우리는 마우스 축산에 대 한 안과의 UCL 학회에 생물 자원 단위의 직원과 타임된 matings 수행에 대 한 Vasiliki Chantzara 감사 합니다. 이 연구는 Wellcome 신뢰 조사 상 095623/Z/11/Z CR에 의해 지원 되었다.

모든 동물 작품 영국 홈 오피스 및 로컬 윤리 지침에 따라 수행 되었다.
1입니다. 단계와 타이밍의 요약
<ol><li>배아 일 (전자) 9.5 e13.5 임신;를 조사 생물학 질문에 대답 하는 적합 한 스트레인에서 성인 쥐의 초과 matings를 수행 12-15 일이 필요합니다.</li>
	<li>선택적으로, 준비 5-브로 모-2'-deoxyuridine (BrdU) / deoxyuridine (듀)-5-ethynyl-2' 솔루션 수행 주입 (프로토콜 섹션 2); 필요 합니다 ~ 전날 또는 듀/BrdU 라벨의 원하는 길이 따라 배아 격리의 하루에 1 시간.</li>
	<li>수행 하는 고립과 hindbrain 절 개 태아 (프로토콜 섹션 3); 필요 합니다 ~ 10 분/태아.</li>
	<li>수행 하는 wholemount 면역 형광 라벨 (프로토콜 섹션 4); 3 일이 필요합니다.</li>
	<li>부동 섹션 면역 형광 라벨 (프로토콜 섹션 4)을 수행 하는 vibratome를 사용 하 여 섹션: 2 일 필요 합니다.</li>
	<li>cryostat를 사용 하 여 섹션과 면역 형광 라벨 cryosections (프로토콜 섹션 5);의 수행 2 일 필요합니다.</li>
</ol>2. 주입 임신 여성 마우스 BrdU 또는 듀 (선택 사항)
<ol><li>분해 BrdU 또는 듀 버퍼링 멸 균 인산 염 (PBS) 10 mg/mL 및 1 mg/mL의 농도에서 각각. 주의: BrdU와 듀는 독성; 적절 한 보호를 착용 하십시오.</li>
	<li>임신 마우스 무게와 계산 BrdU 또는 듀 솔루션 BrdU 100 mg/kg를 도달 하는 관리 되는 볼륨 또는 5 mg/kg에 듀.</li>
	<li>라벨의 필요한 길이 따라 배아를 수집 하기 전에 어느 1 h 또는 1 일 복 경로 통해 BrdU 또는 듀 솔루션을 주입. 참고: S-단계에서 hindbrain 셀 시각화 1 h에 대 한 라벨. 1 일 라벨 시각화 hindbrain NPCs의 자손.</li>
</ol>3. Hindbrains e9.5-e13.5 마우스 배아에서에서의 해 부
<ol><li>(예를 들면, 자 궁 경부 전위) 필요한 임신 단계에서 윤리적으로 승인 된 절차를 사용 하 여 타임-임신 여성 마우스 안락사 날카로운가 위를 사용 하 여 복 막 구멍을 자르면 고 신중 하 게 자 궁을 삭제할. 20 mL의 얼음 처럼 차가운 PBS를 포함 하는 60 m m 플라스틱 접시에 배아를 포함 하는 삭제 자 궁을 놓습니다. 참고: 무 균 기술을 필요 하지 않습니다.</li>
	<li>모든 추가 절 개 해 현미경을 사용 하 여 수행 합니다. Using 시계 집게 번호 5, 배아를 노출, 각 배아 탯 severing 하 여 놓고 노른자위 낭 제거 자 궁 근육 벽 눈물.</li>
	<li>넓은 구멍 열기와 살 균 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여, 얼음 처럼 차가운 PBS 가진 깨끗 한 플라스틱 접시에 각 배아를 전송 합니다.</li>
	<li>Using 시계 집게 번호 55, 머리 (그림 1E) 서버.</li>
	<li>필요에 따라 조직 (예를 들어, 노 른 자 삭 또는 약 2mm 꼬리 끝의 ¼) 게놈 DNA 분리 및 후속 유전형의 작은 조각을 유지 합니다.</li>
	<li>Using 시계 집게 번호 55, 삭제할 hindbrain 병렬 하 고 즉시 얼굴 및 개 조직 (그림 1 층)에서 분리 hindbrain neuroepithelium 아래를 포함 하는 조직.</li>
	<li>위치는 hindbrain 및 꼬리 머리 조직 등 쪽 고 얇은 조직 층 (지붕 격판덮개)에 의해 덮여 있는 4번째 심 실 식별. 조심 스럽게 시계 집게 번호 55 (그림 1G)을 사용 하 여 지붕 판 피어스와 집게, rostrally는 중간 선 따라 midbrain, 위로 이동 함께 멀리 초과 조직 껍질 그리고 caudally 후부 hindbrain 척수 (그림 1G 이상 ); hindbrain 이제 오픈 책 준비 (그림 1 H)에 노출 되어야 합니다.</li>
	<li>Hindbrains wholemount immunolabeling (옵션 1)에 대 한 준비.<ol>
<li>Using 시계 집게 번호 55, 신중 하 게 나무 랄 수 멀리 나머지 머리 mesenchyme 및 hindbrain 집게 (그림 1I)를 사용 하 여의 pial 측에 연결 된 모든 meninges. Hindbrain 조직 (그림 1 K)만 두고 midbrain 및 척수 조직 (그림 1J)를 제거 합니다. 참고:이 절차의이 단계 하지 따라야 한다 e9.5 또는 e10.5, 시도 hindbrain neuroepithelium; 손상 가능성이 것 때문에 또한, meninges 제거 되지 않습니다 필수 hindbrain neuroepithelium immunolabeling에 대 한 항 체의 효율적인 침투 수 있도록이 단계에서 충분히 얇은 이기 때문에. 그러나이 단계,, 한다 meningeal 조직 통합, hindbrain neuroepithelium에 항 체 침투를 향상 시킬 때 이후, e11.5에서 따라야. 해 부는 얼음 처럼 차가운 PBS (각 hindbrain에 대 한 사용 깨끗 한 PBS)에서 수행 될 때 가장 쉬운.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hindbrains vibratome 및 cryosectioning (옵션 2)에 대 한 준비<ol>
<li>시계 겸 번호 55를 사용 하면, 제거할 midbrain 및 척수 조직 (그림 1J). 참고: 아니에요 mesenchyme 및 meninges 단면 ( 그림 1I에서 같이)를 위한 hindbrains의 제거 하는 데 필요한.</li>
	</ol>
</li>
	<li>플라스틱 접시에서 둥근 바닥 2 mL 튜브 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 hindbrains를 전송 하 고 모든 PBS, 발음 갓 해 동된 4 %w / v 포 름 알 데히드 PBS에 녹아 있는 부드러운 동요와 4 ° C에서 2 시간에 대 한 수정. 주의: 포름알데히드는 독성이; 적절 한 보호를 착용 하십시오.</li>
	<li>Hindbrains 3 배 시간 PBS와 린스. Immunolabeling 2-3 일 이내에 시작 됩니다 또는-20° C에 저장을 위해 100% 메탄올을 전송 하기 전에 5 분 동안 50% methanol/50% PBS와 PBS를 대체 하는 경우 PBS에 4 ° C에서 저장
</li>
</ol>4. Wholemount 면역 형광 검사
<ol><li>필요한 경우, 순차적으로 감소 하는 5 분 동안 실 온 (RT)에서 (예를 들어, 75% 메탄올, 50% 메탄올, 25% 메탄올) PBS에 메탄올의 희석에 hindbrains를 rehydrate 하 고 PBS에 전송. 참고: 메탄올의 등급된 시리즈는 부드럽게 hindbrains를 rehydrate 하 고 적절 한 조직 보존을 보장 합니다.</li>
	<li>0.1%를 포함 하는 PBS에 4 ° C에서 30 분 동안 hindbrains를 permeabilize Triton X-100 (PBT) 부드러운 동요와 함께.</li>
	<li>PBT 포함 된 부드러운 동요와 함께 10% 열 비활성화 염소 혈 청에서에서 4 ° C에서 1 시간에 대 한 hindbrains를 품 어. 참고: 2 차 항 체에 제기 했다 호스트 종에서 혈 청을 사용 합니다. 염소에 1 차 항 체 혈 청 무료에서 품 어 대 한 단백질 차단, 예를 들어 5% 소 혈 청 알 부 민 PBS 또는 적당 한 상업적인 대안에 ( 재료의 표참조). 이 일반적인 염소에서 1 차 항 체를 사용 하는 경우 자주 관찰 얼룩을 줄일 것입니다.</li>
	<li>Hindbrains 1% 열 비활성화 세럼과 부드러운 동요와 1 차 항 체를 포함 하는 PBT에서 4 ° C에서 하룻밤을 품 어 (예를 들어, 토끼 안티 인 히스톤 H3 [pHH3] 희석 1:400). 참고: 염소에서 기본 항 체, 혈 청 하지 않고 PBT를 사용 합니다.</li>
	<li>4 ° c 5는 hindbrains를 씻어 1 h PBT와 배.</li>
	<li>PBT 적절 한 fluorophore 활용 된 이차 항 체 (예를 들면, 염소 안티 토끼 알 렉 사 Fluor 488) PBT 사용 기본 항 체에 대 한 대상에서 1: 200에서 포함에 4 ° C에서 하룻밤 hindbrains를 품 어. Photobleaching에서 fluorophores를 보호 하기 위해 여기 hindbrains 어둠 속에서 계속. 참고: 염소에서 1 차 항 체에 대 한 일반적인 얼룩을 줄이기 위해 2 차 항 체의 항 염소 Fab 조각을 사용 합니다.</li>
	<li>4 ° c 5는 hindbrains를 씻어 1 h PBT와 배.</li>
	<li>항 체 바인딩의 장기 보존을 위한 RT에서 15 분 동안 4% 포름알데히드 PBS에 있는 hindbrains 접미사 짧게 PBS에 두 번 씻어.</li>
	<li>검은 전기 테이프의 2 개의 층으로 유리 현미경 슬라이드 커버 하 고 작은 사각형 하나의 hindbrain를 충분히 큰 주머니를 만들 계층된 테이프에서 삭제할.</li>
	<li>각 hindbrain 파스퇴르 피 펫으로 주머니에 전송, 과잉 액체를 제거 하 고 추가 적절 한 antifade 시 약 주머니는 coverslip에서 트랩 공기 방울을 피하기 위해 유리 coverslip로 천천히 그것을 취재 하기 전에. coverslip 봉인 하 고 매니큐어의 얇은 층을 가진 슬라이드에 부착. 이미지 수집 (프로토콜 섹션 7)까지 어둠 속에서 4 ° C에서 슬라이드를 저장 합니다.</li>
</ol>5입니다. Vibratome 단면 및 부동 섹션 면역 형광 검사
<ol><li>4.1 단계에서 설명한 대로 필요한 경우 메탄올에서 hindbrains rehydrate.</li>
	<li>증류수에 녹은 3 %w / v agarose에 hindbrains를 포함 합니다. 참고: 녹은 agarose hindbrain에 열 손상을 방지 하기 위해 포함 하기 전에 짧게 약 55 ° C에 냉각 허용 합니다.</li>
	<li>vibratome을 사용 하 여 70 µ m의 두께로 가로 hindbrain 섹션을 잘라. 얼음 처럼 차가운 PBS를 포함 하는 24-잘 접시의 한 잘에는 붓으로 갓 커트 각 섹션을 전송 합니다.</li>
	<li>4.2-4.7, 단계에서 설명한 대로 부동 섹션 라벨 하지만 단계를 다음과 같이 수정: 세척 부동 섹션 4 ° C에서 3 x PBT와 15 분 각, 2 h, 2 차 항 체에 대 한 보육 시간을 단축 하 고 실시간에 이차 항 체에 품 어</li>
	<li>필요한 경우, 단계 5.4에서에서 설명 된 대로 다른 epitopes에 대 한 항 체와 라벨, 후 듀+ 핵은 듀 라벨 제조업체의 지침에 따라 장비를 사용 하 여 검색. 어둠 속에서 37 ° C에서 30 분 동안 칵테일 반응에서 부동 섹션을 품 어. 세척 hindbrain 섹션 4 ° C에서 15 분 동안 PBT와 3 배.</li>
	<li>필요한 경우, 단계 5.4에서에서 설명 된 대로 다른 epitopes에 대 한 라벨, 후 감지 BrdU+ 핵 다음과 같습니다.<ol>
<li>어둠 속에서 30 분 동안 37 ° C에서 2 N 염 산에 부동 섹션을 품 어.</li>
		<li>두 번 5 분 동안 각 RT에 염 산을 중화 하는 어둠 속에서 0.1 M 나트륨 붕 산 염 버퍼 pH 8.5에서에서 부동 섹션을 품 어.</li>
		<li>부동 섹션 3 짧게 x PBS에 4 ° c.에 세척</li>
		<li>면역 형광 검사 BrdU 단계 5.4에서에서 설명 된 대로 대 한 라벨을 수행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>10 µ g/mL 4', counterstain 세포 핵에 PBS에서 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)에 실시간에 2 분 동안 부동 섹션을 품 어.</li>
	<li>실시간에서 15 분 동안 4% 포름알데히드에 부동 섹션 후 위</li>
	<li>PBS에서 짧게 부동 섹션을 씻어. 신중 하 게 유리 현미경 슬라이드는 페인트 브러시를 사용 하 여 부동 섹션 전송. 초과 PBS 압 종이 또는 직물을 사용 하 여 섹션 주위를 청소 하십시오.</li>
	<li>섹션 사용 하 여 PBS에 커버 80% 글리세롤 천천히 유리 coverslip 트랩 공기 방울을 피하기 위해 탑재 합니다. 이미지 수집 (7 단계)까지 어둠 속에서 4 ° C에서 슬라이드를 저장 합니다.</li>
</ol>6. cryostat 단면화 및 Cryosection 면역 형광 라벨
<ol><li>4.1 단계에서 설명한 대로 필요한 경우 메탄올에서 hindbrains rehydrate.</li>
	<li>Hindbrains cryoprotect hindbrains 동결 이전에 PBS에서 30 %w / v 자당에서 품 어. 참고: Hindbrains 그들은 일반적으로 ≤ 2 h 하는 관의 바닥에 침 몰 하는 때 동결에 대 한 준비가 e9.5 10.5 hindbrains 및 3-6 h e11.5 13.5 hindbrains.</li>
	<li>잠수함 복합 광학 절삭 온도에 hindbrains (10 월) 및-40 ° C와-50 ° C에서 드라이 아이스 냉각 isopentane를 10 월에 hindbrains를 포함 하는 금형을 전송 하 여 신속 하 게 동결. 참고: 고정 된, 포함 된 hindbrains는-20 ° C 단기 및 장기 단면까지 보기 위해-80 ° C에 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>Cryostat 및 전송 정전 접착제 현미경 슬라이드를 사용 하 여 10 µ m의 두께로 가로 hindbrain 섹션을 잘라. 참고: Hindbrain cryosections-20 ° C 단기 및 장기 라벨까지 보기 위해-80 ° C에 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>슬라이드 슬라이드 섹션 건조 15 분 RT에서 품 어. PBS 가진 cryosections 세척 디졸브 10 월 및 마크 cryosections PAP 펜을 사용 하 여 주위 소수 성 장벽. 5.4-5.8 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>5.10 글리세롤 대신 폴 리 비닐 알코올 기반 설치 매체를 사용 하 여 단계를 반복 합니다.</li>
</ol>7. 이미지 수집
<ol><li>Epifluorescent 또는 수성 미디어 탑재 슬라이드 및 광학 필터 fluorophores immunolabeling 사용에 대 한 적합 한 적합 한 렌즈를 장착 하는 confocal 레이저 스캐닝 현미경을 사용 하 여 이미지 샘플.</li>
	<li>전체 hindbrain 또는 hindbrain 섹션 이미지를 사용 하 여 렌즈를 10 배 확대 (예를 들어, 그림 2B);에 대 한 정량화에 대 한 hindbrains 영역을 시각화 하려면 40 배율 (예를 들어, 그림 2D) X 개별 셀을 시각화, 63 x 확대 (예를 들어, 그림 2C)와 함께 사용 하는 렌즈를 사용 합니다.</li>
</ol>8. 다른 방법
<ol><li>3.8 단계, cytometry 응용 프로그램15에 대 한 단일 세포 현 탁 액을 생산 하기 위해 고정 되지 않은 hindbrains 균질.</li>
	<li>3.8 단계, 실시간 정량 (예를 들어, 16)에 대 한 단일 셀 정지에서 RNA 추출 하 고정된 hindbrains 균질. 참고: 확인 모든 시 약 및 장비 살 균과 RNase-무료 전체 RNA의 저하를 방지 하기 위해 유지 됩니다.</li>
	<li>3.8 단계, NPCs를 격리 하 여 neurospheres hindbrain NPC 행동17의 분석으로 그들을 생체 외에서 전파 고정된 hindbrains 균질. 주: 모든 시 약 및 장비 neurosphere 문화의 세균/곰 팡이 오염을 방지 하기 위해 살 균 보관 됩니다 확인 하십시오.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wilsch-Brauninger, M., Florio, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neocortex+expansion+in+development+and+evolution+-+from+cell+biology+to+single+genes.">Neocortex expansion in development and evolution - from cell biology to single genes.</a> Curr Opin Neurobiol. 39, 122-132 (2016).</li><li>Gregg, C., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNTF/LIF/gp130+receptor+complex+signaling+maintains+a+VZ+precursor+differentiation+gradient+in+the+developing+ventral+forebrain.">CNTF/LIF/gp130 receptor complex signaling maintains a VZ precursor differentiation gradient in the developing ventral forebrain.</a> Development. 132 (3), 565-578 (2005).</li><li>Kwon, G. S., Hadjantonakis, A. 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작가의 아무도 경쟁 관심사 또는 상반 되는 관심사를 있다.

이 프로토콜 개발 성체의 메커니즘 연구 모델로 마우스 배아 hindbrain를 사용 하는 방법을 설명 합니다. 다양 한 다른 immunolabeling 메서드를 사용 하 여, hindbrain NPCs 구상 될 수 있다 그리고 그들의 수 정량 조직 섹션에서 나 기관 wholemounts 전. 절 개 플랫 해부학의 용이성은 hindbrain 기관 전체 성체 패턴에 대 한 정보를 수집 하는 '열린 책' 준비에 몇 군데 될 수 보장 합니다.
우리 더는 NPC 형태학 및 세포 주기 관련 NPC 위치 구상 될 수 있다 쉽게 부동에 표시-또는 cryosections는 hindbrain의. 두 동작 이전 포유류 telencephalon20에서 수행 된 새로운 조상 인구 정의 악용 될 수 있습니다. 예를 들어 초기 형성 Sox2+ neuroepithelia 및 Pax6+ 꼭대기 방사형 명과 hindbrain21,22에 존재 하지만 hindbrain 부족 Tbr2+ 기저 창시자3 .
여기에 설명 된 프로토콜 또한 라이브 이미징 및 혈통 추적 고정된 조직에서의 형광 라벨 특정 NPC 모집단의 동작을 관찰 하는 것 적용할 수 있습니다. 이 얻을 수 있습니다, 예를 들어 마우스 들고 tamoxifen을 유도할 수 있는 Sox1 iCreERT2 transgene와 Rosa26tdTomato 기자23에서 hindbrains를 공부 하 여.
Murine 성체의 지식 강화, 이외는 hindbrain 공부 수 있습니다 명료 종에 걸쳐 공유 되는 광범위 하 게 관련 neurogenic 메커니즘은 hindbrain 더 비슷할 것으로 예상 되는 높은 보존된 뇌 영역 이므로 사이는 개 보다 척 추가 있는 종.
Hindbrain 신생 개 신생23보다 비교적 짧은 시간 창 동안에 일어난다, 그것은 적절 하 게 비교 하기 위한 필요 개최 배아를 고려 하는 것이 중요. 따라서, 실험적인 바이어스 계산 하 고 그 hindbrain 분리 이전 배아에 somite 쌍의 수를 기록 하 여 피 한다. Hindbrain 조직 자체는 연약한과 집게 따라서 처리 해야 신중 하 게 머리 mesenchyme meninges;에서 hindbrain 조직 분리 하는 경우 '연습 실행'의 몇 따라서 귀중 한 배아의 해 부를 시도 하기 전에 권장 수 있습니다. 또한, hindbrains (피 펫의 여 수 수 확대의 끝을 절단 하 여 깨끗 한가 위)의 손상을 방지 하려면 집게 대신 넓은 구멍 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 다른 하나의 튜브에서 메시지를 전송 한다. 마지막으로, 비록 드문, S 상 Npc에 듀/BrdU 정관의 범위 수 있습니다 변수, 특히 짧은 (즉, 1 시간) 펄스 동안. 라벨 개선, 듀/BrdU 주사기에는 솔루션을 로드 하기 전에 제대로 해산 확인 하 고 복 막 구멍에 조심 스럽게 삽입 합니다. 사고, 피하 만든 같은 불 쌍 한 주사 지 나 듀/BrdU 솔루션을 트래핑 하 고 순환에 들어가기에서 방지.

포유류 배아 개발 하는 동안 Npc '성체'를 불리는 과정에서 새로운 신경 세포를 생성 하는 심 실 (VZ)와 확장 neuroepithelium의 subventricular (SVZ) 지역에 분할. 새로운 신경 세포와 그들의 NPC 선구자의 세대는 조사 광범위 하 게1개 더 적은 다른 지역에서이 프로세스에 대 한 알려져 있다 하는 동안.
개는 복잡 하 고 복잡 하 게 접힌 구조는 크게 조직 단면, 후 조직학 방법으로 공부를 시키는 이해 성체 패턴 전체 기관에 걸쳐 도전 이다. 또한, 개 신생의 연구는 반드시 다른 뇌 영역 또는 척수 neurogenic 행동의 예측. 예를 들어 측면 절 예 하, 하지만 드라이브에 자체-갱신 NPCs의 홍보는 속눈썹 neurotrophic 요인 및 백혈병 금지 요인 관찰 단서 별개의 CNS 영역에 걸쳐 서로 다른 응답을 이끌어내는 수 신호, 척수 창시자2분화 NPCs는 대뇌 피 질의1 의 확장에 크게 기여 하 고 개발 개 채울의 하위 클래스는 또한, hindbrain 및 척수3에서. 반대로, 그것은 생각할 수 있는 척수와 hindbrain 피 질에는 없음 대체 NPC 하위 포함입니다.
마우스 배아 hindbrain 포유류 두뇌의 진화의 가장 오래 된 지역 이며, 소 뇌 및 brainstem 생성. 종에 걸쳐 그것의 보존에도 불구 하 고 상대적으로 작은 hindbrain 성체, 전인대 하위 또는 그들의 규칙을 포함 하 여에 대 한 알려져 있다. 마우스에서 hindbrain 연구의 대부분은 조직 세분화, Hox 유전자4, 포스트 mitotic 신경5의 패턴화에 의해 구동 하는 과정에 집중 했다. 또한,는 hindbrain 발달 신생6의 메커니즘 연구 모델로 사용 되었습니다.
마우스 hindbrain 달리 zebrafish hindbrain NPC 차별화와 척추 모델 생물 (예를 들어,7,8)에서 계보 진행에 따라 광범위 하 게 사용 되어 왔습니다. 병아리 hindbrain 또한 척추 개발 (예를 들어,9,10) 동안 성체를 공부 고용 되었습니다. Zebrafish hindbrain11와 마찬가지로 여자 hindbrain 수 라이브12시간 동안 NPC 행동 규정을 공부 하 고 몇 군데. 라이브 영상에 의해 유사한 경도 관측 불가능 현재 포유류 유기 체에서 개발 하기 때문에 utero. 또한, 살아있는 zebrafish 태아 나 병아리 태아에서 비켜에서 (예를 들어,13), electroporation를 쉽게 적용할 수 있지만 이러한 기술은 또한 더 도전 에와 같은 기술을 통해 조작 대상으로 utero.
그럼에도 불구 하 고, 마우스 배아 hindbrain은 정교 하 게 성체를 제어 하는 분자 및 세포 메커니즘 정의 적합 합니다. 첫째, 마우스 hindbrain의 분석, 많은 경우에 정보를 제공할 더 낮은 척추 동물을 공부를 통해 얻은 것 보다 인간 개발에 관련 된. 또한, 유전자 변형된 마우스 긴장의 광대 한 수 있습니다 사용할 수 있는 하나 운명 murine NPCs 매핑 또는 관련 유전자의 제정 또는 조건부 돌연변이 체 대립 유전자와 규제 메커니즘을 변경. 마지막으로, 그것은 최근에 보였다 그 microinjection 창시자 비보 전 심 실 hindbrain의 hindbrain 전인대 속도 론14의 적어도 간단한 검사를 허용. 그러나, 현재, 아주 작은 spatiotemporal 조직 및 전체 기관 컨텍스트에서 hindbrain NPCs의 행동에 대 한 알려져 있다.
여기, wholemount 준비와 조직 섹션에서 포유류 NPC 행동을 분석 하기 위한 강력한 모델로 hindbrain 사용할 간단 하 고 빠른 방법을 설명 합니다. 우리는 추가 프로토콜을 사용 하 여 immunolabeling 다른 신생 매개 변수를 공부에 대 한 프로세스 hindbrain 샘플 추가 양적 역전사 (qRT) 등 다운스트림 분자 응용 프로그램에 대 한 제공-PCR.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="763">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Round-bottomed reagent tube, 2.0 ml (Safe-Lock)</td>
			<td style="width:97px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">211-2120</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Plastic cell culture dish, 60 mm</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">150288</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Cell culture plates, 12-well</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">150628</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Pasteur pipettes</td>
			<td style="width:97px;">Copan</td>
			<td style="width:119px;">200C</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Dumont Watchmaker forceps, no. 5</td>
			<td style="width:97px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">91150-20</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Dumont Watchmaker forceps, no. 55</td>
			<td style="width:97px;">FST</td>
			<td>11295-51</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">29G needle/syringe</td>
			<td style="width:97px;">BD</td>
			<td>BD Micro-Fine +1ml</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Anti-phospho-histone H3 primary antibody</td>
			<td style="width:97px;">Millipore</td>
			<td>06-570</td>
			<td style="width:291px;">Goat, dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Anti-BrdU primary antibody</td>
			<td style="width:97px;">Abcam</td>
			<td>ab6326</td>
			<td style="width:291px;">Rat, dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Anti-Ki67 primary antibody</td>
			<td style="width:97px;">BD Biosciences</td>
			<td>550609</td>
			<td style="width:291px;">Mouse, dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:257px;">Anti-RC2 primary antibody</td>
			<td style="width:97px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>RC2</td>
			<td style="width:291px;">Mouse (IgM), dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Alexa Fluor 488-conjugated goat anti rabbit secondary antibody</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A11029</td>
			<td style="width:291px;">Dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rabbit secondary antibody</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A11037</td>
			<td style="width:291px;">Dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse IgM secondary antibody</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A21042</td>
			<td style="width:291px;">Dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse secondary antibody</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A11001</td>
			<td style="width:291px;">Dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rat secondary antibody</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A11007</td>
			<td style="width:291px;">Dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D9542</td>
			<td style="width:291px;">Use at 10 &#956;g per mL</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">5-ethynyl-2&#8217;-deoxyuridine (EdU)</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">900584</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">5-bromo-2&#180;-deoxyuridine (BrdU)</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B5002</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">C10086</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Heat-inactivated goat serum</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G9023</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A7906</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">DAKO protein-block serum free</td>
			<td style="width:97px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">X0909</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T8787</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Phosphate buffer saline</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4417</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Sodium tetraborate</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B9876</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Sucrose</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S0389</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Agarose</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9539</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Super PAP pen liquid blocker</td>
			<td style="width:97px;">Ted Pella, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">22309</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">SlowFade Antifade Kit</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S-2828</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Glycerol</td>
			<td style="width:97px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10337700</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Mowiol</td>
			<td style="width:97px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">475904</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">OCT</td>
			<td style="width:97px;">Scigen</td>
			<td style="width:119px;">4583</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Isopentane</td>
			<td style="width:97px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M32631</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Methanol</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">10675112</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:97px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">10316380</td>
			<td style="width:291px;">Also available from other commercial suppliers</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:97px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">631-0912</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Superfrost microscope slides</td>
			<td style="width:97px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">631-0108</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Thermometer</td>
			<td style="width:97px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">620-0858</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Cover glass</td>
			<td style="width:97px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">631-0137</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:257px;">Stereo Microscope, Leica MZ16</td>
			<td style="width:97px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">not applicable</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:257px;">Confocal laser scanning microscope&#160; LSM710</td>
			<td style="width:97px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">not applicable</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the mouse hindbrain as a model for studying embryonic neurogenesis

마우스 배아 개 개발 중 포유류 성체를 공부 하는 가장 일반적으로 고용된 시스템입니다. 그러나, 높게 접힌된 개 neuroepithelium wholemount 분석 검사 기관 전체 성체 패턴을 의무가 아니다. 또한, 개 신생의 메커니즘을 정의 하지 않습니다 반드시 신생; 뇌의 다른 부분에서의 예측 등으로 인해 개 특정 조상 하위의 존재. 마우스 hindbrain 배아 신생 의무가 wholemount 분석, 뿐만 아니라 조직 단면도 spatiotemporal 유통 및 신경 창시자의 동작을 관찰 하는 공부에 대 한 대체 모델을 제공 합니다. 또한, 그것은 쉽게 세포 격리 또는 분자 생물학 분석 같은 다른 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 해 부. 마우스 hindbrain 세포 계보 기자 및 제공 되는 돌연변이 마우스 긴장의 광대 한 수에 쉽게 분석할 수 있습니다, 그것은 공부는 포유류 발달 성체의 세포 및 분자 메커니즘에 대 한 강력한 모델을 제공 합니다. 유기 체입니다. 여기, 우리가 마우스 배아 hindbrain wholemount 준비와 조직 섹션에서 포유류 신경 조상 세포 (NPC) 동작을 분석 하는 데 사용 하는 간단 하 고 빠른 방법을 제시.

이 섹션에서는 wholemount 및 조직 섹션 분석을 통해 마우스 배아 hindbrain에 성체를 공부 하면 얻을 수 있는 결과의 예를 보여 줍니다.
우리는 mitotic 마커 pHH3 시각화 나누어 NPCs VZ ( - 를그림 2B D)에 대 한 항 체와 microdissected hindbrain의 wholemount immunolabeling 그를 보여줍니다. 우리 쇼 pHH3+ NPCs 유사 분열 (그림 2C)의 여러 단계를 강조 하 고 확대. 우리는이 표기 방법은이 기관 (그림 2D)에 있는 NPC 유사 분열의 시간 과정을 관찰 하 hindbrain 개발의 여러 가지 연속 단계에 걸쳐 수행 적합 하 그림 있다.
우리는 분열 방향 mitotic NPCs (그림 3B), 순환의 pseudostratified, interkinetic 핵 이동 패턴의 시각화 듀 주입 후 가로 immunolabeled vibratome 섹션 hindbrain 1 h의 이미징 쇼 창시자18 (그림 3B, D), 그리고 전반적인 VZ 구조 (그림 3B - D). 참고 그 mitotic pHH3+ NPCs는 심 실 표면에만 존재 하 고 하지 더 basally (그림 3C)는 대조19개 더 전념된 NPCs의 기저 부 패턴.
우리는 또한 어떻게 사이클링 NPCs 및 차별화 된 그들의 자손 수 있습니다 표시 평가 NPC 혈통 진행 (그림 4) BrdU 또는 듀 보여 줍니다. 마우스 hindbrain BrdU와 Ki67 BrdU 주입 후 1 일의 가로 cryosections immunolabeling수와 사이클링 NPCs (그림 4A, B), neuroepithelium에 의하여의 수의 위치를 보여 줍니다 자동 갱신 NPCs Ki67의 비율을 계산 하 여 정의할 수 있습니다+ + BrdU (그림 4A, C) BrdU+ 셀 사이 세포.
마지막으로, 우리는 r c 2는 신경 관련 중간 필 라 멘 트 NPC endfeet (그림 5B)와 프로세스 (그림 5C) 시각화 nestin에 항 원에 대 한 hindbrain vibratome 섹션의 immunolabeling의 예를 보여줍니다. 얇은 cryosections, 보다는 오히려 Vibratome 섹션, 높은 분기 NPCs의 그리고 또한 전체 neuroepithelial 구조 향상 된 관측을 허용 한다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig1.jpg"> 그림 1 : 키 e11.5 마우스 배아에서 한 hindbrain의 해 부에 단계. (A - D) Hindbrain 서의 도식 묘사입니다. (A) 꼬리 머리 조직 빨간 점선 따라 절단 하 여 제거 됩니다. (B) 지붕 판 피어 싱 이며 다음 중간 선 (빨간색 세로선)를 따라 rostral와 꼬리 방향에서 떨어져 찢 어 그리고 hindbrain neuroepithelium을 옆으로. (C)는 neuroepithelium 두 구조 사이 집게를 삽입 한 후 meninges에서 들어올려서는 고 midbrain 및 척수 조직 빨간 점선 따라 집게와 조직을 절단 하 여 제거 됩니다. (D)이이 절차는 병합된 hindbrain을 생성합니다. (KE-) 이미지 캡처 hindbrain 서 절차의 주요 단계. (E) 태아는 점선을 따라 절단 하 여 참입니다. (F)는 hindbrain 지붕 접시로 4번째 심 excised 및 점선 따라 severing 하 여 머리에서 분리. 작은 구멍은 지붕 판 (별표)에 피어 싱 전에 (G) 4번째 심 실 방향의 위쪽입니다. 구멍은 중간 선 (화살표)는 hindbrain 노출에 따라 신중 하 게 rostrally와 caudally 조직을 박 리 하 여 확대 됩니다. hindbrain 이며 아래로 위치 pial 쪽 오픈 책 준비에 접어 왼쪽 (H; 블랙 화살촉 나타냅니다 hindbrain 신경 조직). hindbrain에 필요한 경우 wholemount immunolabeling, pial 막 부드럽게 캐 겸 자 (나)를 사용 하 여 주변의 meningeal 세포 막에서 hindbrain neuroepithelium에 의해 제거 됩니다. 초과 midbrain (mb) 및 척수 (sc) 조직 제거 (점선 J에)은 hindbrain (K)을. 눈금 막대: 500 µ m (E), (F - K) 300 µ m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig2.jpg"> 그림 2 : Wholemount immunolabeling는 hindbrain에 걸쳐 NPC mitoses 척도를 사용할 수 있습니다. (A) 회로도 hindbrain 심 실 계층에 mitotic NPCs의 en 얼굴 이미지를 보여주는 V, 심 실 hindbrain 쪽; P, pial hindbrain 측면입니다. (B) 공초점 타일 스캔 z 스택 e10.5 hindbrain mitotic 마커 pHH3 (빨간색)에 대 한 wholemount immunolabeling 다음의. 백색 상자 (D)에 두 번째 패널에 높은 확대에 표시 된 영역을 나타냅니다. (C) 사전 anaphase (흰색 화살표) 및 anaphase (검은 화살표) mitotic 수치 mitotic NPCs. (D) 시간 과정 wholemount pHH3 e9.5-13.5에서 라벨의 전체 코 호트 내에서 구별할 수 있습니다. 스케일 바: (B); 500 µ m 20 µ m (C); (D) µ 하 m 100 이다 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig3.jpg"> 그림 3 : Rostral hindbrain에 그들의 새싹 내 자전거 NPCs. (A) 회로도 mitotic (녹색)와 S-위상 (레드) Npc hindbrain 실의 표면에 뇌 영역에서의 위치를 각각 묘사 hindbrain 통해 가상 횡단면 더 높은 확대 오른쪽에 표시 됩니다. 검은색 화살표 차별화 영역으로 세포 주기 종료 NPC 자손의 이동의 방향을 나타냅니다. 1 h 듀 펄스; 받은 배아에서 부동 e11.0 hindbrain 섹션의 (B) 공초점 z 스택 immunolabeling pHH3와 듀 각각 mitotic (녹색)와 S-위상 (레드) Npc를 시각화 하기 위해 사용 되었다. Hindbrain 표면 점선;로 표시 됩니다. V, 심 실 hindbrain 쪽; P, pial hindbrain 측면입니다. 흰색 상자에 표시 된 지역 삽입; 더 높은 확대에 표시 됩니다. 화살표는 심 실 표면에 상대적인 anaphase에서 NPC의 분열 비행기를 나타냅니다. (C) 단일 채널 pHH3 immunolabeling만을 표시. Mitotic NPCs; 시안색 화살촉으로 표시 됩니다. 기저 부의 부족은 Δ. (D) 단일 채널 듀 라벨만 표시로 표시 됩니다. 듀+ NPCs 채택 그들의 interkinetic 핵 이동으로 인해 pseudostratified 배포 합니다. 대표 주황색 선으로 표시 된 대로 NPCs 실의 표면에서 이동 거리를 측정할 수 있습니다. 스케일 바:에 100 µ m (B -D); (B)에서 삽입에 개의 하 µ 10 m <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig4.jpg"> 그림 4 : Hindbrain NPC 자체 갱신 용량을 확인 Ki67 라벨와 함께 결합 BrdU. (A) Confocal z 스택 Ki67 (녹색) BrdU (빨간색) BrdU 1 일 다음 펄스에 대 한 라벨링 후 e10.5 hindbrain cryosection의. 심 실 영역에서 두 배 긍정적인 세포 Ki67 라벨에 표시 된 대로 BrdU를 통합 하 고 아직도 세포 주기를 통해 이동 하는 Npc는. 총 BrdU+ 인구 사이 이중 표시 된 셀의 비율 자체 갱신 NPCs. (B, C)의 비율을 나타냅니다 단일 채널 Ki67 표시 (B)와 (C) BrdU immunolabeling만. BrdU+ 셀을 Ki67 부족 하 고 따라서 세포 주기 종료 가능성이 (A,C) 시안색 화살촉으로 표시 됩니다. Hindbrain 표면 점선;로 표시 됩니다. V, 심 실 hindbrain 쪽; P, pial hindbrain 측면입니다. 눈금 막대: 50 µ m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56793/56793fig5.jpg"> 그림 5 : Nestin immunolabeling 시각화 NPC 프로세스와 endfeet. A - ( C) RC2 nestin 신경 중간 필 라 멘 트에는 epitope를 인식에 대 한 면역 형광 hindbrain neuroepithelium에 걸쳐 NPC 형태를 보여 줍니다. RC2 immunolabeling; 다음 e11.5 hindbrain에서 부동 섹션의 (A) Confocal z 스택 박스형된 영역에서 더 높은 확대에 표시 됩니다 (B, B', 꼭대기/심 실 지역)와 (C, C'; 기저 지역). Hindbrain 표면 점선;로 표시 됩니다. V, 심 실 hindbrain 쪽; P, pial hindbrain 측면입니다. (B, C) (A); 박스형 영역의 confocal z 스택 단일 광학 섹션에 표시 됩니다 (B', C'), 각각. 심 실 표면에 고정 하는 NPC 꼭대기 endfoot (B')에 화살표로 표시 됩니다. 단일 및 fasciculated NPC 프로세스에서 흰색과 검은색 화살촉으로 표시 됩니다 (C'), 각각. 스케일 바: 100 µ m, (A); (B, C)에 대 한 개의 하 µ 25 m <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56793/56793fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

마우스 Hindbrain 배아 신생 공부에 대 한 모델

이 문서 양측 검정 전체 기관에 조직 섹션 준비 발달 신생 공부 모델 마우스 배아 hindbrain를 사용 하는 방법을 보여 줍니다.

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.9K 조회수.  UCL Institute of Ophthalmology. 이 문서 양측 검정 전체 기관에 조직 섹션 준비 발달 신생 공부 모델 마우스 배아 hindbrain를 사용 하는 방법을 보여 줍니다.

비디오: The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish embryos, injection of plasmid DNA results in mosaic expression, allowing for the visualization of single cells or small clusters of cells 1 . We describe how injection of plasmid DNA encoding membrane-targeted Green Fluorescent Protein (mGFP) under the control of a ubiquitous promoter can be used for imaging cells undergoing neurulation. Central to this protocol is the methodology for imaging labeled cells at high resolution in sections and also in real time. This protocol entails the injection of mGFP DNA into young zebrafish embryos. Embryos are then processed for vibratome sectioning, antibody labeling and imaging with a confocal microscope. Alternatively, live embryos expressing mGFP can be imaged using time-lapse confocal microscopy. We have previously used this straightforward approach to analyze the cellular behaviors that drive neural tube formation in the hindbrain region of zebrafish embryos 2. The fixed preparations allowed for unprecedented visualization of cell shapes and organization in the neural tube while live imaging complemented this approach enabling a better understanding of the cellular dynamics that take place during neurulation.

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early embryo is the ability to image cells at high resolution. We describe here a technique for labeling single cells or small clusters of cells in whole zebrafish embryos with membrane-targeted Green Fluorescent Protein.

Zebrafish의 Hindbrain에 라벨 부착 및 이미징 셀

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish ...

연구

신경과학

A Procedure for Studying the Footshock-Induced Reinstatement of Cocaine Seeking in Laboratory Rats

The most insidious aspect of drug addiction is the high propensity for relapse. Animal models of relapse, known as reinstatement procedures, have been used extensively to study the neurobiology and phenomenology of relapse to drug use. Although procedural variations have emerged over the past several decades, the most conventional reinstatement procedures are based on the drug self-administration (SA) model. In this model, an animal is trained to perform an operant response to obtain drug. Subsequently, the behavior is extinguished by withholding response-contingent reinforcement. Reinstatement of drug seeking is then triggered by a discrete event, such as an injection of the training drug, re-exposure to drug-associated cues, or exposure to a stressor 1.
Reinstatement procedures were originally developed to study the ability of acute non-contingent exposure to the training drug to reinstate drug seeking in rats and monkeys 1, 2. Reinstatement procedures have since been modified to study the role of environmental stimuli, including drug-associated cues and exposure to various forms of stress, in relapse to drug seeking 1, 3, 4.
Over the past 15 years, a major focus of the reinstatement literature has been on the role of stress in drug relapse. One of the most commonly used forms of stress for studying this relationship is acute exposures to mild, intermittent, electric footshocks. The ability of footshock stress to induce reinstatement of drug seeking was originally demonstrated by Shaham and colleagues (1995) in rats with a history of intravenous heroin SA5. Subsequently, the effect was generalized to rats with histories of intravenous cocaine, methamphetamine, and nicotine SA, as well as oral ethanol SA 3, 6.
Although footshock-induced reinstatement of drug seeking can be achieved reliably and robustly, it is an effect that tends to be sensitive to certain parametrical variables. These include the arrangement of extinction and reinstatement test sessions, the intensity and duration of footshock stress, and the presence of drug-associated cues during extinction and testing for reinstatement. Here we present a protocol for footshock-induced reinstatement of cocaine seeking that we have used with consistent success to study the relationship between stress and cocaine seeking.

Animal models of relapse, known as reinstatement procedures, have been used extensively to study the role of stress in relapse to drug seeking. Here, we report on a method for inducing the reinstatement of cocaine seeking in laboratory rats via acute exposures to mild, intermittent electric footshock.

실험실 쥐의 추구 코카인 Footshock 유발 복직을 유학을위한 절차

The most insidious aspect of drug addiction is the high propensity for relapse.  Animal models of relapse, known as reinstatement procedures, have been ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

Neurosphere 분석을 사용하여 마우스 배아 신경 줄기 세포 문화 구축

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. Neuroepithelial cells of the neural tube that express Nkx6.1 are the unique precursor cells for spinal motoneurons1. Though postmitotic motoneurons move towards their final position and organize themselves into columns along the spinal tract2,3. More than 90% of all these differentiated and positioned motoneurons express the transcription factors Islet 1/2. They innervate the muscles of the limbs as well as those of the body and the inner organs. Among others, motoneurons typically express the high affinity receptors for brain derived neurotrophic factor (BDNF) and Neurotrophin-3 (NT-3), the tropomyosin-related kinase B and C (TrkB, TrkC). They do not express the tropomyosin-related kinase A (TrkA)4. Beside the two high affinity receptors, motoneurons do express the low affinity neurotrophin receptor p75NTR. The p75NTR can bind all neurotrophins with similar but lower affinity to all neurotrophins than the high affinity receptors would bind the mature neurotrophins. Within the embryonic spinal cord, the p75NTR is exclusively expressed by the spinal motoneurons5. This has been used to develop motoneuron isolation techniques to purify the cells from the vast majority of surrounding cells6. Isolating motoneurons with the help of specific antibodies (panning) against the extracellular domains of p75NTR has turned out to be an expensive method as the amount of antibody used for a single experiment is high due to the size of the plate used for panning. A much more economical alternative is the use of lectin. Lectin has been shown to specifically bind to p75NTR as well7. The following method describes an alternative technique using wheat germ agglutinin for a preplating procedure instead of the p75NTR antibody. The lectin is an extremely inexpensive alternative to the p75NTR antibody and the purification grades using lectin are comparable to that of the p75NTR antibody. Motoneurons from the embryonic spinal cord can be isolated by this method, survive and grow out neurites.

An alternative way of isolating mouse embryonic motoneurons from the spinal cord is described. The method takes into account the fact that lectin can bind to the low affinity nerve growth factor receptor p75NTR. This lectin-based preplating allows a purification similar to that with a specific antibody against the p75NTR.

마우스 배아의 Motoneurons의 렉틴 기반 격리와 문화

Spinal motoneurons develop towards postmitotic stages through early embryonic nervous system development and subsequently grow out dendrites and axons. ...

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C. elegans genome includes potential antipsychotic drug (APD) targets conserved in humans, including genes encoding proteins required for neurotransmitter synthesis and for synaptic structure and function. APD exposure produces developmental delay and/or lethality in nematodes in a concentration-dependent manner. These phenotypes are caused, in part, by APD-induced inhibition of pharyngeal pumping1,2. Thus, the developmental phenotype has a neuromuscular basis, making it useful for pharmacogenetic studies of neuroleptics. Here we demonstrate detailed procedures for testing APD effects on nematode development and pharyngeal pumping. For the developmental assay, synchronized embryos are placed on nematode growth medium (NGM) plates containing APDs, and the stages of developing animals are then scored daily. For the pharyngeal pumping rate assay, staged young adult animals are tested on NGM plates containing APDs. The number of pharyngeal pumps per unit time is recorded, and the pumping rate is calculated. These assays can be used for studying many other types of small molecules or even large molecules.

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Approaches for testing the effects of antipsychotic drugs (APDs) in Caenorhabditis elegans are demonstrated. Assays are described for testing drug effects on development and viability and on pharyngeal pumping rate. These methods are also applicable for pharmacogenetic experiments with drug classes other than APDs.

에서 항 정신병 약물의 작용 메커니즘을 공부하는 방법<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

개발 마우스 배아의 피질 유사 분열의 라이브 영상

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets containing specific growth factors that trigger blood vessel growth throughout the naturally avascular cornea, angiogenesis can be measured and quantified. In this assay the angiogenic response is generated over the course of several days, depending on the type and dose of growth factor used. The induction of neovascularization is commonly triggered by either basic fibroblast growth factor (bFGF) or vascular endothelial growth factor (VEGF). By combining these growth factors with sucralfate and hydron (poly-HEMA (poly(2-hydroxyethyl methacrylate))) and casting the mixture into pellets, they can be surgically implanted in the mouse eye. These uniform pellets slowly-release the growth factors over five or six days (bFGF or VEGF respectively) enabling sufficient angiogenic response required for vessel area quantification using a slit lamp. This assay can be used for different applications, including the evaluation of angiogenic modulator drugs or treatments as well as comparison between different genetic backgrounds affecting angiogenesis. A skilled investigator after practicing this assay can implant a pellet in less than 5 min per eye.

The protocol describes the corneal micropocket assay as developed in mice.

각막 Micropocket 분석 : 마우스 눈에있는 혈관의 모델

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets ...

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering the molecular signals that cooperatively guide neuronal migration in the embryonic brain is therefore important to understand how the complex neural networks form which later support postnatal life. Facial branchiomotor (FBM) neurons in the mouse embryo hindbrain migrate from rhombomere (r) 4 caudally to form the paired facial nuclei in the r6-derived region of the hindbrain. Here we provide a detailed protocol for wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains suitable to investigate the signaling pathways that regulate FBM migration. In this method, hindbrains of E11.5 mouse embryos are dissected and cultured in an open book preparation on cell culture inserts for 24 hr. During this time, FBM neurons migrate caudally towards r6 and can be exposed to function-blocking antibodies and small molecules in the culture media or heparin beads loaded with recombinant proteins to examine roles for signaling pathways implicated in guiding neuronal migration.

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the neural tube, but migrate to reach appropriate targets. Facial branchiomotor (FBM) neurons are a useful model to study neuronal migration. This protocol describes the wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains to investigate mechanisms that regulate FBM migration.

마우스 후뇌<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 문화 얼굴 Branchiomotor 신경 세포의 마이 그 레이션을 연구하는

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional afferent fibers monitor other characteristics of the muscle environment, including metabolite buildup, temperature, and nociceptive stimuli. Overall, abnormal activation of sensory neurons can lead to movement disorders or chronic pain syndromes. We describe the isolation of the extensor digitorum longus (EDL) muscle and nerve for in vitro study of stretch-evoked afferent responses in the adult mouse. Sensory activity is recorded from the nerve with a suction electrode and individual afferents can be analyzed using spike sorting software. In vitro preparations allow for well controlled studies on sensory afferents without the potential confounds of anesthesia or altered muscle perfusion. Here we describe a protocol to identify and test the response of muscle spindle afferents to stretch. Importantly, this preparation also supports the study of other subtypes of muscle afferents, response properties following drug application and the incorporation of powerful genetic approaches and disease models in mice.

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons are involved in proprioceptor signaling and also report on metabolic state and injury related events. We describe an adult mouse in vitro muscle-nerve preparation for studies on stretch-activated muscle afferents.

<em&gt; 체외</em근육의 구 심성의 소성 특성을 연구&gt; 성인 마우스 근육 - 신경 준비

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

모델로 후각 시스템은 축삭 성장 패턴 및 형태를 연구하는<em&gt; 생체</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

마우스 Hindbrain 배아 신생 공부에 대 한 모델

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Zebrafish의 Hindbrain에 라벨 부착 및 이미징 셀

실험실 쥐의 추구 코카인 Footshock 유발 복직을 유학을위한 절차

Neurosphere 분석을 사용하여 마우스 배아 신경 줄기 세포 문화 구축

마우스 배아의 Motoneurons의 렉틴 기반 격리와 문화

에서 항 정신병 약물의 작용 메커니즘을 공부하는 방법

개발 마우스 배아의 피질 유사 분열의 라이브 영상

각막 Micropocket 분석 : 마우스 눈에있는 혈관의 모델

마우스 후뇌

모델로 후각 시스템은 축삭 성장 패턴 및 형태를 연구하는