JBWための：;この作品は、コールター財団、Beysterファウンデーション、学部研究の機会（UROP）ATAおよび全米科学財団大学院学生研究フェローシップ（2010101926。番号グラントないDGE 0718128）のためのサマープログラムによってサポートされていました。

1。位相システムの特性解析：相分離のための決定しきい値<ol><li>目的のバッファまたは細胞培養培地15 mlまたは50 mlコニカルチューブに図1（紫ドット）に示すようにPEGとDEXを含む溶液を調製します。以下、PEGとDEXは35 kDaのPEGおよび500kDaのDEXを参照しますが、臨界濃度は、使用される2つのポリマーに応じて変化します。各溶液中のPEGとDEXの質量を記録する。高濃度ポリマー溶液は、溶解するために数時間かかることがあります。ボルテックスは、無血清のソリューションを使用することができます。両方のポリマーが完全に溶解するまでのタンパク質または血清を含有する培地については、ロッキングステージにチューブを置きます。ポリマーを溶解し、初期濃度のメモを取るために使用されるメディアの重量を記録する。 </li><li>ポリマーが完全に溶解したら、溶液は濁って見えるはずです。これは、相分離が発生したことを最初の兆候です。これを確認するには、許可ポリマー溶液を20分間室温で垂直位置で休ませる。 1,000×gで遠心分離し、相分離のプロセスを加速するために使用できます。より高密度下相はDEX-リッチになり、上相は、PEG-リッチになります。 </li><li>ゆっくり管に、追加のバッファーまたはメディアを追加します。少しずつではなくシュート相分離点をするように使用されるべきである。 </li><li>溶液は遠心分離後に明らかになると、もはや、相分離した場合、相分離のためのしきい値に達しました。チューブの最終重量を記録します。 </li><li>メディアを追加した後、相分離が発生しなくなったときのそれぞれの二つのポリマーの重量％/重量を決定する最終的な重量と一緒に、ポリマーのための前に記録した重みを使用して。 </li><li>これらの値をプロットし、x軸、y軸および％重量/重量％、DEXで重量/重量PEGなど。 binodal曲線として知られているこのプロットは、異なるconcentratiための相分離のための閾値濃度を決定するために使用することができます特定の細胞培養培地中のPEG / DEXのアドオン。 </li></ol> 2。構成1：除外パターニング（96ウェルプレートフォーマット） <ol><li> 5.0パーセント重量/重量PEGおよび細胞培養培地の12.8％重量/重量DEXの別個の溶液を調製する。ポリマーは互いに対して平衡化した後ATPSが残っていることを確認するために二回少なくとも臨界点のATPSソリューションを使用しています。 PEG-rich相とその逆にDEXの少量のフラックス量があるため、臨界点以下の濃度の低下などの相系が失われる可能性が臨界濃度近く過ぎて働き。同様に、湿度と温度制御されたインキュベーターに細胞培養皿を転送するには、2つの位相特性を変更し、2つの溶液を混和することができます。注：一部の細胞は他のATPS製剤でパフォーマンスが向上する場合があります。許容される製剤は、第1部から決定binodal曲線に基づいて選択することができる。 </li><li>除外パットに使用される細胞を回収rning。利用できる細胞の総数/濃度を決定する。オプション：CellTrackerや蛍光顕微鏡法のための他の非細胞毒性のラベルで細胞を標識する。 </li><li>細胞をペレット化と排除のための細胞の必要な数を達成するために、5.0％のPEGの適切な音量でペレットを再懸濁します。例えば、96ウェルプレートのウェル1は37,500線維芽細胞は翌日合流を生成するために、PEGを200μlに再懸濁されている必要があります。他のタイプの細胞と培養基板サイズのため、必要に応じてこれらの数値をスケーリングします。 </li><li>マイクロピペッターを用いて、乾燥した細胞培養基板上にDEXの0.5μlの液滴を分注する。大きな体積の液滴が大きく除外ゾーンを作り出す。 0.1から1μlまでの範囲のサイズの液滴は除外微細化のために推奨されています。オプション：DEX滴が前もって24時間を堆積させ、室温で脱水させることができる。これは、掃除機のパターンを生成することができます。 </li><li>トンへのPEGの細胞懸濁液200μLを分注し彼はよくDEX滴をカバーする。 </li><li> 37℃で12時間加湿インキュベーター℃、5％CO 2の場所。皿は取扱い中に傾いていないこと、それはパターンの中断を避けるために、レベルインキュベーターの棚に置かれていることを確認します。 </li><li>のPEG溶液を除去し、培地200μlで3回洗浄する。 </li><li>新鮮な培地とインキュベーターへの復帰を追加します。 </li><li>除外ゾーンに細胞の動きを観察するために定期的な文化を監視します。 </li></ol> 3。構成2：島のパターニング（96ウェルプレートフォーマット） <ol><li>上記のように、細胞培養培地は5.0％重量/重量PEGおよび12.8パーセント重量/重量DEXの溶液を調製する。 </li><li>島のパターニングに使用される細胞を回収する。利用できる細胞の総数/濃度を決定する。 </li><li>ペレットと島のパターニングのための細胞の所望の濃度を達成するために、12.8パーセントDEXの適切な音量で細胞を再懸濁します。 5000 CEの濃度LLS /μL以下を強く接着細胞型に対して推奨されています。難易アタッチまたは緩く付着した細胞を有する細胞は、最大10,000細胞/μlの濃度を考慮してもよい。 </li><li>上述のように、乾燥した細胞培養基板上に、DEXのピペット0.5μlの液滴の乾燥を避けるために迅速に取り組んでいます。液滴が乾燥させないでください。オプション：PEG溶液200μlを前もってウェルに添加することができます。 DEXの液滴は、それらが底に沈むと文化面をご連絡いたしPEG溶液中に堆積させることができる。これはクリーナー島パターンを生成することができます。 </li><li> PEGの200μlとDEX滴をカバーしています。 </li><li> 37℃で12時間加湿インキュベーター℃、5％CO 2の場所。皿は取扱い中に傾いていないこと、それはパターンの中断を避けるために、レベルインキュベーターの棚に置かれていることを確認します。 </li><li>のPEG溶液を除去し、培地200μlで3回洗浄する。 </li><li>新鮮な培養を追加中規模およびインキュベーターに戻ります。 </li><li>島からの細胞の移動と増殖を外側に観察するために定期的な文化を監視します。 </li></ol> 4。構成3：除外共培養（96ウェルプレートフォーマット） <ol><li>上記のように、細胞培養培地は5.0％重量/重量PEGおよび12.8パーセント重量/重量DEXの溶液を調製する。 </li><li>除外と島のパターニングに使用される細胞を回収する。各細胞型のために利用できる細胞の総数/濃度を決定する。オプション：いくつかのセルの組み合わせは劇的に異なる増殖指標を表示することがあります。島パターン化細胞（特に長期の培養用）overpopulatingから除外細胞を防ぐために、2時間のためにマイトマイシンCを除外するために使用した細胞を治療したり、収穫前にそれらを照射します。これは増殖を防ぐことができます。蛍光CellTracker色素は、必要に応じて2つの細胞集団を区別するために使用することができます。 </li><li>細胞をペレット化し、exclusioためのペレットを再懸濁上記のように、細胞の必要な数を達成するために5.0％のPEGの適切な音量にnパターニング。上記のように、細胞の所望の濃度を達成するために、12.8パーセントDEXの適切なボリュームで、島のパターニングにペレットを再懸濁する。 </li><li>マイクロピペッターを用いて、乾燥した細胞培養基板上にDEXの細胞懸濁液0.5μlの液滴を分注する。液滴が乾燥させないでください。 </li><li> PEGの細胞懸濁液200μlとDEX滴をカバーしています。 </li><li> 37℃で12時間加湿インキュベーター℃、5％CO 2の場所。皿は取扱い中に傾いていないこと、それはパターンの中断を避けるために、レベルインキュベーターの棚に置かれていることを確認します。 </li><li>のPEG溶液を除去し、培地を200μlで3回洗浄する。 </li><li>新鮮な培地とインキュベーターへの復帰を追加します。 </li><li>細胞集団の間の相互作用を観察するために共培養を監視します。オプション：コントロールが除外または個人ラージヒル島パターニングを行うことにより調製することができるidually、相互作用しない共培養細胞によるまたはパターニング前または後のいずれかまたは両方の細胞集団への関心の経路を遮断することによって。 </li></ol>

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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precisely+targeted+delivery+of+cells+and+biomolecules+within+microchannels+using+aqueous+two-phase+systems.">Precisely targeted delivery of cells and biomolecules within microchannels using aqueous two-phase systems.</a> Biomed. Microdevices. 13 (6), 1043-1051 (2011).</li><li>Hossein Tavana, K. K., Bersano-Begey, T., Luker, K. E., Luker, G. 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著者らは、経済的利益を競っていない。

ATPSセルの微細化方法は、細胞培養技術における習熟度を超えて非常に少ない専門知識を必要とし、速やかに習得することができます。このアプローチの利点は、それが、安価で迅速かつ細胞型および文化の様々なフォーマットと互換性があることです。これらの理由から、我々のプロトコルは、簡単に、特に生命科学、細胞の増殖、遊走および走化性、および細胞集団の間でjuxtacrineおよび?...

水性二相系（ATPSs）互換性のない2つのポリマーの溶液は十分に高い濃度で一緒に混合される形。相分離は、ポリマー、溶液の温度、pH、および水性溶媒、1,2のイオン含有量の分子量と極性を含む様々な要因に影響されます。 2ポリマー溶液が別々にある点は、選択された相系の物理化学的特性によって決まりますが、一般に、非変性条件下で低いポリマー濃度（20％未満の重量/重量）で発生し、ATPSsはバイオテクノロジーを使用することができるようにすることですアプリケーション3-9。 これまでで最も広範囲に研究ATPSは、ポリエチレングリコール（PEG）/デキストラン（DEX）のシステムです。これらの安価で、生体適合性ポリマーによって形成ATPSはもともと分子ショニング2、10を介して生体分子の精製の ​​ために記述されていた。分割相系に寄与しない付加的な分子や粒子をPEGとDEXと混合している場合に発生します。 DEXまたはPEGのどちらかのためにそれらの相対的な親和性に基づいて、分子や粒子が優先的に二つの相の一つの中に、またはインターフェイスに属します。 PEG / DEX ATPSの別のプロパティには、2つのポリマー相の間の界面張力の存在である。 PEGとDEXによって形成ATPSsは、一般的に、水と油のような他の液-液二相系よりもはるかに低い界面張力を表示していますが、界面張力軍はまだそのようなウイルスは、細胞やタンパク質凝集体2のような小さな粒子に効果を発揮、11月13日 。哺乳類細胞上の任意の有害な影響は、これらの内に組み込まれた場合は最後に、塩の生理的濃度の存在下で低濃度（高分子量ポリマーの品種のための5％未満の重量/重量）で、より高い分子量のPEGとDEXが個別以来、いくつかありますシステム14から16。 最近では、界面特性とATPSsのパーティショニング効果が細胞パターニング14、16から20のための私達の研究室で適用されている。これは、PEGの存在下で細胞培養基板上に微細緻密なDEXのソリューションによって達成された。細胞は、PEG相に組み込まれている場合、それらは、PEG / DEX界面張力20によるDEX滴に入るから除外されます。細胞はDEXのフェーズにパターニングされている場合、それらは界面張力とパーティション16、17、19で細胞培養基板の表面に保持されます。 セルパターニングのための他の方法とは対照的に、ATPS細胞のパターニングは、学ぶことは簡単であり、唯一のポリマー自体、および細胞培養を行い、マイクロピペッターを使用する機能に関する初歩的な知識を必要とします。セルパターニングのための他の方法は、多くの場合、簡単に目に翻訳されていない特殊な機器と訓練を伴う電子生命科学。たとえば、いくつかの方法（マイクロコンタクト印刷やインクジェット印刷）間接的に続いて細胞接着21,22のための部位としての役割を果たす培養基質への細胞接着性生体分子のパターンを適用することにより、パターンセル。間接的なアプローチには、いくつかの細胞型のために有用であるが、それらはユーザスキルとパターニングツールを製作するための特殊な装置の高度を必要とし、特定の細胞型/生体分子のパターンに応じて特異性を欠くことができます。あるいは、細胞を層流パターニング、ステンシルやインクジェット印刷23から26を含むダイレクトパターニングのアプローチの方法によって高いパターン特異性で成膜することができる。しかしながら、これらの技術はまた、ユーザーの専門知識と特殊な装置を必要とし、印刷処理中に細胞を損傷することがあります。これらのアプローチは一般に、細胞パターニングのための生命科学分野の有用なツールであることが、細胞の正確なパターンを生成するが、それは費用対効果がなければなりません実装が簡単でND。 ここで我々は、以前に公開された出願に記載されてATPSsを用いてパターン化培養細胞を生成するための詳細なプロトコルを報告している。 micropipettorsのみを使用して、ユーザーは移動アッセイのための細胞除外ゾーンまたはセルの島を生成することができます。これはどちらかDEX期における細胞を保持またはDEXからのPEG相に堆積セルを除外PEG / DEX界面張力の方法によって達成される。これら2つの基本的なパターニング技術を組み合わせることによって、それは急速にそのような肝臓の線維芽細胞の共培養などの細胞の共培養を生成することが可能である。パターニング方法、ATPSパラメータと期待される結果を詳細に説明されています。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬 </td><td> メーカー </td></tr><tr><td>デキストラン50万kDaの</td><td> Pharmacosmos、デンマーク</td></tr><tr><td>ポリエチレングリコール35000 kDaの</td><td> Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州</td></tr><tr><td>ヒーラ</td><td> ATCC、マナッサス</td></tr><tr><td>たHepG2 C3A </td><td> ATCC、マナッサス</td></tr><tr><td> NIH 3T3 </td><td> ATCC、マナッサス</td></tr><tr><td>セルトラッカー</td><td>インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州</td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco社、カールスバッド、カリフォルニア州</td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Gibco社、カールスバッド、カリフォルニア州</td></tr><tr><td> [F12] </td><td> Gibco社、カールスバッド、カリフォルニア州</td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td> Gibco社、カールスバッド、カリフォルニア州</td></tr></tbody></table>

cell co-culture patterning using aqueous two-phase systems

、速く、使いやすく、手頃な価格であり、細胞パターニング技術は、ハイスループット細胞アッセイ、細胞間相互作用や組織工学システムを研究するためのプラットフォームの将来の発展のため必要となります。この詳細なプロトコルは、閾値濃度の上に組み合わせた相分離することデキストラン（DEX）とポリエチレングリコール（PEG）の生体適合性のソリューションを用いて細胞の共培養を生成する方法を説明します。細胞は、このメソッドを使用して、さまざまな構成でパターニングすることができる。セルの除外パターニングは、基板上にDEXの滴を印刷して、PEGを含有する細胞のソリューションでそれらをカバーすることによって行うことができる。 2ポリマー溶液との間に形成される界面張力はDEXの液滴の外側に落下してマイグレーションアッセイに使用することができる円形のクリアを形成する細胞が発生。細胞島はPEG溶液に細胞が豊富なDEXフェーズを分配することによって、またはDEXを覆うことによりパターニングすることができるPEGの溶液を用いて滴。共培養はDEX島パターニングによる細胞除外を組み合わせることによって直接形成することができる。これらの方法は、マニュアルmicropipetting含む液体処理アプローチの様々な互換性があり、実質的に任意の接着細胞タイプで使用することができます。

セルパターニングのためのPEGとDEXの適切な組み合わせを選択するには、それはbinodal曲線を決定することが重要です。この曲線はATPSが形成でき、温度、pHおよびイオン内容に基づいて、ポリマーの特定のセットで異なる場合がありますする点を区別します。カスタマイズされた培地の処方を必要とする細胞を培養するためには、実験的にbinodal曲線を決定する必要があるかもしれません。これ?...

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Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

水性二相系が細胞のパターンを同時に複数の集団に使用されていました。セルパターニングのためのこの迅速かつ簡単な方法は、デキストランとポリエチレングリコールと2ポリマー溶液との間に存在する界面張力の水溶液の相分離を利用しています。

水性二相系を用いた細胞の共培養パターニング

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

cell-co-culture-patterning-using-aqueous-two-phase-systems

Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.3K ビュー.  University of Michigan. 水性二相系が細胞のパターンを同時に複数の集団に使用されていました。セルパターニングのためのこの迅速かつ簡単な方法は、デキストランとポリエチレングリコールと2ポリマー溶液との間に存在する界面張力の水溶液の相分離を利用しています。

ビデオ: Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular phenomena. To address this requirement, we have developed a plasma lithography technique to manipulate the cellular microenvironment by creating a patterned surface with feature sizes ranging from 100 nm to millimeters. The goal of this technique is to be able to study, in a controlled way, the behaviors of individual cells as well as groups of cells and their interactions.
This plasma lithography method is based on selective modification of the surface chemistry on a substrate by means of shielding the contact of low-temperature plasma with a physical mold. This selective shielding leaves a chemical pattern which can guide cell attachment and movement. This pattern, or surface template, can then be used to create networks of cells whose structure can mimic that found in nature and produces a controllable environment for experimental investigations. The technique is well suited to studying biological phenomenon as it produces stable surface patterns on transparent polymeric substrates in a biocompatible manner. The surface patterns last for weeks to months and can thus guide interaction with cells for long time periods which facilitates the study of long-term cellular processes, such as differentiation and adaption. The modification to the surface is primarily chemical in nature and thus does not introduce topographical or physical interference for interpretation of results. It also does not involve any harsh or toxic substances to achieve patterning and is compatible for tissue culture. Furthermore, it can be applied to modify various types of polymeric substrates, which due to the ability to tune their properties are ideal for and are widely used in biological applications. The resolution achievable is also beneficial, as isolation of specific processes such as migration, adhesion, or binding allows for discrete, clear observations at the single to multicell level.
This method has been employed to form diverse networks of different cell types for investigations involving migration, signaling, tissue formation, and the behavior and interactions of neurons arraigned in a network.

A versatile plasma lithography technique has been developed to generate stable surface patterns for guiding cellular attachment. This technique can be applied to create cell networks including those that mimic natural tissues and has been used for studying several, distinct cell types.

細胞ネットワークの作成のためのプラズマのリソグラフィ表面パターニング

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

生物工学

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

全内部反射蛍光顕微鏡を用いた微生物のCortex組織とダイナミクスの可視化、

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

A Toolkit to Enable Hydrocarbon Conversion in Aqueous Environments

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The toolkit consists of multiple standard interchangeable parts (BioBricks)9 addressing the conversion of alkanes, regulation of gene expression and survival in toxic hydrocarbon-rich environments.
A three-step pathway for alkane degradation was implemented in E. coli to enable the conversion of medium- and long-chain alkanes to their respective alkanols, alkanals and ultimately alkanoic-acids. The latter were metabolized via the native &beta;-oxidation pathway. To facilitate the oxidation of medium-chain alkanes (C5-C13) and cycloalkanes (C5-C8), four genes (alkB2, rubA3, rubA4and rubB) of the alkane hydroxylase system from Gordonia sp. TF68,21 were transformed into E. coli. For the conversion of long-chain alkanes (C15-C36), theladA gene from Geobacillus thermodenitrificans was implemented. For the required further steps of the degradation process, ADH and ALDH (originating from G. thermodenitrificans) were introduced10,11. The activity was measured by resting cell assays. For each oxidative step, enzyme activity was observed.
To optimize the process efficiency, the expression was only induced under low glucose conditions: a substrate-regulated promoter, pCaiF, was used. pCaiF is present in E. coli K12 and regulates the expression of the genes involved in the degradation of non-glucose carbon sources.
The last part of the toolkit - targeting survival - was implemented using solvent tolerance genes, PhPFD&alpha; and &beta;, both from Pyrococcus horikoshii OT3. Organic solvents can induce cell stress and decreased survivability by negatively affecting protein folding. As chaperones, PhPFD&alpha; and &beta; improve the protein folding process e.g. under the presence of alkanes. The expression of these genes led to an improved hydrocarbon tolerance shown by an increased growth rate (up to 50%) in the presences of 10% n-hexane in the culture medium were observed.
Summarizing, the results indicate that the toolkit enables E. coli to convert and tolerate hydrocarbons in aqueous environments. As such, it represents an initial step towards a sustainable solution for oil-remediation using a synthetic biology approach.

A sustainable auto regulating bacterial system for the remediation of oil pollutions was designed using standard interchangeable DNA parts (BioBricks). An engineered E. coli strain was used to degrade alkanes via &beta;-oxidation in toxic aqueous environments. The respective enzymes from different species showed alkane degradation activity. Additionally, an increased tolerance to n-hexane was achieved by introducing genes from alkane-tolerant bacteria.

水性環境で炭化水素の変換を有効にするツールキット

This work puts forward a toolkit that enables the conversion of alkanes by Escherichia coli and presents a proof of principle of its applicability. The ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

はSiO：フォトリソグラフィによって画定されたパリレン-C上の細胞のパターニング<sub&gt; 2</sub&gt;基板

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

薬物検査のための水性二相系と癌細胞スフェロイドのロボット生産

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

3Dペーパーマイクロ流体デバイスを構築するために接着剤パターニングを使用して、

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential mechanosensing characteristics. Engineering and analysis of these tissue types remain a challenge. Layered hydrogel constructs provide an opportunity for investigating the interactions among multiple cell populations within single constructs. Alginate hydrogels are both biocompatible and allow for easy isolation of cells after experimentation. Here, we describe a method for the development of small sized dual layered alginate hydrogel discs. This process maintains high cell viability of human mesenchymal stem cells during the formation process and these layered discs can withstand unconfined cyclic compression, commonly used for stimulation of hMSCs undergoing chondrogenesis. These layered constructs can potentially be scaled up to include additional levels, and also be used to segregate cell populations initially after layering. This dual layer alginate hydrogel culture platform can be used for many different applications including engineering and analysis of cells of load bearing tissues and co-cultures of other cell types.

Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct.

階層化アルギン酸構築：異種細胞集団の共培養のためのプラットフォーム

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one particular implementation of the MFP, the hierarchical hydrodynamic flow confinement (hHFC), multiple liquids are simultaneously brought in contact with a substrate. Local chemical action and liquid shaping using the hHFC, is exploited to create cell patterns by locally lysing and removing cells. By utilizing the scanning ability of the MFP, user-defined patterns of cell monolayers are created. This protocol enables rapid, real-time and spatially controlled cell patterning, which can allow selective cell-cell and cell-matrix interaction studies.

We present a protocol to perform subtractive patterning of live cell monolayers on a surface. This is achieved by local and selective lysis of adherent cells using a microfluidic probe (MFP). The cell lysate retrieved from local regions can be used for downstream analysis, enabling molecular profiling studies.

マイクロ流体プローブとのライブの細胞層の急速なサブトラクティブパターニング

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Simple, Affordable, and Modular Patterning of Cells using DNA

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells of the same or different type, micropatterning techniques have proved useful. DNA Programmed Assembly of Cells (DPAC) is a micropatterning technique that targets the adhesion of cells to a substrate or other cells using DNA hybridization. The most basic operations in DPAC begin with decorating cell membranes with lipid-modified oligonucleotides, then flowing them over a substrate that has been patterned with complementary DNA sequences. Cells adhere selectively to the substrate only where they find a complementary DNA sequence. Non-adherent cells are washed away, revealing a pattern of adherent cells. Additional operations include further rounds of cell-substrate or cell-cell adhesion, as well as transferring the patterns formed by DPAC to an embedding hydrogel for long-term culture. Previously, methods for patterning oligonucleotides on surfaces and decorating cells with DNA sequences required specialized equipment and custom DNA synthesis, respectively. We report an updated version of the protocol, utilizing an inexpensive benchtop photolithography setup and commercially available cholesterol modified oligonucleotides (CMOs) deployed using a modular format. CMO-labeled cells adhere with high efficiency to DNA-patterned substrates. This approach can be used to pattern multiple cell types at once with high precision and to create arrays of microtissues embedded within an extracellular matrix. Advantages of this method include its high resolution, ability to embed cells into a three-dimensional microenvironment without disrupting the micropattern, and flexibility in patterning any cell type.

Here we present a protocol to micropattern cells at single-cell resolution using DNA-programmed adhesion. This protocol uses a benchtop photolithography platform to create patterns of DNA oligonucleotides on a glass slide and then labels cell membranes with commercially available complementary oligonucleotides. Hybridization of the oligos results in programmed cell adhesion.

DNAを用いた細胞のシンプル、手頃な価格、モジュール式パターニング

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells ...

Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat soft substrates that deform under cell traction (2D-TFM). TFM relies on the use of linear elastic materials, such as polydimethylsiloxane (PDMS) or polyacrylamide (PA). For 2D-TFM on PA, the difficulty in achieving high throughput results mainly from the large variability of cell shapes and tractions, calling for standardization. We present a protocol to rapidly and efficiently fabricate micropatterned PA hydrogels for 2D-TFM studies. The micropatterns are first created by maskless photolithography using near-UV light where extracellular matrix proteins bind only to the micropatterned regions, while the rest of the surface remains non-adhesive for cells. The micropatterning of extracellular matrix proteins is due to the presence of active aldehyde groups, resulting in adhesive regions of different shapes to accommodate either single cells or groups of cells. For TFM measurements, we use PA hydrogels of different elasticity by varying the amounts of acrylamide and bis-acrylamide and tracking the displacement of embedded fluorescent beads to reconstruct cell traction fields with regularized Fourier Transform Traction Cytometry (FTTC).
To further achieve precise recording of cell forces, we describe the use of a controlled dose of patterned light to release cell tractions in defined regions for single cells or groups of cells. We call this method local UV illumination traction force microscopy (LUVI-TFM). With enzymatic treatment, all cells are detached from the sample simultaneously, whereas with LUVI-TFM traction forces of cells in different regions of the sample can be recorded in sequence. We demonstrate the applicability of this protocol (i) to study cell traction forces as a function of controlled adhesion to the substrate, and (ii) to achieve a greater number of experimental observations from the same sample.

Near-UV lithography and traction force microscopy are combined to measure cellular forces on micropatterned hydrogels. The targeted light-induced release of single cells enables a high number of measurements on the same sample.

牽引力顕微鏡における応用のためのハイドロゲルパターン法を用いた細胞接着制御

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat ...