ヴァシリキ Chantzara にありがとう時限とマウスの飼育のための眼科学 UCL 研究所で生物学的リソースの単位のスタッフを運ぶします。この研究は、Wellcome の信頼賞 095623/Z/11/z CR に支えられました。

すべての動物の仕事は英国ホーム オフィスおよびローカル倫理指針に従って行われました。
1. 手順とタイミングの概要
<ol><li>日 (e) 9.5 e13.5 妊娠; を入手するための調査の下で生物学的質問に答える適切な緊張から成体マウスのわれわれのタイムアウトを実行します。12-15 日が必要です。</li>
	<li>必要に応じて、準備 5-ブロモ-2'-デオキシウリジン (BrdU)/5-エチニル-2'-デオキシウリジン (EdU) ソリューション注入 (プロトコル セクション 2); を実行し、必要とする ~ 1 h 前に、の日にまたは胚分離、エドゥ/brdu 細胞標識の所望の長さに応じての日。</li>
	<li>胚単離と菱脳解剖 (プロトコル セクション 3); を実行します。必要があります 〜 10 分/胚。</li>
	<li>Wholemount 蛍光分類の (プロトコル セクション 4); を実行します。3 日間が必要です。</li>
	<li>フローティング セクション蛍光分類の (プロトコル セクション 4) を行い、vibratome を使用してセクション: 2 日間が必要です。</li>
	<li>クライオスタットを使用してセクションし、凍結切片 (プロトコル セクション 5) の蛍光標識を実行2 日間が必要です。</li>
</ol>2. BrdU とエドゥ (オプション) 妊娠中の雌マウスを注入します。
<ol><li>それぞれ BrdU または EdU を滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 10 mg/mL と 1 mg/mL の濃度で溶解します。 注意: BrdU とエドゥが毒性適切な保護具を着用します。</li>
	<li>妊娠マウスの重量を量るし、BrdU の 100 mg/kg に達するに投与されるべきである BrdU または EdU のソリューションの体積を計算または 5 mg/kg エドゥ。</li>
	<li>ラベルの必要な長さに応じて、胚を収集する前にいずれかの 1 時間または 1 日腹腔内のルートを通じて BrdU または EdU の溶液を注入します。 注: 1 h のラベル S 期に脳細胞を可視化します。1 日のために分類後脳 Npc の子孫を可視化します。</li>
</ol>3. e9.5 - e13.5 マウス胚からの Hindbrains の郭清
<ol><li>(例えば、頚部転位) 必要な妊娠段階で倫理的に承認された手順を使用してタイミング妊娠雌マウスを安楽死させます。鋭いはさみを使用して腹腔内を開いてカットし、慎重に子宮を切除します。20 mL の氷冷 PBS を含む 60 mm プラスチックの皿に胚を含む切除した子宮を配置します。 注: 無菌技術は必要ありません。</li>
	<li>解剖顕微鏡を用いたさらに郭清のすべてを実行します。鉗子数 5 の時計を使用して、胚を公開、臍帯を切断してそれぞれの胚を解放および卵黄嚢を削除する子宮の筋肉の壁を引き裂きます。</li>
	<li>滅菌パスツール ピペットを使用すると、ワイド穴の開くと、氷冷 PBS のきれいなプラスチック皿にそれぞれの胚を転送します。</li>
	<li>時計鉗子数 55 を使用すると、(図 1E) 頭を断ちます。</li>
	<li>必要に応じて、組織 (例えば卵黄嚢または約 2 mm 尾部先端の 1/4) ゲノムの DNA の隔離およびそれに続く遺伝子型解析のための小さな部分を保持します。</li>
	<li>時計鉗子数 55 を使用して、菱脳とすぐに顔面と脳組織 (図 1 階) と区別するため後脳神経上皮下に並列を含む組織を切除します。</li>
	<li>菱脳と尾側頭部組織の背側を (屋根板) の薄い組織層によって覆われている 4th心室を識別します。慎重に時計鉗子番号 55 (図 1) を使用して屋根に穴を開けるし、鉗子、中脳の正中線に沿って吻方移動で離れた余分な組織を剥離し、後部後脳と脊髄 (図 1 を尾側);菱脳は、開かれた本準備 (図 1 H) で今公開ください。</li>
	<li>Wholemount 反応 (オプション 1) の hindbrains を準備します。<ol>
<li>離れて残り頭間充織と鉗子 (図 1I) による菱脳の軟膜の側に接続されている任意の髄膜をいじめる鉗子数 55 の時計を使用して、慎重に。菱脳組織 (図 1 K) だけを残して中脳、脊髄組織 (図 1 j) を削除します。 注: のこの手順をたどることが e9.5 または e10.5、そうしようと、菱脳神経上皮; に損傷を与える可能性が高いのでさらに、髄膜を削除する必要はありません後脳神経上皮は反応のための抗体の効率的な浸透を許可するようにこの段階で十分に薄いので。この手順は、必要があります、しかし、e11.5 以降から後脳神経上皮侵入抗体を強化する、硬膜の組織を統合する際に従います。郭清は、氷冷 PBS (各脳の使用きれいな PBS) で実行すると最も簡単です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hindbrains vibratome と cryosectioning (オプション 2) を備える<ol>
<li>時計鉗子数 55 を使用して、中脳、脊髄組織 (図 1 j) を削除します。 注: 間充織と髄膜の区分 (図 1Iで示すように) のためのもの hindbrains を削除する必要はありません。</li>
	</ol>
</li>
	<li>プラスチックの皿から hindbrains を 2 mL の丸底チューブ パスツール ピペットを使用して転送、すべての PBS を吸引し、PBS に溶解したて解凍 4 %w/v ホルムアルデヒドの穏やかな撹拌 4 ° C で 2 時間修正します。 注意: ホルムアルデヒドは有毒である;適切な保護具を着用します。</li>
	<li>PBS の hindbrains 3 倍をすすいでください。反応、2-3 日以内に開始または-20° c.で長期保管のため 100% メタノールに転送する前に 5 分間 50% methanol/50% PBS と PBS を置き換えると、PBS で 4 ° C で保存します。
</li>
</ol>4. Wholemount 蛍光抗体法
<ol><li>必要な場合は、連続 5 分間室温 (RT) で (例えば75% メタノール、メタノール 50%、25% メタノール) PBS でメタノールの希釈液を減少させる hindbrains を水分補給し、PBS に転送。 注: メタノールの一連の階級は優しく hindbrains を水分補給し、適切な組織保全の確保に必要です。</li>
	<li>0.1% を含む PBS で 4 ° C で 30 分の hindbrains を permeabilize 穏やかな攪拌とトリトン X-100 (PBT)。</li>
	<li>Hindbrains 穏やかな攪拌を 10% 熱不活化ヤギ血清を含む PBT で 4 ° C で 1 時間インキュベートします。 注: は、二次抗体を上げた宿主動物種由来の血清を使用します。ヤギ、一次抗体を血清フリー孵化用蛋白質ブロック、たとえば PBS または適切な商業代替 5% ウシ血清アルブミン (材料の表を参照してください)。これは、非特定のヤギで発生した一次抗体を使用する場合に頻繁に観察された染色が低減されます。</li>
	<li>一晩で 4 ° C 1% 熱非動化血清と穏やかな攪拌と一次抗体を含む PBT hindbrains を孵化させなさい (例えばウサギ抗リン ヒストン H3 [pHH3] 希釈 1: 400)。 注: ヤギの一次抗体、血清なし PBT を使用します。</li>
	<li>4 ° c 5、hindbrains を洗う 1 h の PBT と x。</li>
	<li>一晩で PBT を含む適切な蛍光標識二次抗体 (例えばヤギ抗うさぎ Alexa Fluor 488) PBT 使用一次抗体に対してターゲットで 1: 200 で 4 ° C hindbrains を孵化させなさい。退色から蛍光物質を保護するために、ここから暗闇の中で hindbrains を維持します。 注: ヤギの一次抗体、非特定の染色を抑えるアンチ山羊二次抗体の Fab 断片を使用します。</li>
	<li>4 ° c 5、hindbrains を洗う 1 h の PBT と x。</li>
	<li>抗体の結合の長期保全のため常温 15 分 PBS で 4% ホルムアルデヒドに hindbrains を後置します。簡単に PBS で 2 回すすいでください。</li>
	<li>黒の絶縁テープの 2 つの層とガラス顕微鏡スライドをカバーし、1 つの脳を保持するために十分な大きさのポケットを作成する層状テープから小さな正方形の消費税します。</li>
	<li>パスツール ピペットでポケットにそれぞれ脳を転送、余分な液体を除去し、coverslip の下でトラップ空気泡を避けるためにガラス基板にゆっくりとそれをカバーする前にポケットに適切な antifade 試薬を追加します。Coverslip のシールやマニキュアの薄い層を使用してスライドに貼付。暗闇の中で画像の取得 (プロトコル セクション 7) まで 4 ° C でスライドを格納します。</li>
</ol>5. Vibratome 区分およびセクション蛍光をフローティング
<ol><li>必要な場合は、手順 4.1 で説明したメタノールから hindbrains を水分補給します。</li>
	<li>溶融 3% の w/v agarose 蒸留水の準備に hindbrains を埋め込みます。 注: は、後脳の熱損傷を防ぐへの埋め込み前に簡潔におよそ 55 ° C に冷却する溶解アガロースを許可します。</li>
	<li>横菱脳のセクションを vibratome を使用して 70 μ m の厚さにカットします。各転送は新鮮な氷冷 PBS を含む 24 ウェル プレートの 1 つのウェルに絵筆を持つセクションをカットしました。</li>
	<li>フローティングのセクション 4.2 4.7 の手順で説明するようにラベルを付けるが、次のように手順を変更: セクション浮動の 4 ° C で PBT と 3 x 15 分 2 h に二次抗体の孵化時間を短縮し、二次抗体室温で孵化させなさい洗浄</li>
	<li>必要に応じて、ステップ 5.4 で説明したように、他のエピトープに対する抗体のラベル付け後、ラベリング キット製造元の指示に従ってエドゥを用いたエドゥ+核を検出します。暗闇の中で 37 ° C で 30 分間カクテルの反応でフローティングのセクションを孵化させなさい。洗浄後脳は 4 ° C で 15 分 PBT と 3 x をセクションします。</li>
	<li>必要に応じて、ステップ 5.4 で説明したように、他のエピトープのラベル付け後、とおり BrdU+核を検出します。<ol>
<li>暗闇の中で 30 分の 37 ° C で 2 N 塩酸で浮動セクションを孵化させなさい。</li>
		<li>0.1 M ナトリウム ホウ酸バッファー pH 8.5 5 分各 RT で塩酸を中和するために暗闇の中での 2 回の浮動セクションを孵化させなさい。</li>
		<li>フローティングのセクション 3 簡単に x PBS で 4 ° C でを洗う</li>
		<li>蛍光 BrdU ステップ 5.4 で説明するようにラベル付けを実行します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>フローティングのセクション 10 μ g/mL 4', 6-diamidino-2-phenylindole 二塩酸塩 (DAPI) 細胞核対比染色に PBS での RT で 2 分間、インキュベートします。</li>
	<li>室温 15 分 4% のホルムアルデヒドのフローティングのセクションを後置します。</li>
	<li>簡単に PBS の浮動セクションを洗います。慎重に絵筆を使ってガラス顕微鏡スライドにフローティングのセクションを転送します。あぶらとり紙やティッシュを使用してセクションの周り余分な PBS をモップでふきます。</li>
	<li>PBS とカバーの 80% グリセロールを使用するゆっくりとガラス基板とトラップの空気の泡を避けるためにセクションをマウントします。暗闇の中で画像の取得 (ステップ 7) まで 4 ° C でスライドを格納します。</li>
</ol>6. クライオスタット切片と Cryosection 蛍光ラベリング
<ol><li>必要な場合は、手順 4.1 で説明したメタノールから hindbrains を水分補給します。</li>
	<li>Hindbrains cryoprotect hindbrains 凍結前に PBS で 30 w/v ショ糖で孵化させなさい。 注: Hindbrains、彼らは通常 ≤ 2 h は、管の底に沈んでいるときにフリーズの準備ができて e9.5 10.5 hindbrains と e11.5 13.5 hindbrains の 3-6 時間。</li>
	<li>光切断温度化合物の hindbrains (OCT) が水没し、イソペンタン-40 ° C とドライアイスで-50 ° C の間に冷却する 10 月の hindbrains を含む鋳型を転送することによってすぐにフリーズします。 注: 短期的に-20 ° C と区分まで-80 ° C 長期冷凍、組み込み hindbrains を格納できます。</li>
	<li>クライオスタットと静電剥離防止用スライドへの転送を使用して 10 μ m の厚さに横菱脳のセクションをカットします。 注: 菱脳の凍結切片は-20 ° C 短期およびラベリングまで長期的に-80 ° C で保存できます。</li>
	<li>常温 15 分スライドするセクションを乾燥するスライドを孵化させなさい。PBS の凍結切片を洗うディゾルブ 10 月とマーク PAP ペンを使って凍結切片のまわりで障壁を疎水性にします。5.4 5.8 の手順を繰り返します。</li>
	<li>5.10 グリセリンの代わりにポリビニル アルコール ベース マウント媒体を使用して手順を繰り返します。</li>
</ol>7. 画像の取得
<ol><li>画像のサンプルは、epifluorescent または水性メディア マウント スライドと反応に使用される蛍光物質に適した光学フィルターに適したレンズを搭載した共焦点レーザー走査顕微鏡を使用します。</li>
	<li>全体の脳や脳セクションをイメージするには、(例えば図 2 b); 10 倍の倍率のレンズを使用します。定量化のための hindbrains 領域を視覚化するには、倍の倍率 (例図 2 D) 個々 の細胞を可視化する、(例えば図 2) 63 x 倍率とレンズを使用する 40 を使用します。</li>
</ol>8. 代替方法
<ol><li>次のステップは、3.8、フローサイトメトリーアプリケーション15の単一細胞懸濁液を生成する固定されていない hindbrains をホモジナイズしてください。</li>
	<li>次のステップは、3.8、固定されていない hindbrains RT qPCR (例えば、 16) の単一細胞懸濁液から RNA を抽出するホモジナイズしてください。 注: すべての試薬および機器は、維持滅菌と RNase フリーで RNA の分解を防ぐために。</li>
	<li>次のステップは、3.8、Npc を分離し、体外の菱脳 NPC 動作17の分析のための神経幹細胞としてそれらを広めるに固定されていない hindbrains をホモジナイズしてください。 注: すべての試薬および機器は、維持 neurosphere 文化の細菌/真菌の汚染を防ぐために滅菌します。</li>
</ol>

<ol>
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作者が競合する利益または矛盾した興味あります。

このプロトコルでは、発達神経新生のメカニズムを研究するモデルとしてマウス胚後脳を使用する方法について説明します。さまざまな異なる反応方法を使用して、菱脳の Npc を視覚化できるし、自分の番号定量化ティッシュ セクション内またはオルガン wholemounts。郭清とフラット構造の容易さは、菱脳器官全体神経パターンに関する情報を収集する「開いた本」準備ために視覚化されることを保証します。
さらに、NPC の形態と細胞周期関連 NPC 位置フローティングで簡単に視覚化することを示す- または菱脳の凍結切片。哺乳類終20以前行った新しい前駆細胞集団を定義する両方の動作が悪用される可能性があります。たとえば、 Sox2+原基の初期形成とPax6+頂放射状グリア細胞が脳21,22、存在ですが菱脳Tbr2+基底前駆細胞3 が欠けています。.
ここで説明されているプロトコルは、ライブ イメージングや固定組織でトレースする血統の蛍光標識によって特定の NPC 集団の行動を観察することができます。たとえば、タモキシフェン誘導Sox1 iCreERT2遺伝子とRosa26tdTomato記者23運ぶマウスから hindbrains を研究することによってこの実現できます。
マウス神経新生の知識を高めるだけでなく菱脳の勉強が広く関連する神経因性機構解明、種の間で共有される菱脳が非常に節約された脳の領域と似ていると予想されるため脳よりも脊椎動物種は。
脳神経は脳神経新生23より比較的短い時間帯にわたって起こる、十分に比較する必要がある段階胚を考慮することが重要です。したがって、実験的バイアスを回避してからカウント、その後脳を分離する前に胚の体節のペアの数を記録します。菱脳組織自体は壊れやすく、ヘッド間充織と髄膜; から脳組織を分離する時、鉗子は慎重に処理するかではそのため「練習実行」のカップルをお勧めしたがって場合があります貴重な胚の解剖を試みる前に。さらに、hindbrains は、鉗子 (ピペットの開口部は清潔なハサミで先端の切断によって拡張できる) 損傷を避けるためではなく、ワイドボア パスツール ピペットを使用して別の 1 つの管から移送すべき。最後に、稀に、S 相 Npc へのエドゥ/BrdU 取り込みの範囲変数があります、特に (すなわち、1 h) 短いパルスの中に。標識を改善するためにエドゥ/BrdU を注射器にソリューションを読み込む前に正しく解散を確認、慎重に腹腔内に注入します。貧しい注射、皮下の事故によって作られたものなどで失ったり、エドゥ/BrdU 溶液をトラップと循環に入るからそれを防ぐ。

哺乳類胚発生時に Npc を '神経' と呼ばれるプロセスで新しい神経細胞を生成する心室 (VZ) と拡大神経上皮の脳室下帯 (SVZ) ゾーンに分割します。新しいニューロンとその NPC の前駆体の生成を調べた広範囲脳1、以下はこのプロセスの他の地域について知られている間。
脳は複雑な複雑に折り畳まれた構造ですティッシュ後、組織学的方法について検討している主挑戦全臓器間神経パターンになります。さらに、脳神経の研究は、必ずしも他の頭脳領域または脊髄における神経因性の動作の予測。たとえば、外側の神経節隆起がドライブ Npc の自己複製を促進する毛様体神経栄養因子と白血病の抑制的な要因に手がかりは異なる中枢神経系領域にわたって異なる応答を引き出す可能性があります信号、2脊髄前駆細胞の分化。さらに、発展途上の脳を設定し大脳皮質1の拡大に大きく貢献することが出来る npc サブ クラス欠席している菱脳と脊髄の3から。逆に、脊髄と脳を含む皮質内に存在しない代替 NPC サブタイプが考えられます。
マウス胚の脳は哺乳類の脳の進化の最も古い地域で、小脳と脳幹を生成します。種を越えたその保全、にもかかわらず比較的少し知られている NPC のサブタイプまたはその規制を含む脳神経について。マウスの脳研究の大半は、Hox 遺伝子4とポスト mitotic ニューロン5のパターニングによって駆動される、組織の細分化のプロセスを重視しています。さらに、菱脳は発達的血管新生6のメカニズムを研究するためのモデルとして使用されています。
マウス脳と対照をなしてゼブラフィッシュ脳は、NPC の分化と脊椎動物のモデル生物 (例えば,7,8) の系統の進行に従うこと広く使用されています。ひよこ菱脳は、脊椎動物の開発 (例えば9,10) における神経新生にも採用されています。ゼブラフィッシュ脳11と同様に、ひよこの後脳することができますライブ時間12上 NPC の行動と規制を勉強するイメージします。ライブ イメージングによる類似の縦断的観察は、彼らが成長するので、哺乳類で、現在可能ではありません子宮内で。エレクトロポレーションは自由生活性のゼブラフィッシュ胚またはひよこの胚内 ovo (例えば、13) に容易に適用できますが、このような技術はまたより困難でようまた、技術によって操作を対象と子宮。
それにもかかわらず、マウス胚の脳、神経を支配する分子・細胞メカニズムを定義する絶妙な適しています。まず、マウス脳の分析、多くのインスタンスで情報提供されます下等脊椎動物の勉強を通じて得られたよりも人間の発展に関連しています。さらに、遺伝子組み換えマウスの膨大な数があります、いずれかまたは使用できますマウス Npc をマッピングの運命関連遺伝子の構成または条件付き変異対立遺伝子の調節機構を変更します。最後に、最近使用されているそのマイクロインジェクション後脳室の前のヴィヴォ前駆細胞により、菱脳 NPC 速度14の簡単な検査で、少なくとも。まだ、現時点では、時空間の組織と脳全体の臓器において Npc の挙動についてほとんど知られています。
ここでは、wholemount 準備とティッシュ セクションで哺乳類の NPC の行動を分析するための強力なモデルとして菱脳を使用する簡単かつ迅速な方法を示します。我々 はさらに、定量的逆転写酵素 (qRT) などの下流分子の反応の異なる神経パラメーターを勉強してプロセスの後脳サンプルをさらに使用するプロトコルを提供-PCR。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="763">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Round-bottomed reagent tube, 2.0 ml (Safe-Lock)</td>
			<td style="width:97px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">211-2120</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Plastic cell culture dish, 60 mm</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">150288</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Cell culture plates, 12-well</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">150628</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Pasteur pipettes</td>
			<td style="width:97px;">Copan</td>
			<td style="width:119px;">200C</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Dumont Watchmaker forceps, no. 5</td>
			<td style="width:97px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">91150-20</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Dumont Watchmaker forceps, no. 55</td>
			<td style="width:97px;">FST</td>
			<td>11295-51</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">29G needle/syringe</td>
			<td style="width:97px;">BD</td>
			<td>BD Micro-Fine +1ml</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Anti-phospho-histone H3 primary antibody</td>
			<td style="width:97px;">Millipore</td>
			<td>06-570</td>
			<td style="width:291px;">Goat, dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Anti-BrdU primary antibody</td>
			<td style="width:97px;">Abcam</td>
			<td>ab6326</td>
			<td style="width:291px;">Rat, dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Anti-Ki67 primary antibody</td>
			<td style="width:97px;">BD Biosciences</td>
			<td>550609</td>
			<td style="width:291px;">Mouse, dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:257px;">Anti-RC2 primary antibody</td>
			<td style="width:97px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>RC2</td>
			<td style="width:291px;">Mouse (IgM), dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Alexa Fluor 488-conjugated goat anti rabbit secondary antibody</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A11029</td>
			<td style="width:291px;">Dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rabbit secondary antibody</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A11037</td>
			<td style="width:291px;">Dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse IgM secondary antibody</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A21042</td>
			<td style="width:291px;">Dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse secondary antibody</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A11001</td>
			<td style="width:291px;">Dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rat secondary antibody</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A11007</td>
			<td style="width:291px;">Dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D9542</td>
			<td style="width:291px;">Use at 10 &#956;g per mL</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">5-ethynyl-2&#8217;-deoxyuridine (EdU)</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">900584</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">5-bromo-2&#180;-deoxyuridine (BrdU)</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B5002</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">C10086</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Heat-inactivated goat serum</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G9023</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A7906</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">DAKO protein-block serum free</td>
			<td style="width:97px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">X0909</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T8787</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Phosphate buffer saline</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4417</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Sodium tetraborate</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B9876</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Sucrose</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S0389</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Agarose</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9539</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Super PAP pen liquid blocker</td>
			<td style="width:97px;">Ted Pella, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">22309</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">SlowFade Antifade Kit</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S-2828</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Glycerol</td>
			<td style="width:97px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10337700</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Mowiol</td>
			<td style="width:97px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">475904</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">OCT</td>
			<td style="width:97px;">Scigen</td>
			<td style="width:119px;">4583</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Isopentane</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M32631</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Methanol</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">10675112</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">10316380</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:97px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">631-0912</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Superfrost microscope slides</td>
			<td style="width:97px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">631-0108</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Thermometer</td>
			<td style="width:97px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">620-0858</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Cover glass</td>
			<td style="width:97px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">631-0137</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Stereo Microscope, Leica MZ16</td>
			<td style="width:97px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">not applicable</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Confocal laser scanning microscope&#160; LSM710</td>
			<td style="width:97px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">not applicable</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the mouse hindbrain as a model for studying embryonic neurogenesis

マウス胚の脳は、開発中に哺乳類の神経を研究するため最も一般的に使用されるシステムです。しかし、非常に折られた脳神経上皮は器官全体神経パターンを調査する wholemount 分析に従う義務があるではないです。さらに、前脳神経新生のメカニズムの定義は必ずしも脳の他の部分における神経新生の予測などにより脳固有前駆細胞サブタイプの存在。マウスの脳は、時空間分布と神経前駆細胞の挙動を観察するための切片と同様、wholemount 分析、クレームが萌芽期の神経を研究するための代替モデルを提供します。さらに、それは簡単に細胞分離や分子生物学的分析などの他のダウン ストリーム アプリケーションを解剖しました。哺乳類で発達神経新生の分子・細胞メカニズムを勉強して、強力なモデルを提供していますセル リネージュ記者となりの変異マウス系統の膨大な数のマウス脳を容易に分析できます。生物。Wholemount 準備とティッシュ セクションで哺乳類の神経前駆細胞 (NPC) 動作の分析にマウス胚の脳を使用する簡単かつ迅速な方法を紹介します。

このセクションでは、wholemount と組織の断面解析によるマウス胚脳における神経新生を勉強して得られる結果の例を示しています。
分裂マーカー pHH3 VZ (図 2 b - D) の Npc を分割を可視化するため抗体 microdissected 菱脳の wholemount の反応を示します。PHH3 を示す+ Npc 有糸分裂 (図 2) のさまざまな段階を強調する高倍率で。我々 はこの臓器 (図 2 D) NPC 細胞分裂の時間的経過を観察するための脳の開発のいくつかの連続した段階にわたって実行するこの標識方法が適しているを説明しています。
我々 は、エドゥ注射後 1 h 後脳の横カルビンディン抗体 vibratome セクションをイメージング分裂 Npc (図 3 b)、サイクリングの偽重層上皮核移行パターンの胸の谷間方向を可視化する表示します。前駆細胞18 (図 3 b, D) と VZ の全体的な構造 (図 3 b - D)。その細胞分裂の pHH3 に注意してください+ Npc が心室の表面にのみ存在とないより肺尖 (図 3) を対照前脳19でもっと努力して Npc の基底部のパターン。
また Npc とその子孫な分化をサイクリングを分類 BrdU やエドゥ NPC 系統進行 (図 4) を評価することができる方法を示します。マウス脳 BrdU のキ67 BrdU 投与後 1 日目の横の凍結切片の反応という数の神経上皮 (図 4 a, B) で Npc をサイクリングの位置と数を示しますキ67 の割合を計算することで Npc を自己更新を定義できます (図 4 a、 C) すべての BrdU+細胞の中で細胞の+ BrdU+ 。
最後に、RC2、NPC 終足 (図 5 b)、プロセス (図 5) 視覚化すること、ネスチン神経固有の中間径フィラメント内の抗原の菱脳 vibratome セクションの反応の例を示します。Vibratome セクションではなく、薄い凍結切片改良された観測高度分岐の Npc とも全体的な上皮細胞内構造を許可します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig1.jpg"> 図 1: E11.5 マウス胚から、菱脳の解剖の重要なステップです。(A - D)菱脳レーザーマイクロダイ セクションの模式図。(A) 尾側頭部組織、赤点線に沿って切断することによって削除されます。(B) 屋根板のピアスし、正中線 (垂直の赤い線) に沿って吻側と尾側方向に引き裂かし、横菱脳神経上皮を明らかにします。(C) 神経上皮は、両方の構造体の間の鉗子を挿入後髄膜から pried、中脳、脊髄の組織は赤い点線に沿って鉗子で組織を切断することによって削除されます。(D) この手順には、平坦化された脳が得られます。(E-K)菱脳レーザーマイクロダイ セクション手順で主要な段階のイメージをキャプチャします。(E) 胚は点線に沿って切断することによって首を。(F) 菱脳と屋根板で囲まれた 4th心室を切除、点線に沿って切断することによって頭から分離します。(G) 4th心室は上向きに前に小さな穴 (アスタリスク) 屋根板に穴を開けています。菱脳を公開する正中線 (矢印) に沿って尾側と吻方両方慎重に組織を剥離により穴が拡大します。菱脳は軟膜側を下に配置、左に開いた本準備にさっと (H; 黒矢印は菱脳神経組織を示します)。菱脳は wholemount 反応のために必要がある場合、(私) 鉗子を使用して周囲の硬膜の膜から脳神経を優しくこじった軟膜が削除されます。中脳 (mb) と脊髄 (sc) を過剰な組織が削除された (点線j) 後脳 (K) を分離します。スケール バー: (E) 500 μ m、300 μ m (F - K) のため。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig2.jpg"> 図 2: Wholemount 反応は菱脳の間で NPC の有糸分裂を定量化する使用ことができます。(A) 回路図は後脳室層で細胞分裂の Npc のアンの顔画像を示します。V、後脳室側。P、菱脳軟膜側。(B) タイル共焦点スキャン z スタック e10.5 後脳細胞分裂マーカー pHH3 (赤) の wholemount 反応を次の。白いボックスは、(D) で 2 番目のパネルで高倍率で表示される領域を示します。(C) 前後期 (白い矢印) と後期 (黒矢印) の核分裂像は、wholemount pHH3 の有糸分裂の Npc。 (D) 時間コース e9.5 13.5 からラベルの総コホート内で区別。スケール バー: (B) 500 μ m(C) 20 μ m(D) 100 μ m。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig3.jpg"> 図 3: 内の吻側菱脳の胚ゾーン内サイクリング Npc 。(A) の回路図が分裂 (緑) と S 期 (赤) Npc 後脳室表面と脳室周囲地区の位置をそれぞれ描いた。菱脳を介して仮想断面が右側の高倍率で表示されます。黒い矢印は、分化ゾーンに向かって細胞周期が終了した NPC の子孫の移動の方向を示します。1 h エドゥ パルス; を受信した胚から浮動 e11.0 菱脳セクションの (B) 共焦点 z スタックpHH3 とエドゥの反応は、それぞれ分裂 (緑) と S 期 (赤) Npc を視覚化に使用されました。菱脳表面は点線で示されます。V、後脳室側。P、菱脳軟膜側。はめ込み; の高倍率に白いボックスで示された領域が表示されます。矢印は、後期では、心室の表面を基準にして NPC のへき開面を示しています。(C) シングル チャネルの pHH3 反応のみを表示します。有糸分裂の Npc は水色の矢印で示されます基底部門の欠如は、Δ。 (D) 単一チャネル エドゥ ラベルのみを表示するが表示されます。エドゥ+の Npc は、胎生期のため多分布を採用します。代表的なオレンジ色の線で示される、Npc が心室の表面から移行距離を測定できます。スケール バー: 100 μ m (B -D);(B) の挿入で 10 μ m。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig4.jpg"> 図 4: 脳 NPC 自己複製能力を決定するキ67 付け組み合わせ BrdU 。キ67 (緑) と BrdU (赤) 1 翌日 BrdU パルスにラベリングした後 e10.5 菱脳 cryosection の (A) 共焦点 z スタック。心室のゾーンで二重陽性細胞は、キ67 ラベルで示された BrdU を組み込まれている、まだ細胞周期を通って動いている Npc です。BrdU+の総人口の間で二重標識細胞の割合は、自己更新 Npc。 (B、 C) の割合を表すキ67 を表示するチャンネルをシングル (B) と BrdU (C) 反応のみ。キ67 を欠いている、したがって細胞周期を終了している可能性が高い BrdU+セルは、(A、C) 水色の矢印によって示されます。菱脳表面は点線で示されます。V、後脳室側。P、菱脳軟膜側。スケール バー: 50 μ m.<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig5.jpg"> 図 5: NPC プロセスと終足特異反応を可視化します。(A - C)ネスチン神経の中間径フィラメントのエピトープを認識する RC2 の蛍光は、後脳神経上皮間 NPC 形態を示しています。次の RC2 反応; e11.5 菱脳からフローティング部 (A) 共焦点 z スタックボックス エリアに高倍率で表示されます (B、 B'; 頂/心室領域) と (C、 C'; 基底領域)。菱脳表面は点線で示されます。V、後脳室側。P、菱脳軟膜側。(B、 C)(A) でボックス化された地域の共焦点 z スタック光学セクションの一つは, (B' C')、それぞれ。心室の表面に停泊している NPC 頂 endfoot (B') の矢印で示されます。シングル、しかしいくつかの NPC プロセスで白と黒の矢印で示されます (C')、それぞれ。スケール バー: 100 μ m、(A);(B、C) の 25 μ m。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

萌芽期の神経を研究するためのモデルとしてのマウス脳

この資料では、マウス胚の脳をモデルとして使用し、全体の器官およびティッシュ セクションの準備における発達神経新生を勉強するため方法を示します。

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.9K ビュー.  UCL Institute of Ophthalmology. この資料では、マウス胚の脳をモデルとして使用し、全体の器官およびティッシュ セクションの準備における発達神経新生を勉強するため方法を示します。

ビデオ: The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish embryos, injection of plasmid DNA results in mosaic expression, allowing for the visualization of single cells or small clusters of cells 1 . We describe how injection of plasmid DNA encoding membrane-targeted Green Fluorescent Protein (mGFP) under the control of a ubiquitous promoter can be used for imaging cells undergoing neurulation. Central to this protocol is the methodology for imaging labeled cells at high resolution in sections and also in real time. This protocol entails the injection of mGFP DNA into young zebrafish embryos. Embryos are then processed for vibratome sectioning, antibody labeling and imaging with a confocal microscope. Alternatively, live embryos expressing mGFP can be imaged using time-lapse confocal microscopy. We have previously used this straightforward approach to analyze the cellular behaviors that drive neural tube formation in the hindbrain region of zebrafish embryos 2. The fixed preparations allowed for unprecedented visualization of cell shapes and organization in the neural tube while live imaging complemented this approach enabling a better understanding of the cellular dynamics that take place during neurulation.

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early embryo is the ability to image cells at high resolution. We describe here a technique for labeling single cells or small clusters of cells in whole zebrafish embryos with membrane-targeted Green Fluorescent Protein.

ゼブラフィッシュ後脳における標識およびイメージング細胞

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish ...

神経科学

A Procedure for Studying the Footshock-Induced Reinstatement of Cocaine Seeking in Laboratory Rats

The most insidious aspect of drug addiction is the high propensity for relapse. Animal models of relapse, known as reinstatement procedures, have been used extensively to study the neurobiology and phenomenology of relapse to drug use. Although procedural variations have emerged over the past several decades, the most conventional reinstatement procedures are based on the drug self-administration (SA) model. In this model, an animal is trained to perform an operant response to obtain drug. Subsequently, the behavior is extinguished by withholding response-contingent reinforcement. Reinstatement of drug seeking is then triggered by a discrete event, such as an injection of the training drug, re-exposure to drug-associated cues, or exposure to a stressor 1.
Reinstatement procedures were originally developed to study the ability of acute non-contingent exposure to the training drug to reinstate drug seeking in rats and monkeys 1, 2. Reinstatement procedures have since been modified to study the role of environmental stimuli, including drug-associated cues and exposure to various forms of stress, in relapse to drug seeking 1, 3, 4.
Over the past 15 years, a major focus of the reinstatement literature has been on the role of stress in drug relapse. One of the most commonly used forms of stress for studying this relationship is acute exposures to mild, intermittent, electric footshocks. The ability of footshock stress to induce reinstatement of drug seeking was originally demonstrated by Shaham and colleagues (1995) in rats with a history of intravenous heroin SA5. Subsequently, the effect was generalized to rats with histories of intravenous cocaine, methamphetamine, and nicotine SA, as well as oral ethanol SA 3, 6.
Although footshock-induced reinstatement of drug seeking can be achieved reliably and robustly, it is an effect that tends to be sensitive to certain parametrical variables. These include the arrangement of extinction and reinstatement test sessions, the intensity and duration of footshock stress, and the presence of drug-associated cues during extinction and testing for reinstatement. Here we present a protocol for footshock-induced reinstatement of cocaine seeking that we have used with consistent success to study the relationship between stress and cocaine seeking.

Animal models of relapse, known as reinstatement procedures, have been used extensively to study the role of stress in relapse to drug seeking. Here, we report on a method for inducing the reinstatement of cocaine seeking in laboratory rats via acute exposures to mild, intermittent electric footshock.

実験用ラットに求めてコカインのフットショック誘発性回復を勉強するための手順

The most insidious aspect of drug addiction is the high propensity for relapse.  Animal models of relapse, known as reinstatement procedures, have been ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

ニューロスフェアのアッセイを使用してマウス胎児神経幹細胞培養の確立

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. Neuroepithelial cells of the neural tube that express Nkx6.1 are the unique precursor cells for spinal motoneurons1. Though postmitotic motoneurons move towards their final position and organize themselves into columns along the spinal tract2,3. More than 90% of all these differentiated and positioned motoneurons express the transcription factors Islet 1/2. They innervate the muscles of the limbs as well as those of the body and the inner organs. Among others, motoneurons typically express the high affinity receptors for brain derived neurotrophic factor (BDNF) and Neurotrophin-3 (NT-3), the tropomyosin-related kinase B and C (TrkB, TrkC). They do not express the tropomyosin-related kinase A (TrkA)4. Beside the two high affinity receptors, motoneurons do express the low affinity neurotrophin receptor p75NTR. The p75NTR can bind all neurotrophins with similar but lower affinity to all neurotrophins than the high affinity receptors would bind the mature neurotrophins. Within the embryonic spinal cord, the p75NTR is exclusively expressed by the spinal motoneurons5. This has been used to develop motoneuron isolation techniques to purify the cells from the vast majority of surrounding cells6. Isolating motoneurons with the help of specific antibodies (panning) against the extracellular domains of p75NTR has turned out to be an expensive method as the amount of antibody used for a single experiment is high due to the size of the plate used for panning. A much more economical alternative is the use of lectin. Lectin has been shown to specifically bind to p75NTR as well7. The following method describes an alternative technique using wheat germ agglutinin for a preplating procedure instead of the p75NTR antibody. The lectin is an extremely inexpensive alternative to the p75NTR antibody and the purification grades using lectin are comparable to that of the p75NTR antibody. Motoneurons from the embryonic spinal cord can be isolated by this method, survive and grow out neurites.

An alternative way of isolating mouse embryonic motoneurons from the spinal cord is described. The method takes into account the fact that lectin can bind to the low affinity nerve growth factor receptor p75NTR. This lectin-based preplating allows a purification similar to that with a specific antibody against the p75NTR.

マウス胚の運動ニューロンのレクチンに基づく分離と文化

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C. elegans genome includes potential antipsychotic drug (APD) targets conserved in humans, including genes encoding proteins required for neurotransmitter synthesis and for synaptic structure and function. APD exposure produces developmental delay and/or lethality in nematodes in a concentration-dependent manner. These phenotypes are caused, in part, by APD-induced inhibition of pharyngeal pumping1,2. Thus, the developmental phenotype has a neuromuscular basis, making it useful for pharmacogenetic studies of neuroleptics. Here we demonstrate detailed procedures for testing APD effects on nematode development and pharyngeal pumping. For the developmental assay, synchronized embryos are placed on nematode growth medium (NGM) plates containing APDs, and the stages of developing animals are then scored daily. For the pharyngeal pumping rate assay, staged young adult animals are tested on NGM plates containing APDs. The number of pharyngeal pumps per unit time is recorded, and the pumping rate is calculated. These assays can be used for studying many other types of small molecules or even large molecules.

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Approaches for testing the effects of antipsychotic drugs (APDs) in Caenorhabditis elegans are demonstrated. Assays are described for testing drug effects on development and viability and on pharyngeal pumping rate. These methods are also applicable for pharmacogenetic experiments with drug classes other than APDs.

抗精神病薬の作用のメカニズムを研究するための方法<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

発生中のマウス胚性皮質における有糸分裂のライブイメージング

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets containing specific growth factors that trigger blood vessel growth throughout the naturally avascular cornea, angiogenesis can be measured and quantified. In this assay the angiogenic response is generated over the course of several days, depending on the type and dose of growth factor used. The induction of neovascularization is commonly triggered by either basic fibroblast growth factor (bFGF) or vascular endothelial growth factor (VEGF). By combining these growth factors with sucralfate and hydron (poly-HEMA (poly(2-hydroxyethyl methacrylate))) and casting the mixture into pellets, they can be surgically implanted in the mouse eye. These uniform pellets slowly-release the growth factors over five or six days (bFGF or VEGF respectively) enabling sufficient angiogenic response required for vessel area quantification using a slit lamp. This assay can be used for different applications, including the evaluation of angiogenic modulator drugs or treatments as well as comparison between different genetic backgrounds affecting angiogenesis. A skilled investigator after practicing this assay can implant a pellet in less than 5 min per eye.

The protocol describes the corneal micropocket assay as developed in mice.

角膜マイクロアッセイ：マウス眼における血管新生のモデル

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets ...

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering the molecular signals that cooperatively guide neuronal migration in the embryonic brain is therefore important to understand how the complex neural networks form which later support postnatal life. Facial branchiomotor (FBM) neurons in the mouse embryo hindbrain migrate from rhombomere (r) 4 caudally to form the paired facial nuclei in the r6-derived region of the hindbrain. Here we provide a detailed protocol for wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains suitable to investigate the signaling pathways that regulate FBM migration. In this method, hindbrains of E11.5 mouse embryos are dissected and cultured in an open book preparation on cell culture inserts for 24 hr. During this time, FBM neurons migrate caudally towards r6 and can be exposed to function-blocking antibodies and small molecules in the culture media or heparin beads loaded with recombinant proteins to examine roles for signaling pathways implicated in guiding neuronal migration.

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the neural tube, but migrate to reach appropriate targets. Facial branchiomotor (FBM) neurons are a useful model to study neuronal migration. This protocol describes the wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains to investigate mechanisms that regulate FBM migration.

マウス後脳<em&gt;生体外</em&gt;文化顔面Branchiomotorニューロンの移行を研究する

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional afferent fibers monitor other characteristics of the muscle environment, including metabolite buildup, temperature, and nociceptive stimuli. Overall, abnormal activation of sensory neurons can lead to movement disorders or chronic pain syndromes. We describe the isolation of the extensor digitorum longus (EDL) muscle and nerve for in vitro study of stretch-evoked afferent responses in the adult mouse. Sensory activity is recorded from the nerve with a suction electrode and individual afferents can be analyzed using spike sorting software. In vitro preparations allow for well controlled studies on sensory afferents without the potential confounds of anesthesia or altered muscle perfusion. Here we describe a protocol to identify and test the response of muscle spindle afferents to stretch. Importantly, this preparation also supports the study of other subtypes of muscle afferents, response properties following drug application and the incorporation of powerful genetic approaches and disease models in mice.

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons are involved in proprioceptor signaling and also report on metabolic state and injury related events. We describe an adult mouse in vitro muscle-nerve preparation for studies on stretch-activated muscle afferents.

アン<em&gt;体外</em筋求心性神経の焼成特性を研究するための&gt;成体マウス筋肉神経の準備

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

モデルとしての嗅覚系は、軸索の成長パターンと形態を研究する<em&gt;インビボ</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...