メレディス ・ ラボでの研究は、エバリー科学大学 (ペンシルベニア州立大学) によって提供されるスタートアップ資金によって支えられました。専門的技術的な助言とペンシルベニア州プロテオミクスと質量分析法による中核施設、大学公園、PA の質量分析法による分析を行った機器へのアクセス、博士タチアナ Laremore に感謝します

1. セル成長および換散
<ol><li>遅い指数段階 (外径600 1.0 1.5) に 15 mL のトリプシン大豆のスープ (TSB) または同じようなリッチ メディアの細菌を成長します。遠心分離によって細胞を収穫、トリス緩衝生理食塩水/EDTA (TBSE) で 1 回洗浄しプロトコルは、または使用するまで凍結します。 注: TBSE: 20 mM トリス塩酸 (HCl)、pH 8.0、130 mM 塩化ナトリウム (NaCl) と 5 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA))。リポ蛋白の発現と修正は、(例えば酸味、塩分、成長媒体) の成長条件と成長段階15によって影響があります。細胞の成長は望ましい、しかし 15 mL スケールが過剰なバイオマスは、リポタンパク質収量を減らすことができます、セルのリポタンパク質の 1 つの準備のため推奨です。1 つ 15 mL 準備は一般的に 2 ~ 4 の最適な読み込みのために十分なサンプルを生成標準 SDS ページのミニ ゲルの車線。</li>
	<li>800 μ L TBSE 1 mM フェニルメチル フッ素 (PMSF) と 0.5 mg/mL リゾチーム細胞を再懸濁します。スクリュー キャップと o リング 2.0 mL スレッド微量遠心チューブにソリューションを転送し、37 ° C で 20 分間インキュベート 注: 特定の種はリゾチームによる溶解に感受性がないです。換散の支援するためには、適切な酵素を置き換えてください。</li>
	<li>チューブに 〜 800 μ L 0.1 mm ジルコニア ・ シリカ ビーズを追加し、30 の 5 サイクルの圧力式ホモジナイザーの最大速度 (7,000 rpm) で揺することによって細胞を混乱させる各サイクル間氷の上残り 2 分、それぞれ s。</li>
	<li>(ビーズと切れ目のない細胞の餌) に 4 ° C で 5 分間 3000 × g で遠心分離機のサンプルです。新しい 2.0 mL 遠心チューブに上清を転送して氷の上。</li>
	<li>残りのペレットに TBSE 200 μ L を追加し、追加のサイクルのホモジナイザーに戻ります。(上記) 遠心し、(800-1000 μ L の総ボリュームあるべき) 以前の上澄みで上清を組み合わせます。</li>
</ol>2. テキサス州 114 フェーズ分割によるリポタンパク質の濃縮
<ol><li>逆解析による混合 〜 15 分毎、1 時間氷上インキュベートし、4% (巻/巻) 冷たい TBSE の界面活性剤の等しい量を追加することによって最終濃度 2% (巻/巻) のテキサス州 114 を界面活性剤で上清を補完します。 注: ときに冷やして、上澄みと界面活性剤になります混和性。</li>
	<li>37 ° C の水浴にチューブを転送し、相分離を誘発する 10 分間インキュベートします。Bi 一過性の分離を維持するために室温で 10 分間、10,000 × g でサンプルを遠心します。</li>
	<li>優しくピペットの上部の水相をオフし、破棄します。元のボリュームにチューブを補充する低い界面活性剤相に冷たい TBSE を追加し、ミックスに反転します。氷上で 10 分間インキュベートします。</li>
	<li>37 ° C の水浴にチューブを転送し、相分離を誘発する 10 分間インキュベート、室温で 10 分間、10,000 × g で遠心分離します。</li>
	<li>3 分版の合計に対して手順 2.3 2.4 をもう一度繰り返します。上層の水相を削除し、破棄します。</li>
	<li>界面活性剤相に冷たい TBSE の 1 ボリュームを追加して (管の下部に表示されます)、抽出の過程で形成された沈殿したタンパク質のペレットを削除します。不溶性タンパク質を餌に 2 分 16,000 x g で 4 ° C で遠心分離機します。 注: サンプル単相のままする必要があります。相分離が発生すると、再サンプルを冷やすし、再び遠心分離します。ペレットが非リポタンパク質の汚染物質の一般的構成の詳細な分析を保持できます。</li>
	<li>すぐに 100% アセトンの 1250 μ L を含む新鮮な 2.0 mL 遠心チューブに上清を転送します。粘性があるため先端からサンプルを洗う徹底的に上下ピペットします。逆解析による混合し、蛋白質を沈殿させるのに-20 ° C で一晩インキュベートします。</li>
	<li>管の向きに注意してリポタンパク質ペレットを室温で 20 分間 16,000 x g でサンプルを遠心します。リポタンパク質管の外の壁に沿って薄く、白い膜が形成されます。</li>
	<li>100% アセトンで 2 回ペレットを洗浄します。アセトンをデカントし、乾燥空気サンプルを許可します。</li>
	<li>10 mm トリス-HCl、pH 8.0 または標準的な塩化物イオンと SDS ページ サンプル バッファー16 20 40 μ L を追加し、沈殿したリポタンパク質が付いている壁に対して上下にピペッティングして徹底的に再懸濁します。リポタンパク質を取り除くためピペット チップ、チューブの側面をこすり。 注: リポタンパク質は Tris バッファーでは分解しないが、懸濁液を形成します。<ol>
<li>使用するまで-20 ° C でリポを保存します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. SDS-PAGE、ウェスタンブロッティング、およびプロトコルが Ponceau s 染色
<ol><li>標準的な方法16を使用して SDS ページによる独立したリポタンパク質。 注: 適切なゲル アクリルアミドの割合は、その使用目的とリポタンパク質のサイズによって異なります。ここでは、 e. フェカリスリポタンパク質分離された 10% 以上トリス-グリシン ゲル大腸菌小さい Lpp17リポタンパク質の 16.5% トリス トリシン ゲルが使用されていた。</li>
	<li>標準的な電気的ブロッティング法プロシージャを使用してニトロセルロース転送膜にリポ蛋白を転送します。 注: Bjerrum シェーファー ニールセン バッファー プラス 0.1 %sds を使用して半乾燥の転送は、25 V、1.3 で行われた 15 分18mA。また、ブロッティング (PVDF) される可能性があります、しかし、それは後の手順で膜から疎水性 lipopeptides の効率的な溶出を減らすことがニトロセルロースより疎水性よりは。</li>
	<li>硝酸セルロースの膜を Ponceau S 溶液 (0.2% (w/v) Ponceau S 5% 酢酸) でカバーしてコンテナーに転送します。ロック 5 分間優しくまたは赤ピンクのバンドが表示されるまで。</li>
	<li>Ponceau S 溶液を捨て、dH2過剰な削除する O 染色と硝酸セルロースの膜を慎重にすすいでください。 注: Ponceau ステンド帯域が急速にすすぐ。バンドが表示されなくなった場合は、染色の手順を繰り返します。</li>
	<li>きれいなかみそりの刃を持つバンドと微量遠心チューブへの転送を切除します。DH2O にバンドを完全にすすぐの 1 mL で 3 回洗浄します。 注: プロトコルはここで一時停止することができます。使用するまで-20 ° C で水で覆われて切除のセクションを格納します。</li>
	<li>きれいなかみそりの刃ときれいな表面にセクションを転送、0.5 mL 低蛋白結合遠心チューブに個小片のおよそ 1 mm x 1 mm. 収集にニトロセルロース ストリップをサイコロします。</li>
	<li>出来立ての 50 mM 重炭酸アンモニウム (NH4HCO3)、0.5 mL で 2 回部分を洗浄し高速液体クロマトグラフィー (HPLC) グレード水で pH 7.8。</li>
</ol>4. トリプシン消化、硝酸セルロースの膜、MALDI ターゲット、およびデータ集録の沈着からリポペプチド抽出
<ol><li>50 mM NH4HCO3、pH 7.8 HPLC グレードの水でトリプシンの 20 μ g/mL の溶液の 20 μ l 硝酸セルロースの部分を再懸濁します。ミックスする渦は、すべての作品が、トリプシン溶液によって完全に覆われていることを確保するため簡単にスピンします。蒸発を防ぐために、ダイジェスト 37 ° C で一晩インキュベート パラフィン フィルムを使用してチューブの蓋をカバーします。</li>
	<li>スピン 30 s や削除ピペッティングによる液体のための 16,000 x g でサンプル。 注: これはトリプシンの親水性ペプチド MALDI-TOF 質量分析法によるタンパク質の同定を後で調べることが削除されます。</li>
	<li>HPLC グレードの水に 0.5% トリフルオロ酢酸 (TFA) の 50 μ L を追加します。渦の回転のすべての部分は、ソリューションによって覆われていることを確認する簡単にサンプルを。室温で 10 分間インキュベートします。ピペッティングで液体を削除します。 注意:TFA は吸入すると有害です。注意して処理し、化学の発煙のフードを使用します。皮膚との接触を避けてください。</li>
	<li>手順 4.3 10% アセトニ トリル HPLC グレードの水の 50 μ L を繰り返します。 注意:アセトニ トリルは吸入すると有害です。注意して処理し、化学の発煙のフードを使用します。皮膚との接触を避けてください。</li>
	<li>手順 4.3 20% アセトニ トリル HPLC グレードの水の 50 μ L を繰り返します。 注: これは緩く、ニトロセルロースにバインドされている任意の緩やかな疎水性ペプチドを削除します。</li>
	<li>溶出が緊密にバインドされた lipopeptides をクロロホルム-メタノール (2:1、v/v) に溶解したて 10 mg/mL α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸 (CHCA) マトリックスの 15 μ L を追加し、断続的なボルテックスを室温で 10 分間インキュベートします。<ol>
<li>または、追加 15 μ L クロロホルム-メタノール溶出が lipopeptides と後で行列と混ぜます。2, 5-ジヒドロキシ安息香酸 (DHB) など、他の行列は、不満足な結果が特定のリポペプチド コンポジションの場合 CHCA に代わるものとしてテスト必要があります。 注意:クロロホルム、メタノール、吸入すると有害。注意して処理し、化学の発煙のフードを使用します。皮膚との接触を避けてください。</li>
		<li>
オプション:ナトリウムを促進する付加体を形成、1 mM の最終的な集中に炭酸水素ナトリウム水溶液 (NaHCO3) とクロロホルム - メタノール CHCA のソリューションを補完します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>サンプルを簡単にスピンします。ピペット、新しい低蛋白結合遠心チューブに液体を慎重に転送します。このソリューションは、N 末端 lipopeptides の大部分を含まれます。 注: 硝酸セルロース部分的または完全に分解するかもしれないことクロロホルム-メタノール溶液中。これは MS の結果、マイナス影響を及ぼさない、リポペプチド リターンを高めるに代替手段として使用することがあります。PVDF 膜は同じように分解しません。</li>
	<li>洗練された鋼 MALDI ターゲットに CHCA で溶出した lipopeptides の 1 μ L を入金します。 注: クロロホルム-メタノールは迅速に、結晶の CHCA と lipopeptides を残して蒸発されます。オプション 2 番目 1 μ L 分注は、サンプル濃度を増加する同じ場所上に堆積することができます。クロロホルム-メタノールはターゲットに沈着後大幅に広がる可能性があり、よう、注意が必要サンプルがターゲットの混合を避けるために。預金、各サンプルの複数のスポットを撮影することをお勧めします。</li>
	<li>すぐに質量分析に進みます。特に場合は、スポットは、2 番目の層は、スポットの外側の縁に、lipopeptides をプッシュ可能性がありますサンプルでは、2 つの層は、リポペプチド信号のためのスポットのすべての領域をスキャンします。 注: 推奨される開始レーザー強度が 25%、信号を集録し、十分な信号対雑音比を達成するために複数のスペクトル (20 以上スキャン) の合計強度を高める必要があります。ここでは、スペクトルは MALDI-TOF TOF の計測器で得られた (材料の表を参照してください) リフレクター陽イオン検出 700-3500 m/z範囲にわたって工場構成楽器法を用いたします。ウシ血清アルブミン (BSA) のトリプシン ペプチド混合物と計測器が校正されました。</li>
</ol>

<ol>
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著者が明らかに何もありません。

本プロトコルは、リポタンパク質特性の 2 つの明瞭な段階を記述: テキサス州 114 によって濃縮相 MALDI-TOF 質量分析法による分割と構造決定。テキサス州 114 抽出中に追加の遠心分離は高濃縮のリポタンパク質を生成するアセトンの沈殿物に続いて、このプロセス中に沈殿汚染タンパク質を削除します。各セル 15 mL 分の準備の規模を制限すると、いくつかのサンプルすることができます簡単に?...

細菌のリポタンパク質は、節約された N ターミナル脂質修飾システイン細胞膜の表面に球状タンパク質ドメインをアンカーによって特徴付けられます。彼らは普遍的に、典型的なゲノム1内のすべての細胞遺伝子の 2 ~ 5% を構成する細菌で配布されます。リポタンパク質はさまざまな養分吸収、シグナル伝達、細胞プロセスで重要な役割を再生、タンパク質複合体の維持およびアセンブリ細胞エンベロープ構造健全性2。病原性細菌のリポタンパク質は病原性因子3,4として機能します。感染中は、Toll 様受容体 (TLR) 2 によって N 末端 lipopeptides の認識は侵入病原体を削除する自然免疫応答を誘発します。N 末端のアシル化状態に応じてリポタンパク質一般に代替 TLR2 ヘテロ二量体複合体によって認識されます。TLR2 TLR1 は、TLR2 TLR6 バインド無料リポペプチド α-アミノ酸テルミニ間の N アシル化 lipopeptides を認識しています。炎症性サイトカイン3,4の分泌を誘発するのにバインドされた後、シグナル伝達経路は収束します。
以前、グラム陽性細菌由来のリポ蛋白だったおよびグラム陰性菌からの diacylated triacylated、節約された N ターミナル システイン残基のアミド結合脂肪酸の有無が異なると考えた。この仮定は、Lnt、triacylated リポ蛋白5を形成するグラム陰性 N アシル転移酵素にグラム陽性菌ゲノムのシーケンスのオルソログ遺伝子の欠如によって支えられました。しかし、最近の研究は明らかにグラム陽性フィルミクテス門その欠如lntでリポ triacylation として、ペプチド、lyso とN -アセチル フォーム6,7 と呼ばれる 3 つの新規 N ターミナル リポタンパク質構造 ,8。これらの調査結果はまだ発見の可能なリポ蛋白フォーム、様々 な形態を伝えるこれらの小説のリポタンパク質の作り方について基本的な質問どのような生理学的な目的や利点と一緒にについて問題を提起します。さらに、彼らは明らかに、リポ蛋白質の構造を予測するためのゲノム科学の現在できないことを示しています。確かに、リポタンパク質 N アシル基転移酵素は、腸球菌セレウス菌、lyso フォーム リポタンパク質9から点灯と呼ばれるの新しいクラスが最近わかりました。これは実験的、非常に疎水性とその分子構造の特性評価に利用可能な限られた方法のために挑戦することができますリポ蛋白の構造を確認する必要を示します。
リポ蛋白質 N 末端構造決定と同様に、宿主の免疫応答の誘導に関する研究を容易にするには、我々 は細菌性リポ蛋白質を浄化し、トリプシンの N 末端を準備するためにいくつか説明したプロトコルを適応しています。MALDI-TOF MS6,10、11,12による解析のための lipopeptides。リポタンパク質は、汚染の非リポタンパク質を削除し、リポタンパク質の収穫を増加するための最適化を使用してメソッドを分割設立 (界面活性剤またはテキサス州 114 と今後は呼ばれる) Triton X-114 位相を用いた濃縮されています。これらの脂蛋白質は SDS ページによって更に精製、TLR の試金で直接使用するために適しています。MALDI-TOF MS の硝酸セルロースの膜にリポ蛋白の転送はトリプシン消化効率の良いその場の足場を提供し、洗浄、および高の結果、膜表面からその後溶出精製 N 末端 lipopeptides。ニトロセルロースは検体の取扱いを容易にし、リポタンパク質9,10 と同様に不可欠な膜蛋白質13,14から高疎水性ペプチド シーケンス カバレッジを向上させる示されています。.このメソッドは単一の実験の N 末端構造決定と同時に精度の高いタンパク質同定の中間洗浄ソリューションを解析するので、極性に基づくペプチドを分留の付加的な利点.このプロトコル一意に機能意図的なナトリウムは、MS/MS Nアシル化状態の構造の割り当てを支援中に dehydroalanyl イオンに向かって親イオン化を促進するために形成を付加物します。N 末端は、リポタンパク質の TLR の認識に関連する最も変数とキーの両方の機能です。一緒に取られて、このプロトコルが精製と簡単に実験の全体的な目標に応じて適応 MALDI-TOF 質量分析法による構造決定の個々 の段階でのリポタンパク質に集中的に、再現性のある研究をできました。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.01 mm Zirconia/silica beads</td><td>BioSpec Products</td><td>110791012</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>EMD</td><td>AX0073-9</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>EMD</td><td>AX0116-6</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>EMD</td><td>AX0142-6</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium bicarbonate</td><td>Fluka Analytical</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>BioTrace NT Nitrocellulose</td><td>PALL Life Sciences</td><td>66485</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA) digest standard</td><td>Protea</td><td>PS-204-1</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Acros Organics</td><td>423550025</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Grade water</td><td>EMD</td><td>WX0008-1</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP535-1</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF)</td><td>Amresco</td><td>0754</td><td></td></tr><tr><td>Pierce trypsin protease</td><td>Thermo Scientific</td><td>90057</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Acros Organics</td><td>161470100</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind Tube 0.5mL</td><td>Eppendorf</td><td>022431064</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792519</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>7581-06</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>299537</td><td></td></tr><tr><td>Tris-hydrochloride (HCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-114</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93422</td><td></td></tr><tr><td>Tryptic soy broth (TSB)</td><td>BD</td><td>211822</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-cyano-4-hydroxycinnamic acid (MS Grade)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8982</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MagNALyser</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF target</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultraflextreme MALDI-TOF-TOF</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td>Equipped with a 355 nm frequency-tripled Nd:YAG smartbeam-II laser</td></tr></tbody></table>

enrichment of bacterial lipoproteins and preparation of n-terminal lipopeptides for structural determination by mass spectrometry

リポ蛋白は、細胞膜の重要な構成要素と哺乳動物の生得の免疫反応の強力な活性剤です。細胞生理学と免疫学にその重要性にもかかわらず多くの新しいリポ フォーム、合成方法、および宿主免疫能に関する様々 な形態の影響について発見される遺跡します。リポタンパク質に関する徹底した研究を有効にするには、このプロトコルを記述する細菌のリポタンパク質濃縮法と N 末端トリプシン lipopeptides のマトリックス支援レーザによる構造決定のための準備脱離イオン化飛行時質量 (MALDI-TOF MS)。プロトコルにはリポタンパク質の抽出と濃縮細菌の細胞膜から分割設立 Triton X-114 段階で拡大して、リポ蛋白の収率を増加させる、非リポタンパク質の汚染物質を除去する追加の手順が含まれていて、純度。リポタンパク質は、Toll 様受容体 (TLR) 試金で一般に使用され、最初 MALDI-TOF さん・・・による N 末端構造を特徴づける重要なは、N 末端の濃縮濃縮された疎水性ペプチドを分離する手法を提案します。lipopeptides ナトリウム Dodecyl 硫酸塩ポリ アクリルアミド ゲル電気泳動 (SDS-PAGE) によって分離されている MALDI-TOF MS さんのリポタンパク質の直接分析に適したニトロセルロース膜に転送されますその場で消化トリプシン、順番にポーラー由来ペプチドを削除する洗浄し、最後にクロロホルム-メタノールで溶出します。洗浄溶液からより極 trypsinized ペプチドの MS と相まって、このメソッドは、リポ蛋白質を識別して単一の実験でその N 末端を特徴付けるのための機能を提供します。意図的なナトリウム付加体形成より多く構造的に有益な断片化スペクトルを促進するツールとしても採用することができます。最終的には、リポタンパク質の濃縮とその N 末端構造の決定は、細菌蛋白質のこのユビキタス クラスのより広範な調査が許可されます。

プロトコルの概略は、図 1で提供しています。テキサス州 114 によって腸球菌ATCC 19433 から抽出されたリポ蛋白濃縮率は図 2に示します。比較、また沈殿の蛋白分画の帯状の模様が表示されます。この画分からの蛋白質は非常に豊富なリポタンパク質 (表 1) 以外のタンパク質を汚染する MALDI MS によって確?...

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Enrichment of Bacterial Lipoproteins and Preparation of N-terminal Lipopeptides for Structural Determination by Mass Spectrometry

細菌のリポタンパク質と質量分析法による構造決定のための N 末端 Lipopeptides 準備の充実

非イオン性界面活性剤相分割手法を用いた細菌のリポタンパク質の濃縮は、TLR の試金で直接使用したり、他のアプリケーションの説明します。詳細さらなるステップは、質量分析法による構造解析の N 末端トリプシン lipopeptides を準備します。

Lipoproteins are important constituents of the bacterial cell envelope and potent activators of the mammalian innate immune response. Despite their ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.5K ビュー.  Pennsylvania State University. 非イオン性界面活性剤相分割手法を用いた細菌のリポタンパク質の濃縮は、TLR の試金で直接使用したり、他のアプリケーションの説明します。詳細さらなるステップは、質量分析法による構造解析の N 末端トリプシン lipopeptides を準備します。

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Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS can be subdivided into three domains: the distal O-polysaccharide, a core oligosaccharide, and the lipid A domain consisting of a lipid A molecular species and 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid residues (Kdo). The lipid A domain is the only component essential for bacterial cell survival. Following its synthesis, lipid A is chemically modified in response to environmental stresses such as pH or temperature, to promote resistance to antibiotic compounds, and to evade recognition by mediators of the host innate immune response. The following protocol details the small- and large-scale isolation of lipid A from gram-negative bacteria. Isolated material is then chemically characterized by thin layer chromatography (TLC) or mass-spectrometry (MS). In addition to matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF) MS, we also describe tandem MS protocols for analyzing lipid A molecular species using electrospray ionization (ESI) coupled to collision induced dissociation (CID) and newly employed ultraviolet photodissociation (UVPD) methods. Our MS protocols allow for unequivocal determination of chemical structure, paramount to characterization of lipid A molecules that contain unique or novel chemical modifications. We also describe the radioisotopic labeling, and subsequent isolation, of lipid A from bacterial cells for analysis by TLC. Relative to MS-based protocols, TLC provides a more economical and rapid characterization method, but cannot be used to unambiguously assign lipid A chemical structures without the use of standards of known chemical structure. Over the last two decades isolation and characterization of lipid A has led to numerous exciting discoveries that have improved our understanding of the physiology of gram-negative bacteria, mechanisms of antibiotic resistance, the human innate immune response, and have provided many new targets in the development of antibacterial compounds.

Isolation and characterization of the lipid A domain of lipopolysaccharide (LPS) from gram-negative bacteria provides insight into cell surface based mechanisms of antibiotic resistance, bacterial survival and fitness, and how chemically diverse lipid A molecular species differentially modulate host innate immune responses.

グラム陰性菌からの単離とリピドAの化学特性評価

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

化学

Defining Substrate Specificities for Lipase and Phospholipase Candidates

Microorganisms produce a wide spectrum of (phospho)lipases that are secreted in order to make external substrates available for the organism. Alternatively, other (phospho)lipases may be physically associated with the producing organism causing a turnover of intrinsic lipids and frequently giving rise to a remodeling of the cellular membranes. Although potential (phospho)lipases can be predicted with a number of algorithms when the gene/protein sequence is available, experimental proof of the enzyme activities, substrate specificities, and potential physiological functions has frequently not been obtained. This manuscript describes the optimization of assay conditions for prospective (phospho)lipases with unknown substrate specificities and how to employ these optimized conditions in the search for the natural substrate of a respective (phospho)lipase. Using artificial chromogenic substrates, such as p-nitrophenyl derivatives, may help to detect a minor enzymatic activity for a predicted (phospho)lipase under standard conditions. Having encountered such a minor enzymatic activity, the distinct parameters of an enzyme assay can be varied in order to obtain a more efficient hydrolysis of the artificial substrate. After having determined the conditions under which an enzyme works well, a variety of potential natural substrates should be assayed for their degradation, a process that can be followed employing distinct chromatographic methods. The definition of substrate specificities for new enzymes, often provides hypotheses for a potential physiological role of these enzymes, which then can be tested experimentally. Following these guidelines, we were able to identify a phospholipase C (SMc00171) that degrades phosphatidylcholine to phosphocholine and diacylglycerol, in a crucial step for the remodeling of membranes in the bacterium Sinorhizobium meliloti upon phosphorus-limiting conditions of growth. For two predicted patatin-like phospholipases (SMc00930 and SMc01003) of the same organism, we could redefine their substrate specificities and clarify that SMc01003 is a diacylglycerol lipase.

Many predicted (phospho)lipases are poorly characterized with regard to their substrate specificities and physiological functions. Here we provide a protocol to optimize enzyme activities, search for natural substrates, and propose physiological functions for these enzymes.

リパーゼ及びホスホリパーゼ候補者のための基質特異性を定義します

Microorganisms produce a wide spectrum of (phospho)lipases that are secreted in order to make external substrates available for the organism. ...

生化学

Isolation and Preparation of Bacterial Cell Walls for Compositional Analysis by Ultra Performance Liquid Chromatography

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the face of turgor pressures several atmospheres in magnitude. Across the diverse shapes and sizes of the bacterial kingdom, the cell wall is composed of peptidoglycan, a macromolecular network of sugar strands crosslinked by short peptides. Peptidoglycan&#8217;s central importance to bacterial physiology underlies its use as an antibiotic target and has motivated genetic, structural, and cell biological studies of how it is robustly assembled during growth and division. Nonetheless, extensive investigations are still required to fully characterize the key enzymatic activities in peptidoglycan synthesis and the chemical composition of bacterial cell walls. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) is a powerful analytical method for quantifying differences in the chemical composition of the walls of bacteria grown under a variety of environmental and genetic conditions, but its throughput is often limited. Here, we present a straightforward procedure for the isolation and preparation of bacterial cell walls for biological analyses of peptidoglycan via HPLC and Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC), an extension of HPLC that utilizes pumps to deliver ultra-high pressures of up to 15,000 psi, compared with 6,000 psi for HPLC. In combination with the preparation of bacterial cell walls presented here, the low-volume sample injectors, detectors with high sampling rates, smaller sample volumes, and shorter run times of UPLC will enable high resolution and throughput for novel discoveries of peptidoglycan composition and fundamental bacterial cell biology in most biological laboratories with access to an ultracentrifuge and UPLC.

The bacterial cell wall is composed of peptidoglycan, a macromolecular network of sugar strands crosslinked by peptides. Ultra Performance Liquid Chromatography provides high resolution and throughput for novel discoveries of peptidoglycan composition. We present a procedure for the isolation of cell walls (sacculi) and their subsequent preparation for analysis via UPLC.

超高性能液体クロマトグラフィーによる組成解析のための細菌細胞壁の分離と調製

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of virion morphogenesis. Quantitative lipid droplet proteome analysis can be used to identify proteins that localize to or are displaced from lipid droplets under conditions such as virus infections. Here, we describe a protocol that has been successfully used to characterize the changes in the lipid droplet proteome following infection with HCV. We use Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Cell Culture (SILAC) and thus label the complete proteome of one population of cells with &#34;heavy&#34; amino acids to quantitate the proteins by mass spectrometry. For lipid droplet isolation, the two cell populations (i.e.&#160;HCV-infected/&#34;light&#34; amino acids and uninfected control/&#34;heavy&#34; amino acids) are mixed 1:1 and lysed mechanically in hypotonic buffer. After removing the nuclei and cell debris by low speed centrifugation, lipid droplet-associated proteins are enriched by two subsequent ultracentrifugation steps followed by three washing steps in isotonic buffer. The purity of the lipid droplet fractions is analyzed by western blotting with antibodies recognizing different subcellular compartments. Lipid droplet-associated proteins are then separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) followed by Coomassie staining. After tryptic digest, the peptides are quantified by liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). Using this method, we identified proteins recruited to lipid droplets upon HCV infection that might represent pro- or antiviral host factors. Our method can be applied to a variety of different cells and culture conditions, such as infection with pathogens, environmental stress, or drug treatment.

Lipid droplets are important organelles for the replication of several pathogens, including the Hepatitis C Virus (HCV). We describe a method to isolate lipid droplets for quantitative mass spectrometry of associated proteins; it can be used under a variety of conditions, such as virus infection, environmental stress, or drug treatment.

定量的質量分析のための脂肪滴の分離

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the majority of exogenous fatty acids are present within host lipoprotein particles. Uncertainty remains as to the reservoirs of host fatty acids and the mechanisms by which bacteria extract fatty acids from the lipoprotein particles. In this work, we describe protocols for enrichment of low-density lipoprotein (LDL) particles from chicken egg yolk and determining whether LDLs serve as fatty acid reservoirs for S. aureus. This method exploits unbiased lipidomic analysis and chicken LDLs, an effective and economical model for the exploration of interactions between LDLs and bacteria. The analysis of S. aureus integration of exogenous fatty acids from LDLs is performed using high-resolution/accurate mass spectrometry and tandem mass spectrometry, enabling the characterization of the fatty acid composition of the bacterial membrane and unbiased identification of novel combinations of fatty acids that arise in bacterial membrane lipids upon exposure to LDLs. These advanced mass spectrometry techniques offer an unparalleled perspective of fatty acid incorporation by revealing the specific exogenous fatty acids incorporated into the phospholipids. The methods outlined here are adaptable to the study of other bacterial pathogens and alternative sources of complex fatty acids.

This method provides a framework for studying incorporation of exogenous fatty acids from complex host sources into bacterial membranes, particularly Staphylococcus aureus. To achieve this, protocols for the enrichment of lipoprotein particles from chicken egg yolk and subsequent fatty acid profiling of bacterial phospholipids utilizing mass spectrometry are described.

細菌病原体脂肪酸を膜リン脂質に取り込む研究のための鶏卵黄からのリポタンパク質粒子の単離

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral membrane enzymes, resulting in triacylated proteins. The first step in the lipoprotein modification pathway involves the transfer of a diacylglyceryl group from phosphatidylglycerol onto the prolipoprotein, resulting in diacylglyceryl prolipoprotein. In the second step, the signal peptide of prolipoprotein is cleaved, forming an apolipoprotein, which in turn is modified by a third fatty acid derived from a phospholipid. This last step is catalyzed by apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt). The lipoprotein modification pathway is essential in most &#947;-proteobacteria, making it a potential target for the development of novel antibacterial agents. Described here is a sensitive assay for Lnt that is compatible with high-throughput screening of small inhibitory molecules. The enzyme and substrates are membrane-embedded molecules; therefore, the development of an in vitro test is not straightforward. This includes the purification of the active enzyme in the presence of detergent, the availability of alkyne-phospholipids and diacylglyceryl peptide substrates, and the reaction conditions in mixed micelles. Furthermore, in order to use the activity test in a high-throughput screening (HTS) setup, direct readout of the reaction product is preferred over coupled enzymatic reactions. In this fluorometric enzyme assay, the alkyne-triacylated peptide product is rendered fluorescent through a click-chemistry reaction and detected in a multiwell plate format. This method is applicable to other acyltransferases that use fatty acid-containing substrates, including phospholipids and acyl-CoA.

Presented here is a sensitive fluorescence assay to monitor apolipoprotein N-acyltransferase activity using diacylglyceryl peptide and alkyne-phospholipids as substrates with click-chemistry.

酵素特性評価からハイスループットスクリーニングまでのアポリポタンパク質N-アシルトランスフェラーゼのクリックケミストリーベースの蛍光アッセイ(英語)

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan structure are fairly conserved across all bacteria, there is also considerable variation between Gram-positives/negatives and between species. In addition, there are numerous known variations, modifications, or adaptations to the peptidoglycan that can occur within a bacterial species in response to growth phase and/or environmental stimuli. These variations produce a highly dynamic structure that is known to participate in many cellular functions, including growth/division, antibiotic resistance, and host defense avoidance. To understand the variation within peptidoglycan, the overall structure must be broken down into its constitutive parts (known as muropeptides) and assessed for overall cellular composition. Peptidoglycomics uses advanced mass spectrometry combined with high-powered bioinformatic data analysis to examine peptidoglycan composition in fine detail. The following protocol describes the purification of peptidoglycan from bacterial cultures, the acquisition of muropeptide intensity data through a liquid chromatograph&#8212;mass spectrometer, and the differential analysis of peptidoglycan composition using bioinformatics.

This protocol covers a detailed analysis of peptidoglycan composition using liquid chromatography mass spectrometry coupled with advanced feature extraction and bioinformatic analysis software.

液体クロマトグラフィー質量分析とバイオインフォマティクスによるペプチドグリカンの半定量分析

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug discovery because they are the targets of more than half of all drugs. An obstacle to conducting biochemical, biophysical, and structural studies of membrane proteins as well as antibody development has been the difficulty in producing large amounts of high-quality membrane protein with correct conformation and activity. Here we describe a &#8220;bilayer-dialysis method&#8221; using a wheat germ cell-free system, liposomes, and dialysis cups to efficiently synthesize membrane proteins and prepare purified proteoliposomes in a short time with a high success rate. Membrane proteins can be produced as much as in several milligrams, such as GPCRs, ion channels, transporters, and tetraspanins. This cell-free method contributes to reducing the time, cost and effort for preparing high-quality proteoliposomes, and provides suitable means for functional analysis of membrane proteins, drug targets screening, and antibody development.

This protocol describes an efficient cell-free method for production of high-quality proteoliposome by bilayer-dialysis method using wheat cell-free system and liposomes. This method provides suitable means for functional analysis of membrane proteins, drug targets screening, and antibody development.

膜タンパク質を標的とした機能解析と抗体開発のためのプロテオリポソームの無細胞生産

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown into highly ordered two-dimensional (2D) crystals under favorable conditions. The quality of the grown 2D crystals is crucial to the resolution of the final reconstruction via 2D image processing. Over the years, lipid monolayers have been used as a supporting layer to foster the 2D crystallization of peripheral membrane proteins as well as soluble proteins. This method can also be applied to 2D crystallization of integral membrane proteins but requires more extensive empirical investigation to determine detergent and dialysis conditions to promote partitioning to the monolayer. A lipid monolayer forms at the air-water interface such that the polar lipid head groups remain hydrated in the aqueous phase and the non-polar, acyl chains, tails partition into the air, breaking the surface tension and flattening the water surface. The charged nature or distinctive chemical moieties of the head groups provide affinity for proteins in solution, promoting binding for 2D array formation. A newly formed monolayer with the 2D array can be readily transfer into an electron microscope (EM) on a carbon-coated copper grid used to lift and support the crystalline array. In this work, we describe a lipid monolayer methodology for cryogenic electron microscopic (cryo-EM) imaging.

Lipid monolayers have been used as a foundation for forming two-dimensional (2D) protein crystals for structural studies for decades. They are stable at the air-water interface and can serve as a thin supporting material for electron imaging. Here we present the proven steps on preparing lipid monolayers for biological studies.

電子結晶学研究のための脂質単層法を用いたサンプル調製

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...

High-Resolution Studies of Proteins in Natural Membranes by Solid-State NMR

Membrane proteins are vital for cell function and thus represent important drug targets. Solid-state Nuclear Magnetic Resonance (ssNMR) spectroscopy offers a unique access to probe the structure and dynamics of such proteins in biological membranes of increasing complexity. Here, we present modern solid-state NMR spectroscopy as a tool to study structure and dynamics of proteins in natural lipid membranes and at atomic scale. Such spectroscopic studies profit from the use of high-sensitivity ssNMR methods, i.e., proton-(1H)-detected ssNMR and DNP (Dynamic Nuclear Polarization) supported ssNMR. Using bacterial outer membrane beta-barrel protein BamA and the ion channel KcsA, we present methods to prepare isotope-labeled membrane proteins and to derive structural and motional information by ssNMR.

This work details robust basic routines on how to prepare isotope-labeled membrane protein samples and analyze them at high-resolution with modern solid-state NMR spectroscopy methods.

Membrane proteins are vital for cell function and thus represent important drug targets. Solid-state Nuclear Magnetic Resonance (ssNMR) spectroscopy ...