このプロトコルは、骨髄に由来し、組織因子やサイトカインにさらされたことのない刺激されていないマクロファージを大量に取得することを目的としています。この手法の主な利点は、1匹の動物から獲得した細胞の数です。正しい手順で、約2×10の7乗のマクロファージを得ることができます。
この方法は、細胞生物学、病理学、免疫学、寄生虫学などのマクロファージを研究するさまざまな分野の研究者に役立つ可能性があります。細胞は常に汚染を受けやすいため、すべての無菌ステップに注意し、層流バイオセーフティキャビネットを使用することは、細胞の生存率を維持するために必要です。手順を実演するのは、Izabela Aparecida de Souzaです。当研究室の修士課程の学生です。
適切に安楽死させた8週齢のC57BL/6野生型雄マウスで手順を開始するには、マウスを70%エタノール溶液に浸します。滅菌ハサミを使用して、腹部に沿って1センチの切開を行い、後肢の筋肉が完全に露出するまで皮膚を取り除きます。次に、大腿骨と脛骨を壊さずに、股関節の高さで後ろ足を慎重に取り外します。
無傷の後肢を70%エタノール溶液が入った円錐形の遠心分離チューブに入れます。層流バイオセーフティキャビネット内で、分離された脚を70%エタノールから滅菌PBSに移します。鉗子と消毒用ワイプを使用して、付着しているすべての筋肉と筋膜を取り除き、骨をきれいにします。
次に、滅菌済みの外科用メスの刃を使用して、両端の骨端を切断し、骨髄を露出させます。20ミリリットルの注射器に、2%ペニシリンストレプトマイシン溶液を補充した10ミリリットルの滅菌PBSを入れ、26ゲージの針を接続します。解剖鉗子を使用して片手で骨を保持します。
もう一方の手で、骨をつぶさずに慎重に針を骨腔に挿入します。次に、PBSで骨の内側を洗い流し、骨髄を滅菌済みの円錐形遠心チューブに集めます。洗浄すると、骨腔は白く見えるはずです。
採取した細胞を300G、摂氏4度で10分間遠心分離します。上清を捨て、細胞ペレットを1ミリリットルのDMEM/F1210培地に再懸濁します。懸濁液を均質化し、さらに9ミリリットルの媒体を追加して、総容量を最大10ミリリットルにします。
100ミリリットル×20ミリメートルの10個の丸いプラスチックペトリ皿のそれぞれに、前駆細胞懸濁液1ミリリットルを加えます。ピペットで細胞をプレート全体に広げて、均一な分布を得ます。次に、20%のL929細胞上清を補充した9ミリリットルのDMEM/F1210を各皿に加えます。
皿を摂氏37度と二酸化炭素5%でインキュベートします。3日目に、各皿に20%のL929細胞上清を補充した10ミリリットルのDMEM/F1210培地を追加します。得られた各皿中の20ミリリットルの培地は、成熟するまでの細胞増殖に十分です。
すべての培養皿から上清を捨てます。各培養皿を10ミリリットルの滅菌マグネシウムおよびカルシウムを含まないPBSで洗浄し、摂氏37度に予熱し、洗浄後に溶液を廃棄します。各皿に摂氏37度に予熱した3ミリリットルの非酵素細胞解離溶液を加えます。
摂氏37度と5%二酸化炭素で10分間インキュベートします。次に、倒立顕微鏡を使用して、マクロファージが細胞培養皿から解離するかどうかを視覚化します。血清学的ピペットを使用して、非酵素的細胞解離溶液で皿を洗浄し、円運動を繰り返し行い、マクロファージの完全な解離を確保します。
すべての培養皿から溶液を収集し、50ミリリットルの円錐形遠心チューブに結合します。もう一度、空の培養皿に10ミリリットルの滅菌済み温めたPBSを追加します。結合した回収溶液を含む円錐管を300G、摂氏4度で10分間遠心分離します。
上清を捨て、ペレットを1ミリリットルのDMEM / F1210で再懸濁します。.懸濁液をピペッティングして、細胞を傷つけることなくゆっくりと慎重に均質化します。10マイクロリットルのトリパンブルーを加えてマクロファージ溶液の10マイクロリットルのアリコートを希釈し、血球計算盤を使用して細胞をカウントします。
7日目には、各ディッシュは約200万個のマクロファージを産生します。L929上清からのマクロファージコロニー刺激因子への曝露は、骨髄前駆細胞を成熟マクロファージに徐々に変化させ、細胞質の伸長による典型的な広がりの形態を示した。3日目には、いくつかの未成熟マクロファージが出現し、膜突起がほとんどない典型的な丸い形の形態をしています。
彼らはプロセス全体に沿って変化しましたが、十分な数と成熟度を達成するためには7日間が必要でした。得られたマクロファージは、フローサイトメトリー解析において、サイズと粒度の点で均質な集団を示しました。さらに、集団の100%が特徴的なF480およびCD11B表面分子を発現し、単一の明確に定義された細胞集団を形成しました。
成熟した高分化型マクロファージの食作用能力は、マクロファージ内の食作用リーシュマニアの主要な寄生虫を示す蛍光顕微鏡画像によって確認されました。脚は非滅菌環境で行われ、最も重要な汚染源であるため、動物から慎重に取り外す必要があります。脚は、層流バイオセーフティキャビネットの外側で壊れてはなりません。
このプロトコルから得られた骨髄由来のマクロファージは、マクロファージの生理学を理解するために、その後マクロファージのin vitro分極を行うために使用することができる。
