita, Y., Tomita, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+concomitance+of+disease+marker+autoantibodies+in+anti-DFS70/LEDGF+autoantibody-positive+patients+with+autoimmune+rheumatic+disease.">High concomitance of disease marker autoantibodies in anti-DFS70/LEDGF autoantibody-positive patients with autoimmune rheumatic disease.</a> Lupus. 17 (3), 171-176 (2008).</li><li>Muro, Y., Sugiura, K., Nakashima, R., Mimori, T., Akiyama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+prevalence+of+anti-DFS70/LEDGF+antibodies+in+patients+with+dermatomyositis+and+other+systemic+autoimmune+rheumatic+diseases.">Low prevalence of anti-DFS70/LEDGF antibodies in patients with dermatomyositis and other systemic autoimmune rheumatic diseases.</a> J Rheumatol. 40 (1), 92-93 (2013).</li><li>Mutlu, E., Eyigor, M., Mutlu, D., Gultekin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confirmation+of+anti-DFS70+antibodies+is+needed+in+routine+clinical+samples+with+DFS+staining+pattern.">Confirmation of anti-DFS70 antibodies is needed in routine clinical samples with DFS staining pattern.</a> Cent Eur J Immunol. 41 (1), 6-11 (2016).</li><li>Okamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibodies+to+DFS70/LEDGF+are+increased+in+alopecia+areata+patients.">Autoantibodies to DFS70/LEDGF are increased in alopecia areata patients.</a> J Autoimmun. 23 (3), 257-266 (2004).</li><li>Pazini, A. M., Fleck, J., dos Santos, R. S., Beck, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+relevance+and+frequency+of+cytoplasmic+and+nuclear+dense+fine+speckled+patterns+observed+in+ANA-HEp-2.">Clinical relevance and frequency of cytoplasmic and nuclear dense fine speckled patterns observed in ANA-HEp-2.</a> Rev Bras Reumatol. 50 (6), 655-660 (2010).</li><li>Schmeling, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibodies+to+Dense+Fine+Speckles+in+Pediatric+Diseases+and+Controls.">Autoantibodies to Dense Fine Speckles in Pediatric Diseases and Controls.</a> J Rheumatol. 42 (12), 2419-2426 (2015).</li><li>Wiik, A. S., Hoier-Madsen, M., Forslid, J., Charles, P., Meyrowitsch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antinuclear+antibodies:+a+contemporary+nomenclature+using+HEp-2+cells.">Antinuclear antibodies: a contemporary nomenclature using HEp-2 cells.</a> J Autoimmun. 35 (3), 276-290 (2010).</li><li>Mahler, M., Fritzler, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Clinical+Significance+of+the+Dense+Fine+Speckled+Immunofluorescence+Pattern+on+HEp-2+Cells+for+the+Diagnosis+of+Systemic+Autoimmune+Diseases.">The Clinical Significance of the Dense Fine Speckled Immunofluorescence Pattern on HEp-2 Cells for the Diagnosis of Systemic Autoimmune Diseases.</a> Clin Dev Immunol. 2012, 494356 (2012).</li><li>Mahler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-DFS70/LEDGF+Antibodies+Are+More+Prevalent+in+Healthy+Individuals+Compared+to+Patients+with+Systemic+Autoimmune+Rheumatic+Diseases.">Anti-DFS70/LEDGF Antibodies Are More Prevalent in Healthy Individuals Compared to Patients with Systemic Autoimmune Rheumatic Diseases.</a> J Rheumatol. 39 (11), 2104-2110 (2012).</li><li>Conrad, K., Rober, N., Andrade, L. 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Comment on the article by Mariz et al.</a> Arthritis Rheum. 63 (12), 4036-4037 (2011).</li></ol>

著者キショール Malyavantham と Lakshmanan Suresh トリニティ バイオ テクノロジー、米国の従業員であります。

核と細胞質の抗原に対する自己抗体は、全身性自己免疫疾患における非常に普及しています。IIF HEp 2 では全身性の自己免疫疾患2,3,4高感度・低コストのスクリーニング法として広くみなされる単一のアッセイは、最高の可能な感度と特異性を提供しないが.にもかかわらず、50 年以上の IIF プロトコルの普及により、IIF アッセイの精度はプロトコルの個々 のステップと手入れの行き届いたを使用して結果の正確な解釈を慎重に実行、技術者のスキルに大きく依存蛍光顕微鏡。HEp 2 によって基づくべき全身性の自己免疫疾患の診断は IIF など単一の血清学的テストの結果ありません。
高品質の試薬の溶解 (蒸留/脱イオン) 水、標準化されたキット コンポーネント (HEp 2 細胞膜、サンプル希釈液、正と負のコントロール、希釈最適化 FITC 共役、メディアをマウントとスライド) の使用結果に肯定的な影響があります。井戸のコントロールやサンプルの追加をスキップして偽否定的な解釈を促すことができます。サンプルやコントロールを追加することができます人工偽陽性反応および/または不適切なパターンの結果後、任意の時点でスライドの乾燥。スライド左側にあまりにも多くの洗浄バッファーや成果物につながるメディアをマウントの摂理の前にスライドの井戸の乾燥します。ぼやけているか顕微鏡下で観察すると焦点が合っていないを見て反応で起因できる媒体をマウントまたは観察を配置する前にスライドの表面に泡の生成の不足数量を追加します。マウント スライドを 2-8 ° C で保存し、偽否定的または人工の結果を最小限に抑える時間の推奨ウィンドウ内で解析する必要があります。
適切な LED/Hg/キセノン光源ときれいな光学部品は破損していない刺激および放出のフィルターを含むがある手入れの行き届いたエピ蛍光顕微鏡を用いた IIF の正確な結果を得るために重要です。エンド ユーザー識別の正/負の反応強度とパターンの解釈のトレーニングが重要です。HEp 2 IIF 試金プロシージャ、顕微鏡構成では、エンドユーザーのトレーニングやスキルの標準化の欠如に対して脆弱です。コンセンサス名称及び代表パターンと様々 なメーカーを使用して取得した画像の例は、ICAP で利用可能 (< www.ANApatterns.org>) 教育目的4。核、細胞質、細胞分裂の様々 なパターンの ICAP によって提供される HEp 2 セル パターン分類ツリーは未熟な目4に似て見えるかもしれませんが様々 なパターンの微妙な違いを学ぶ貴重なリソースです。挑戦的なパターンの主な例の 1 つはまた自己免疫の条件と異なる協会が不足している DFS70 と、このパターンは非常に健康的な集団5で普及し、前のセクションで説明したよう。
研究では、抗 DFS70 抗体の有病率は異なります健康コホート間 ANA スクリーニング集団と ANA 陽性の個体全身性自己免疫疾患9,16,20 の証拠と ,,3031。DFS70 抗体は、分離だけでなく、他の病気に関連する ANA パターンと発生すること報告されています。分離または抗 DFS70 パターンは健常者の 2-22% が自己免疫リウマチ性疾患32例の 1% 未満で報告されます。これらの傾向に基づき、DFS70 モノラル肯定的なパターンは、ICAP 委員会3,31,32により自己免疫リウマチ性疾患から除外する条件として提案されました。自己抗体テスト命名法の調和と ANA 報告 DFS70 陽性の報告推奨 HEp 2 IIF 結果の解釈を促進するために確立された ICAP の委員会審査結果4。
DFS70 モノラル陽性に基づく全身性自己免疫疾患を排除前、現在スクリーニングと確認方法 (特に DFS70 のそれらの特定) の状態を確認することが重要です。様々 な研究13,22,25,33 間様々 DFS70 HEp 2 iif 関数と固相験試金すなわち ELISA で陽性、CLIA、line イムノアッセイ/ドットしみメソッドと一致).この意見の相違に貢献するパラメーターがされている IIF 解釈および確証的アッセイ5,13,34は前述。抗 DFS70 抗体の確認のための提案された免疫吸着アプローチ (DFS70) のアドレスを現在の固相の試金の欠陥のいくつかが疑いのあるサンプルに IIF 手順の追加の手順を実行するラボを必要とします。結果13を報告するためのコストと所要時間が増加します。ANA のルーチンのスクリーニングに HEp 2 エリート/DFS70 島細胞を使用する場合、この追加の手順は必要ありません。これは、全体的なコストを削減、さらに納期への影響 DFS70 パターンを最初のスクリーニングの洞察としてステップない27があります。従来の HEp 2 IIF メソッドを使用して追加の欠点が共起する他の ANA パターン スクリーニング段階で DFS70 パターンを区別することです。しかし、HEp 2 エリート/DFS70 島細胞27の使用によってこの欠点を克服します。
従来 HEp 2 と新しい設計 HEp-2 (HEp 2 エリート/DFS70 KO) モノラル正 DFS70 コントロールと ANA 陽性コントロールおよびそれらの組合せを使用しての比較評価は同時に新しい基板の能力の有用性を示す画面の ANAs DFS70 パターン (図 1) を確認してください。新しい基板の IIF プロトコルは、従来の HEp 2 IIF 法と同じです。ANA パターンのすべての疾患に関連する解釈方式は DFS70 パターン (表 1) を除いて同じです。モノラル正と混合の DFS70 パターンの解釈は比較的簡単に新しいメソッドを使用して、追加の試金 (図 1 b) を保証しません。臨床実習でこの新しいメソッドの実装 DFS70 パターンの解釈に関連する課題を簡素化し、全日空 ANA 以前によって隠されているパターンの病気に関連するさらに明らかにしてスクリーニングの全体的な精度を向上DFS70 (混合パターン)。

ANAs は、自己免疫の仲介された全身性結合組織疾患1の特徴です。いくつかの方法は、スクリーニングと ANAs の確認に用いられます。Iif 関数を用いた HEp 2 基板のままは、最も広く使用される、頻繁 ANAs1,2のスクリーニング法を推奨します。酵素結合抗体法 (ELISA)、酵素免疫測定法 (EIA)、化学発光免疫測定法 (CLIA) ビーズ ベース マルチプレックスアッセイなど固相診断アッセイ方法論の進歩にもかかわらず、HEp 2 IIF は最も一般的なスクリーニングその診断の有用性とコスト有効性1,2,3のためのメソッドです。上記の試金技術が精製されたネイティブの限定セットに依存または組換え抗原ガラス スライド井戸に HEp 2 セル単分子膜の準備が自然な形で自己抗原の広範な配列を提示に対し分散核と細胞質、患者血清やポジティブ コントロールは、さまざまな自己免疫疾患に関連付けられているパターンの多数の結果から自己抗体と反応しています。これらのパターンは、細胞内抗原の位置に基づいて核、細胞質、細胞分裂のパターンに分類されます。各パターンと関連付けられた抗原・抗原および病気の状態は、よく特徴付けられて4です。IIF 法の存在は自然な構成の自己抗原の多数を維持するために適切に固定 HEp 2 細胞の単層培養ガラス スライドの井戸で患者とコントロール血清を孵化します。患者の血清やポジティブ コントロール抗体は、潜伏中に基板 (ガラス スライドも) HEp 2 細胞によって提示された抗原にバインドが許可されます。ポスト インキュベーション、非連結の抗体が洗浄し、フルオレセイン/フルオレセイン イソチオ シアン酸 (FITC) 共役抗ひと igg 抗体試薬と結合した IgG クラスの抗体が検出されました。非連結報告共役で流されている、ガラス coverslips は、反応を保持し、蛍光顕微鏡下で観察できるメディアをマウントを使用してスライド上にマウントされます。反応が使用されるレポーターに従って構成されている適切な励起蛍光フィルターの組み合わせを搭載した蛍光顕微鏡下で観察される (FITC 記者診断顕微鏡通常を使用してフィルター 467 の加振範囲-498 nm、513-556 nm の発光範囲)。アナの存在は、細胞内の特定の構造の明るい緑の蛍光性によって示されています。自動分析プラットフォームとは異なり、IIF 方法論はシリアル希釈血清と重要なユーザーの専門知識5,6を必要とする染色パターンの視覚的肯定的な決定の困難なプロセスに依存します。これらの制限にもかかわらず HEp 2 iif 関数は最も広く使用されている残っているし、パターン (ICAP) の委員会、ANA に国際的なコンセンサスが ANAs のパターン解釈と命名に向けて標準化の努力のためのスクリーニング法を推奨IIF スライド処理、および結果の解釈3のオートメーション ソリューションの可用性の向上。
HEp 2 IIF 法、 psip1遺伝子産物 (LEDGF/p75/DFS70 とも呼ばれる) を対象とする自己抗体によって検出されたパターンの多数の間で、近年いくつかの理由4,5 に大きな関心を集めています。 ,6,7,8,9,10。DFS70 抗体は健常者、高価であるし、研究はこれまで DFS70 抗体7,8,9 の存在を明瞭な臨床協会を示すため失敗しています。、10、11,12,13。様々 な病気の状態と健康コホート研究6,8,9,10,14 の間で広く変化 DFS70 抗体の肯定的な結果を報告された率 ,,1516,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26,,2728。混合均質な斑点パターンの解釈が均一または斑点パターンと抗 DFS70 パターンを区別しても、他の ANAs と共起する抗 DFS70 抗体は専門家の読者のためにも挑戦。IIF スクリーニング方法と DFS70 特定の固相試金の現在の世代は抗 DFS70 反応混合パターン (図 1 aアルゴリズムの黄色の斜線部分) からの差別化を図ることが可能ではありません。均一、まだら、DFS70 パターンまたは混合パターン、またはその逆誤解は、患者ケアに深刻な影響があります。現在一般的に使用されるプロトコルは以下のとおりです: ANAs の疾患に関連する臨床検査室採用固相確証的なテストの数および/または DFS70/LEDGF 高密度微細斑点 (AC-2) パターン時の免疫吸着法 (図の疑いがあります。1 a)4,5。
このプロトコルの目標は小説のユーティリティ設計 HEp 2 IIF 基板を示す、(HEp 2 エリート/DFS70 ノックアウト (KO) は HEp 2 エリートにいいますが) 同時 ANAs をスクリーニングするため従来 HEp 2 のすべての利点を保持します。抗と混合 ANA 陽性例 (図 1 bアルゴリズムの黄色の斜線部分)5の両方で信頼性の高さが DFS70 パターンと区別します。HEp 2 エリート基板は、1:9 の比率の5LEDGF/p75/DFS70 抗原を欠いてそのまま従来 HEp 2 細胞とエンジニア リングのおおよその混合で構成されます。HEp 2 エリートの iif 関数プロシージャは HEp 2 従来と同じです。HEp 2 エリート基板の固有の構成だけでなく従来の HEp2 のすべての利点を保持、初期スクリーニングまたはサンプル (図 1 b のテストで DFS70 パターンから均質な斑点、および混合反応パターンを区別できます。)5。HEp 2 IIF 基板をスライドに反応する患者血清希釈 1:40 で希釈を審査または個々 の臨床基準に従ってをする必要があります。1:40 またはより高い力価で特定の反応は、正と見なされます。
この研究では均一、まだら、セントロメア、核小体、細胞質網状/海部、スクリーニングで (相対的なネガティブ コントロールと正アナ コントロール キットによって提供される) 中程度の肯定的な信号を生産 DFS70 パターンに陽性血清1:40 の希釈は、HEp 2 基板上にモノラル固有および混合パターンをシミュレートするため選ばれた (従来、HEp 2 エリート)。1:40 1:40 と混合希釈 DFS70 陽性血清個々 の疾患に関連する ANA の希釈パターン様々 な比率 (コントロール: 正立単、試しました、50: 50、DFS70 のコントロール (同質なまだら、動原体、核小体、細胞質網状海部)20: 80、および 0:100)、従来の評価と HEp 2 エリート基板次標準 IIF 手順は以下の通り。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HEp-2 ELITE / DFS70-KO 12 Well Slide sealed individually in pouch</td>
			<td>Trinity Biotech</td>
			<td>part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANA positive control</td>
			<td>Trinity Biotech&#160;</td>
			<td>part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DFS70 antibody positive control</td>
			<td>Trinity Biotech</td>
			<td>part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative control</td>
			<td>Trinity Biotech</td>
			<td>part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human IgG FITC conjugate containing Evan&#39;s blue counterstain</td>
			<td>Trinity Biotech</td>
			<td>part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer diluent for serum</td>
			<td>Trinity Biotech</td>
			<td>part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Trinity Biotech</td>
			<td>part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Trinity Biotech</td>
			<td>part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips&#160;</td>
			<td>Trinity Biotech</td>
			<td>part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmuGlo ANA HEp-2 Cells 12 well slide sealed individually in pouch</td>
			<td>Trinity Biotech</td>
			<td>part of kit# 1103, 1103-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials used in the study but not provided by the kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diagnostic fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon Eclipse 50i</td>
			<td></td>
			<td>Equipped with a spot dignostic camera, model 2.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation chamber</td>
			<td>Trinity Biotech</td>
			<td></td>
			<td>provided for customers (no catalog #)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
			<td>General labware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
			<td>General lab supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>distilled/deionized water</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
			<td>General lab supplies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous distinction of monospecific and mixed dfs70 patterns during ana screening with a novel hep-2 elite/dfs70 knockout substrate

全身の自己免疫の結合組織疾患は抗核抗体 (ANA) を循環させることにより特徴付けられます。スクリーニング アナは、いくつかの技術がありますが、優れた感度のためプライマリで推奨される方法のままひと上皮細胞 2 (HEp 2) 基板を用いた間接蛍光抗体 (IIF) です。HEp 2 基板は、多数の様々 なタンパク質や核酸自己抗原核と細胞の細胞質全体に分散する自己抗体の結合から生じるパターンを検出できます。抗とまた HEp 2 基板に対するポジティブな反応から生じる混合パターンの偉大な多様性では、解釈と報告の正確性を複雑にします。細心の注意を最近受け取った 1 つ具体的な例高密度微細斑点 70 (DFS70) パターンですレンズ由来上皮成長因子 (LEDGF) と呼ばれる蛋白質にとりわけ結合する自己抗体に起因。特定の全身性自己免疫疾患と健康的な集団での高い有病率に明確な関連付けの欠如重要な DFS70 パターンの正確な解釈をしました。従来の HEp 2 基板を用いた疾患関連のパターンから DFS70 パターンの正確な区別は困難です。また、均質、斑点、および混合均質な斑点パターンなどの疾患に関連するパターンと DFS70 パターンの共起関係を頻繁には、IIF 解釈を複雑にします。本稿の目的小説のユーティリティは同時に両方で高い信頼性と DFS70 パターンを区別するための能力を提供しながら従来の HEp 2 基板のすべての利点を保持する HEp 2 IIF 基板設計を示すことです。抗と混合のアナの肯定的な例。新しい基板は以前 DFS70 パターンによって隠された疾患関連アナ パターンのマスクを解除することができるさらに。

HEp 2 エリート/DFS70 KO 基板し古典的なアナのパターンを保持し DFS70 パターンの明確な区別が容易になります。
HEp 2 エリート/DFS70 島基板上従来と設計された細胞は、同一 LEDGF/p75 を除いてすべて自己抗原を維持します。キットによって提供される否定的な制御は、ベースラインの蛍光信号を確立します。HEp 2 エリートに均一、まだら、セントロメア、核小体およびミトコンドリアのパターンの肯定的なコントロールは、従来の IIF HEp 2 基板 (図 2 a) 上想定されるパターンと同じパターンを生成します。これらの参照パターンは、各パターンの抗原病協会とともに詳細に記載されている以前4,29。表 1に図 2 aで見られるパターンの簡単な説明があります。
HEp 2 エリート DFS70 パターン:
それぞれのセルの約 10% はよく高密度微細斑点パターンを示す (ICAP 名称を割り当てられる: AC 2)、核のクロマチン上で観察できるし、の分裂核 (図 2 b) を見る関連するクロマチン染色します。従来の HEp 2 基板のすべてのセルはこのパターン DFS70 肯定的なサンプルと反応があります。HEp 2 セルの残りの ~ 90% はノックアウト LEDGF 抗原をコードするpsip1遺伝子がある、したがって信号または抗 DFS70 陽性血清 (図 2 b) と反応のパターンは生成されません。HEp 2 細胞の 10% がある明るい蛍光 DFS70 パターンとセル現在追加パターン (例えば、細かい斑点または核小体) の残りの部分に対応する、混合パターンの存在を示します。このようなパターンを綿密に検討は DFS70 パターンだけでなく存在しているすべての自己抗体の特異性を確認するために不可欠です。HEp 2 エリート基板、血清サンプルで作成されたパネルの能力を実証するには、各種濃度の DFS70 および ANA 陽性血清を制御し、従来の両方でテストおよび HEp 2 エリート基板標準 IIF を使用するプロトコル (図 3、図 4、図 5、図 6、図 7)。
DFS70 抗と従来と HEp 2 エリート基板上に混合反応の解釈:
パターンごとに特定疾患関連アナ (図 3、図 4、図 5、図 6、図 7)、抗アナはほとんど列左のパターンおよび抗 DFS70 柄右側列観察することができます。途中で 3 つの列は、様々 な疾患関連の比率と DFS70 パターンのポジティブ コントロールを表します。結果として得られる混合パターンは従来の HEp 2 基板 (図 3図 4図 5図 6図 7の一番上の行) で識別し挑戦しています。しかし、サンプルのほとんどの小説の Hep 2 エリート基板変更されていないし、設計したセルの強度の違いは異なる (以下の明るい細胞に明るいの比がある場合だけではなく DFS70 自己抗体の存在を確認します。1:9) が、またセカンダリ アナ パターンを明らかにします。均質な DFS70 や斑点 DFS70 混合反応の場合、自信を持って追加の試金 (図 1 a) の数を実行することを選択 labs につながる正しいパターンを予測することはにくい。セントロメア DFS70 と核小体 DFS70 の場合混合の反応、DFS70 陽性は非常に挑戦的な疑い (図 5図 6) を実行します。DFS70 パターンは、核小体および細胞質網状/海部反応血清比 50% に達するまでない支配的です。すべての例で DFS70 パターンを提示することができます HEp 2 エリート基板と強度の広い範囲の基になるセカンダリ パターン レベルおよびこうしてより正確なアナの解釈が容易になります。
密接に混合パターン、アナとコントロールされ拡大 (図 8) 従来の HEp 2 エリート基板肯定的な DFS70 の様々 な 50: 50 の組み合わせの結果を観察。中間期および有糸分裂染色解釈と報告されたパターンの精度を向上する HEp 2 基板上への DFS70 を含むすべての ANA パターンを観察することをお勧めします。ただし、混合パターンの細胞核を分割によって提示された差分パターンは可能性があります正確な解釈を容易にするための十分なできません。赤い矢印 (図 8) は、従来、設計された細胞の分裂核を示します。それは、混合 DFS70 細胞分裂反応が準拠していない疾患関連の解釈のためのルールの設定と ANA パターン観察できます。黄色と青の矢印は変更されていないし、設計した (DFS70 島) HEp 2 細胞核をそれぞれ示します。同時上映ができます、同じ顕微鏡の視野の変更されていない細胞核染色 (~ 10%) と人工細胞核 (~ 90%) パターンの明確な強度の違いが観察されるすべての組み合わせは、(図 8) で、DFS70 パターンの確認。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig1.jpg"> 図 1: 従来 HEp 2 と HEp 2 エリート/DFS70 島 IIF を使用してアルゴリズムをスクリーニング アナ。(A) 回路図解くスクリーニング段階 (黄色の斜線部分) で抗と混合 DFS70 肯定的なパターンを識別するに従来の HEp 2 IIF の欠乏と ANA パターンを使用する疾患に関連するセカンダリを排除できない可能性がありますDFS70 パターンによって隠されます。さらに、現在の世代の DFS70 特定の固相験試金は ANAs の追加テストにつながる抗 DFS70 陽性を確認することがないです。(B) 回路図 ANAs、抗と混合の DFS70 反応の同時の区別のスクリーニングのため HEp 2 エリートの機能を明らかにし、確認を試金する固相 DFS70 の必要性を排除すること。大幅 HEp 2 エリートを使用してアルゴリズムとスクリーニング アナを簡単確認試金の必要数が減る。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig2.jpg"> 図 2: 古典的なアナと DFS70 HEp 2 エリート/DFS70 島の基板パターン。(A) HEp 2 エリート/DFS70 島基板古典的なアナ パターンが保持されます。古典的な均一反応と DFS70 の肯定的な反応は、キットによって提供される肯定的なコントロールを使用して作り出されました。他の反応は、核小体および細胞質網状/海部反応5まだら、セントロメアの以前に確立された陽性コントロール血清を使用して作り出されました。(B) 基板の HEp 2 エリート/DFS70 島 DFS70 パターンの簡単な区別を容易にする従来設計の細胞を提供しています。その結果、DFS70 抗反応界面上のパターンを汚すと従来と設計 (DFS70-KO) 細胞の細胞核を分割回路図を示しています。設計の HEp 2 細胞は通常従来の HEp 2 基板上 DFS70 自己抗体反応によって隠されているセカンダリのパターンの同時検出を可能にする LEDGF/p75/DFS70 抗原を欠いています。矢印 (黄色) は、有糸分裂細胞核の例を示します。スケール バーを表す 20 μ m.<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig3.jpg"> 図 3: DFS70 との組み合わせで均一な血清。DFS70 抗血清は様々 な比率 (正立単、試しました、50: 50、20: 80、および 0:100) の肯定的な均一パターン制御と併用され、従来と設計 (DFS70-KO) HEp 2 基板上でテストします。スケール バーを表す 20 μ m.<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig4.jpg"> 図 4: DFS70 の組み合わせで血清を斑点と。DFS70 抗血清は様々 な比率 (正立単、試しました、50: 50、20: 80、および 0:100) の肯定的な斑点パターン制御と併用され、従来と設計 (DFS70-KO) HEp 2 基板上でテストします。スケール バーを表す 20 μ m.<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig5.jpg"> 図 5: DFS70 と動原体血清の組み合わせ。DFS 70 抗血清は様々 な比率 (正立単、試しました、50: 50、20: 80、および 0:100) の肯定的なセントロメア パターン制御と併用され、従来と設計 (DFS70-KO) HEp 2 基板上でテストします。スケール バーを表す 20 μ m.<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig6.jpg"> 図 6: DFS70 との組み合わせで核小体血清。DFS 70 抗血清は様々 な比率 (正立単、試しました、50: 50、20: 80、および 0:100) の肯定的な核小体パターン制御と併用され、従来と設計 (DFS70-KO) HEp 2 基板上でテストします。スケール バーを表す 20 μ m.<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig7.jpg"> 図 7: DFS70 との組み合わせで細胞質網状/海部血清。DFS70 抗血清は様々 な比率 (正立単、試しました、50: 50、20: 80、および 0:100) の肯定的なミトコンドリア パターン制御と併用され、従来と設計 (DFS70-KO) HEp 2 基板上でテストします。スケール バーを表す 20 μ m.<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig8.jpg"> 図 8: 混在パターン (50: 50 の比率) 従来の生産と HEp 2 エリート基板。2 枚の基板間の相違点を明らかにしました。赤い矢印は、両方の基板上に設計された従来の細胞の分裂核を示します。これらの組み合わせの従来の HEp 2 基板上の細胞核を割って提示差分パターンは混合パターンの正確な解釈のために十分ではありません。それは、細胞分裂の混合の DFS70 反応することができます摂動疾患関連の解釈のためのルールの設定 ANA パターン観察できます。黄色と青の矢印は変更されていないし、設計した (DFS70 島) HEp 2 細胞核をそれぞれ示します。すべての組み合わせの結果が設計された基板上テスト: 明確な強度差に属する間期核パターン (~ 10%) のセルをそのまま、設計の細胞 (~ 90%) を認めた有効に同時検出と DFS70 パターンの確認。スケール バーを表す 20 μ m.<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ANA パターン</td>
			<td colspan="2">説明</td>
		</tr>
<tr>
<td>均一</td>
			<td colspan="2">全体の核は、びまん性の染色パターンと均等に蛍光を発する。</td>
		</tr>
<tr>
<td>斑点</td>
			<td colspan="2">離散の斑点をもつ核全体で蛍光を発する。 微細な斑点と粗い斑点パターンが記載されています。</td>
		</tr>
<tr>
<td>核小体</td>
			<td colspan="2">核小体は核内で複数の固体または斑点のボディとして染色します。サブタイプは、以前に記載されています。</td>
		</tr>
<tr>
<td>セントロメア</td>
			<td colspan="2">有限数の大きな斑点。凝縮染色体細胞有糸分裂を経る反応性抗原を分離します。</td>
		</tr>
<tr>
<td>細胞質網状/海部</td>
			<td colspan="2">細胞質とミトコンドリアの染色陽性顆粒が表示されます。</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">DFS70</td>
			<td colspan="2">ありきたり HEp 2 細胞: 細胞分裂核で見られる染色間期核のクロマチン関連高密度微細斑点パターンが観察されます。</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">•Engineered DFS70 島細胞: 抗 DFS70 抗体を作り出す否定的な汚損</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">HEp 2 エリート/約 1:9 比で従来と設計 (DFS70 島) セルには DFS70 島します。従来の細胞を作り出す典型的な DFS70 パターンと設計の細胞を作り出す負のパターン DFS70 抗/分離陽性反応と反応。</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: ANA パターンの説明。

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Simultaneous Distinction of Monospecific and Mixed DFS70 Patterns During ANA Screening with a Novel HEp-2 ELITE/DFS70 Knockout Substrate

DFS70 抗体は、従来 HEp 2 基板を使用して、正確な解釈を挑戦的な共通の抗核抗体の病気に関連するパターンを模倣します。プロトコルでは、スクリーニングと抗と混合 ANA 陽性で高信頼の DFS70 パターンを区別するアナに従来 HEp 2 に新規設計された HEp 2 基の利点について説明します。

抗と新規 HEp 2 エリート/DFS70 ノックアウト基板アナ選考において混合 DFS70 パターンの同時の区別

Systemic autoimmune connective tissue disorders are characterized by circulating antinuclear antibodies (ANA). Although there are several technologies ...

simultaneous-distinction-monospecific-mixed-dfs70-patterns-during-ana

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

35.3K ビュー.  A Trinity Biotech Company. DFS70 抗体は、従来 HEp 2 基板を使用して、正確な解釈を挑戦的な共通の抗核抗体の病気に関連するパターンを模倣します。プロトコルでは、スクリーニングと抗と混合 ANA 陽性で高信頼の DFS70 パターンを区別するアナに従来 HEp 2 に新規設計された HEp 2 基の利点について説明します。

ビデオ: Simultaneous Distinction of Monospecific and Mixed DFS70 Patterns During ANA Screening with a Novel HEp-2 ELITE/DFS70 Knockout Substrate

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration of T cells into lymph nodes is a complex process which involves both cellular and chemical factors including chemokines. Recently, the use of two-photon microscopy has permitted to track T cells in intact lymph nodes and to derive some quantitative information on their behavior and their interactions with other cells. While there are obvious advantages to an in vivo system, this approach requires a complex and expensive instrumentation and provides limited access to the tissue. To analyze the behavior of T cells within murine lymph nodes, we have developed a slice assay 
1, originally set up by neurobiologists and transposed recently to murine thymus 2. In this technique, fluorescently labeled T cells are plated on top of an acutely prepared lymph node slice. In this video-article, the localization and migration of T cells into the tissue are analyzed in real-time with a widefield and a confocal microscope. The technique which complements in vivo two-photon microscopy offers an effective approach to image T cells in their natural environment and to elucidate mechanisms underlying T cell migration.

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

This protocol describes a method to image fluorescent T cells introduced into lymph node slices. The technique permits real-time analyses of T cell migration with traditional widefield fluorescence or confocal microscopes.

広視野と共焦点顕微鏡によるマウスリンパ節スライスにおけるT細胞のex vivoでのイメージング

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

免疫・感染学

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

肺炎球菌による鼻腔内コロニー形成時の炎症反応の特徴

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming bacterium, Bacillus subtilis. Germination is triggered by small molecule germinants and occurs without the need for macromolecular synthesis. Though differences exist between the mechanisms of spore germination in species of Bacillus and Clostridium, a common requirement is the hydrolysis of the peptidoglycan-like cortex which allows the spore core to swell and rehydrate. After rehydration, metabolism can begin and this, eventually, leads to outgrowth of a vegetative cell. The detection of hydrolyzed cortex fragments during spore germination can be difficult and the modifications to the previously described assays can be confusing or difficult to reproduce. Thus, based on our recent report using this assay, we detail a step-by-step protocol for the colorimetric detection of cortex fragments during bacterial spore germination.

Herein, we describe a colorimetric assay to detect the presence of reducing sugars during bacterial spore germination.

細菌胞子の発芽中に皮質断片を検出

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

使用してリンパ球血管外漏出の分析<em&gt;インビトロ</em&gt;ヒト血液脳関門のモデル

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory response by the endothelial layer is crucial to efficiently fight against harmful inputs and aid in the recovery of damaged areas. When the endothelial cells are exposed to an inflammatory environment, such as the outer component of gram-negative bacteria membrane, lipopolysaccharide (LPS), they express soluble pro-inflammatory cytokines, such as Ccl5, Cxcl1 and Cxcl10, and trigger the activation of circulating leukocytes. In addition, the expression of adhesion molecules E-selectin, VCAM-1 and ICAM-1 on the endothelial surface enables the interaction and adhesion of the activated leukocytes to the endothelial layer, and eventually the extravasation towards the inflamed tissue. In this scenario, the endothelial function must be tightly regulated because excessive or defective activation in the leukocyte recruitment could lead to inflammatory-related disorders. Since many of these disorders do not have an effective treatment, novel strategies with a focus on the vascular layer must be investigated. We propose comprehensive assays that are useful to the search of novel endothelial regulators that modify leukocyte function. We analyze endothelial activation by using specific expression targets involved in leukocyte recruitment (such as, cytokines, chemokines, and adhesion molecules) with several techniques, including: real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), western-blot, flow cytometry and adhesion assays. These approaches determine endothelial function in the inflammatory context and are very useful to perform screening assays to characterize novel endothelial inflammatory regulators that are potentially valuable for designing new therapeutic strategies.

Vascular endothelium tightly controls leukocyte recruitment. Inadequate leukocyte extravasation contributes to human inflammatory diseases. Therefore, searching for novel regulatory elements of endothelial activation is necessary to design improved therapies for inflammatory disorders. Here, we describe a comprehensive methodology to characterize novel endothelial regulators that can modify leukocyte trafficking during inflammation.

炎症反応に関与する新規血管内皮レギュレータを特徴付けるための試金をスクリーニング

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

Improving the speed and accuracy of bacterial detection is important for patient stratification and to ensure the appropriate use of antimicrobials. To achieve this goal, the development of diagnostic techniques to recognize bacterial presence in real-time at the point-of-care is required. Optical imaging for direct identification of bacteria within the host is an attractive approach. Several attempts at chemical probe design and validation have been investigated, however none have yet been successfully translated into the clinic. Here we describe a method for ex vivo validation of bacteria-specific probes for identification of bacteria within the distal lung, imaged by fibered confocal fluorescence microscopy (FCFM). Our model used ex vivo human lung tissue and a clinically approved confocal laser endomicroscopy (CLE) platform to screen novel bacteria-specific imaging compounds, closely mimicking imaging conditions expected to be encountered with patients. Therefore, screening compounds by this technique provides confidence of potential clinical tractability.

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

This technique describes an efficient screening process for evaluating bacteria-specific optical imaging agents within ex vivo human lung tissue, by fibered confocal fluorescence microscopy for the rapid identification of small molecule chemical probe-candidates with translatable potential.

共焦点レーザー Endomicroscopy Ex Vivoひと肺組織の新規細菌固有の光学検査プローブします。

Improving the speed and accuracy of bacterial detection is important for patient stratification and to ensure the appropriate use of antimicrobials. To ...

Sexual Transmission of American Trypanosomes from Males and Females to Naive Mates

American trypanosomiasis is transmitted to humans by triatomine bugs through the ingestion of contaminated food, by blood transfusions or accidently in hospitals and research laboratories. In addition, the Trypanosoma cruzi infection is transmitted congenitally from a&#160;chagasic mother to her offspring, but the male partner&#39;s contribution to in utero contamination is unknown. The findings of nests and clumps of amastigotes and of trypomastigotes in the theca cells of the ovary, in the goniablasts and in the lumen of seminiferous tubules suggest that T. cruzi infections are sexually transmitted. The research protocol herein presents the results of a family study population showing parasite nuclear DNA in the diploid blood mononuclear cells and in the haploid gametes of human subjects. Thus, three independent biological samples collected one year apart confirmed that T. cruzi infections were sexually transmitted to progeny. Interestingly, the specific T. cruzi antibody was absent in the majority of family progeny that bore immune tolerance to the parasite antigen. Immune tolerance was demonstrated in chicken refractory to T. cruzi after the first week of embryonic growth, and chicks hatched from the flagellate-inoculated eggs were unable to produce the specific antibody.&#160;Moreover, the instillation of the human semen ejaculates intraperitoneally or into the vagina of naive mice yielded T. cruzi amastigotes in the epididymis, seminiferous tubule, vas deferens and uterine tube with an absence of inflammatory reactions in the immune privileged organs of reproduction. The breeding of T. cruzi-infected male and female mice with naive mates resulted in acquisition of the infections, which were later transmitted to the progeny. Therefore, a robust education, information and communication program that involves the population and social organizations is deemed necessary to prevent Chagas disease.

The Trypanosoma cruzi agent of Chagas disease produces long-lasting asymptomatic infections that abruptly develop into clinically recognized pathology. The following research protocol describes a short-run family-based epidemiological study to unravel the T. cruzi infection transmitted sexually from parent to progeny.

男性と女性からのナイーブの仲間にアメリカトリパノソーマの性行

American trypanosomiasis is transmitted to humans by triatomine bugs through the ingestion of contaminated food, by blood transfusions or accidently in ...

"Liver-on-a-Chip" Cultures of Primary Hepatocytes and Kupffer Cells for Hepatitis B Virus Infection

Despite the exceptional infectivity of the hepatitis B virus (HBV) in vivo, where only three viral genomes can result in a chronicity of experimentally infected chimpanzees, most in vitro models require several hundreds to thousands of viral genomes per cell in order to initiate a transient infection. Additionally, static 2D cultures of primary human hepatocytes (PHH) allow only short-term studies due to their rapid dedifferentiation. Here, we describe 3D liver-on-a-chip cultures of PHH, either in monocultures or in cocultures with other nonparenchymal liver-resident cells. These offer a significant improvement to studying long-term HBV infections with physiological host cell responses. In addition to facilitating drug efficacy studies, toxicological analysis, and investigations into pathogenesis, these microfluidic culture systems enable the evaluation of curative therapies for HBV infection aimed at eliminating covalently closed, circular (ccc)DNA. This presented method describes the set-up of PHH monocultures and PHH/Kupffer cell co-cultures, their infection with purified HBV, and the analysis of host responses. This method is particularly applicable to the evaluation of long-term effects of HBV infection, treatment combinations, and pathogenesis.

The goal of this protocol is to provide a step-by-step guide to perform 3-D &#34;liver-on-a-chip&#34; infection experiments with the hepatitis B virus.

初代肝細胞とクッパー細胞 B 型肝炎ウイルス感染の「肝臓-オン-チップ」文化

Despite the exceptional infectivity of the hepatitis B virus (HBV) in vivo, where only three viral genomes can result in a chronicity of experimentally ...

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development and autoimmune diseases. This is facilitated through a process of capture from free flow onto the luminal surface of activated endothelial cells, followed by their adhesion and transendothelial migration (transmigration) into the underlying affected tissue. However, the mechanisms that support the preferential and context-dependent recruitment of monocyte subpopulations are still not fully understood. Therefore, we have developed a method that allows the recruitment of different monocyte subpopulations to be simultaneously visualized and measured under flow. This method, based on time-lapse confocal imaging, allows for the unambiguous distinction between adherent and transmigrated monocytes. Here, we describe how this method can be used to simultaneously study the recruitment cascade of pro-angiogenic and non-angiogenic monocytes in vitro. Furthermore, this method can be extended to study the different steps of recruitment of up to three monocyte populations.

Here, we present an integrated protocol that measures monocyte subpopulation trafficking under flow in vitro by use of specific surface markers and confocal fluorescence microscopy. This protocol can be used to explore sequential recruitment steps as well as to profile other leukocyte subtypes using other specific surface markers.

体外流れ球サブポピュレーションの募集の同時研究

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease of newborn infants. It is characterized by multiple pathophysiologic alterations in the human intestinal epithelium, leading to increased intestinal permeability, impaired restitution, and increased cell death. Although there are numerous animal models of NEC, response to injury and therapeutic interventions may be highly variable between species. Furthermore, it is ethically challenging to study disease pathophysiology or novel therapeutic agents directly in human subjects, especially children. Therefore, it is highly desirable to develop a novel model of NEC using human tissue. Enteroids are 3-dimensional organoids derived from intestinal epithelial cells. They are ideal for the study of complex physiologic interactions, cell signaling, and host-pathogen defense. In this manuscript we describe a protocol that cultures human enteroids after isolating intestinal stem cells from patients undergoing bowel resection. The crypt cells are cultured in media containing growth factors that encourage differentiation into the various cell types native of the human intestinal epithelium. These cells are grown in a synthetic, collagenous mix of proteins that serve as a scaffold, mimicking the extra-cellular basement membrane. As a result, enteroids develop apical-basolateral polarity. Co-administration of lipopolysaccharide (LPS) in media causes an inflammatory response in the enteroids, leading to histologic, genetic, and protein expression alterations similar to those seen in human NEC. An experimental model of NEC using human tissue may provide a more accurate platform for drug and treatment testing prior to human trials, as we strive to identify a cure for this disease.

Enteroids are emerging as a novel model in the study of human disease. The protocol describes how to simulate an enteroid model of human necrotizing enterocolitis using lipopolysaccharide (LPS) treatment of enteroids generated from neonatal tissue. Collected enteroids demonstrate inflammatory changes akin to those seen in human necrotizing enterocolitis.

壊死性腸炎新規ヒト上皮 Enteroid モデル

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease of newborn infants. It is characterized by multiple pathophysiologic alterations in the human ...