Wir danken Vasiliki Chantzara zur Durchführung zeitlich Paarungen und die Mitarbeiter des Referats biologische Ressourcen am UCL Institute of Ophthalmology für Maus Tierhaltung. Diese Studie wurde unterstützt durch ein Wellcome Trust Investigator Award 095623/Z/11/Z CR.

Alle tierische Arbeit wurde nach UK Home Office und lokalen ethischen Richtlinien durchgeführt.
1. Zusammenfassung der Schritte und Timing
<ol><li>Führen Sie zeitgesteuerte Paarungen erwachsener Mäuse aus einem Stamm geeignet, die biologische Frage untersuchten embryonalen Tag (e) 9,5-e13.5 Schwangerschaften zu erhalten; 12-15 Tage erfordert.</li>
	<li>Bereiten Sie optional, 5-Bromo-2'-Deoxyuridine (BrdU) / 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine (EdU) Lösung, und führen Sie Injektion (Protokoll Abschnitt 2); erfordert ~ 1 h am Vortag oder am Tag der Embryo isoliert, abhängig von der gewünschten Länge der EdU/BrdU Beschriftung.</li>
	<li>Führen Sie Embryo isoliert und Hinterhirn Dissektion (Protokoll Abschnitt 3); erfordert ~ 10 min/Embryo.</li>
	<li>Führen Sie Wholemount Immunfluoreszenz Kennzeichnung (Protokoll Abschnitt 4); 3 Tage benötigt.</li>
	<li>Abschnitt mit einer Vibratome und schwimmenden Abschnitt Immunfluoreszenz Kennzeichnung (Protokoll Abschnitt 4) durchführen: dauert 2 Tage.</li>
	<li>Abschnitt mit einem Kryostaten und führen Immunfluoreszenz Kennzeichnung von Cryosections (Protokoll Abschnitt 5); 2 Tage benötigt.</li>
</ol>2. Spritzen Sie schwangere weibliche Maus mit BrdU oder EdU (Optional)
<ol><li>Lösen Sie auf, BrdU oder EdU in sterilen Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) zu einer Konzentration von 10 mg/mL und 1 mg/mL, beziehungsweise. Achtung: BrdU und EdU sind giftig; angemessenen Schutz zu tragen.</li>
	<li>Wiegen die schwangere Maus und berechnen Sie das Volumen der BrdU oder EdU-Lösung, die verabreicht werden sollten, um 100 mg/kg BrdU zu erreichen bzw. 5 mg/kg EdU.</li>
	<li>BrdU oder EdU-Lösung durch die intraperitoneale Route entweder 1 h oder 1 Tag vor dem Sammeln der Embryonen, abhängig von der erforderlichen Länge der Beschriftung zu injizieren. Hinweis: Kennzeichnung für 1 h Hinterhirn Zellen in der S-Phase visualisiert. Kennzeichnung für 1 Tag visualisiert die Nachkommen von Hinterhirn NPCs.</li>
</ol>3. Zerlegung des Hindbrains aus e9.5 - e13.5-Maus-Embryonen
<ol><li>Einschläfern Sie eine zeitlich-schwangeren weiblichen Maus mit einem ethisch genehmigten Verfahren in der erforderlichen Schwangerschafts Stadium (z.B. zervikale Dislokation). Mit einer scharfen Schere aufschneiden der Bauchhöhle und sorgfältig Verbrauchsteuern die Gebärmutter. Legen Sie die ausgeschnittene Gebärmutter mit den Embryonen in einer 60 mm Plastikschale mit 20 mL eiskaltem PBS. Hinweis: Aseptischer Technik ist nicht erforderlich.</li>
	<li>Führen Sie alle weiteren Dissektion mit einem sezierenden Mikroskop. Verwendung von Uhrmacher Pinzette Nummer 5, reißen Sie die uterine Muskelwand zu entlarven die Embryonen, lösen Sie jedes Embryo durch die Nabelschnur durchtrennen und Entfernen der Dottersack.</li>
	<li>Mit einer sterilen Pasteurpipette mit Wide-Bohrung öffnen jedes Embryo übertragen Sie in eine saubere Kunststoff Schale mit eiskaltem PBS.</li>
	<li>Trennen Sie Uhrmacher Pinzette Nummer 55 verwenden, den Kopf (Abbildung 1E).</li>
	<li>Ein kleines Stück des Gewebes (z. B.¼ der einen Dottersack oder ca. 2 mm Schwanzspitze) für genomische DNA-Isolierung und anschließende Genotypisierung optional zu behalten.</li>
	<li>Mit Uhrmacher Pinzette Nummer 55, Verbrauchsteuern des Gewebes mit dem Hinterhirn parallel und gleich unter dem Hinterhirn Neuroepithelium es Gesichts- und Vorderhirn Gewebe (Abb. 1F) getrennt.</li>
	<li>Positionieren Sie das Hinterhirn und kaudalen Kopf Gewebe Rückenseite oben und identifizieren Sie die 4th Ventrikel, die durch eine dünne Gewebeschicht (Dach Platte) abgedeckt ist. Sorgfältig die Dach-Platte mit Uhrmacher Pinzette Nummer 55 (Abbildung 1) durchbohren und schälen entfernt überschüssiges Gewebe mit der Pinzette, das Mittelhirn, Rostral entlang der Mittellinie überfahren und dann kaudal über den hinteren Hinterhirn und des Rückenmarks (Abbildung 1 ); Das Hinterhirn sollten jetzt in ein offenes Buch-Vorbereitung (Abbildung 1 H) ausgesetzt werden.</li>
	<li>Bereiten Sie Hindbrains für Wholemount Immunolabeling (Option 1).<ol>
<li>Necken Sie mit Uhrmacher Pinzette Nummer 55, sorgfältig entfernt restlichen Kopf Mesenchym und jede Hirnhaut pial seitlich von dem Hinterhirn mit Pinzette (Abbildung 1I) befestigt. Entfernen Sie das Mittelhirn und Rückenmark Gewebe (Abbildung 1J) um nur das Hinterhirn Gewebe (Abbildung 1 K) zu verlassen. Hinweis: Dieser Schritt des Verfahrens sollte nicht bei e9.5 oder e10.5, zurückgegriffen werden, da Versuch, dazu wahrscheinlich das Hinterhirn Neuroepithelium beschädigen würde. Entfernen der Hirnhäute ist übrigens nicht erforderlich, weil das Hinterhirn Neuroepithelium zum jetzigen Zeitpunkt effiziente Eindringen von Antikörpern für Immunolabeling ausreichend dünn ist. Dieser Schritt sollte jedoch, von e11.5 ab, verfolgt werden, wenn die meningealen Gewebe festigt um Antikörper Eindringen in das Hinterhirn Neuroepithelium zu verbessern. Dissektion ist am einfachsten, wenn Sie in eiskaltem PBS (Nutzung sauber PBS für jedes Hinterhirn) durchgeführt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hindbrains für Vibratome und Kryoschneiden (Option 2) vorbereiten<ol>
<li>Mit Uhrmacher Pinzette Nummer 55, entfernen Sie das Mittelhirn und Rückenmark Gewebe (Abbildung 1J). Hinweis: Es ist nicht notwendig, Mesenchym und Hirnhäuten des Hindbrains für den Schnitt (siehe Abbildung 1I) zu entfernen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hindbrains aus der Plastikschale auf Runde Talsohle 2 mL Röhrchen mit einer Pasteurpipette übertragen, aspirieren Sie alle PBS und fix für 2 h bei 4° C mit sanft-Agitation in frisch aufgetauten 4 % w/V Formaldehyd in PBS aufgelöst. Achtung: Formaldehyd ist giftig; angemessenen Schutz zu tragen.</li>
	<li>Waschen Sie Hindbrains 3 X mal mit PBS. Bei 4 ° C mit PBS-Puffer zu speichern, wenn Immunolabeling wird innerhalb von 2-3 Tagen beginnen oder PBS mit 50 % methanol/50% PBS für 5 min ersetzen vor der Übertragung zu 100 % Methanol für eine längere Lagerung bei-20° C.
</li>
</ol>4. Wholemount Immunfluoreszenz
<ol><li>Bei Bedarf, rehydrieren Hindbrains in abnehmender seriell Verdünnungen von Methanol mit PBS-Puffer (z. B.75 % Methanol, 50 % Methanol, 25 % Methanol) bei Raumtemperatur (RT) für 5 min und dann übertragen auf PBS. Hinweis: Eine abgestufte Reihe von Methanol ist erforderlich, um sanft rehydrieren Hindbrains und richtige Gewebe Erhaltung zu gewährleisten.</li>
	<li>Permeabilize Hindbrains für 30 min bei 4 ° C in PBS mit 0,1 % Triton x-100 (PBT) mit sanften Agitation.</li>
	<li>Inkubieren Sie Hindbrains für 1 h bei 4 ° C im PBT mit 10 % Hitze-inaktivierten Ziegenserum unter schonenden rühren. Hinweis: Verwenden Sie Serum aus der Wirtsarten, denen die sekundäre Antikörper in erhoben wurden. Für Primärantikörper angehoben Ziege, brüten in serumfreien Protein blockieren, zum Beispiel 5 % Rinderserumalbumin in PBS oder eine kommerzielle Alternative (siehe Tabelle der Materialien). Dadurch verringert sich unspezifische Färbung häufig zu beobachten, wenn Sie Primärantikörper angehoben Ziege verwenden.</li>
	<li>Hindbrains über Nacht bei 4 ° C im PBT mit 1 % Hitze-inaktivierten Serum und primären Antikörper mit sanften Agitation inkubieren (z.B., Kaninchen-Anti-Phospho-Histon H3 [pHH3] verdünnt 1: 400). Hinweis: Für Primärantikörper angehoben Ziege, nutzen Sie PBT ohne Serum.</li>
	<li>Waschen Sie die Hindbrains bei 4 ° C 5 X mit PBT für 1 h.</li>
	<li>Inkubieren Sie Hindbrains über Nacht bei 4 ° C im PBT mit entsprechenden Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörper (z.B. Ziege Anti-Kaninchen Alexa Fluor 488) bei 1: 200 in PBT gezielt gegen die primäre Antikörper verwendet. Halten Sie Hindbrains in der Dunkelheit von hier aus auf Immunofluoreszenz Fluorophore schützen. Hinweis: Für Primärantikörper angehoben Ziege, verwenden Sie Anti-Ziege Fab-Fragmente der Sekundärantikörper, um unspezifische Färbung zu reduzieren.</li>
	<li>Waschen Sie die Hindbrains bei 4 ° C 5 X mit PBT für 1 h.</li>
	<li>Die Hindbrains in 4 % Formaldehyd in PBS für 15 min bei RT für dauerhafte Erhaltung der Antikörperbindung Postfix. Spülen Sie kurz zweimal mit PBS-Puffer.</li>
	<li>Decken Sie einen Glas-Objektträger mit zwei Schichten schwarzes Isolierband und Verbrauchsteuern ein kleines Quadrat aus geschichteten Band erstelle ich eine Tasche groß genug für eine Hinterhirn.</li>
	<li>Übertragen Sie jedes Hinterhirn in eine Tasche mit einer Pasteurpipette, entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit zu und fügen Sie eines entsprechenden antifade Reagenz in der Tasche vor dem abdecken es langsam mit einem Glas Deckgläschen Trapping Luftblasen unter dem Deckglas zu vermeiden hinzu. Versiegeln Sie das Deckglas und kleben Sie es auf die Folie mit einer dünnen Schicht des Nagellacks. Folie bei 4 ° C im Dunkeln bis zur Bildaufnahme (Protokoll Abschnitt 7) lagern.</li>
</ol>5. Vibratome schneiden und schwimmende Abschnitt Immunfluoreszenz
<ol><li>Falls erforderlich, rehydrieren Sie Hindbrains aus Methanol wie unter Punkt 4.1 beschrieben.</li>
	<li>Betten Sie Hindbrains in geschmolzenem 3 % w/V Agarose in destilliertem Wasser zubereitet. Hinweis: Lassen Sie flüssige Agarose auf ca. 55 ° C abkühlen, kurz vor dem Einbetten um Hinterhirn Hitzeschäden zu vermeiden.</li>
	<li>Schnitt quer Hinterhirn Abschnitten bis zu einer Dicke von 70 µm mit einer Vibratome. Übertragen Sie frisch geschnittene Abschnitte mit einem Pinsel in einen Brunnen von einer 24-Well-Platte mit eiskaltem PBS.</li>
	<li>Die schwimmenden Abschnitte zu kennzeichnen, wie in 4.2-4.7 beschrieben, aber ändern Sie die Schritte wie folgt: Waschen der schwimmenden Abschnitte bei 4 ° C 3 X mit PBT jeweils 15 min Inkubationszeit für Sekundärantikörper 2 h zu verringern und in Sekundärantikörper bei RT inkubieren</li>
	<li>Optional nach Kennzeichnung mit Antikörpern für andere Epitope, wie unter Punkt 5.4 beschrieben, EdU+ Kerne mit einer EdU labeling Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers zu erkennen. Inkubieren Sie die schwimmenden Abschnitte in der Reaktion cocktail für 30 min bei 37 ° C im Dunkeln. Waschen Hinterhirn Abschnitte 3 X mit PBT für 15 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Optional nach Kennzeichnung für andere Epitope, wie unter Punkt 5.4 beschrieben, erkennen Sie BrdU+ Kerne wie folgt.<ol>
<li>Inkubieren Sie schwimmende Abschnitte in 2 N Salzsäure bei 37 ° C für 30 Minuten im Dunkeln.</li>
		<li>Inkubieren Sie schwimmende Abschnitte in 0,1 M Natrium Borat Puffer pH 8,5 zweimal für jeweils 5 min bei RT in der Dunkelheit, die Salzsäure zu neutralisieren.</li>
		<li>Schwimmende Abschnitte 3 x kurz mit PBS-Puffer bei 4 ° c zu waschen</li>
		<li>Durchführen Sie Immunfluoreszenz labeling für BrdU wie unter Punkt 5.4 beschrieben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inkubieren Sie die schwimmenden Abschnitte für 2 min bei RT in 10 µg/mL 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride (DAPI) mit PBS-Puffer, Zellkerne Gegenfärbung.</li>
	<li>Postfix die schwimmenden Abschnitte in 4 % Formaldehyd für 15 min bei RT</li>
	<li>Waschen Sie schwimmende Abschnitte kurz in PBS. Übertragen Sie schwimmende Abschnitte sorgfältig auf einen Glas-Objektträger mit einem Pinsel. Wischen Sie überschüssiges PBS rund um den Bereich mit Löschpapier oder Gewebe.</li>
	<li>Montieren Sie Abschnitte mit 80 % Glycerin in PBS und Abdeckung langsam mit einem Glas Deckgläschen Trapping Luftblasen zu vermeiden. Folie bei 4 ° C im Dunkeln bis zur Bildaufnahme (Schritt 7) lagern.</li>
</ol>6. Kryostat schneiden und Cryosection Immunfluoreszenz Kennzeichnung
<ol><li>Falls erforderlich, rehydrieren Sie Hindbrains aus Methanol wie unter Punkt 4.1 beschrieben.</li>
	<li>Hindbrains in 30 % w/V Saccharose in PBS, Cryoprotect Hindbrains vor dem Einfrieren zu inkubieren. Hinweis: Hindbrains sind bereit für das Einfrieren, wenn sie an der Unterseite des Rohres, versenkt haben, die dauert in der Regel ≤ 2 h für e9.5-10.5 Hindbrains und 3-6 h für e11.5-13.5 Hindbrains.</li>
	<li>Tauchen Sie Hindbrains in optischen Schnitttemperatur zusammengesetzten (OCT) und frieren Sie schnell durch die Übertragung von Formen mit den Hindbrains im Okt. bis Isopentane auf-40 ° C bis-50 ° C auf Trockeneis gekühlt. Hinweis: Bei-20 ° C kurzfristig und langfristig-80 ° C bis-Schnitt können gefroren, eingebettete Hindbrains gespeichert werden.</li>
	<li>Schnitt quer Hinterhirn Abschnitten bis zu einer Dicke von 10 µm mit einem Kryostaten und Transfer zum elektrostatisch anhaftenden Objektträger. Hinweis: Hinterhirn Cryosections können bei-20 ° C kurzfristig und langfristig-80 ° C bis Kennzeichnung gespeichert werden.</li>
	<li>Inkubieren Sie Folien bei RT für 15 min Abschnitte zu den Folien zu trocknen. Cryosections mit PBS Waschen auflösen OCT und Mark eine hydrophobe Barriere rund um Cryosections mit einem PAP-Stift. Wiederholen Sie die Schritte 5.4-5.8.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 5.10 mit einem polyvinyl Alkohol basierenden Eindeckmedium anstelle von Glycerin.</li>
</ol>7. die Bildaufnahme
<ol><li>Bildbeispiele mit einem Epifluorescent oder konfokale Laserscanning-Mikroskop mit Linsen geeignet für wässrige Medien montierte Folien und optische Filter für die Fluorophore verwendet für Immunolabeling ausgestattet.</li>
	<li>Um das ganze Hinterhirn oder dem Hinterhirn Abschnitt Bild, verwenden Sie ein Objektiv für 10 X Vergrößerung (z.B. Abb. 2 b); Verwenden Sie um Hindbrains Bereiche für die Quantifizierung zu visualisieren, eine 40 X Vergrößerung (z.B. Abb. 2D) und zu visualisieren Einzelzellen, verwenden Sie ein Objektiv mit einer 63 X Vergrößerung (z.B. Abb. 2).</li>
</ol>8. alternative Methoden
<ol><li>Folgender Schritt 3,8 homogenisieren Sie unfixierten Hindbrains um eine einzelne Zelle Aufhängung für Durchflusszytometrie Anwendungen15zu produzieren.</li>
	<li>Folgender Schritt 3,8 homogenisieren Sie unfixierten Hindbrains zum Extrahieren von RNA aus einzelnen Zellsuspensionen für RT-qPCR (z.B. 16). Hinweis: Stellen Sie sicher alle Reagenzien und Geräte sind gehalten, steril und RNase-kostenlos im gesamten Abbau der RNA zu verhindern.</li>
	<li>Folgender Schritt 3,8 homogenisieren Sie unfixierten Hindbrains um NPCs zu isolieren und sie als Neurosphären für die Analyse von Hinterhirn NPC Verhalten17 in Vitro zu propagieren. Hinweis: Stellen Sie sicher alle Reagenzien und Geräte sind steril, Bakterien-/Pilzbefall Neurosphäre Kulturen zu verhindern gehalten.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wilsch-Brauninger, M., Florio, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neocortex+expansion+in+development+and+evolution+-+from+cell+biology+to+single+genes.">Neocortex expansion in development and evolution - from cell biology to single genes.</a> Curr Opin Neurobiol. 39, 122-132 (2016).</li><li>Gregg, C., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNTF/LIF/gp130+receptor+complex+signaling+maintains+a+VZ+precursor+differentiation+gradient+in+the+developing+ventral+forebrain.">CNTF/LIF/gp130 receptor complex signaling maintains a VZ precursor differentiation gradient in the developing ventral forebrain.</a> Development. 132 (3), 565-578 (2005).</li><li>Kwon, G. S., Hadjantonakis, A. 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Die Autoren keine konkurrierenden Interessen oder widersprüchliche Interessen.

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Maus embryonalen Hinterhirn als Modell verwenden, um die Mechanismen der Entwicklung Neurogenese zu studieren. Mit einer Vielzahl von verschiedenen Immunolabeling Methoden, Hinterhirn NPCs visualisiert werden und ihre Zahl quantifiziert in Gewebeschnitten oder über Orgel Wholemounts. Die Leichtigkeit der Dissektion und flache Anatomie sorgt dafür, dass das Hinterhirn in ein "offenes Buch" Vorbereitung zu sammeln Informationen über Orgel-weite Neurogenese Muster abgebildet werden kann.
Wir zeigen weiter, dass NPC Morphologie und Zellzyklus-bezogene NPC Positionierung leicht in schwimmenden visualisiert werden können- oder Cryosections von dem Hinterhirn. Beide Verhaltensweisen können ausgenutzt werden, um neue Stammvater Bevölkerungen zu definieren, wie zuvor in den Säugetieren Telencephalon20durchgeführt wurde. Zum Beispiel frühen gebildet Sox2+ Neuroepithelia und apikalen radialen Glia Pax6+ sind in das Hinterhirn21,22, aber das Hinterhirn fehlt Tbr2+ basalen Vorfahren3 .
Das hier beschriebene Protokoll kann auch zu beobachten das Verhalten von bestimmten NPC Subpopulationen von fluoreszierenden Kennzeichnung für live Imaging und/oder Linie Ablaufverfolgung in festen Gewebe angepasst werden. Dies kann beispielsweise erreicht werden, durch das Studium der Hindbrains von Mäusen mit dem Tamoxifen-induzierbaren Sox1-iCreERT2 -Transgen und Rosa26TdTomato Reporter23.
Neben der Verbesserung der Kenntnisse der murinen Neurogenese, kann studieren das Hinterhirn aufzuklären im großen und ganzen relevante neurogene Mechanismen, die über Artgrenzen, geteilt werden weil das Hinterhirn eine hoch konservierte Gehirnregion ist, die ähnlicher werden voraussichtlich zwischen Wirbeltierarten als Vorderhirn.
Da Hinterhirn Neurogenese über eine vergleichsweise kürzere Zeitfenster als Vorderhirn Neurogenese23stattfindet, ist es wichtig zu berücksichtigen, dass die Notwendigkeit für den Vergleich von ausreichend Embryonen inszeniert. Dementsprechend ist experimentelle Verzerrungen vermieden durch zählen und aufzeichnen, die Anzahl der Somiten Paare in einem Embryo vor seiner Hinterhirn zu isolieren. Das Hinterhirn Gewebe selbst ist zerbrechlich und Zange sollte deshalb sorgfältig behandelt werden, wenn das Hinterhirn Gewebe aus dem Kopf Mesenchym und Hirnhäute zu trennen; ein paar "Praxis läuft" könnte daher ratsam sein, bevor Dissektion wertvolle Embryonen versucht wird. Zudem sollten Hindbrains aus einem Rohr übertragen werden, zum anderen mit einer Pasteurpipette weite Bohrung und nicht mit einer Pinzette, um Schäden zu vermeiden (die Pipette Eröffnung durch Schneiden der Spitze mit einer sauberen Schere verbreiterbar). Zu guter Letzt kann obwohl selten, das Ausmaß der EdU/BrdU-Aufnahme in S-Phase NPCs variabel, insbesondere während kurzer (d.h., 1 h) Impulse sein. Zur Verbesserung der Kennzeichnung zu gewährleisten Sie, dass EdU/BrdU richtig aufgelöst wird, bevor Sie die Lösung in die Spritze laden und injizieren Sie sorgfältig in die Bauchhöhle. Armen Injektionen, wie Sie subkutan durch Unfall, werden verlieren oder Überfüllung der EdU/BrdU Lösung führen und verhindern, dass es in den Kreislauf.

Während der Säugetier-Embryonalentwicklung unterteilen NPCs in die ventrikuläre (VZ) und subventricular (SVZ) Zonen des expandierenden Neuroepithelium neue Neuronen in einem Prozess bezeichnet "Neurogenese" zu generieren. Die Generation der neuen Nervenzellen und deren Vorläufern NPC wurde ausgiebig im Vorderhirn1, untersucht, während weniger über diesen Prozess in anderen Regionen bekannt ist.
Das Vorderhirn ist eine komplexe und kunstvoll gefalteten Struktur, die weitgehend nach Gewebe zu schneiden, mit histologischen Methoden untersucht ist, die Verständnis Neurogenese Muster über das gesamte Organ anspruchsvoll macht. Darüber hinaus sind die Studien des Vorderhirns Neurogenese nicht unbedingt prädiktiv für neurogene Verhalten in anderen Regionen des Gehirns oder des Rückenmarks. Zum Beispiel fördern, Signaltechnik Hinweise über verschiedene CNS Regionen, unterschiedliche Reaktionen hervorrufen können, wie im Fall von ciliary Neurotrophic Factor und hemmender Faktor der Leukämie beobachtet, die Selbsterneuerung der NPCs in die seitliche ganglionic Eminenz, sondern Fahrt Differenzierung des Rückenmarks Stammväter2. Darüber hinaus eine Unterklasse von NPCs, die füllen die entwickelnden Vorderhirn und tragen wesentlich zum Ausbau der Großhirnrinde1 fehlen aus dem Hinterhirn und Rückenmark3. Umgekehrt ist es denkbar, dass das Rückenmark und Hinterhirn alternative NPC Subtypen nicht vorhanden in der Rinde enthalten.
Die Maus-Embryo-Hinterhirn ist evolutionär ältesten Umgebung: das Gehirn von Säugetieren und erzeugt das Kleinhirn und der Hirnstamm. Trotz seiner Erhaltung über Artgrenzen ist relativ wenig über Hinterhirn Neurogenese, einschließlich NPC Subtypen oder ihre Verordnung bekannt. Die Mehrheit der Hinterhirn Forschung in der Maus konzentriert sich auf den Prozess der Gewebe Segmentierung, Hox-Gene-4und die Strukturierung von Post-mitotische Neuronen5angetrieben. Darüber hinaus hat das Hinterhirn als Modell für die Untersuchung der Mechanismen der Entwicklungsbiologie Angiogenese6verwendet worden.
Im Gegensatz zu der Maus Hinterhirn wurde Zebrafisch Hinterhirn ausgiebig zur NPC Differenzierung und Abstammung Progression in vertebrate Modellorganismus (z.B.7,8) folgen. Die Küken Hinterhirn wurde auch eingesetzt, um die Neurogenese während der vertebrate Entwicklung (z.B.9,10) zu studieren. Ähnlich wie bei der Zebrafisch Hinterhirn11, kann die Küken Hinterhirn spannungsführend sein abgebildet um NPC Verhalten und Verordnung über Zeit12zu studieren. Analog longitudinale Beobachtung von live Imaging kann nicht derzeit in Säugetieren Organismen, weil sie entwickeln in der Gebärmutter. Darüber hinaus gezielte Manipulation durch Techniken wie Elektroporation ohne weiteres auf freilebende Zebrafish Embryos oder Küken Embryonen in Ovo (z.B.13) angewendet werden kann, aber diese Techniken auch anspruchsvoller in sind Utero.
Dennoch eignet sich die Maus Embryo Hinterhirn exquisit, die molekularen und zellulären Mechanismen zu definieren, die Neurogenese regieren. Erstens, Analyse der Maus Hinterhirn in vielen Fällen liefern Informationen, die für Menschen Entwicklungen relevanter als die durch das Studium der unteren Wirbeltiere erhalten ist. Darüber hinaus gibt es eine Vielzahl von genetisch veränderte Mausstämme, dass entweder für Schicksal mapping murinen NPCs oder Regulationsmechanismen mit konstitutiven oder bedingte mutierten Allele Gene verändern verwendet werden kann. Schließlich, es wurde kürzlich gezeigt, dass Mikroinjektion von ventrikulären Hinterhirn Stammväter ex Vivo ermöglicht zumindest eine kurze Prüfung von Hinterhirn NPC Kinetik14. Noch heute ist sehr wenig bekannt über die räumlich-zeitliche Organisation und das Verhalten von Hinterhirn NPCs in einem Kontext des gesamten Organs.
Hier zeigen wir eine einfache und schnelle Methode um das Hinterhirn als ein leistungsfähiges Modell für die Analyse von Säugetieren NPC Verhalten in Wholemount Vorbereitungen und Gewebeschnitte zu verwenden. Wir bieten weitere Protokolle, um Immunolabeling nutzen für das Studium verschiedener Neurogenese Parameter und Prozessproben Hinterhirn weiter für nachgeschaltete molekularen Anwendungen wie quantitative Reverse Transkriptase (qRT)-PCR.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="763">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Round-bottomed reagent tube, 2.0 ml (Safe-Lock)</td>
			<td style="width:97px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">211-2120</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Plastic cell culture dish, 60 mm</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">150288</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Cell culture plates, 12-well</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">150628</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Pasteur pipettes</td>
			<td style="width:97px;">Copan</td>
			<td style="width:119px;">200C</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Dumont Watchmaker forceps, no. 5</td>
			<td style="width:97px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">91150-20</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Dumont Watchmaker forceps, no. 55</td>
			<td style="width:97px;">FST</td>
			<td>11295-51</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">29G needle/syringe</td>
			<td style="width:97px;">BD</td>
			<td>BD Micro-Fine +1ml</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Anti-phospho-histone H3 primary antibody</td>
			<td style="width:97px;">Millipore</td>
			<td>06-570</td>
			<td style="width:291px;">Goat, dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Anti-BrdU primary antibody</td>
			<td style="width:97px;">Abcam</td>
			<td>ab6326</td>
			<td style="width:291px;">Rat, dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Anti-Ki67 primary antibody</td>
			<td style="width:97px;">BD Biosciences</td>
			<td>550609</td>
			<td style="width:291px;">Mouse, dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:257px;">Anti-RC2 primary antibody</td>
			<td style="width:97px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>RC2</td>
			<td style="width:291px;">Mouse (IgM), dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Alexa Fluor 488-conjugated goat anti rabbit secondary antibody</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A11029</td>
			<td style="width:291px;">Dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rabbit secondary antibody</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A11037</td>
			<td style="width:291px;">Dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse IgM secondary antibody</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A21042</td>
			<td style="width:291px;">Dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse secondary antibody</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A11001</td>
			<td style="width:291px;">Dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rat secondary antibody</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A11007</td>
			<td style="width:291px;">Dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D9542</td>
			<td style="width:291px;">Use at 10 &#956;g per mL</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">5-ethynyl-2&#8217;-deoxyuridine (EdU)</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">900584</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">5-bromo-2&#180;-deoxyuridine (BrdU)</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B5002</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">C10086</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Heat-inactivated goat serum</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G9023</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A7906</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">DAKO protein-block serum free</td>
			<td style="width:97px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">X0909</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T8787</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Phosphate buffer saline</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4417</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Sodium tetraborate</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B9876</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Sucrose</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S0389</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Agarose</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9539</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Super PAP pen liquid blocker</td>
			<td style="width:97px;">Ted Pella, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">22309</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">SlowFade Antifade Kit</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S-2828</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Glycerol</td>
			<td style="width:97px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10337700</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Mowiol</td>
			<td style="width:97px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">475904</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">OCT</td>
			<td style="width:97px;">Scigen</td>
			<td style="width:119px;">4583</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Isopentane</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M32631</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Methanol</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">10675112</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">10316380</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:97px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">631-0912</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Superfrost microscope slides</td>
			<td style="width:97px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">631-0108</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Thermometer</td>
			<td style="width:97px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">620-0858</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Cover glass</td>
			<td style="width:97px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">631-0137</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Stereo Microscope, Leica MZ16</td>
			<td style="width:97px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">not applicable</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Confocal laser scanning microscope&#160; LSM710</td>
			<td style="width:97px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">not applicable</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the mouse hindbrain as a model for studying embryonic neurogenesis

Die Maus-Embryo Vorderhirn ist die am meisten verwendeten System für das Studium von Säugetieren Neurogenese während der Entwicklung. Stark gefaltete Vorderhirn Neuroepithelium ist jedoch nicht zu Wholemount Analyse, Orgel-weite Neurogenese Muster zu untersuchen. Definieren die Mechanismen des Vorderhirns Neurogenese ist übrigens nicht unbedingt prädiktive der Neurogenese in anderen Teilen des Gehirns; zum Beispiel durch das Vorhandensein des Vorderhirns-spezifische Stammvater Subtypen. Die Maus Hinterhirn bietet ein alternatives Modell zur Erforschung embryonaler Neurogenese, die zu Wholemount Analyse sowie Gewebeschnitte, die räumlich-zeitliche Verteilung und das Verhalten von neuronalen Vorläuferzellen zu beobachten ist. Darüber hinaus ist es leicht für andere nachgeschaltete Anwendungen wie Isolation oder Molekularbiologie Zellanalyse seziert. Wie die Maus Hinterhirn leicht analysiert werden kann in die überwiegende Zahl der Zelle Abstammung Reporter und mutierte Maus-Stämmen, die verfügbar geworden sind, bietet es ein leistungsfähiges Modell für die Erforschung der zellulären und molekularen Mechanismen der Entwicklungsbiologie Neurogenese in einem Säugetier Organismus. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache und schnelle Methode, um die Maus Embryo Hinterhirn nutzen zur Auswertung von Säugetieren neuronalen Vorläuferzellen Zelle (NPC) Verhalten in Wholemount Vorbereitungen und Gewebeschnitte.

Dieser Abschnitt zeigt Beispiele für Ergebnisse, die bei der Neurogenese in der Maus embryonalen Hinterhirn durch Wholemount und Gewebe Abschnitt Analyse Untersuchung gewonnen werden können.
Wir zeigen, dass Wholemount Immunolabeling der Microdissected Hinterhirn mit einem Antikörper für die mitotische Marker pHH3 visualisiert NPCs in der VZ ( – Abbildung 2 b D) dividiert. Wir zeigen pHH3+ NPCs bei hoher Vergrößerung, verschiedene Stadien der Mitose (Abbildung 2) hervorzuheben. Wir haben gezeigt, die diese Kennzeichnung Methode ist geeignet, um in mehreren aufeinander folgenden Phasen des Hinterhirn Entwicklung zu beobachten, den zeitlichen Verlauf der NPC Mitose in diesem Organ (Abb. 2D) durchgeführt werden.
Wir zeigen, dass imaging quer Immunolabeled Vibratome Abschnitte von Hinterhirn 1 h nach der Injektion der EdU, visualisiert die Spaltung Ausrichtung der mitotischen NPCs (Abb. 3 b), pseudostratified, interkinetic nuklearen Migration Muster des Radsports Stammväter18 (Abb. 3 b, D), und die allgemeine VZ-Struktur (Abb. 3 b – D). Beachten Sie, dass mitotischen pHH3+ NPCs sind nur an der ventrikulären Oberfläche und nicht mehr basaler (Abbildung 3), die Kontraste der basalen Bereich Muster engagiertere NPCs im Vorderhirn19.
Wir zeigen auch, wie Radfahren, NPCs und deren differenzierten Nachkommen mit BrdU oder EdU NPC Linie Fortschreiten (Abbildung 4) zu bewerten bezeichnet werden kann. Die Immunolabeling quer Cryosections der Maus Hinterhirn 1 Tag nach der Injektion von BrdU für BrdU und Ki67zeigt die Anzahl und Positionierung des Radsports NPCs in der Neuroepithelium (Abb. 4A, B), wobei der Anzahl der selbst erneuern NPCs kann definiert werden, durch die Berechnung des Anteils des Ki67+ + BrdU Zellen unter allen BrdU+ Zellen (Abbildung 4A, C).
Zu guter Letzt zeigen wir ein Beispiel für Immunolabeling Hinterhirn Vibratome Abschnitte für RC2, ein Antigen in der neuronalen-spezifische intermediate Filament nestin, um NPC Endfeet (Abb. 5 b) und Prozesse (Abbildung 5) zu visualisieren. Vibratome Abschnitte, sondern als dünne Cryosections ermöglichen bessere Beobachtung der stark verzweigte NPCs und auch der Gesamtstruktur Gliazellen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig1.jpg"> Abbildung 1 : Wichtige Schritte in die Dissektion der ein Hinterhirn aus dem e11.5-Maus-Embryo. (A – D) Schematische Darstellung der Hinterhirn Mikrodissektion. (A) der kaudalen Kopf Gewebe wird durch Durchtrennung entlang der roten gepunkteten Linien entfernt. (B) die Dach-Platte ist durchbohrt und dann weggerissen in rostral und kaudalen Richtungen entlang der Mittellinie (vertikale rote Linie) und dann seitlich auf dem Hinterhirn Neuroepithelium offenbaren. (C) die Neuroepithelium ist von der Hirnhaut nach dem Einlegen der Zange zwischen beiden Strukturen aufgebrochen, und das Mittelhirn und Rückenmark Gewebe werden durch Abtrennen des Gewebes mit der Zange an den rot gestrichelten Linien entfernt. (D) dieses Verfahren ergibt eine abgeflachte Hinterhirn. (E–K) Bilderfassung von Schlüsselstellen im Hinterhirn Mikrodissektion Verfahren. (E) des Embryos wird durch Abtrennen entlang der gestrichelten Linie geköpft. (F) das Hinterhirn 4th Ventrikel, umgeben von der Dach-Platte herausgeschnitten und durch Durchtrennung entlang der gestrichelten Linien vom Kopf getrennt. (G) orientiert sich die 4th Ventrikel nach oben bevor ein kleines Loch in die Dach-Platte (Sternchen) durchbohrt ist. Das Loch wird erweitert durch schälen das Gewebe vorsichtig sowohl Rostral und kaudal entlang der Mittellinie (Pfeile), dem Hinterhirn verfügbar zu machen. Das Hinterhirn ist positionierte pial Seite nach unten und links in ein offenes Buch-Vorbereitung, Falten (H; schwarze Pfeilspitze zeigt Hinterhirn Nervengewebe). Wenn das Hinterhirn für Wholemount Immunolabeling erforderlich ist, wird die pial Membran durch sanft neugierigen Hinterhirn Neuroepithelium aus den umliegenden meningealen Membranen mit Pinzette (ich) entfernt. Überschüssige Mittelhirn (mb) und Rückenmark (sc) Gewebe wird entfernt (gepunktete Linien in J), das Hinterhirn (K) zu isolieren. Maßstabsleiste: 500 µm für (E), 300 µm (F – K). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig2.jpg"> Abbildung 2 : Wholemount Immunolabeling kann verwendet werden, um die NPC Mitosen über das Hinterhirn quantifizieren. (A) schematische Darstellung En face Bildgebung der mitotischen NPCs im Hinterhirn ventrikuläre Layer. V, ventrikuläre Hinterhirn Seite; P, pial Hinterhirn Seite. (B) konfokale Fliese Scan Z-Stapel von e10.5 Hinterhirn nach Wholemount Immunolabeling für die mitotische Marker pHH3 (rot). Das weiße Feld zeigt den Bereich bei höherer Vergrößerung im zweiten Panel (D) gezeigt. (C) Pre-Anaphase (weiße Pfeilspitze) und Anaphase (schwarze Pfeilspitze) mitotischen Figuren unterscheiden sich innerhalb der insgesamt Kohorte der mitotischen NPCs. (D) zeitlichen Verlauf der Wholemount pHH3 aus e9.5-13.5 Kennzeichnung. Skalieren Sie Bars: 500 µm (B); 20 µm (C); 100 µm (D). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig3.jpg"> Abbildung 3 : Radsport NPCs innerhalb ihrer germinal-Zone in die rostral Hinterhirn. (A) schematische Darstellung der Position der mitotischen (grün) und S-Phase (rot) NPCs an der Hinterhirn ventrikuläre Oberfläche und in der periventrikulären Region, beziehungsweise. Ein virtuelle Querschnitt durch das Hinterhirn ist bei höherer Vergrößerung auf der rechten Seite angezeigt. Der schwarze Pfeil zeigt die Richtung der Migration der NPC-nachkommen, die den Zellzyklus in Richtung der Differenzierung Zone verlassen haben. (B) konfokale Z Stack eines schwimmenden 11,0 Hinterhirn Abschnitts aus dem Embryo, der einen 1 h EdU Puls erhalten; Immunolabeling für pHH3 und EdU wurde zur mitotischen (grün) und S-Phase (rot) NPCs, bzw. zu visualisieren. Hinterhirn Oberflächen werden durch punktierte Linien gekennzeichnet; V, ventrikuläre Hinterhirn Seite; P, pial Hinterhirn Seite. Der Bereich durch ein weißes Feld angegeben wird bei höherer Vergrößerung im Einschub dargestellt; Pfeile zeigen die Spaltung Flugzeug von einem NPC in Anaphase, relativ zur linksventrikulären Oberfläche. (C) Einkanal anzeigen pHH3 Immunolabeling nur. Mitotische NPCs sind durch Cyan Pfeilspitzen angezeigt; das Fehlen der basalen Divisionen wird durch Δ. (D) Einkanal EdU Kennzeichnung nur anzeigen angezeigt. EdU+ NPCs annehmen eine pseudostratified Verteilung aufgrund ihrer interkinetic nuklearen Migration. Die Distanz, die NPCs Weg von der ventrikulären Oberfläche migrieren kann gemessen werden, wie mit einer repräsentativen orange Linie angegeben. Skalieren Sie Bars: 100 µm im (B -D); 10 µm im Einschub in (B). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig4.jpg"> Abbildung 4 : Kombination von BrdU mit Ki67 Kennzeichnung Hinterhirn NPC Selbsterneuerung Kapazität ermitteln. (A) konfokale Z-Stapel von ein e10.5 Hinterhirn Cryosection nach Kennzeichnung für Ki67 (grün) und BrdU (rot) nach einem 1 Tag BrdU Puls. Doppel-positiven Zellen in der ventrikulären Zone sind NPCs, die BrdU aufgenommen haben und immer noch bewegen sich durch den Zellzyklus, wie von Ki67 Kennzeichnung angegeben. Der Anteil der Doppel-markierten Zellen unter der Gesamtbevölkerung BrdU+ stellt den Prozentsatz der selbst erneuernde NPCs. (B, C) einzelne Kanäle anzeigen Ki67 (B) und (C) BrdU Immunolabeling nur. Eine BrdU+ -Zelle, die Ki67 fehlt und daher wurde wahrscheinlich beendet den Zellzyklus wird durch eine Cyan Pfeilspitze in (A,C). Hinterhirn Oberflächen werden durch punktierte Linien gekennzeichnet; V, ventrikuläre Hinterhirn Seite; P, pial Hinterhirn Seite. Maßstabsleiste: 50 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig5.jpg"> Abbildung 5 : Nestin Immunolabeling visualisiert NPC Prozesse und Endfeet. (A – C) Immunfluoreszenz für RC2, die ein Epitop auf das neuronale intermediate Filament nestin erkennt, zeigt NPC Morphologie über das Hinterhirn Neuroepithelium. (A) konfokale Z-Stapel von schwimmenden Ausschnitt aus einem e11.5 Hinterhirn nach RC2 Immunolabeling; geschachtelte Bereiche werden bei höherer Vergrößerung in angezeigt (B, B'; apikale/ventrikuläre Region) und (C, C'; basale Region). Hinterhirn Oberflächen werden durch punktierte Linien gekennzeichnet; V, ventrikuläre Hinterhirn Seite; P, pial Hinterhirn Seite. (B, C) Konfokale Z-Stapel von geschachtelte Bereiche in (A); einzigen optischen Abschnitte werden in gezeigt (B', C'), beziehungsweise. Ein NPC apikalen Endfoot verankert an der ventrikulären Oberfläche wird durch einen Pfeil (B') angezeigt. Einzel- und fasciculated NPC-Prozesse sind gekennzeichnet durch weiße und schwarze Pfeilspitzen in (C'), beziehungsweise. Skalieren Sie Bars: 100 µm, (A); 25 µm (B, C). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

Die Maus Hinterhirn als Modell für die Erforschung embryonaler Neurogenese

Dieser Artikel beschreibt, wie die Maus embryonalen Hinterhirn als Modell für das Studium Entwicklungsstörungen Neurogenese im gesamten Organ und Gewebe Abschnitt Vorbereitungen verwendet werden kann.

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.9K Aufrufe.  UCL Institute of Ophthalmology. Dieser Artikel beschreibt, wie die Maus embryonalen Hinterhirn als Modell für das Studium Entwicklungsstörungen Neurogenese im gesamten Organ und Gewebe Abschnitt Vorbereitungen verwendet werden kann.

Serie: The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish embryos, injection of plasmid DNA results in mosaic expression, allowing for the visualization of single cells or small clusters of cells 1 . We describe how injection of plasmid DNA encoding membrane-targeted Green Fluorescent Protein (mGFP) under the control of a ubiquitous promoter can be used for imaging cells undergoing neurulation. Central to this protocol is the methodology for imaging labeled cells at high resolution in sections and also in real time. This protocol entails the injection of mGFP DNA into young zebrafish embryos. Embryos are then processed for vibratome sectioning, antibody labeling and imaging with a confocal microscope. Alternatively, live embryos expressing mGFP can be imaged using time-lapse confocal microscopy. We have previously used this straightforward approach to analyze the cellular behaviors that drive neural tube formation in the hindbrain region of zebrafish embryos 2. The fixed preparations allowed for unprecedented visualization of cell shapes and organization in the neural tube while live imaging complemented this approach enabling a better understanding of the cellular dynamics that take place during neurulation.

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early embryo is the ability to image cells at high resolution. We describe here a technique for labeling single cells or small clusters of cells in whole zebrafish embryos with membrane-targeted Green Fluorescent Protein.

Labeling und Imaging Cells in der Zebrafisch Hinterhirn

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish ...

Forschung

Neurowissenschaften

A Procedure for Studying the Footshock-Induced Reinstatement of Cocaine Seeking in Laboratory Rats

The most insidious aspect of drug addiction is the high propensity for relapse. Animal models of relapse, known as reinstatement procedures, have been used extensively to study the neurobiology and phenomenology of relapse to drug use. Although procedural variations have emerged over the past several decades, the most conventional reinstatement procedures are based on the drug self-administration (SA) model. In this model, an animal is trained to perform an operant response to obtain drug. Subsequently, the behavior is extinguished by withholding response-contingent reinforcement. Reinstatement of drug seeking is then triggered by a discrete event, such as an injection of the training drug, re-exposure to drug-associated cues, or exposure to a stressor 1.
Reinstatement procedures were originally developed to study the ability of acute non-contingent exposure to the training drug to reinstate drug seeking in rats and monkeys 1, 2. Reinstatement procedures have since been modified to study the role of environmental stimuli, including drug-associated cues and exposure to various forms of stress, in relapse to drug seeking 1, 3, 4.
Over the past 15 years, a major focus of the reinstatement literature has been on the role of stress in drug relapse. One of the most commonly used forms of stress for studying this relationship is acute exposures to mild, intermittent, electric footshocks. The ability of footshock stress to induce reinstatement of drug seeking was originally demonstrated by Shaham and colleagues (1995) in rats with a history of intravenous heroin SA5. Subsequently, the effect was generalized to rats with histories of intravenous cocaine, methamphetamine, and nicotine SA, as well as oral ethanol SA 3, 6.
Although footshock-induced reinstatement of drug seeking can be achieved reliably and robustly, it is an effect that tends to be sensitive to certain parametrical variables. These include the arrangement of extinction and reinstatement test sessions, the intensity and duration of footshock stress, and the presence of drug-associated cues during extinction and testing for reinstatement. Here we present a protocol for footshock-induced reinstatement of cocaine seeking that we have used with consistent success to study the relationship between stress and cocaine seeking.

Animal models of relapse, known as reinstatement procedures, have been used extensively to study the role of stress in relapse to drug seeking. Here, we report on a method for inducing the reinstatement of cocaine seeking in laboratory rats via acute exposures to mild, intermittent electric footshock.

Ein Verfahren zur Untersuchung der Fußschock-Induced Wiedereinsetzung von Kokain suche in Laborratten

The most insidious aspect of drug addiction is the high propensity for relapse.  Animal models of relapse, known as reinstatement procedures, have been ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

Gründung Embryonale Maus Neural Stem Cell Culture Mit dem Neurosphäre Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. Neuroepithelial cells of the neural tube that express Nkx6.1 are the unique precursor cells for spinal motoneurons1. Though postmitotic motoneurons move towards their final position and organize themselves into columns along the spinal tract2,3. More than 90% of all these differentiated and positioned motoneurons express the transcription factors Islet 1/2. They innervate the muscles of the limbs as well as those of the body and the inner organs. Among others, motoneurons typically express the high affinity receptors for brain derived neurotrophic factor (BDNF) and Neurotrophin-3 (NT-3), the tropomyosin-related kinase B and C (TrkB, TrkC). They do not express the tropomyosin-related kinase A (TrkA)4. Beside the two high affinity receptors, motoneurons do express the low affinity neurotrophin receptor p75NTR. The p75NTR can bind all neurotrophins with similar but lower affinity to all neurotrophins than the high affinity receptors would bind the mature neurotrophins. Within the embryonic spinal cord, the p75NTR is exclusively expressed by the spinal motoneurons5. This has been used to develop motoneuron isolation techniques to purify the cells from the vast majority of surrounding cells6. Isolating motoneurons with the help of specific antibodies (panning) against the extracellular domains of p75NTR has turned out to be an expensive method as the amount of antibody used for a single experiment is high due to the size of the plate used for panning. A much more economical alternative is the use of lectin. Lectin has been shown to specifically bind to p75NTR as well7. The following method describes an alternative technique using wheat germ agglutinin for a preplating procedure instead of the p75NTR antibody. The lectin is an extremely inexpensive alternative to the p75NTR antibody and the purification grades using lectin are comparable to that of the p75NTR antibody. Motoneurons from the embryonic spinal cord can be isolated by this method, survive and grow out neurites.

An alternative way of isolating mouse embryonic motoneurons from the spinal cord is described. The method takes into account the fact that lectin can bind to the low affinity nerve growth factor receptor p75NTR. This lectin-based preplating allows a purification similar to that with a specific antibody against the p75NTR.

Lectin-basierte Isolierung und Kultivierung von embryonalen Maus-Motoneuronen

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C. elegans genome includes potential antipsychotic drug (APD) targets conserved in humans, including genes encoding proteins required for neurotransmitter synthesis and for synaptic structure and function. APD exposure produces developmental delay and/or lethality in nematodes in a concentration-dependent manner. These phenotypes are caused, in part, by APD-induced inhibition of pharyngeal pumping1,2. Thus, the developmental phenotype has a neuromuscular basis, making it useful for pharmacogenetic studies of neuroleptics. Here we demonstrate detailed procedures for testing APD effects on nematode development and pharyngeal pumping. For the developmental assay, synchronized embryos are placed on nematode growth medium (NGM) plates containing APDs, and the stages of developing animals are then scored daily. For the pharyngeal pumping rate assay, staged young adult animals are tested on NGM plates containing APDs. The number of pharyngeal pumps per unit time is recorded, and the pumping rate is calculated. These assays can be used for studying many other types of small molecules or even large molecules.

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Approaches for testing the effects of antipsychotic drugs (APDs) in Caenorhabditis elegans are demonstrated. Assays are described for testing drug effects on development and viability and on pharyngeal pumping rate. These methods are also applicable for pharmacogenetic experiments with drug classes other than APDs.

Methoden zur Untersuchung der Wirkmechanismen von Psychopharmaka in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Live-Imaging der Mitose in der Entwicklung von embryonalen Maus-Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets containing specific growth factors that trigger blood vessel growth throughout the naturally avascular cornea, angiogenesis can be measured and quantified. In this assay the angiogenic response is generated over the course of several days, depending on the type and dose of growth factor used. The induction of neovascularization is commonly triggered by either basic fibroblast growth factor (bFGF) or vascular endothelial growth factor (VEGF). By combining these growth factors with sucralfate and hydron (poly-HEMA (poly(2-hydroxyethyl methacrylate))) and casting the mixture into pellets, they can be surgically implanted in the mouse eye. These uniform pellets slowly-release the growth factors over five or six days (bFGF or VEGF respectively) enabling sufficient angiogenic response required for vessel area quantification using a slit lamp. This assay can be used for different applications, including the evaluation of angiogenic modulator drugs or treatments as well as comparison between different genetic backgrounds affecting angiogenesis. A skilled investigator after practicing this assay can implant a pellet in less than 5 min per eye.

The protocol describes the corneal micropocket assay as developed in mice.

Die Hornhaut-Mikrotest: Ein Modell der Angiogenese bei der Maus Augen

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets ...

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering the molecular signals that cooperatively guide neuronal migration in the embryonic brain is therefore important to understand how the complex neural networks form which later support postnatal life. Facial branchiomotor (FBM) neurons in the mouse embryo hindbrain migrate from rhombomere (r) 4 caudally to form the paired facial nuclei in the r6-derived region of the hindbrain. Here we provide a detailed protocol for wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains suitable to investigate the signaling pathways that regulate FBM migration. In this method, hindbrains of E11.5 mouse embryos are dissected and cultured in an open book preparation on cell culture inserts for 24 hr. During this time, FBM neurons migrate caudally towards r6 and can be exposed to function-blocking antibodies and small molecules in the culture media or heparin beads loaded with recombinant proteins to examine roles for signaling pathways implicated in guiding neuronal migration.

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the neural tube, but migrate to reach appropriate targets. Facial branchiomotor (FBM) neurons are a useful model to study neuronal migration. This protocol describes the wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains to investigate mechanisms that regulate FBM migration.

Maus-Hinterhirn<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kultur zu Gesichts Branchiomotor Neuron Migrationsstudie

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional afferent fibers monitor other characteristics of the muscle environment, including metabolite buildup, temperature, and nociceptive stimuli. Overall, abnormal activation of sensory neurons can lead to movement disorders or chronic pain syndromes. We describe the isolation of the extensor digitorum longus (EDL) muscle and nerve for in vitro study of stretch-evoked afferent responses in the adult mouse. Sensory activity is recorded from the nerve with a suction electrode and individual afferents can be analyzed using spike sorting software. In vitro preparations allow for well controlled studies on sensory afferents without the potential confounds of anesthesia or altered muscle perfusion. Here we describe a protocol to identify and test the response of muscle spindle afferents to stretch. Importantly, this preparation also supports the study of other subtypes of muscle afferents, response properties following drug application and the incorporation of powerful genetic approaches and disease models in mice.

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons are involved in proprioceptor signaling and also report on metabolic state and injury related events. We describe an adult mouse in vitro muscle-nerve preparation for studies on stretch-activated muscle afferents.

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Adult Maus Muskel-Nerven Vorbereitung für das Studium der Brenneigenschaften des Muskel-Afferenzen

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

Das olfaktorische System als Modell zur Axonal Wachstumsmuster und Morphologie Studieren<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Die Maus Hinterhirn als Modell für die Erforschung embryonaler Neurogenese

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Labeling und Imaging Cells in der Zebrafisch Hinterhirn

Ein Verfahren zur Untersuchung der Fußschock-Induced Wiedereinsetzung von Kokain suche in Laborratten

Gründung Embryonale Maus Neural Stem Cell Culture Mit dem Neurosphäre Assay

Lectin-basierte Isolierung und Kultivierung von embryonalen Maus-Motoneuronen

Methoden zur Untersuchung der Wirkmechanismen von Psychopharmaka in

Live-Imaging der Mitose in der Entwicklung von embryonalen Maus-Cortex

Die Hornhaut-Mikrotest: Ein Modell der Angiogenese bei der Maus Augen

Maus-Hinterhirn

Ein

Das olfaktorische System als Modell zur Axonal Wachstumsmuster und Morphologie Studieren