Andrew Zenger IIf deneyler yapmak ve görüntüleri toplama için teşekkür ederiz.

Protokol Trinity biyoteknoloji kurumsal insan araştırma Etik Komitesi kuralları izler.
1. örnek ve yüzey hazırlama
<ol><li>Substrat slaytları içeren torbalar içinde izin (cam HEp2 ya da HEp içeren her bir slayt üzerinde 12 kuyu ile slaytlar-2 + HEp2 KO hücre karışımı) oda sıcaklığında en iyi performans için equilibrate ve nem önce slayt yüzeyinde yoğunlaşma önlemek için örnek eklenmesi. Bu yaklaşık 10-15 dakika arasında sürer.</li>
	<li>Sonra oda sıcaklığında equilibrated, onlara dokunmadan kese kenarlarında parmak kullanarak substrat slaytları dikkatli bir şekilde çıkarın.</li>
	<li>Slaytları etiket ve örnek ve eşlenik kuluçka sırasında slayt kurutma önlemek için su ile nemlendirilmiş kağıt havlu ile kaplı bir kuluçka Odası (oda sıcaklığında) içinde koyun. Not: Non-spesifik boyama kuru kuyulardan neden olabilir; bir ıslak kağıt havlu kuluçka odası içinde nem sağlar ve iyi kuruluk engeller.</li>
</ol>2. ek denetimleri ve örnekleri
<ol><li>Yaklaşık 50 µL negatif/pozitif kontrollerin DFS70-ANA olumlu sera kombinasyonları bu çalışma veya hasta serum numuneleri üzerine tek tek slayt wells açıklandığı gibi dağıtmak.</li>
	<li>Control(s) ve örnekleri slayttaki her kuyuya dağıtmak.</li>
	<li>İyi çapraz kontaminasyonu önlemek için kuyuları yavaşça kaçının. Kuyu yavaşça değil, süre iyi yüzey komple kapsama sağlamak ve hava kabarcıkları kaçının. Not: Adım 2.1 göre 50 µL önerilen birimdir.</li>
	<li>Kuluçka odası kapağı yerleştirin ve oda sıcaklığında 30 dk slaytlarını kuluçkaya. Herhangi bir ANA hastanın serum içinde mevcut ise, bu kuluçka döneminde her kuyuya mevcut hücreleri bağlayacaksınız.</li>
	<li>Kuluçka süresi bittikten sonra slayt kuluçka odasından kaldırın. Slayt sekmesini sonunda tutun ve yavaşça bir pipet kullanarak Seti'nde sağlanan yaklaşık 10 mL fosfat tamponlu tuz (PBS) yıkama arabellek ile durulayın ya da 10-15 s. için PBS ile dolu bir ölçek slayt hemen PBS yıkama arabellek ve yıkama (bir Coplin kavanoza aktarın 10 dk. tekrar süreci ile tüm kalan slaytlar için emmek). Not: birden fazla slayt Coplin kavanoza koyarak sağlamak zaman slayt hücre tarafında başka bir slayt ile değil bu da yol açar gibi hücreleri zarar cam slayt üzerinde yapıştırılır.</li>
</ol>3. floresan eşlenik eklenmesi
<ol><li>Tek bir slayt teker teker Coplin kavanozdan kaldırın. Aşırı PBS yıkama arabellek slaytından kaldırmak için hafifçe dokunun veya slayt kağıt havlu üzerinde leke. Her kit Anti-insan IgG floresan eşlenik etiketli FITC ile sağlanır. Her şey üstünde-e doğru yavaşça 1 damla (yaklaşık 50 µL) sağlanan eşlenik uygulanır.</li>
	<li>Slaytlar için 30 dk kapalı boyama kuluçka odasında kuluçkaya. Not: Fc belirli IgG eşlenik kullanılması önerilir. ANA herhangi bir hasta serum içinde mevcut ise, mevcut her kuyuya wells mevcut hücrelerin belirli Floresans sonuçlanan bu kuluçka döneminde hücrelere eşlenik olmasını bağlayacaksınız. Eşlenik olmasını ışığa duyarlıdır. Kapalı kuluçka odası ışık her kuyuya mevcut hücrelerin eşlenik tepki ile etkilenmemesi için yardımcı olacaktır.</li>
	<li>Kuluçka süresi bittikten sonra slayt kuluçka odasından kaldırın. Slayt sekmesini sonunda tutun ve yavaşça yaklaşık 10 mL PBS yıkama arabellek kullanarak bir pipet seti veya PBS ile dolu bir ölçek ile durulayın. 10 dk. tekrarlamak için kalan tüm slaytlar işlemine slayt hemen PBS yıkama tamponu ve yıkama (emmek) bir Coplin kavanoza aktarın. Not: birden fazla slayt Coplin kavanoza koyarak sağlamak zaman slayt hücre tarafında başka bir slayt ile değil bu da yol açar gibi hücreleri zarar cam slayt üzerinde yapıştırılır.</li>
	<li>Sağlanan coverslips kuru kağıt havlu seti yerleştirin. Montaj media kit ile sağlanır. 3-4 damla bir çizgi montaj medya arasında coverslip alt kenarına uygulayın.</li>
	<li>Bir kaymak dışarı bir zamanda yıkama arabellek içeren Coplin kavanozdan almak. Fazla yıkama arabellek kaldırmak için hafifçe dokunun veya slayt kağıt havlu üzerinde leke.</li>
	<li>Sürgüyü yavaşça üstünde-e doğru coverslip coverslip kenarına slayt alt kenarına yerleştirerek indirin. Bu slayt üst kenarına akmaya alt kenar coverslip montaj medya sağlar ve her şey bir slaydın okuma ile girişime neden olabilir hava kabarcıklarının oluşumunu en aza indirir. Not: En az basınç kapağı slayt slayt üzerine takmak için kullanılır. Herhangi bir aşırı basınç kapağı kâğıdını yanal hareket neden olabilir. Bu hücreler ve sonuç monolayer hazırlanması bozulma zarar verebilir.</li>
	<li>2-8 ° C'de karanlıkta slaytları depolama En kısa zamanda onlar monte edilir ya da 48 saat içinde slaytları inceleyin. Not: Uzun depolama desen ve floresan sinyal bozulmasına neden olabilir.</li>
</ol>4. olumlu ve olumsuz sonuçları tanımlaması
<ol><li>Karanlık bir odada bulunan bir FITC filtre kümesini kullanarak floresan mikroskop ile slaytları görüntülemek.</li>
	<li>Belirli parlak yeşil Floresans 200 X veya pozitifliği ile ilgili son yorumu yapmak ve desen daha büyük bir büyütmede floresan mikroskop altında incelemek. Pozitif ve negatif denetimleri gözlemlemek. Not: Olumlu denetim parlak yeşil Floresans çekirdeği (şekil 2A, homojen) görüntüler. Negatif kontrol hiçbir belirli yeşil Floresans floresan mikroskop altında görüntüler.</li>
	<li>Her şey için pozitif/negatif sonucu kaydedebilir ve ANA desen olumlu durumlar için.</li>
</ol>

<ol>
	<li>. Position Statement. Methodology of testing for antinuclear antibodies Available from: <a target="_blank" href="https://www.rheumatology.org/Portals/0/Files/Methodology%20of%20Testing%20Antinuclear%20Antibodies%20Position%20Statement.pdf">https://www.rheumatology.org/Portals/0/Files/Methodology%20of%20Testing%20Antinuclear%20Antibodies%20Position%20Statement.pdf</a> (2011)</li><li>Meroni, P. L., Schur, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ANA+screening:+an+old+test+with+new+recommendations.">ANA screening: an old test with new recommendations.</a> Ann Rheum Dis. 69 (8), 1420-1422 (2010).</li><li>Agmon-Levin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+recommendations+for+the+assessment+of+autoantibodies+to+cellular+antigens+referred+to+as+anti-nuclear+antibodies.">International recommendations for the assessment of autoantibodies to cellular antigens referred to as anti-nuclear antibodies.</a> Ann Rheum Dis. 73 (1), 17-23 (2014).</li><li>Chan, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+of+the+First+International+Consensus+on+Standardized+Nomenclature+of+Antinuclear+Antibody+HEp-2+Cell+Patterns+2014-2015.">Report of the First International Consensus on Standardized Nomenclature of Antinuclear Antibody HEp-2 Cell Patterns 2014-2015.</a> Front Immunol. 6, 412 (2015).</li><li>Malyavantham, K., Suresh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+DFS70+pattern+and+impact+on+ANA+screening+using+a+novel+HEp-2+ELITE/DFS70+knockout+substrate.">Analysis of DFS70 pattern and impact on ANA screening using a novel HEp-2 ELITE/DFS70 knockout substrate.</a> Auto Immun Highlights. 8 (1), 3 (2017).</li><li>Sperotto, F., Seguso, M., Gallo, N., Plebani, M., Zulian, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-DFS70+antibodies+in+healthy+schoolchildren:+A+follow-up+analysis.">Anti-DFS70 antibodies in healthy schoolchildren: A follow-up analysis.</a> Autoimmun Rev. , (2017).</li><li>Ayaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+cytotoxic+anti-LEDGF+autoantibodies+in+atopic+dermatitis.">Detection of cytotoxic anti-LEDGF autoantibodies in atopic dermatitis.</a> Autoimmunity. 35 (5), 319-327 (2002).</li><li>Ochs, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibodies+to+DFS+70+kd/transcription+coactivator+p75+in+atopic+dermatitis+and+other+conditions.">Autoantibodies to DFS 70 kd/transcription coactivator p75 in atopic dermatitis and other conditions.</a> J Allergy Clin Immunol. 105 (6 Pt 1), 1211-1220 (2000).</li><li>Watanabe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-DFS70+antibodies+in+597+healthy+hospital+workers.">Anti-DFS70 antibodies in 597 healthy hospital workers.</a> Arthritis Rheum. 50 (3), 892-900 (2004).</li><li>Yamada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humoral+immune+response+directed+against+LEDGF+in+patients+with+VKH.">Humoral immune response directed against LEDGF in patients with VKH.</a> Immunol Lett. 78 (3), 161-168 (2001).</li><li>Seelig, C. A., Bauer, O., Seelig, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibodies+Against+DFS70/LEDGF+Exclusion+Markers+for+Systemic+Autoimmune+Rheumatic+Diseases+(SARD).">Autoantibodies Against DFS70/LEDGF Exclusion Markers for Systemic Autoimmune Rheumatic Diseases (SARD).</a> Clin Lab. 62 (4), 499-517 (2016).</li><li>Ochs, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+significance+of+autoantibodies+to+DFS70/LEDGFp75+in+health+and+disease:+integrating+basic+science+with+clinical+understanding.">The significance of autoantibodies to DFS70/LEDGFp75 in health and disease: integrating basic science with clinical understanding.</a> Clin Exp Med. 16 (3), 273-293 (2016).</li><li>Bizzaro, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+chemoluminescence+and+immunoasdorption+tests+for+anti-DFS70+antibodies+avoid+false+positive+results+by+indirect+immunofluorescence.">Specific chemoluminescence and immunoasdorption tests for anti-DFS70 antibodies avoid false positive results by indirect immunofluorescence.</a> Clin Chim Acta. 451 (Pt B), 271-277 (2015).</li><li>Bizzaro, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+the+lens+and+cornea+in+anti-DFS70-positive+subjects.">Antibodies to the lens and cornea in anti-DFS70-positive subjects.</a> Ann N Y Acad Sci. 1107, 174-183 (2007).</li><li>Daniels, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antinuclear+autoantibodies+in+prostate+cancer:+immunity+to+LEDGF/p75,+a+survival+protein+highly+expressed+in+prostate+tumors+and+cleaved+during+apoptosis.">Antinuclear autoantibodies in prostate cancer: immunity to LEDGF/p75, a survival protein highly expressed in prostate tumors and cleaved during apoptosis.</a> Prostate. 62 (1), 14-26 (2005).</li><li>Dellavance, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+spectrum+of+antinuclear+antibodies+associated+with+the+nuclear+dense+fine+speckled+immunofluorescence+pattern.">The clinical spectrum of antinuclear antibodies associated with the nuclear dense fine speckled immunofluorescence pattern.</a> J Rheumatol. 32 (11), 2144-2149 (2005).</li><li>Gundin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+anti-DFS70+antibodies+in+patients+with+ANA-associated+autoimmune+rheumatic+diseases+suspicion+is+cost-effective.">Measurement of anti-DFS70 antibodies in patients with ANA-associated autoimmune rheumatic diseases suspicion is cost-effective.</a> Auto Immun Highlights. 7 (1), 10 (2016).</li><li>Kang, S. Y., Lee, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+significance+of+dense+fine+speckled+pattern+in+anti-nuclear+antibody+test+using+indirect+immunofluorescence+method.">Clinical significance of dense fine speckled pattern in anti-nuclear antibody test using indirect immunofluorescence method.</a> Korean J Lab Med. 29 (2), 145-151 (2009).</li><li>Lee, H., Kim, Y., Han, K., Oh, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+anti-DFS70+antibody+and+specific+autoantibody+test+algorithms+to+patients+with+the+dense+fine+speckled+pattern+on+HEp-2+cells.">Application of anti-DFS70 antibody and specific autoantibody test algorithms to patients with the dense fine speckled pattern on HEp-2 cells.</a> Scand J Rheumatol. 45 (2), 122-128 (2016).</li><li>Mariz, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+on+the+antinuclear+antibody-HEp-2+test+is+a+critical+parameter+for+discriminating+antinuclear+antibody-positive+healthy+individuals+and+patients+with+autoimmune+rheumatic+diseases.">Pattern on the antinuclear antibody-HEp-2 test is a critical parameter for discriminating antinuclear antibody-positive healthy individuals and patients with autoimmune rheumatic diseases.</a> Arthritis Rheum. 63 (1), 191-200 (2011).</li><li>Marlet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombophilia+Associated+with+Anti-DFS70+Autoantibodies.">Thrombophilia Associated with Anti-DFS70 Autoantibodies.</a> PLoS One. 10 (9), e0138671 (2015).</li><li>Mercado, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+autoantibodies+to+DSF70/LEDGFp75+in+Mexican+Hispanics+using+multiple+complementary+assay+platforms.">Detection of autoantibodies to DSF70/LEDGFp75 in Mexican Hispanics using multiple complementary assay platforms.</a> Auto Immun Highlights. 8 (1), 1 (2017).</li><li>Muro, Y., Sugiura, K., Morita, Y., Tomita, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+concomitance+of+disease+marker+autoantibodies+in+anti-DFS70/LEDGF+autoantibody-positive+patients+with+autoimmune+rheumatic+disease.">High concomitance of disease marker autoantibodies in anti-DFS70/LEDGF autoantibody-positive patients with autoimmune rheumatic disease.</a> Lupus. 17 (3), 171-176 (2008).</li><li>Muro, Y., Sugiura, K., Nakashima, R., Mimori, T., Akiyama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+prevalence+of+anti-DFS70/LEDGF+antibodies+in+patients+with+dermatomyositis+and+other+systemic+autoimmune+rheumatic+diseases.">Low prevalence of anti-DFS70/LEDGF antibodies in patients with dermatomyositis and other systemic autoimmune rheumatic diseases.</a> J Rheumatol. 40 (1), 92-93 (2013).</li><li>Mutlu, E., Eyigor, M., Mutlu, D., Gultekin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confirmation+of+anti-DFS70+antibodies+is+needed+in+routine+clinical+samples+with+DFS+staining+pattern.">Confirmation of anti-DFS70 antibodies is needed in routine clinical samples with DFS staining pattern.</a> Cent Eur J Immunol. 41 (1), 6-11 (2016).</li><li>Okamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibodies+to+DFS70/LEDGF+are+increased+in+alopecia+areata+patients.">Autoantibodies to DFS70/LEDGF are increased in alopecia areata patients.</a> J Autoimmun. 23 (3), 257-266 (2004).</li><li>Pazini, A. M., Fleck, J., dos Santos, R. S., Beck, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+relevance+and+frequency+of+cytoplasmic+and+nuclear+dense+fine+speckled+patterns+observed+in+ANA-HEp-2.">Clinical relevance and frequency of cytoplasmic and nuclear dense fine speckled patterns observed in ANA-HEp-2.</a> Rev Bras Reumatol. 50 (6), 655-660 (2010).</li><li>Schmeling, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibodies+to+Dense+Fine+Speckles+in+Pediatric+Diseases+and+Controls.">Autoantibodies to Dense Fine Speckles in Pediatric Diseases and Controls.</a> J Rheumatol. 42 (12), 2419-2426 (2015).</li><li>Wiik, A. S., Hoier-Madsen, M., Forslid, J., Charles, P., Meyrowitsch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antinuclear+antibodies:+a+contemporary+nomenclature+using+HEp-2+cells.">Antinuclear antibodies: a contemporary nomenclature using HEp-2 cells.</a> J Autoimmun. 35 (3), 276-290 (2010).</li><li>Mahler, M., Fritzler, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Clinical+Significance+of+the+Dense+Fine+Speckled+Immunofluorescence+Pattern+on+HEp-2+Cells+for+the+Diagnosis+of+Systemic+Autoimmune+Diseases.">The Clinical Significance of the Dense Fine Speckled Immunofluorescence Pattern on HEp-2 Cells for the Diagnosis of Systemic Autoimmune Diseases.</a> Clin Dev Immunol. 2012, 494356 (2012).</li><li>Mahler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-DFS70/LEDGF+Antibodies+Are+More+Prevalent+in+Healthy+Individuals+Compared+to+Patients+with+Systemic+Autoimmune+Rheumatic+Diseases.">Anti-DFS70/LEDGF Antibodies Are More Prevalent in Healthy Individuals Compared to Patients with Systemic Autoimmune Rheumatic Diseases.</a> J Rheumatol. 39 (11), 2104-2110 (2012).</li><li>Conrad, K., Rober, N., Andrade, L. E., Mahler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Clinical+Relevance+of+Anti-DFS70+Autoantibodies.">The Clinical Relevance of Anti-DFS70 Autoantibodies.</a> Clin Rev Allergy Immunol. , (2016).</li><li>Miyara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Phenotypes+of+Patients+with+Anti-DFS70/LEDGF+Antibodies+in+a+Routine+ANA+Referral+Cohort.">Clinical Phenotypes of Patients with Anti-DFS70/LEDGF Antibodies in a Routine ANA Referral Cohort.</a> Clin Dev Immunol. 2013, 703759 (2013).</li><li>Bizzaro, N., Tonutti, E., Villalta, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognizing+the+dense+fine+speckled/lens+epithelium-derived+growth+factor/p75+pattern+on+HEP-2+cells:+not+an+easy+task!+Comment+on+the+article+by+Mariz+et+al.">Recognizing the dense fine speckled/lens epithelium-derived growth factor/p75 pattern on HEP-2 cells: not an easy task! Comment on the article by Mariz et al.</a> Arthritis Rheum. 63 (12), 4036-4037 (2011).</li></ol>

Yazarlar Kishore Malyavantham ve Lakshmanan Suresh Trinity biyoteknoloji, ABD, çalışanlardır.

Otoantikorlar nükleer ve sitoplazmik antijenleri için sistemik otoimmün hastalıklarda son derece yaygındır. Yok tek tahlil en iyi olası duyarlılık ve özgüllük sağlasa da, IIf HEp-2 yaygın sistemik otoimmün hastalıklar2,3,4 için son derece hassas ve maliyet-etkin tarama yöntemi olarak kabul edilir . 50 yıldan fazla için IIf Protokolü yaygınlığı rağmen IIf tahlil doğruluğunu son derece teknisyen, dikkatli yürütülmesi iletişim kuralının tek tek adımları ve sonuçları bir bakımlı kullanarak doğru yorumlanması yeteneklerinize bağlıdır Floresan mikroskop. Sistemik otoimmün hastalığı tanısı IIf gibi tek bir serolojik test sonuçlarını HEp-2 tarafından dayalı olmamalıdır.
Yüksek kaliteli kullanarak reaktifler sulandırma (/ deiyonize distile) su, Standart kit bileşenleri (slayt HEp-2 hücre monolayers, örnek seyreltici, pozitif ve negatif kontrol eder, önceden seyreltilmiş en iyi duruma getirilmiş FITC eşlenik ve montaj orta) kullanın sonuçları üzerinde olumlu bir etkiye sahip. Denetimleri veya örnekleri eklenmesi wells atlama yanlış negatif Yorumlar teşvik edebilir. Herhangi bir noktada slaytların örnek veya denetimi eklenmesi manipülasyonun yanlış olumlu tepkiler ve/veya uygunsuz desenleri neden olabilir sonra kurutma. Çok fazla yıkama arabellek olan slayttan yaptı veya slayt Wells montaj orta ve öncesinde kurutma aktarımında neden olabilir. Orta montaj veya bir coverslip yerleştirerek önce slayt yüzeyinde kabarcıklar üreten yeterli miktar ekleme bulanık ya da mikroskop altında gözlenen odak dışı tepkiler neden olabilir. Bağlı slayt 2-8 ° C'de depolanan ve zaman yanlış negatif veya manipülasyonun sonuçları en aza indirmek için önerilen penceresi içinde analiz gerekir.
Hangi uygun bir LED/Hg/Xenon ışık kaynağı ve hasar görmemiş uyarma ve emisyon filtreleri de dahil olmak üzere temiz optik bileşenleri evler bakımlı bir epi-floresan mikroskop kullanarak doğru IIf sonuç elde etmek için önemlidir. Son kullanıcı eğitim ayrımcılık pozitif/negatif reaksiyon yoğunluklarda ve desenler yorumlanması için önemlidir. HEp-2 IIf deneyleri belirli yordamlar, mikroskop yapılandırma ve son kullanıcı eğitimi veya beceri için güvenlik açığından etkilenir. Fikir birliği isimlendirme ve temsilcisi desen ve çeşitli üreticilerin kullanarak alınan görüntüleri örnekleri ICAP tarafından kullanılabilir yapılır (< www.ANApatterns.org>) eğitim amaçlı4için. ICAP tarafından sağlanan çeşitli nükleer, sitoplazmik ve Mitotik desenler için HEp-2 hücre desen sınıflandırma ağaç eğitimsiz gözler4' e benzer görünebilir çeşitli desenler arasındaki ince farkları öğrenmek için değerli bir kaynaktır. Ayrıca otoimmün bir koşulu ile ayrı bir dernek yoksun DFS70 zorlu bir desen birincil örneklerinden biridir ve sağlıklı nüfus5' te önceki bölümlerde açıklandığı gibi bu model son derece yaygındır.
Çalışma bağlı olarak anti-DFS70 otoantikorlar yaygınlığı değişir sağlıklı kohort arasında ANA tarama nüfus ve ANA olumlu bireyler ile sistemik Otoimmün hastalık9,16,20 izine rastlanmadı ,30,31. DFS70 otoantikorlar yalıtım yanı sıra diğer hastalık ilişkili ANA desenleri ile oluştuğu bildirilmiştir. İzole veya monospecific DFS70 desen 2-%22 sağlıklı kontrol ama otoimmün romatizmal hastalık32olan olguların % 1'den daha az bildirilmektedir. Bu eğilimleri üzerinde bağlı olarak, DFS70 mono-pozitif desen otoimmün romatizmal hastalıklarda dışlamak için ölçüt olarak ICAP Komitesi3,31,32tarafından önerilmiş. Antikor testi adlandırma uyumlaştırılması ve yorumu DFS70 pozitifliği ANA sırasında bildirdiği önerir HEp-2 IIf sonuçlarının tanıtmak için kurulan ICAP komite sonuçları4eleme.
Sistemik Otoimmün hastalık DFS70 mono-pozitif üzerinde dayalı dışarı iktidar önce geçerli tarama ve onay yöntemleri (özellikle bu özel DFS70 için) durumunu gözden geçirmek için hayati önem taşımaktadır. DFS70 HEp-2 IIf ve katı faz doğrulayıcı deneyleri Yani ELISA pozitifliği, CLIA ve satır immunoassay/nokta leke yöntemleri arasındaki anlaşma) yaygın olarak çeşitli çalışmalar13,22,25arasında,33 çeşitli . Daha önce tartışılan5,13,34IIf yorumu ve doğrulayıcı tahlil bu anlaşmazlık için katkıda parametreleri olmuştur. Anti-DFS70 antikor onay son zamanlarda önerilen immunoadsorption yaklaşım bazı geçerli katı faz deneyleri eksiklikleri (DFS70 için) adresleri ama IIf yordam şüpheli örnekleri üzerinde ek bir adım gerçekleştirmek için labs gerektirir hangi sonuçları13bildirdiği için maliyet ve geri dönüş süresi artar. ELITE/DFS70 HEp-2 KO hücreleri rutin ANA tarama için kullanıldığında ek bu adım gerekli değildir. Bu toplam maliyeti azaltır ve ayrıca işte gerçekleştirme süresi üzerinde hiçbir etkisi DFS70 desen başlangıç tarama ayırt gibi adım27. Geleneksel HEp-2 IIf yöntemi kullanarak ek bir dezavantaj ile diğer ANA desen tarama aşamasında işbirliği meydana gelen DFS70 desen ayırt edemiyor olmasıdır. Ancak, bu dezavantajı ELITE/DFS70 HEp-2 KO hücreleri27kullanımı ile üstesinden olduğunu.
Geleneksel HEp-2 ve yeni tasarlanmış HEp-ANA pozitif kontrol eder ve onların birleştirme bir mono-pozitif DFS70 denetimle kullanarak 2 (ELITE/DFS70 HEp-2 KO) karşılaştırmalı değerlendirme göstermek yeni alt katman'ın yetenek-e doğru belgili tanımlık yarar aynı anda ANAs için ekran ve DFS70 desen (şekil 1) onaylayın. Yeni alt katman için IIf protokolü için geleneksel HEp-2 IIf yöntemi aynıdır. Tüm hastalık ilişkili ANA desen için yorumu şeması DFS70 desen (Tablo 1) dışında aynıdır. Mono-pozitif ve karışık DFS70 desenleri yorumlanması yeni yöntemle nispeten daha kolay ve ek deneyleri (şekil 1B) garanti etmez. Klinik laboratuvar bu yeni yöntemin uygulanması DFS70 desen yorumu ile ilişkili meydan basitleştirir ve hastalık ilişkili daha fazla ifşa tarafından ANA tarafından daha önce gizlenmiş desenleri eleme ANA genel doğruluğunu artırır DFS70 (desenleri karışık).

ANAs otoimmün aracılı sistemik bağ dokusu hastalıkları1damgasını vardır. Birkaç yöntem tarama ve ANAs onayı için istihdam edilmektedir. IIf tekniği HEp-2 substrat kalır en yaygın olarak kullanılan ve sık sık tavsiye edilen ANAs1,2süzmek için yöntem. Katı faz teşhis tahlil yöntemleri enzim bağlantılı immunosorbent assay (ELISA), enzim immunoassay (ÇED), Kemiluminesan immunoassay (CLIA) ve boncuk tabanlı multiplex deneyleri gibi gelişmeler rağmen IIf HEp-2 en yaygın tarama olduğu. yöntemi tanı kullanışlılığı ve maliyet etkinliği1,2,3. HEp-2 hücre monolayer hazırlıkları üzerinde cam slayt kuyu autoantigens geniş bir yelpazede kendi doğal formunda mevcut ise rekombinant autoantigens arasında dağıtılmış veya yukarıda belirtilen tahlil teknolojileri sınırlı miktarda saflaştırılmış yerli güvenmeyin çekirdek ve sitoplazma, bu hasta sera veya pozitif denetimleri, çeşitli otoimmün koşullarıyla ilişkili desen çok sayıda sonuçlanan otoantikorlar ile tepki. Bu kalıpları hücreler antijen konumunu temel alan nükleer, sitoplazmik ve Mitotik desenleri göre sınıflandırılır. Her model ve ilişkili antijen/antijenleri ve hastalık durumlarında de karakterize4vardır. IIf yönteminde, hasta ve kontrol sera uygun sabit autoantigens doğal yapılandırmalarında çok sayıda korumak için HEp-2 hücreleri monolayer kültürünün mevcut cam slayt wells üzerinde inkübe. Hasta sera veya pozitif denetimlerin otoantikorlar kuluçka sırasında belgili tanımlık substrate (cam kaymak iyi) üzerinde HEp-2 hücreleri tarafından sunulan autoantigens bağlamak için izin verilir. Sonrası kuluçka, ilişkisiz antikorlar yıkanır ve ilişkili antikorlar IgG sınıfının floresein/floresein isothiocyanate (FITC) konjuge Anti-insan ile IgG reaktif tespit edilir. İlişkisiz rapor eşlenik yıkadı ve cam coverslips, tepkiler koruyan ve gözlem floresan mikroskop altında kolaylaştırır bir montaj orta kullanarak slaytlar üzerine monte edilir. Kullanılan muhabir göre yapılandırılmış uygun uyarma-emisyon filtre kombinasyonu ile donatılmış bir floresan mikroskop altında gözlenen tepkiler (FITC muhabir için tanılama mikroskop genellikle filtreleri 467 uyarma yelpazesi ile kullanır -498 nm ve emisyon çeşitte 513-556 nm). Parlak yeşil floresan hücreleri belirli yapıların ANA varlığı gösterilmiştir. Otomatik tahlil platformlar, IIf metodoloji zahmetli seri sera ve önemli ölçüde kullanıcı uzmanlık5,6gerektiren görsel olumlu belirlenmesi boyama desenleri sulandrarak üzerinde dayanır. Bu sınırlamalar rağmen IIf HEp-2 tarafından en çok kullanılan kalır ve desenler (ICAP) Komitesi ANA uluslararası birliğine tarafından ANAs taraması nedeniyle Standartlaştırma çabaları desen yorumu ve adlandırma yöntemi önerilir, artırılmış kullanılabilirlik IIf slayt işleme ve sonuç yorumu3için otomasyon çözümleri.
Desen çok sayıda arasında HEp-2 IIf yöntemi, (LEDGF/p75/DFS70 da bilinir) psip1 gen ürünü hedefleme otoantikorlar tarafından algılanan, faiz önemli birkaç nedeni4,5 için son yıllarda kazanmıştır ,6,7,8,9,10. DFS70 otoantikorlar yüksek titreleri sağlıklı kontrol yok ve çalışmalar defa DFS70 otoantikorlar7,8,9 varlığı için ayrı bir klinik Derneği göstermek başarısız oldu ,10,11,12,13. Çeşitli hastalık durumlarında ve sağlıklı tabur yaygın olarak çeşitli çalışmalar6,8,9,10arasında,14 DFS70 otoantikorlar için bildirilen olumlu sonuçlar oranları ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. Monospecific DFS70 desen de homojen veya benekli desenli karışık desenler homojen benekli yorumlanması ama gelen farklılaşmış ve diğer ANAs ile birlikte meydana gelen anti-DFS70 antikor bile uzman okuyucular için zor. Tarama yöntemleri ve DFS70 belirli katı faz deneyleri IIf şimdiki nesil bir monospecific karışık desenler (şekil 1A, algoritma sarı gölgeli alan) DFS70 tepki ayırt yeteneğine sahip değildir. DFS70 desen olarak homojen, benekli, veya karma desen veya tersi, yanlış yorumlanmasına hasta bakımı üzerinde ciddi etkileri olabilir. Geçerli sık kullanılan iletişim kuralı aşağıdaki gibidir: Klinik Laboratuvarları katı faz doğrulama testleri çok sayıda hastalık ilişkili ANAs için işe ve/veya DFS70/LEDGF (AC-2) desen yoğun güzel benekli zaman için bir immunoadsorption yöntemi (şekil şüpheleniliyor 1a)4,5.
Bu iletişim kuralının amacı yardımcı programı bir romanın mühendislik HEp-2 IIf substrat göstermektir (HEp-2 ELITE/DFS70 nakavt (KO), anılacaktır HEp-2 ELITE) bu ANAs iken aynı anda eleme için geleneksel HEp-2 tüm avantajlarını korur DFS70 desen monospecific ve karışık ANA olumlu durumlarda (şekil 1B, sarı gölgeli alan algoritma)5yüksek güven ile ayırt etme. HEp-2 ELITE substrat değiştirilmemiş geleneksel HEp-2 hücreleri ve LEDGF/p75/DFS70 antijen 1:9 oranı5yoksun mühendislik hücreleri yaklaşık bir karışımı oluşur. HEp-2 elit için IIf yordamı için geleneksel HEp-2 yöntemi aynıdır. HEp-2 ELITE substrat benzersiz yapılandırma sadece geleneksel HEp2 tüm avantajlarını korur ama DFS70 desen başlangıç tarama veya örneği (şekil 1B test homojen, benekli ve karışık tepki desenleri ayırt )5. HEp-2 IIf substrat bulunan slaytlarda tepki için hasta sera seyreltilmiş 1:40 seyreltme eleme ile ya da aynı derecede bireysel laboratuar kriter olmalıdır. 1:40 ya da daha yüksek titresi belirli bir tepki pozitif olarak kabul edilir.
Bu çalışma, homojen, benekli, şeması, genelde, sitoplazmik Retiküler/AMA ve orta olumlu sinyal (göre negatif kontrol ve paketi tarafından sağlanan olumlu ANA denetimi) gösterimde üretilen DFS70 desenler için olumlu sera 1:40 seyreltme mono özgü ve karışık desenler HEp-2 yüzeyler üzerinde simüle için seçildi (konvansiyonel ve HEp-2 elit). 1:40 1:40 ile seyreltilmiş DFS70 olumlu sera karıştırıldı bireysel hastalık ilişkili ANA dilutions kontroller (homojen, benekli, şeması, genelde, veya sitoplazmik Retiküler AMA) çeşitli oranları (100:0, 80:20, 50: 50, kontrol: DFS70 yılında desen. 20:80 ve 0:100) ve geleneksel olarak değerlendirilir ve HEp-2 ELITE yüzeylerde takip IIf prosedür ana hatlar aşağı.

<table><tbody><tr><td>HEp-2 ELITE / DFS70-KO 12 Well Slide sealed individually in pouch</td><td>Trinity Biotech</td><td>part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240</td><td></td></tr><tr><td>ANA positive control</td><td>Trinity Biotech&amp;nbsp;</td><td>part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240</td><td></td></tr><tr><td>DFS70 antibody positive control</td><td>Trinity Biotech</td><td>part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240</td><td></td></tr><tr><td>Negative control</td><td>Trinity Biotech</td><td>part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human IgG FITC conjugate containing Evan&#039;s blue counterstain</td><td>Trinity Biotech</td><td>part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240</td><td></td></tr><tr><td>Buffer diluent for serum</td><td>Trinity Biotech</td><td>part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Trinity Biotech</td><td>part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240</td><td></td></tr><tr><td>Mounting medium</td><td>Trinity Biotech</td><td>part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips&amp;nbsp;</td><td>Trinity Biotech</td><td>part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240</td><td></td></tr><tr><td>ImmuGlo ANA HEp-2 Cells 12 well slide sealed individually in pouch</td><td>Trinity Biotech</td><td>part of kit# 1103, 1103-240</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials used in the study but not provided by the kits&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diagnostic fluorescent microscope</td><td>Nikon Eclipse 50i</td><td></td><td>Equipped with a spot dignostic camera, model 2.2.1</td></tr><tr><td>Incubation chamber</td><td>Trinity Biotech</td><td></td><td>provided for customers (no catalog #)</td></tr><tr><td>Coplin jar</td><td>n/a</td><td></td><td>General labware</td></tr><tr><td>Paper towels</td><td>n/a</td><td></td><td>General lab supplies</td></tr><tr><td>distilled/deionized water</td><td>n/a</td><td></td><td>General lab supplies</td></tr></tbody></table>

simultaneous distinction of monospecific and mixed dfs70 patterns during ana screening with a novel hep-2 elite/dfs70 knockout substrate

Sistemik otoimmün bağ dokusu bozuklukları (ANA) enerjiye antikorlar dolaşan tarafından karakterize edilmektedir. Eleme ANA için kullanılabilir çeşitli teknolojiler olmakla dolaylı ayirt (IIf) insan epitel hücreleri-2 (HEp-2) substrat kullanarak üstün hassasiyeti nedeniyle birincil ve önerilen yöntem kalır. HEp-2 yüzeylerde antikor bağlama çekirdek ve hücre sitoplazma dağıtılan çeşitli protein ve nükleik asit autoantigens ortaya çıkan desenler çok sayıda algılayabilir. Monospecific ve karışık desenler de olumlu tepkiler HEp-2 yüzey üzerinde kaynaklanan büyük çeşitlilik yorumu ve Doğruluk Raporlama karmaşık hale. Azami dikkat son zamanlarda alınan belirli bir örnek lens epitel elde edilen büyüme faktörü (LEDGF) adı verilen bir protein için özel olarak bağlayan otoantikorlar kaynaklanan yoğun iyi benekli 70 (DFS70) kalıptır. Belirli sistemik otoimmün hastalığı ve yüksek yaygınlık sağlıklı nüfus ile açık ilişkisi eksikliği DFS70 desen doğru yorumlanması önemli yaptık. DFS70 modeli gelen hastalık ilişkili desenleri geleneksel HEp-2 substrat kullanarak doğru ayrım zordur. Ayrıca, DFS70 desen homojen, benekli ve karışık homojen benekli desenleri gibi hastalık ilişkili desenleri ile birlikte sık ortak olay IIf yorumu karmaşık hale. Bu kağıt amacı bir romanın yardımcı programı aynı anda DFS70 desen hem de yüksek güven ile ayırt etmek olanağı sağlarken geleneksel HEp-2 substrat tüm avantajlarını korur HEp-2 IIf substrat mühendislik göstermektir monospecific ve karışık ANA olumlu örnekler. Yeni alt katman daha fazla hastalık ilişkili ANA desen daha önce gizlenmiş bir desen DFS70 meydana çıkarmak yapabiliyor.

Hepatit-2 ELITE/DFS70 KO substrat klasik ANA desen korur ve DFS70 desen açık ayrım kolaylaştırır:
LEDGF/p75 hariç tüm autoantigens koruyarak ELITE/DFS70 HEp-2 KO substrat geleneksel ve mühendislik hücrelerdeyse aynıdır. Kit ile sağlanan negatif kontrol temel floresan sinyal kurar. Pozitif denetimlere HEp-2 ELITE şeması, homojen, benekli, genelde ve mitokondrial modelleri için bir desen beklenen kalıpları geleneksel HEp-2 IIf substrat (şekil 2A) üzerinde aynı üretmek. Bu başvuru desenleri her desen'ın antijen ve hastalığı Derneği ile birlikte ayrıntılı olarak tarif var daha önce4,29. Şekil 2A gözlenen desenleri hakkında kısa bir açıklama Tablo 1' de temin edilmektedir.
HEp-2 elit DFS70 desen:
Her hücre yaklaşık yüzde 10'u de yoğun bir iyi benekli desen göstermek (adlandırma atanan ICAP: AC-2) Interphase çekirdeği üzerinde görülebilir ve ilişkili Kromatin boyama (2B rakam) Mitotik çekirdeği görülür. Geleneksel HEp-2 yüzey üzerinde tüm hücreleri bu deseni ile DFS70 olumlu örnek tepki olacaktır. HEp-2 hücreleri kalan % ~ 90 nakavt LEDGF antijen kodlama psip1 gen vardır ve bu nedenle bir sinyal veya ne zaman bir monospecific DFS70 olumlu serum (şekil 2B) ile tepki desen üretmek değildir. HEp-2 hücreleri yüzde 10'u daha parlak floresan DFS70 desen ve hücreleri mevcut ek desenleri (Örneğin, para cezası benekli veya genelde) geri kalanı için karşılık gelen varsa, bu karışık desenler varlığını gösterir. Böyle desen daha yakından incelendiğinde DFS70 desen yanı sıra mevcut tüm antikor özelliklerine onaylamak için esastır. HEp-2 ELITE substrat, sera örnekleri ile oluşturulmuş bir panel yeteneğini göstermek için çeşitli DFS70 ve ANA pozitif konsantrasyonları sera kontrol ve geleneksel hem de test ve standart IIf kullanarak HEp-2 ELITE yüzeylerde (şekil 3 protokol , 4 rakam, 5 rakam, 6 şekil, Şekil 7).
DFS70 Monospecific ve konvansiyonel ve hepatit-2 elit yüzeyler üzerinde karışık tepkiler yorumlanması:
İçin belirli her hastalık ilişkili ANA desen (3 rakam, 4 rakam, 5 rakam, 6 şekil, Şekil 7), bir monospecific ANA desen sol tarafta çoğu sütun ve bir monospecific DFS70 desen sağ tarafta çoğu sütun görülebilmektedir. Orta üç sütun çeşitli hastalık ilişkili oranları ve DFS70 desen olumlu kontrolünü temsil eden. Elde edilen karma desenler geleneksel HEp-2 substrat (şekil 3, şekil 4, şekil 5, şekil 6, Şekil 7, üst satır) üzerinde ayırt etmek zor. Ancak, örnekleri, çoğunda roman Hep-2 ELITE substrat ile yoğunluklarda unmodified ve mühendislik hücreleri arasındaki farkı (daha az parlak hücrelere daha parlak oranını olduğunda hangi sadece DFS70 otoantikorlar varlığını doğruluyor farklıdır 1:9) ama aynı zamanda bir ikincil ANA deseni ortaya koymaktadır. DFS70 homojen veya benekli DFS70 tepkiler karışık, güvenle ek deneyleri (şekil 1A) bir dizi çalıştırmak için gözle labs açan doğru deseni tahmin etmek mümkün değildir. Karışık tepkiler, DFS70 pozitif çok zordur şüphelenen (şekil 5, şekil 6) şeması-DFS70 ve DFS70 genelde durumunda. Sera oranı % 50 ulaşıncaya kadar genelde ve sitoplazmik Retiküler/AMA tepkiler ile DFS70 desen baskın değil. Tüm örneklerde HEp-2 ELITE substrat DFS70 desen sunabilir ve temel ikincil desen yoğunluğu daha geniş bir yelpazesi üzerinde düzeyleri ve böylece daha doğru bir ANA yorumu kolaylaştırır.
Karışık desenler, çeşitli 50: 50 kombinasyonları ANA ve DFS70 büyütülmüş (şekil 8) için hem geleneksel ve HEp-2 ELITE yüzeylerde denetimleri vardı olumlu sonuçlar yakından gözlemlemek için. Interphase ve Mitotik yorumu ve bildirilen model doğruluğunu geliştirmek için DFS70 HEp-2 yüzeyler üzerinde de dahil olmak üzere tüm ANA desen için boyama gözlemlemek için teşvik edilir. Ancak, karışık desenler için hücre çekirdek bölünmesi ile sunulan farklı desen doğru yorumlanmasını kolaylaştırmak için yeterli olmayabilir. Kırmızı oklar (şekil 8), mühendislik ve konvansiyonel hücredeki Mitotik hücre çekirdeği gösterir. Bu reaksiyonlar hücre bölünmesi üzerinde uygun DFS70 ile kurulan küme kurallar, hastalık ilişkili yorumlanması için ANA desenleri karışık görülebilmektedir. Sarı ve mavi oklar unmodified ve mühendislik (DFS70 KO) HEp-2 hücre çekirdeği, sırasıyla gösterir. Tüm kombinasyonlar içinde (şekil 8), değiştirilmemiş hücre nükleer boyama (~ % 10) ve mühendislik hücre nükleer (~ %90) desen bir açık yoğunluk farkı aynı mikroskobik görüş alanı içinde eş zamanlı tarama sağlayan görülmektedir ve DFS70 desen onay.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig1.jpg"> Şekil 1: geleneksel HEp-2 ve HEp-2 ELITE/DFS70 KO IIf yöntemlerle algoritmaları eleme ANA. (A)şematik unravels geleneksel HEp-2 IIF içinde monospecific ve karışık DFS70 olumlu desenleri tarama aşamasında (sarı gölgeli alan) belirlenmesi eksikliği ve bir ikincil hastalık ilişkili ANA desen ekarte etmek için onun yetersizlik olabilir DFS70 desenine göre karşı daha fazla. , DFS70 belirli katı faz doğrulayıcı deneyleri için ek doğrulama sınama ANAs için yol monospecific DFS70 pozitifliği onaylamak mümkün değildir şimdiki nesil daha fazla. (B) şematik ANAs, monospecific ve karışık DFS70 tepkiler, eşzamanlı ayrım ile taranması için HEp-2 ELITE yeteneklerini açığa çıkarır ve katı faz DFS70 ihtiyacını ortadan kaldırarak deneyi onay. HEp-2 ELITE önemli ölçüde kullanarak algoritma eleme ANA basitleştirir ve onay deneyleri süreyi azaltır. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig2.jpg"> Şekil 2: ELITE/DFS70 HEp-2 KO substrat klasik ANA ve DFS70 desenine. (A)ELITE/DFS70 HEp-2 KO substrat klasik ANA desen korur. Klasik homojen tepki ve DFS70 olumlu tepkiler kit tarafından sağlanan olumlu denetimlerini kullanarak üretildi. Diğer tepkiler daha önce kurulan olumlu denetim sera benekli, şeması, genelde ve sitoplazmik Retiküler/AMA reaksiyonlar5kullanılarak üretildi. (B) ELITE/DFS70 HEp-2 KO substrat sağlar geleneksel ve mühendislik hücreleri, hangi kolay ayrım DFS70 desen kolaylaştırır. Şematik elde edilen DFS70 monospecific tepki ve desen Interphase boyama ve hücre çekirdeği hem geleneksel hem de mühendislik (DFS70-KO) hücrelerin bölünmesi gösterir. Mühendislik HEp-2 DFS70 antikor reaksiyonu geleneksel HEp-2 yüzeyler üzerinde tarafından genellikle gizli ikincil desenleri aynı anda tespiti sağlar LEDGF/p75/DFS70 antijen yoksun hücrelerdir. Oklar (sarı), Mitotik hücre çekirdeği örnekleri gösterir. Ölçek çubukları temsil 20 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig3.jpg"> Şekil 3: DFS70 ve homojen sera birlikte. DFS70 monospecific sera çeşitli oranları (100:0, 80:20, 50: 50, 20:80 ve 0:100) pozitif homojen desen denetiminde ile birlikte ve geleneksel ve mühendislik (DFS70-KO) HEp-2 yüzeyler üzerinde test edilmiştir. Ölçek çubukları temsil 20 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig4.jpg"> Şekil 4: DFS70 ve benekli sera birlikte. DFS70 monospecific sera çeşitli oranları (100:0, 80:20, 50: 50, 20:80 ve 0:100) pozitif benekli desen denetiminde ile birlikte ve geleneksel ve mühendislik (DFS70-KO) HEp-2 yüzeyler üzerinde test edilmiştir. Ölçek çubukları temsil 20 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig5.jpg"> Şekil 5: DFS70 ve şeması sera birlikte. DFS 70 monospecific sera bir pozitif şeması desen denetiminde çeşitli oranları (100:0, 80:20, 50: 50, 20:80 ve 0:100) ile birlikte ve geleneksel ve mühendislik (DFS70-KO) HEp-2 yüzeyler üzerinde test edilmiştir. Ölçek çubukları temsil 20 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig6.jpg"> Şekil 6: DFS70 ve birlikte genelde sera. DFS 70 monospecific sera çeşitli oranları (100:0, 80:20, 50: 50, 20:80 ve 0:100) pozitif genelde desen denetiminde ile birlikte ve geleneksel ve mühendislik (DFS70-KO) HEp-2 yüzeyler üzerinde test edilmiştir. Ölçek çubukları temsil 20 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig7.jpg"> Şekil 7: DFS70 ve sitoplazmik Retiküler/AMA sera birlikte. DFS70 monospecific sera çeşitli oranları (100:0, 80:20, 50: 50, 20:80 ve 0:100) pozitif mitokondrial desen denetiminde ile birlikte ve geleneksel ve mühendislik (DFS70-KO) HEp-2 yüzeyler üzerinde test edilmiştir. Ölçek çubukları temsil 20 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig8.jpg"> Şekil 8: geleneksel olarak üretilen modelleri (50: 50 oranı) karışık ve HEp-2 ELITE yüzeylerde. İki yüzeylerde arasındaki farklar ortaya çıkar. Kırmızı oklar, her iki yüzeylerde mühendislik ve konvansiyonel hücrelerinde Mitotik hücre çekirdeği gösterir. Bu birleşimleri için hücre çekirdeği geleneksel HEp-2 substrat olarak bölünmesi ile sunulan farklı desen karışık desenler doğru yorumlanması için yeterli değildir. Hücre bölünmesi üzerinde karışık DFS70 tepkiler kural hastalık ilişkili yorumlanması için kurulan kümesinin ANA desen huzursuz ki görülebilmektedir. Sarı ve mavi oklar unmodified ve mühendislik (DFS70 KO) HEp-2 hücre çekirdeği, sırasıyla gösterir. Tüm kombinasyonlar için elde edilen sonuçlar üzerinde mühendislik substrat test: ait Interphase nükleer desen net yoğunluk farkı değiştirilmemiş hücreleri (~ %10) ve mühendislik hücreleri (~ %90) gözlenen, etkin eş zamanlı DFS70 desen ile ve algılama. Ölçek çubukları temsil 20 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig8large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ANA desen</td>
			<td colspan="2">Açıklama</td>
		</tr>
<tr>
<td>Homojen</td>
			<td colspan="2">Tüm çekirdeği eşit olarak diffüz boyama desen fluoresces.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Benekli</td>
			<td colspan="2">Ayrık, speckles, ince ayar yapmak için kaba çekirdeği bulabilsem.  İyi benekli ve kaba benekli desenleri anlatmıştık.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Genelde</td>
			<td colspan="2">Çekirdek içinde birden çok katı veya benekli organları olarak nükleulus leke. Alt türlerinden daha önce anlatmıştık.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Şeması</td>
			<td colspan="2">Büyük speckles sonlu numarası. Reaktif antijen ile yoğun kromozomlar mitoz geçiren hücrelerdeki harmanlama.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sitoplazmik Retiküler/AMA</td>
			<td colspan="2">Sitoplazma olumlu mitokondri boyama ile taneli görünür.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">DFS70</td>
			<td colspan="2">•24V HEp-2 hücreleri: yoğun iyi benekli desen Interphase çekirdeği ve ilişkili Kromatin boyama Mitotik hücre çekirdeği üzerinde görülür görülmektedir.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">•Engineered hücre DFS70 KO: Anti-DFS70 antikor üretmek negatif boyama</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">HEp-2 Elite / DFS70 KO geleneksel ve mühendislik (DFS70 KO) hücrelerinde yaklaşık 1:9 oranı vardır. Geleneksel hücreler tipik DFS70 deseni üretmek ve bir DFS70 monospecific/izole olumlu tepkiler ile tepki zaman olumsuz bir desen mühendislik hücreleri üretirler.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: açıklama ANA desen.

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Distinction of Monospecific and Mixed DFS70 Patterns During ANA Screening with a Novel HEp-2 ELITE/DFS70 Knockout Substrate at JoVE.com

Simultaneous Distinction of Monospecific and Mixed DFS70 Patterns During ANA Screening with a Novel HEp-2 ELITE/DFS70 Knockout Substrate

DFS70 otoantikorlar doğru yorumu geleneksel HEp-2 yüzeylerde kullanırken zorlu yapma ortak enerjiye antikor hastalık ilişkili kalıpları taklit. Protokol üzerinden geleneksel HEp-2 eleme ve hem monospecific hem de karma ANA olumlu durumlarda yüksek güven ile DFS70 desenleri ayırt ANA'roman mühendislik HEp-2 substrat avantajları açıklar.

Monospecific ve karışık DFS70 desen bir roman hepatit-2 ELITE/DFS70 nakavt substrat ile birlikte ANA tarama sırasında eşzamanlı ayrım

Systemic autoimmune connective tissue disorders are characterized by circulating antinuclear antibodies (ANA). Although there are several technologies ...

simultaneous-distinction-monospecific-mixed-dfs70-patterns-during-ana

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

35.6K Görüntüleme.  A Trinity Biotech Company. DFS70 otoantikorlar doğru yorumu geleneksel HEp-2 yüzeylerde kullanırken zorlu yapma ortak enerjiye antikor hastalık ilişkili kalıpları taklit. Protokol üzerinden geleneksel HEp-2 eleme ve hem monospecific hem de karma ANA olumlu durumlarda yüksek güven ile DFS70 desenleri ayırt ANA'roman mühendislik HEp-2 substrat avantajları açıklar.

Video: Simultaneous Distinction of Monospecific and Mixed DFS70 Patterns During ANA Screening with a Novel HEp-2 ELITE/DFS70 Knockout Substrate

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance can be caused by a range of mechanisms, including increased drug elimination, decreased drug uptake, drug inactivation and alterations of drug targets. Recent data showed that other than by well-known genetic (mutation, amplification) and epigenetic (DNA hypermethylation, histone post-translational modification) modifications, drug resistance mechanisms might also be regulated by splicing aberrations. This is a rapidly growing field of investigation that deserves future attention in order to plan more effective therapeutic approaches. The protocol described in this paper is aimed at investigating the impact of aberrant splicing on drug resistance in solid tumors and hematological malignancies. To this goal, we analyzed the transcriptomic profiles of several in vitro models through RNA-seq and established a qRT-PCR based method to validate candidate genes. In particular, we evaluated the differential splicing of DDX5 and PKM transcripts. The aberrant splicing detected by the computational tool MATS was validated in leukemic cells, showing that different DDX5 splice variants are expressed in the parental vs. resistant cells. In these cells, we also observed a higher PKM2/PKM1 ratio, which was not detected in the Panc-1 gemcitabine-resistant counterpart compared to parental Panc-1 cells, suggesting a different mechanism of drug-resistance induced by gemcitabine exposure.

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Here we describe a protocol aimed at investigating the impact of aberrant splicing on drug resistance in solid tumors and hematological malignancies. To this goal, we analyzed the transcriptomic profiles of parental and resistant in vitro models through RNA-seq and established a qRT-PCR based method to validate candidate genes.

İlaç Direnci İlgili Roman Splice türevlerini algılamak için RNA sıralamayı kullanarak<em&gt; İn Vitro</em&gt; Kanser Modelleri

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance ...

Kanser Araştırmaları

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation into thousands of nano-sized water-in-oil individual reactions. Recently, ddPCR has become one of the most accurate and sensitive tools for circulating tumor DNA (ctDNA) detection. One of the major limitations of the standard ddPCR technique is the restricted number of mutations that can be screened per reaction, as specific hydrolysis probes recognizing each possible allelic version are required. An alternative methodology, the drop-off ddPCR, increases throughput, since it requires only a single pair of probes to detect and quantify potentially all genetic alterations in the targeted region. Drop-off ddPCR displays comparable sensitivity to conventional ddPCR assays with the advantage of detecting a greater number of mutations in a single reaction. It is cost-effective, conserves precious sample material, and can also be used as a discovery tool when mutations are not known a priori.

Here, we present a protocol to accurately quantify multiple genetic alterations of a target region in a single reaction using drop-off ddPCR and a unique pair of hydrolysis probes.

Tek damlacık dijital polimeraz zincir tepkimesi mutasyonlar Hotspot bölgelerde kapsamlı ve eşzamanlı algılanması için

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Genetik

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

Sulu İki fazlı sistemler kullanma Hücre Co-kültür desenlendirme

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Biyomühendislik

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a cost-effective in vivo method to identify heterochromatin-promoting compounds by using Drosophila. The Drosophila&#39;s DX1 strain, having a variegated eye color phenotype that reflects the extents of heterochromatin formation, thereby providing a tool for a heterochromatin-promoting drug screen. In this screening method, eye variegation is quantified based on the surface area of red pigmentation occupying parts of the eye and is scored on a scale from 1 to 5. The screening method is straightforward and sensitive and allows for testing compounds in vivo. Drug screening using this method provides a fast and inexpensive way for identifying heterochromatin-promoting drugs that could have beneficial effects in cancer therapeutics. Identifying compounds that promote the formation of heterochromatin could also lead to the discovery of epigenetic mechanisms of cancer development.

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

Drosophila is a widely used experimental model suitable for screening drugs with potential applications for cancer therapy. Here, we describe the use of Drosophila variegated eye color phenotypes as a method for screening small-molecule compounds that promote heterochromatin formation.

Drosophila Kullanan Heterokromatin-Teşvik Edici İlaçların Tanımlanması nda Bir Tarama Yöntemi

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a ...

Single Nucleotide Polymorphism-sensitive FISH Detection of Locus-specific Ribosomal RNA Transcription in Drosophila melanogaster

In order to ensure sufficient ribosomal RNA (rRNA) is transcribed for ribosome function, genomes contain hundreds of tandem duplications of the sequences that encode rRNAs, composing regions called ribosomal DNA (rDNA) loci. Many organisms' genomes contain more than one rDNA locus distributed across different chromosomes, and rRNA may be transcribed from multiple rDNA loci or only a single locus. Changes in rRNA transcription sources often indicate ribosomal distress. However, the homogeneity of rRNA obstructs distinguishing if rRNA is transcribed from multiple or a single rDNA locus. Here, we describe a method that uses single nucleotide polymorphism-sensitive fluorescence in situ hybridization (SNP-FISH) to distinguish rRNA transcription between Drosophila melanogaster rDNA loci on the X and Y chromosomes. This method leverages locus-specific rRNA variants to enable easy detection of the source of rRNA transcription with single-cell resolution. This assay can be applied to any Drosophila cell type and may be adapted for use in other systems.

The protocol describes single nucleotide polymorphisms-sensitive fluorescence in situ hybridization (SNP-FISH) method to distinguish ribosomal RNA transcripts derived from the X or Y chromosome ribosomal DNA locus in Drosophila melanogaster.

Tek Nükleotid Polimorfizmine Duyarlı FISH Drosophila melanogaster'de Locus'a Özgü Ribozomal RNA Transkripsiyonunun Tespiti

In order to ensure sufficient ribosomal RNA (rRNA) is transcribed for ribosome function, genomes contain hundreds of tandem duplications of the sequences ...

Nano-Differential Scanning Fluorimetry for Screening in Fragment-based Lead Discovery

Thermal shift assays (TSAs) examine how the melting temperature (Tm) of a target protein changes in response to changes in its environment (e.g., buffer composition). The utility of TSA, and specifically of nano-Differential Scanning Fluorimetry (nano-DSF), has been established over the years, both for finding conditions that help stabilize a specific protein and for looking at ligand binding by monitoring changes in the apparent Tm. This paper presents an efficient screening of the Diamond-SGC-iNEXT Poised (DSi-Poised) fragment library (768 compounds) by the use of nano-DSF, monitoring Tm to identify potential fragment binding. The prerequisites regarding protein quality and concentration for performing nano-DSF experiments are briefly outlined followed by a step-by-step protocol that uses a nano-liter robotic dispenser commonly used in structural biology laboratories for preparing the required samples in 96-well plates. The protocol describes how the reagent mixtures are transferred to the capillaries needed for nano-DSF measurements. In addition, this paper provides protocols to measure thermal denaturation (monitoring intrinsic tryptophan fluorescence) and aggregation (monitoring light back-scattering) and the subsequent steps for data transfer and analysis. Finally, screening experiments with three different protein targets are discussed to illustrate the use of this procedure in the context of lead discovery campaigns. The overall principle of the method described can be easily transferred to other fragment libraries or adapted to other instruments.

Monitoring changes in the melting temperature of a target protein (i.e., thermal shift assay, TSA) is an efficient method for screening fragment libraries of a few hundred compounds. We present a TSA protocol implementing robotics-assisted nano-Differential Scanning Fluorimetry (nano-DSF) for monitoring intrinsic tryptophan fluorescence and light back-scattering for fragment screening.

Parça Bazlı Kurşun Keşfinde Tarama için Nano-Diferansiyel Tarama Florüretrisi

Thermal shift assays (TSAs) examine how the melting temperature (Tm) of a target protein changes in response to changes in its environment (e.g., buffer ...

Biyokimya

Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

A procedure for assessing specificity of anticancer drugs in vitro using cultures containing both tumor and non-tumor cells is demonstrated. The key element is the quantitative determination of a tumor-specific genetic alteration in relation to a universal sequence using a dual-probe digital PCR assay and the subsequent calculation of the proportion of tumor cells. The assay is carried out on a culture containing tumor cells of an established line and spiked-in non-tumor cells. The mixed culture is treated with a test drug at various concentrations. After the treatment, DNA is prepared directly from the survived adhesive cells in wells of 96-well plates using a simple and inexpensive method, and subjected to a dual-probe digital PCR assay for measuring a tumor-specific genetic alteration and a reference universal sequence. In the present demonstration, a heterozygous deletion of the NF1 gene is used as the tumor-specific genetic alteration and a RPP30 gene as the reference gene. Using the ratio NF1/RPP30, the proportion of tumor cells was calculated. Since the dose-dependent change of the proportion of tumor cells provides an in vitro indication for specificity of the drug, this genetic and cell-based in vitro assay will likely have application potential in drug discovery. Furthermore, for personalized cancer-care, this genetic- and cell-based tool may contribute to optimizing adjuvant chemotherapy by means of testing efficacy and specificity of candidate drugs using primary cultures of individual tumors.

Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

The goal of this protocol is to assess specificity of anticancer drugs in vitro using mixed cultures containing both tumor and non-tumor cells.

Antikanser İlaçların Özgüllük değerlendirilmesi<em&gt; İn Vitro</em

A procedure for assessing specificity of anticancer drugs in vitro using cultures containing both tumor and non-tumor cells is demonstrated. The key ...

Tıp

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that allows for the glycosylation profiling of specific proteins. Glycosylation of proteins is the most prevalent post-translational modification found on proteins, and leads diversified modifications of the physical, chemical, and biological properties of proteins. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases. However, current methods to study protein glycosylation typically are too complicated or expensive for use in most normal laboratory or clinical settings and a more practical method to study protein glycosylation is needed. The new protocol described in this study makes use of a chemically blocked antibody microarray with glycan-binding protein (GBP) detection and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements needed to study protein glycosylation. In this method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies are printed directly onto the microarray slides and the N-glycans on the antibodies are blocked. The blocked, immobilized glycoprotein-specific antibodies are able to capture and isolate glycoproteins from a complex sample that is applied directly onto the microarray slides. Glycan detection then can be performed by the application of biotinylated lectins and other GBPs to the microarray slide, while binding levels can be determined using Dylight 549-Streptavidin. Through the use of an antibody panel and probing with multiple biotinylated lectins, this method allows for an effective glycosylation profile of the different proteins found in a given human or animal sample to be developed.
Introduction
Glycosylation of protein, which is the most ubiquitous post-translational modification on proteins, modifies the physical, chemical, and biological properties of a protein, and plays a fundamental role in various biological processes1-6. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases 7-12. In fact, most current cancer biomarkers, such as the L3 fraction of &alpha;-1 fetoprotein (AFP) for hepatocellular carcinoma 13-15, and CA199 for pancreatic cancer 16, 17 are all aberrant glycan moieties on glycoproteins. However, methods to study protein glycosylation have been complicated, and not suitable for routine laboratory and clinical settings. Chen et al. has recently invented a chemically blocked antibody microarray with a glycan-binding protein (GBP) detection method for high-throughput and multiplexed profile glycosylation of native glycoproteins in a complex sample 18. In this affinity based microarray method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies capture and isolate glycoproteins from the complex mixture directly on the microarray slide, and the glycans on each individual captured protein are measured by GBPs. Because all normal antibodies contain N-glycans which could be recognized by most GBPs, the critical step of this method is to chemically block the glycans on the antibodies from binding to GBP. In the procedure, the cis-diol groups of the glycans on the antibodies were first oxidized to aldehyde groups by using NaIO4 in sodium acetate buffer avoiding light. The aldehyde groups were then conjugated to the hydrazide group of a cross-linker, 4-(4-N-MaleimidoPhenyl)butyric acid Hydrazide HCl (MPBH), followed by the conjugation of a dipeptide, Cys-Gly, to the maleimide group of the MPBH. Thus, the cis-diol groups on glycans of antibodies were converted into bulky none hydroxyl groups, which hindered the lectins and other GBPs bindings to the capture antibodies. This blocking procedure makes the GBPs and lectins bind only to the glycans of captured proteins. After this chemically blocking, serum samples were incubated with the antibody microarray, followed by the glycans detection by using different biotinylated lectins and GBPs, and visualized with Cy3-streptavidin. The parallel use of an antibody panel and multiple lectin probing provides discrete glycosylation profiles of multiple proteins in a given sample 18-20. This method has been used successfully in multiple different labs 1, 7, 13, 19-31. However, stability of MPBH and Cys-Gly, complicated and extended procedure in this method affect the reproducibility, effectiveness and efficiency of the method. In this new protocol, we replaced both MPBH and Cys-Gly with one much more stable reagent glutamic acid hydrazide (Glu-hydrazide), which significantly improved the reproducibility of the method, simplified and shorten the whole procedure so that the it can be completed within one working day. In this new protocol, we describe the detailed procedure of the protocol which can be readily adopted by normal labs for routine protein glycosylation study and techniques which are necessary to obtain reproducible and repeatable results.

In this study, we describe an improved protocol for a multiplexed high-throughput antibody microarray with lectin detection method that can be used in glycosylation profiling of specific proteins. This protocol features new reliable reagents and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements as compared to the previous procedure.

Kompleks Örnekleri spesifik protein Glikozilasyon arasında Multiplexed Yüksek verim Profilleme için Kimyasal-bloke Antikor Mikroarray

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

Biyoloji

Anti-Nuclear Antibody Screening Using HEp-2 Cells

The American College of Rheumatology position statement on ANA testing stipulates the use of IIF as the gold standard method for ANA screening1. Although IIF is an excellent screening test in expert hands, the technical difficulties of processing and reading IIF slides &#8211; such as the labor intensive slide processing, manual reading, the need for experienced, trained technologists and the use of dark room &#8211; make the IIF method difficult to fit in the workflow of modern, automated laboratories.
The first and crucial step towards high quality ANA screening is careful slide processing. This procedure is labor intensive, and requires full understanding of the process, as well as attention to details and experience.
Slide reading is performed by fluorescent microscopy in dark rooms, and is done by trained technologists who are familiar with the various patterns, in the context of cell cycle and the morphology of interphase and dividing cells. Provided that IIF is the first line screening tool for SARD, understanding the steps to correctly perform this technique is critical.
Recently, digital imaging systems have been developed for the automated reading of IIF slides. These systems, such as the NOVA View Automated Fluorescent Microscope, are designed to streamline the routine IIF workflow. NOVA View acquires and stores high resolution digital images of the wells, thereby separating image acquisition from interpretation; images are viewed an interpreted on high resolution computer monitors. It stores images for future reference and supports the operator&#8217;s interpretation by providing fluorescent light intensity data on the images. It also preliminarily categorizes results as positive or negative, and provides pattern recognition for positive samples. In summary, it eliminates the need for darkroom, and automates and streamlines the IIF reading/interpretation workflow. Most importantly, it increases consistency between readers and readings. Moreover, with the use of barcoded slides, transcription errors are eliminated by providing sample traceability and positive patient identification. This results in increased patient data integrity and safety.
The overall goal of this video is to demonstrate the IIF procedure, including slide processing, identification of common IIF patterns, and the introduction of new advancements to simplify and harmonize this technique.

Indirect immunofluorescent (IIF) assays have traditionally been used for the detection of antinuclear antibodies (ANA) in human serum. The presence of these antibodies can aid in the diagnosis of systemic autoimmune rheumatic diseases (SARD). This protocol demonstrates how to effectively perform the IIF technique to accurately detect these autoantibodies.

Anti-Nükleer Antikor HEp-2 hücreleri kullanarak Eleme

The American College of Rheumatology position statement on ANA testing stipulates the use of IIF as the gold standard method for ANA screening1. Although ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Yüksek Verimli Tarama kullanma Kinaz-substrat Çiftlerinin Kimlik


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Monospecific ve karışık DFS70 desen bir roman hepatit-2 ELITE/DFS70 nakavt substrat ile birlikte ANA tarama sırasında eşzamanlı ayrım

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

İlaç Direnci İlgili Roman Splice türevlerini algılamak için RNA sıralamayı kullanarak