Forschung im Labor Meredith wurde von Start-up aus Mitteln der Eberly Hochschule der Wissenschaft (Pennsylvania State University) unterstützt. Wir danken Dr. Tatiana Laremore für kompetente technische Beratung und Zugang zu Geräten an der Penn State Proteomics und Mass Spectrometry Core Facility, University Park, PA, wo massenspektrometrische Analysen durchgeführt wurden.

(1) Zelle Wachstum und Lyse
<ol><li>Wachsen Sie Bakterien in 15 mL tryptic Soy Bouillon (TSB) oder ähnliche rich Media zu späten exponentiellen Phase (OD600 von 1,0-1,5). Ernten von Zellen durch Zentrifugation, einmal mit Tris-gepufferte Kochsalzlösung/EDTA (TBSE) waschen und mit Protokoll fortfahren oder bis zum Gebrauch einfrieren. Hinweis: TBSE: 20 mM Tris-Hydrochlorid (HCl), pH 8.0, 130 mM Natriumchlorid (NaCl), und 5 mM Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)). Lipoprotein-Ausdruck und Modifikation können durch Wachstumsbedingungen (z.B. Säure, Salzgehalt, Wachstumsmedien) und Wachstum Phase15beeinflusst werden. Zellwachstum kann skaliert werden, wie gewünscht, sondern 15 mL von Zellen ist für eine einzelne Vorbereitung der Lipoproteine empfehlen, da überschüssige Biomasse Lipoprotein Ertrag verringern kann. Eine 15-mL-Vorbereitung ergibt in der Regel genügend Blut für die optimale Beladung von ~ 2-4 Fahrspuren auf einem standard Mini SDS-PAGE-Gel.</li>
	<li>Zellen in 800 μl TBSE mit 1 mM Phenylmethyl Sulfonyl Fluorid (PMSF) und 0,5 mg/mL Lysozym aufzuwirbeln. Lösung zu einem 2,0 mL Gewinde Microcentrifuge Schlauch mit Schraubverschluss und o-Ring zu übertragen und 20 min bei 37 ° c inkubieren Hinweis: Bestimmte Arten sind nicht anfällig für Lyse von Lysozym. Eine entsprechende lytische Enzym sollten ersetzt werden, um Lyse zu erleichtern.</li>
	<li>Die Röhre ~ 800 μl 0.1 mm Zirkonia/Kieselsäure Perlen hinzu und stören Zellen durch Schütteln mit maximaler Geschwindigkeit (7.000 u/min) auf einem Homogenisator für 5 Zyklen von 30 s jeweils mit 2 min ruhen auf dem Eis zwischen jedem Zyklus.</li>
	<li>Zentrifuge Probe bei 3000 X g für 5 min bei 4 ° C (pellet-Perlen und ungebrochene Zellen). Übertragen Sie den überstand zu, zu einem neuen 2,0 mL Microcentrifuge Schlauch und halten Sie auf dem Eis.</li>
	<li>Die restlichen Pellets 200 μL TBSE hinzu und zurück zu den Homogenisator für einen weiteren Zyklus. Zentrifugieren Sie (siehe oben) und kombinieren Sie überstand mit der vorherigen überstand (sollte 800-1000 μl Gesamtvolumen) zu.</li>
</ol>(2) Anreicherung von Lipoproteinen durch TX-114 Phase Partitionierung
<ol><li>Den Überstand mit TX-114 Tensid, eine Endkonzentration von 2 % (Vol/Vol) durch das Hinzufügen von ein gleiches Volumen von 4 % (Vol/Vol) das Tensid in eiskalten TBSE ergänzen und Inkubation für 1 h, mischen durch Umkehrung jedes ~ 15 min auf Eis. Hinweis: Wenn gekühlt, wird der überstand und Tensid mischbar sein.</li>
	<li>Übertragen Sie das Rohr auf 37 ° C Wasserbad und inkubieren Sie für 10 min, Phasentrennung zu induzieren. Zentrifugieren Sie die Probe bei 10.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur , Bi-phasisch Trennung aufrechtzuerhalten.</li>
	<li>Vorsichtig aus der oberen wässrigen Phase pipette und verwerfen. Die untere Tensid-Phase um das Rohr zu seinem ursprünglichen Volumen wieder aufzufüllen eiskalte TBSE hinzu und kehren Sie um zu mischen. Inkubieren Sie für 10 min auf Eis.</li>
	<li>Übertragen Sie das Rohr auf 37 ° C Wasserbad inkubieren 10 min induzieren Phasentrennung und Zentrifugieren bei 10.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 2,3-2,4 einmal mehr für eine Gesamtmenge von 3 Trennungen. Entfernen der oberen wässrigen Phase und entsorgen.</li>
	<li>Entfernen Sie Pellet ausgefällten Proteine, die im Laufe der Extraktionen (sichtbar an der Unterseite des Rohrs), gebildet, indem die Tensid-Phase 1 Volumen von eiskalten TBSE hinzufügen. Zentrifugieren Sie bei 4 ° C bei 16.000 x g für 2 min zu unlöslichen Protein Pellets. Hinweis: Probe sollte eine einzelne Phase bleiben. Wenn Phasentrennung auftritt, neu chill Probe und Zentrifugieren Sie wieder. Das Pellet besteht im Allgemeinen aus nicht-Lipoprotein Verunreinigungen, aber zur weiteren Analyse beibehalten werden.</li>
	<li>Übertragen Sie den überstand sofort zu einem frischen 2,0 mL Microcentrifuge Schlauch mit 1250 μl 100 % Aceton Pipette oben und unten gründlich, um die Probe von der Spitze zu waschen, wie es zähflüssig sein wird. Mischen Sie durch Umkehrung und Inkubation über Nacht bei-20 ° C Protein ausgefällt.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Probe bei 16.000 x g für 20 min bei Raumtemperatur, pellet-Lipoproteine mit Augenmerk auf die Ausrichtung des Rohres. Lipoproteine bildet einen dünnen, weißen Film entlang der Außenwand des Rohres.</li>
	<li>Waschen Sie Pellet zweimal mit 100 % Aceton. Dekantieren Sie Aceton und lassen Sie Probe an der Luft trocknen.</li>
	<li>20-40 μl 10 mm Tris-HCl, pH 8.0 oder ein standard Laemmli SDS-PAGE Probe Puffer16 hinzufügen und gründlich von oben und unten an der Wand mit der ausgefällten Lipoproteine pipettieren aufzuwirbeln. Kratzen Sie die Seite des Rohrs mit der PIPETTENSPITZE, Lipoproteine zu verdrängen. Hinweis: Lipoproteine löst sich nicht in Tris-Puffer, aber eher eine Suspension bilden.<ol>
<li>Lipoproteine bei-20 ° C bis zu seiner Verwendung zu speichern.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) SDS-PAGE, Elektroblotting und Färbungen mit Ponceau S
<ol><li>Separate Lipoproteine durch SDS-PAGE mit Standardmethoden16. Hinweis: Die entsprechenden Gel Acrylamid-Anteil variiert je nach Verwendungszweck und Größe der Lipoproteine. Hier wurden E. Faecalis Lipoproteine über 10 % Tris-Glycin Gel getrennt, während eine 16,5 %-Tris-Tricine-Gel für die kleineren E. Coli Lipoprotein Lpp17verwendet wurde.</li>
	<li>Übertragen Sie die Lipoproteine auf Nitrozellulose Transfer Membran mit einem standard Elektroblotting-Verfahren. Hinweis: Eine halbtrockene Übertragung mittels Bjerrum Schafer-Nielsen Puffer plus 0,1 % SDS wurde in 25 V, 1,3 mA für 15 min18. Alternativ könnte Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membran verwendet werden, jedoch wie es mehr hydrophobe als Nitrozellulose, es effizient Elution von hydrophoben Lipopeptide von der Membrane in späteren Schritten verringern kann.</li>
	<li>Übertragen Sie die Nitrozellulose-Membran auf einen Behälter und Deckel mit Ponceau S-Lösung (0,2 % (w/V) Ponceau S in 5 % Essigsäure). Rock, sanft für 5 min oder bis rot-rosa Bänder sichtbar sind.</li>
	<li>Ponceau S Lösung abgießen und sorgfältig ausspülen der Nitrozellulose-Membran mit dH2O überschüssiges entfernen Flecken. Hinweis: Ponceau-gefärbten Bändern werden schnell destain. Wenn die Bänder verschwinden, wiederholen Sie Färbung.</li>
	<li>Mit einer sauberen Rasierklinge Verbrauchsteuern Sie die gewünschte Band und den Transfer zu einem Microcentrifuge Schlauch. Waschen Sie dreimal mit 1 mL dH2O, vollständig die Band destain. Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Speichern Sie den ausgeschnittenen Bereich bedeckt mit Wasser bei-20 ° C bis zur Verwendung.</li>
	<li>Abschnitt zu übertragen, um eine saubere Oberfläche und mit einer sauberen Rasierklinge, Würfel des Nitrozellulose-Streifens in kleine Stücke von ca. 1 mm x 1 mm. sammeln die Stücke in einem 0,5 mL eiweißarme Bindung Microcentrifuge Schlauch.</li>
	<li>Waschen Sie die Stücke zweimal mit 0,5 mL des frisch zubereiteten 50 mM Ammonium Bicarbonat (NH4HCO3), pH 7,8 im Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) Grade Wasser.</li>
</ol>4. folgen Verdauung, Lipopeptide Extraktion aus Nitrozellulose-Membran, Ablagerung auf MALDI Ziel- und Datenerfassung
<ol><li>Nitrozellulose-Stücke in 20 μl einer 20 μg/mL Lösung von Trypsin in 50 mM NH4HCO3pH 7,8 in HPLC Grade Wasser aufschwemmen. Wirbel zu mischen, dann kurz drehen, um sicherzustellen, dass alle Stücke die Trypsin-Lösung vollständig abgedeckt sind. Decken Sie den Schlauch Deckel mit Paraffin Film um Verdunstung zu verhindern und Digest über Nacht bei 37 ° c inkubieren</li>
	<li>Drehung der Probe bei 16.000 x g für 30 s und Entfernen der Flüssigkeit durch pipettieren. Hinweis: Dies entfernt trypsiniert hydrophilen Peptide, die später durch MALDI-TOF MS Proteinidentifikation untersucht werden können.</li>
	<li>50 μL der 0,5 % Trifluoroacetic Säure (TFA) in HPLC Grade Wasser hinzufügen. Vortex mischen, dann drehen Sie die Probe kurz um sicherzustellen, dass alle Stücke von der Lösung bedeckt sind. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie die Flüssigkeit durch pipettieren. Vorsicht: TFA ist Gesundheitsschädlich beim Einatmen. Mit Vorsicht handhaben und in der chemischen Dunstabzugshaube verwenden. Vermeiden Sie Hautkontakt.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 4.3 mit 50 μL der 10 % Acetonitril HPLC Grade Wasser. Vorsicht: Acetonitril ist Gesundheitsschädlich beim Einatmen. Mit Vorsicht handhaben und in der chemischen Dunstabzugshaube verwenden. Vermeiden Sie Hautkontakt.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 4.3 mit 50 μL der 20 % Acetonitril HPLC Grade Wasser. Hinweis: Dadurch werden alle mäßig hydrophoben Peptiden lose gebunden, die Nitrozellulose entfernt.</li>
	<li>Eluieren fest gebundenen Lipopeptide, hinzufügen 15 μl 10 mg/mL frisch zubereiteten α-Cyano-4-Hydroxycinnamic Säure (CHCA) Matrix in Chloroform-Methanol (2:1, V/V) gelöst und 10 min bei Raumtemperatur mit intermittierenden Vortexen inkubieren.<ol>
<li>Alternativ fügen Sie 15 μl Chloroform-Methanol zu eluieren Lipopeptide und mischen Sie mit Matrix zu einem späteren Zeitpunkt hinzu. Andere Matrizen, wie z. B. 2,5-Dihydroxybenzoic Acid (DHB), sollte als Alternative zu CHCA getestet werden, wenn unbefriedigende Ergebnisse, für eine bestimmte Lipopeptide Komposition erzielt werden. Vorsicht: Chloroform und Methanol sind gesundheitsschädlich bei Einatmen. Mit Vorsicht handhaben und in der chemischen Dunstabzugshaube verwenden. Vermeiden Sie Hautkontakt.</li>
		<li>
Optional: Natrium zu fördern Bildung Addukt, ergänzen die Lösung von CHCA in Chloroform-Methanol mit wässrigen Natriumbicarbonat (Nahco33) um eine Endkonzentration von 1 mM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Drehen Sie die Probe kurz. Übertragen Sie mit einer Pipette vorsichtig die Flüssigkeit auf einen neuen low-Protein Bindung Microcentrifuge Schlauch. Diese Lösung enthält den Großteil der N-terminalen Lipopeptide. Hinweis: Die Nitrozellulose kann ganz oder teilweise in der Chloroform-Methanol-Lösung auflösen. Dies wirkt sich nicht negativ auf MS-Ergebnisse und kann als alternative Methode zur Steigerung Lipopeptide Rendite verwendet werden. PVDF-Membran löst sich nicht auf die gleiche Weise.</li>
	<li>1 μl der eluierten Lipopeptide mit CHCA auf einer polierten Stahl MALDI-Ziel zu hinterlegen. Hinweis: Das Chloroform-Methanol wird schnell verdunsten hinterließ kristallisierten CHCA und Lipopeptide. Eine optionale zweite 1 μL aliquoten kann auf den gleichen Punkt Erhöhung der probenkonzentration deponiert werden. Chloroform-Methanol kann deutlich nach Absetzung des Ziels verbreitet und als solche sollte darauf geachtet werden um zu vermeiden, Probe mischen auf dem Ziel. Es wird empfohlen, zu hinterlegen und schießen mehrere Flecken jeder Probe.</li>
	<li>Fahren Sie sofort mit Massenspektrometrie. Scannen Sie alle Bereiche des Spots für Lipopeptide Signal, vor allem, wenn der Spot zwei Schichten der Probe, enthält, wie die zweite Schicht der Lipopeptide zum äußeren Rand der Stelle schieben kann. Hinweis: Empfohlene Ausgangspunkt Laserstärke ist 25 %, obwohl es möglicherweise erforderlich, erhöhen die Intensität um Signal zu erwerben und die Summe mehrere Spektren (20 oder mehr Scans) um ausreichendes Signal-Rausch-Verhältnis zu erreichen. Hier Spektren wurden erworben, auf einem MALDI-TOF-TOF-Instrument (siehe die Tabelle der Materialien) mit einer Fabrik konfiguriert Instrument-Methode für den Reflektor positiv-Ionen-Nachweis über den 700-3500 m/Z -Bereich. Das Gerät wurde mit einer Rinderserumalbumin (BSA) folgen Peptid Mischung kalibriert.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Babu, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+database+of+bacterial+lipoproteins+(DOLOP)+with+functional+assignments+to+predicted+lipoproteins.">A database of bacterial lipoproteins (DOLOP) with functional assignments to predicted lipoproteins.</a> J Bacteriol. 188 (8), 2761-2773 (2006).</li><li>Narita, S., Tokuda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+lipoproteins;+biogenesis,+sorting+and+quality+control.">Bacterial lipoproteins; biogenesis, sorting and quality control.</a> Biochim Biophys Acta. 1862 (11), 1414-1423 (2016).</li><li>Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoproteins+of+bacterial+pathogens.">Lipoproteins of bacterial pathogens.</a> Infect Immun. 79 (2), 548-561 (2011).</li><li>Nguyen, M. T., G&#246;tz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoproteins+of+Gram-Positive+Bacteria:+Key+Players+in+the+Immune+Response+and+Virulence.">Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 80 (3), 891-903 (2016).</li><li>Nakayama, H., Kurokawa, K., Lee, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoproteins+in+bacteria:+structures+and+biosynthetic+pathways.">Lipoproteins in bacteria: structures and biosynthetic pathways.</a> FEBS J. 279 (23), 4247-4268 (2012).</li><li>Kurokawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+bacterial+lipoprotein+structures+conserved+in+low-GC+content+Gram-positive+bacteria+are+recognized+by+Toll-like+receptor+2.">Novel bacterial lipoprotein structures conserved in low-GC content Gram-positive bacteria are recognized by Toll-like receptor 2.</a> J Biol Chem. 287 (16), 13170-13181 (2012).</li><li>Kurokawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Triacylated+ATP+Binding+Cluster+Transporter+Substrate-binding+Lipoprotein+of+Staphylococcus+aureus+Functions+as+a+Native+Ligand+for+Toll-like+Receptor+2.">The Triacylated ATP Binding Cluster Transporter Substrate-binding Lipoprotein of Staphylococcus aureus Functions as a Native Ligand for Toll-like Receptor 2.</a> J Biol Chem. 284 (13), 8406-8411 (2009).</li><li>Asanuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+evidence+of+&#945;-aminoacylated+lipoproteins+of+Staphylococcus+aureus.">Structural evidence of &#945;-aminoacylated lipoproteins of Staphylococcus aureus.</a> FEBS J. 278 (5), 716-728 (2011).</li><li>Armbruster, K. M., Meredith, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+Lyso-Form+N-Acyl+Intramolecular+Transferase+in+Low-GC+Firmicutes.">Identification of the Lyso-Form N-Acyl Intramolecular Transferase in Low-GC Firmicutes.</a> J Bacteriol. 199 (11), e00099-e00017 (2017).</li><li>Serebryakova, M. V., Demina, I. A., Galyamina, M. A., Kondratov, I. G., Ladygina, V. G., Govorun, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acylation+state+of+surface+lipoproteins+of+Mollicute+Acholeplasma+laidlawii.">The acylation state of surface lipoproteins of Mollicute Acholeplasma laidlawii.</a> J Biol Chem. 286 (26), 22769-22776 (2011).</li><li>Feng, S. H., Lo, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+mouse+spleen+B-cell+proliferation+and+secretion+of+immunoglobulin+by+lipid-associated+membrane+proteins+of+Mycoplasma+fermentans+incognitus+and+Mycoplasma+penetrans.">Induced mouse spleen B-cell proliferation and secretion of immunoglobulin by lipid-associated membrane proteins of Mycoplasma fermentans incognitus and Mycoplasma penetrans.</a> Infect Immun. 62 (9), 3916-3921 (1994).</li><li>Feng, S. H., Lo, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+extract+of+Mycoplasma+penetrans+proteinase+K-digested+lipid-associated+membrane+proteins+rapidly+activates+NF-kappaB+and+activator+protein+1.">Lipid extract of Mycoplasma penetrans proteinase K-digested lipid-associated membrane proteins rapidly activates NF-kappaB and activator protein 1.</a> Infect Immun. 67 (6), 2951-2956 (1999).</li><li>Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Spellman, D. S., Sun, T. -. T., Neubert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+electroblotted+proteins+by+mass+spectrometry:+protein+identification+after+Western+blotting.">Analysis of electroblotted proteins by mass spectrometry: protein identification after Western blotting.</a> Mol Cell Proteomics. 7 (2), 308-314 (2008).</li><li>Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Sun, T. -. T., Neubert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Nitrocellulose+Membranes+for+Protein+Characterization+by+Matrix-Assisted+Laser+Desorption/Ionization+Mass+Spectrometry.">Use of Nitrocellulose Membranes for Protein Characterization by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry.</a> Anal Chem. 78 (14), 5102-5108 (2006).</li><li>Kurokawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environment-mediated+accumulation+of+diacyl+lipoproteins+over+their+triacyl+counterparts+in+Staphylococcus+aureus.">Environment-mediated accumulation of diacyl lipoproteins over their triacyl counterparts in Staphylococcus aureus.</a> J Bacteriol. 194 (13), 3299-3306 (2012).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Sch&#1235;gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tricine-SDS-PAGE.">Tricine-SDS-PAGE.</a> Nat Protoc. 1, 16-22 (2006).</li><li>Gravel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Blotting+by+the+Semidry+Method.">Protein Blotting by the Semidry Method.</a> The Protein Protocols Handbook. , 321-334 (2002).</li><li>Webster, J., Oxley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Identification+by+Peptide+Mass+Fingerprinting+using+MALDI-TOF+Mass+Spectrometry.">Protein Identification by Peptide Mass Fingerprinting using MALDI-TOF Mass Spectrometry.</a> The Protein Protocols Handbook. , 1117-1129 (2009).</li><li>Wilkins, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+peptide+characterization+using+PEPTIDEMASS+-+a+World-Wide-Web-accessible+tool.">Detailed peptide characterization using PEPTIDEMASS - a World-Wide-Web-accessible tool.</a> Electrophoresis. 18 (3-4), 403-408 (1997).</li><li>Gasteiger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Identification+and+Analysis+Tools+on+the+ExPASy+Server.">Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server.</a> The Proteomics Protocols Handbook. , 571-607 (2005).</li><li>Perkins, D. N., Pappin, D. J. C., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probability-based+protein+identification+by+searching+sequence+databases+using+mass+spectrometry+data.">Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data.</a> Electrophoresis. 20 (18), 3551-3567 (1999).</li><li>Al-Saad, K. A., Zabrouskov, V., Siems, W. F., Knowles, N. R., Hannan, R. M., Hill, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-assisted+laser+desorption/ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+of+lipids:+ionization+and+prompt+fragmentation+patterns.">Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry of lipids: ionization and prompt fragmentation patterns.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 17 (1), 87-96 (2003).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Das Protokoll hierin beschreibt zwei Phasen der Lipoprotein-Charakterisierung: Anreicherung von TX-114 phase Partitionierung und strukturellen Bestimmung durch MALDI-TOF MS. Während der TX-114 Extraktion entfernt zusätzliche Zentrifugation kontaminierende Proteine, die während dieses Prozesses, gefolgt von Aceton Niederschlag hochangereichertem Lipoproteine Ausbeute auszufällen. Durch die Begrenzung des Ausmaßes der jede Vorbereitung auf 15 mL im Wert von Zellen, können mehrere Proben problemlos parallel verarbeite...

Bakterielle Lipoproteine zeichnen sich durch eine konservierte N-terminale Lipid-modifizierten Cystein, die die kugelförmige Protein-Domäne an die Oberfläche der Zellmembran verankert. Sie verteilen sich universell in Bakterien, bildet 2 bis 5 % aller zellulärer Gene innerhalb einer typischen Genom-1. Lipoproteine spielen eine kritische Rolle in einer Vielzahl von zellulären Prozessen, einschließlich der Nährstoffaufnahme, Signaltransduktion, Montage von Proteinkomplexen und bei der Aufrechterhaltung der Zelle Umschlag strukturelle Integrität2. Bei pathogenen Bakterien dienen Lipoproteine als Virulenz Faktoren3,4. Während einer Infektion stachelt Anerkennung der N-terminalen Lipopeptide von Toll-Like-Rezeptor (TLR) 2 eine angeborene Immunantwort gegen eindringende Krankheitserreger zu entfernen. Je nach dem N-terminalen Acylation Zustand sind Lipoproteine Alternative TLR2-heterodimerisierenden-komplexe in der Regel anerkannt. TLR2-TLR1 erkennt N-Acylated Lipopeptide, während TLR2-TLR6 bindet freie Lipopeptide α-Aminosäure Termini. Einmal gebunden, konvergieren die Signalwege induzieren Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen3,4.
Früher dachte man, dass Lipoproteine von gram-positiven Bakterien Diacylated und die von Gram-negativen Bakterien Triacylated waren, unterscheiden sich in das Fehlen oder Vorhandensein einer Amid-linked Fettsäure auf der erhaltenen N-terminalen Cystein Rückstand. Diese Annahme wurde durch den Mangel an Sequenz Orthologe in gram-positiven Genomen, Lnt, Gram-negative N-Acyl-Transferase unterstützt, die Triacylated Lipoproteine5bildet. Jedoch haben neuere Studien Lipoprotein Triacylation in gram-positiven Firmicuten, dass fehlende Lnt, sowie drei neuartige N-terminale Lipoprotein Strukturen bezeichnet die Peptidyl, Lyso und N -Acetyl Formen6,7 gezeigt. ,8. Diese Erkenntnisse werfen Fragen über mögliche noch entdeckt Lipoprotein Formen, neben grundlegende Fragen wie diese neuartige Lipoproteine entstehen und welche physiologischen Zweck oder nutzen die verschiedenen Formen vermitteln. Darüber hinaus zeigen sie die aktuelle Unfähigkeit der Genomik, Lipoprotein Struktur Vorhersagen. In der Tat haben wir vor kurzem eine neuartige Klasse von Lipoprotein-N-Acyl-Transferasen, Lit, von Enterococcus Faecalis und Bacillus Cereus , das Lyso-Formular Lipoproteine9macht aufgerufen. Dies zeigt die Notwendigkeit, die aufgrund ihrer extrem hydrophoben Charakters und begrenzte Methoden zur Verfügung, um ihre molekulare Struktur charakterisieren eine Herausforderung sein Lipoprotein Struktur, experimentell zu überprüfen.
Um Studien auf Lipoprotein Induktion der Host Immunantwort sowie die N-terminale Strukturaufklärung zu erleichtern, haben wir mehrere zuvor beschriebenen Protokolle um bakterielle Lipoproteine reinigen und Vorbereiten der N-terminalen tryptic angepasst Lipopeptide für die Analyse von MALDI-TOF MS6,10,11,12. Lipoproteine sind angereichert mit einer etablierten Triton X-114 (im folgenden als Tensid oder TX-114 bezeichnet) Phase Partitionierung Methode, mit der Optimierung zu entfernen Verunreinigungen nicht-Lipoproteine und Lipoprotein Ertrag zu steigern. Diese Lipoproteine sind geeignet für den direkten Einsatz in TLR Tests oder für weitere Reinigung durch SDS-PAGE. Für MALDI-TOF MS Übertragung der Lipoproteine auf Nitrozellulose-Membran bietet ein Gerüst für die effiziente in Situ Trypsin-Verdauung waschen und anschließende Elution von der Membranoberfläche, was zu sehr gereinigt N-terminale Lipopeptide. Nitrozellulose nachweislich Probenbehandlung Erleichterung und Verbesserung des Sequenz-Abdeckung für stark hydrophobe Peptide aus integrale Membrane Proteine13,14, sowie Lipoproteine9,10 . Die Methode hat den zusätzlichen Vorteil der Fraktionierung Peptide basierend auf Polarität, so dass fortgeschrittene Waschlösungen für hohes Vertrauen Proteinidentifikation gleichzeitig mit N-terminale Strukturaufklärung in einem einzigen Experiment analysiert werden können . Dieses Protokoll eindeutig Merkmale vorsätzliche Natrium Addukt Bildung, übergeordnete Ion Fragmentierung in Richtung Dehydroalanyl-Ionen während MS/MS, Beihilfe bei der strukturellen Zuordnung des N- Acylation Staates zu fördern. Der N-Terminus ist variabel und wichtige Funktion im Zusammenhang mit TLR Anerkennung der Lipoproteine. Zusammengenommen hat dieses Protokoll auf Lipoproteine, mit den einzelnen Stufen der Reinigung und Strukturaufklärung von MALDI-TOF MS leicht angepasst, je nach Ziel des Experiments intensive und reproduzierbare Studien erlaubt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.01 mm Zirconia/silica beads</td>
			<td>BioSpec Products</td>
			<td>110791012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>EMD</td>
			<td>AX0073-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>EMD</td>
			<td>AX0116-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>EMD</td>
			<td>AX0142-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>09830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTrace NT Nitrocellulose</td>
			<td>PALL Life Sciences</td>
			<td>66485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA) digest standard</td>
			<td>Protea</td>
			<td>PS-204-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>423550025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Grade water</td>
			<td>EMD</td>
			<td>WX0008-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP535-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce trypsin protease</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>90057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau S</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>161470100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind Tube 0.5mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022431064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>792519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Macron Fine Chemicals</td>
			<td>7581-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>299537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-hydrochloride (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-114</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy broth (TSB)</td>
			<td>BD</td>
			<td>211822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-cyano-4-hydroxycinnamic acid (MS Grade)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MagNALyser</td>
			<td>Roche</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo Transfer System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI-TOF target</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraflextreme MALDI-TOF-TOF</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td>Equipped with a 355 nm frequency-tripled Nd:YAG smartbeam-II laser</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of bacterial lipoproteins and preparation of n-terminal lipopeptides for structural determination by mass spectrometry

Lipoproteine sind wichtige Bestandteile der bakteriellen Zellhülle und potente Aktivatoren der Säugetier-angeborenen Immunantwort. Trotz ihrer Bedeutung für Zellphysiologie und Immunologie bleibt noch viel um zu entdecken über neuartige Lipoprotein Formen, wie sie synthetisiert werden und die Wirkung der verschiedenen Formen auf wirtsimmunität. Um gründliche Studien über Lipoproteine zu ermöglichen, dieses Protokoll beschreibt eine Methode für bakterielle Lipoprotein Bereicherung und Vorbereitung der N-terminalen tryptic Lipopeptide für die Strukturaufklärung von Matrix-assisted Laser desorption ionisation-Zeit des Fluges Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS). Erweiterung auf einer etablierten Triton X-114 Phase Partitionierung Methode für die Extraktion von Lipoprotein und Anreicherung von der bakteriellen Zellmembran, das Protokoll enthält zusätzliche Schritte aus, um nicht-Lipoprotein Verunreinigungen, Lipoprotein Ertragssteigerung zu entfernen und Reinheit. Da Lipoproteine in Toll-Like-Rezeptor (TLR) Assays allgemein verwendet sind, ist es wichtig, zunächst die N-terminalen Struktur von MALDI-TOF MS. hierin charakterisieren, ein Verfahren vorgestellt, um konzentrierter hydrophobe Peptide in N-terminale angereichert zu isolieren Lipopeptide geeignet für die direkte Analyse von MALDI-TOF-MS/MS.-Lipoproteine, die von Sodium Dodecyl Sulfat Poly-Acrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE) getrennt wurden auf eine Nitrocellulose-Membran übertragen, in Situ mit verdaut Trypsin, gegenüber dem Vorquartal um polare tryptic Peptide zu entfernen gewaschen und schließlich mit Chloroform-Methanol eluiert. Wenn in Verbindung mit MS mehr polare trypsiniert Peptide aus Waschlösungen, bietet diese Methode die Möglichkeit, sowohl das Lipoprotein zu identifizieren und zu charakterisieren seine N-Terminus in einem einzigen Experiment. Absichtliche Natrium Addukt Bildung können auch als Werkzeug eingesetzt werden, um mehr strukturell informative Fragmentierung Spektren zu fördern. Letztlich werden Bereicherung der Lipoproteine und Bestimmung ihrer N-terminale Strukturen umfangreichere Studien auf diese allgegenwärtige Klasse bakterielle Proteine erlauben.

Eine schematische Darstellung des Protokolls ist in Abbildung 1zur Verfügung gestellt. Die Lipoprotein-angereicherten Bruchteil extrahiert von Enterococcus Faecalis ATCC 19433 von TX-114 ist in Abbildung 2dargestellt. Zum Vergleich zeigt sich auch das bandenmuster die ausgefällten Proteinfraktion. Proteine aus dieser Fraktion wurden von MALDI-MS zu sehr reichlich kontaminierende Proteine als Lipoproteine (Tabel...

Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Bacterial Lipoproteins and Preparation of N-terminal Lipopeptides for Structural Determination by Mass Spectrometry at JoVE.com

Enrichment of Bacterial Lipoproteins and Preparation of N-terminal Lipopeptides for Structural Determination by Mass Spectrometry

Bereicherung der bakterielle Lipoproteine und Vorbereitung der N-terminalen Lipopeptide Strukturaufklärung durch Massenspektrometrie

Die Anreicherung von bakterielle Lipoproteine mit einem nichtionischen Tensid Phase Partitionierung Methode wird für die direkte Verwendung in TLR-Tests oder andere Anwendungen beschrieben. Weitere Schritte sind detailliert, um strukturelle Charakterisierung N-terminalen tryptic Lipopeptide Vorbereitung durch Massenspektrometrie.

Lipoproteins are important constituents of the bacterial cell envelope and potent activators of the mammalian innate immune response. Despite their ...

enrichment-bacterial-lipoproteins-preparation-n-terminal-lipopeptides

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.5K Aufrufe.  Pennsylvania State University. Die Anreicherung von bakterielle Lipoproteine mit einem nichtionischen Tensid Phase Partitionierung Methode wird für die direkte Verwendung in TLR-Tests oder andere Anwendungen beschrieben. Weitere Schritte sind detailliert, um strukturelle Charakterisierung N-terminalen tryptic Lipopeptide Vorbereitung durch Massenspektrometrie.

Serie: Enrichment of Bacterial Lipoproteins and Preparation of N-terminal Lipopeptides for Structural Determination by Mass Spectrometry

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be applied to the study of cell invasion by virtually any culturable bacterium. The stages at which specific aspects of invasion can be studied, such as the role of actin rearrangement or caveolae, will be highlighted. Host cells are grown in flasks and when ready for use are seeded into 24-well plates containing Thermanox coverslips. Using coverslips allows subsequent removal of the cells from the wells to reduce interference from serum proteins deposited onto the sides of the wells (to which S. aureus would attach). Bacteria are grown to the required density and washed to remove any secreted proteins (e.g. toxins). Coverslips with confluent layers of endothelial cells are transferred to new 24-well plates containing fresh culture medium before the addition of bacteria. Bacteria and cells are then incubated together for the required amount of time in 5% CO2 at 37&deg;C. For S. aureus this is typically between 15-90 minutes. Thermanox coverslips are removed from each well and dip-washed in PBS to remove unattached bacteria. If total associated bacteria (adherent and internalised) are to be quantified, coverslips are then placed in a fresh well containing 0.5% Triton X-100 in PBS. Gentle pipetting leads to complete cell lysis and bacteria are enumerated by serial dilution and plating onto agar. If the number of bacteria that have invaded the cells is needed, coverslips are added to wells containing 500 &mu;l tissue culture medium supplemented with gentamicin and incubation continued for 1 h, which will kill all external bacteria. Coverslips can then be washed, cells lysed and bacteria enumerated by plating onto agar as described above. If the experiment requires direct visualisation, coverslips can be fixed and stained for light, fluorescence or confocal microscopy or prepared for electron microscopy.

A general protocol for the study of invasion of host cells by a bacterial pathogen, focusing on Staphylococcus aureus and human endothelial cells.

Invasion von menschlichen Zellen durch einen bakteriellen Erreger

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

Cryo-electron microscopy (cryo-EM), combined with image processing, is an increasingly powerful tool for structure determination of macromolecular protein complexes and assemblies. In fact, single particle electron microscopy1 and two-dimensional (2D) electron crystallography2 have become relatively routine methodologies and a large number of structures have been solved using these methods. At the same time, image processing and three-dimensional (3D) reconstruction of helical objects has rapidly developed, especially, the iterative helical real-space reconstruction (IHRSR) method3, which uses single particle analysis tools in conjunction with helical symmetry. Many biological entities function in filamentous or helical forms, including actin filaments4, microtubules5, amyloid fibers6, tobacco mosaic viruses7, and bacteria flagella8, and, because a 3D density map of a helical entity can be attained from a single projection image, compared to the many images required for 3D reconstruction of a non-helical object, with the IHRSR method, structural analysis of such flexible and disordered helical assemblies is now attainable.
In this video article, we provide detailed protocols for obtaining a 3D density map of a helical protein assembly (HIV-1 capsid9 is our example), including protocols for cryo-EM specimen preparation, low dose data collection by cryo-EM, indexing of helical diffraction patterns, and image processing and 3D reconstruction using IHRSR. Compared to other techniques, cryo-EM offers optimal specimen preservation under near native conditions. Samples are embedded in a thin layer of vitreous ice, by rapid freezing, and imaged in electron microscopes at liquid nitrogen temperature, under low dose conditions to minimize the radiation damage. Sample images are obtained under near native conditions at the expense of low signal and low contrast in the recorded micrographs. Fortunately, the process of helical reconstruction has largely been automated, with the exception of indexing the helical diffraction pattern. Here, we describe an approach to index helical structure and determine helical symmetries (helical parameters) from digitized micrographs, an essential step for 3D helical reconstruction. Briefly, we obtain an initial 3D density map by applying the IHRSR method. This initial map is then iteratively refined by introducing constraints for the alignment parameters of each segment, thus controlling their degrees of freedom. Further improvement is achieved by correcting for the contrast transfer function (CTF) of the electron microscope (amplitude and phase correction) and by optimizing the helical symmetry of the assembly.

This article describes a method to obtain a three-dimensional (3D) structure of helically assembled molecules using cryo-electron microscopy. In this protocol, we use HIV-1 capsid assemblies to illustrate the detailed 3D reconstruction procedure for achieving a density map by the iterative helical real-space reconstruction method.

Aufbau des HIV-1 Capsid Assemblies durch Kryo-Elektronenmikroskopie und Iterative Helical Real-Raum Wiederaufbau

Cryo-electron microscopy (cryo-EM), combined with image processing, is an increasingly powerful tool for structure determination of macromolecular protein ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne relapsing fever (Borrelia spp.), Rocky Mountain Spotted fever (Rickettsia rickettsii), ehrlichiosis (Ehrlichia chaffeensis and E. equi), anaplasmosis (Anaplasma phagocytophilum), encephalitis (tick-borne encephalitis virus), babesiosis (Babesia spp.), Colorado tick fever (Coltivirus), and tularemia (Francisella tularensis) 1-8. To be properly transmitted into the host these infectious agents differentially regulate gene expression, interact with tick proteins, and migrate through the tick 3,9-13. For example, the Lyme disease agent, Borrelia burgdorferi, adapts through differential gene expression to the feast and famine stages of the tick's enzootic cycle 14,15. Furthermore, as an Ixodes tick consumes a bloodmeal Borrelia replicate and migrate from the midgut into the hemocoel, where they travel to the salivary glands and are transmitted into the host with the expelled saliva 9,16-19.
As a tick feeds the host typically responds with a strong hemostatic and innate immune response 11,13,20-22. Despite these host responses, I. scapularis can feed for several days because tick saliva contains proteins that are immunomodulatory, lytic agents, anticoagulants, and fibrinolysins to aid the tick feeding 3,11,20,21,23. The immunomodulatory activities possessed by tick saliva or salivary gland extract (SGE) facilitate transmission, proliferation, and dissemination of numerous tick-borne pathogens 3,20,24-27. To further understand how tick-borne infectious agents cause disease it is essential to dissect actively feeding ticks and collect tick saliva. This video protocol demonstrates dissection techniques for the collection of hemolymph and the removal of salivary glands from actively feeding I. scapularis nymphs after 48 and 72 hours post mouse placement. We also demonstrate saliva collection from an adult female I. scapularis tick.

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

The collection of infected tick hemolymph, salivary glands, and saliva is important to study how tick-borne pathogens cause disease. In this protocol we demonstrate how to collect hemolymph and salivary glands from feeding Ixodes scapularis nymphs. We also demonstrate saliva collection from female I. scapularis adults.

Speichel, Speicheldrüse, und Hämolymphe Abholung Ixodes scapularis Zecken

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at all on selective media that are usually used to cultivate bacteria. For this reason, many of these pathogens were discovered only recently or following important outbreaks. These pathogens are often associated with amoebae, which serve as host-cell and allow the survival and growth of the bacteria. We intend here to provide a demonstration of two techniques that allow isolation and characterization of intracellular pathogens present in clinical or environmental samples: the amoebal coculture and the amoebal enrichment. Amoebal coculture allows recovery of intracellular bacteria by inoculating the investigated sample onto an amoebal lawn that can be infected and lysed by the intracellular bacteria present in the sample. Amoebal enrichment allows recovery of amoebae present in a clinical or environmental sample. This can lead to discovery of new amoebal species but also of new intracellular bacteria growing specifically in these amoebae. Together, these two techniques help to discover new intracellular bacteria able to grow in amoebae. Because of their ability to infect amoebae and resist phagocytosis, these intracellular bacteria might also escape phagocytosis by macrophages and thus, be pathogenic for higher eukaryotes.

Amoebal coculture is a cell culture system using adherent amoebae to selectively grow intracellular pathogens able to resist phagocytic cells such as amoebae and macrophages. It thus represents a key tool to discover new infectious agents. Amoebal enrichment allows discovery of new amoebal species and of their specific intracellular bacteria.

Entdeckung neuer intrazelluläre Erreger von Amöben Amöben Cokultur und Enrichment Ansätze

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional identification requires the sub-culture of signaled blood culture broth with identification available only after colonies on solid agar have matured. MALDI-TOF MS is a reliable, rapid method for identification of the majority of clinically relevant bacteria when applied to colonies on solid media. The application of MALDI-TOF MS directly to blood culture broth is an attractive approach as it has potential to accelerate species identification of bacteria and improve clinical management. However, an important problem to overcome is the pre-analysis removal of interfering resins, proteins and hemoglobin&#160;contained in blood culture specimens which, if not removed, interfere with the MS spectra and can result in insufficient or low discrimination identification scores. In addition it is necessary to concentrate bacteria to develop spectra of sufficient quality. The presented method describes the concentration, purification, and extraction of Gram negative bacteria allowing for the early identification of bacteria from a signaled blood culture broth.

The application of matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) directly to blood culture broth expedites the identification of bacteria. The presented method is a rapid and reliable method for identification of Gram negative bacteria directly from blood culture broth.

Schnelle Identifizierung von Gram-negativen Bakterien aus Blutkulturbrühe unter Verwendung von MALDI-TOF-Massenspektrometrie

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a rapid identification of the infectious agent to guide optimal antibiotic treatment. The analysis of Gram stains from positive blood culture can be rapidly conducted and already significantly impact the antibiotic regimen. However, the accurate identification of the infectious agent is still required to establish the optimal targeted treatment. We present here a simple and fast bacterial pellet preparation from a positive blood culture that can be used as a sample for several essential downstream applications such as identification by MALDI-TOF MS, antibiotic susceptibility testing (AST) by disc diffusion assay or automated AST systems and by automated PCR-based diagnostic testing. The performance of these different identification and AST systems applied directly on the blood culture bacterial pellets is very similar to the performance normally obtained from isolated colonies grown on agar plates. Compared to conventional approaches, the rapid acquisition of a bacterial pellet significantly reduces the time to report both identification and AST. Thus, following blood culture positivity, identification by MALDI-TOF can be reported within less than 1 hr whereas results of AST by automated AST systems or disc diffusion assays within 8 to 18 hr, respectively. Similarly, the results of a rapid PCR-based assay can be communicated to the clinicians less than 2 hr following the report of a bacteremia. Together, these results demonstrate that the rapid preparation of a blood culture bacterial pellet has a significant impact on the identification and AST turnaround time and thus on the successful outcome of patients suffering from bloodstream infections.

A rapid bacterial pellet preparation from a positive blood culture can be used as a sample for applications such as identification by MALDI-TOF, Gram staining, antibiotic susceptibility testing and PCR-based test. The results can be rapidly communicated to clinicians to improve the outcome of patients suffering from bloodstream infections.

Vorbereitung einer Blutkultur Pellet Rapid Identifizierung von Bakterien und Antibiotika Empfindlichkeitsprüfung

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. This information is particularly valuable in the context of host-pathogen interactions. Many pathogen proteins function within host cells in a variety of way such as, enabling evasion of the host immune system and survival within the intracellular environment. To study these pathogen-protein host-cell interactions, several approaches are commonly used, including: in vivo infection with a strain expressing a tagged or mutant protein, or introduction of pathogen genes via transfection or transduction. Each of these approaches has advantages and disadvantages. We sought a means to directly introduce exogenous proteins into cells. Electroporation is commonly used to introduce nucleic acids into cells, but has been more rarely applied to proteins although the biophysical basis is exactly the same. A standard electroporator was used to introduce affinity-tagged bacterial effectors into mammalian cells. Human epithelial and mouse macrophage cells were cultured by traditional methods, detached, and placed in 0.4 cm gap electroporation cuvettes with an exogenous bacterial pathogen protein of interest (e.g. Salmonella Typhimurium GtgE). After electroporation (0.3 kV) and a short (4 hr) recovery period, intracellular protein was verified by fluorescently labeling the protein via its affinity tag and examining spatial and temporal distribution by confocal microscopy. The electroporated protein was also shown to be functional inside the cell and capable of correct subcellular trafficking and protein-protein interaction. While the exogenous proteins tended to accumulate on the surface of the cells, the electroporated samples had large increases in intracellular effector concentration relative to incubation alone. The protocol is simple and fast enough to be done in a parallel fashion, allowing for high-throughput characterization of pathogen proteins in host cells including subcellular targeting and function of virulence proteins.

Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells.

Elektroporation von Functional bakterielle Effektoren in Säugerzellen

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Generation und Multi-phänotypischen High-Content-Screening<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon-Mutanten

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine detection of the virus. The current detection and quantification techniques, which rely primarily on nucleic acid amplification, do not discriminate infectious from non-infectious viral particles. The purpose of this article is to present specific details on recent advances in techniques used together in order to acquire further information on the infectivity status of viral particles. One technique involves assessing binding of a norovirus ssDNA aptamer to capsids. Aptamers have the advantage of being easily synthesized and modified, and are inexpensive and stable. Another technique, dynamic light scattering (DLS), has the advantage of observing capsid behavior in solution. Electron microscopy allows for visualization of the structural integrity of the viral capsids. Although promising, there are some drawbacks to each technique, such as non-specific aptamer binding to positively-charged molecules from sample matrices, requirement of purified capsid for DLS, and poor sensitivity for electron microscopy. Nonetheless, when these techniques are used in combination, the body of data produced provides more comprehensive information on norovirus capsid integrity that can be used to infer infectivity, information which is essential for accurate evaluation of inactivation methods or interpretation of virus detection. This article provides protocols for using these methods to discriminate infectious human norovirus particles.

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Routine detection methods utilizing viral genome amplification are limited by their inability to discriminate infectious from non-infectious particles. The purpose of this article is to provide detailed protocols for alternative methods to aid in discrimination of infectious norovirus particles using aptamer binding, dynamic light scattering, and transmission electron microscopy.

Alternative In-vitro- Methoden zur Bestimmung der viralen Kapsid strukturelle Integrität

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine ...

Identification of Nucleolar Factors During HIV-1 Replication Through Rev Immunoprecipitation and Mass Spectrometry

The HIV-1 infectious cycle requires viral protein interactions with host factors to facilitate viral replication, packaging, and release. The infectious cycle further requires the formation of viral/host protein complexes with HIV-1 RNA to regulate the splicing and enable nucleocytoplasmic transport. The HIV-1 Rev protein accomplishes the nuclear export of HIV-1 mRNAs through multimerization with intronic cis-acting targets - the Rev response element (RRE). A nucleolar localization signal (NoLS) exists within the COOH-terminus of the Rev arginine-rich motif (ARM), allowing the accumulation of Rev/RRE complexes in the nucleolus. Nucleolar factors are speculated to support the HIV-1 infectious cycle through various other functions in addition to mediating mRNA-independent nuclear export and splicing. We describe an immunoprecipitation method of wild-type (WT) Rev in comparison to Rev nucleolar mutations (deletion and single-point Rev-NoLS mutations) in the presence of HIV-1 replication for mass spectrometry. Nucleolar factors implicated in the nucleocytoplasmic transport (nucleophosmin B23 and nucleolin C23), as well as cellular splicing factors, lose interaction with Rev in the presence of Rev-NoLS mutations. Various other nucleolar factors, such as snoRNA C/D box 58, are identified to lose interaction with Rev mutations, yet their function in the HIV-1 replication cycle remain unknown. The results presented here demonstrate the use of this approach for the identification of viral/host nucleolar factors that maintain the HIV-1 infectious cycle. The concepts used in this approach are applicable to other viral and disease models requiring the characterization of understudied pathways.

Here we describe Rev immunoprecipitation in the presence of HIV-1 replication for mass spectrometry. The methods described can be used for the identification of nucleolar factors involved in the HIV-1 infectious cycle and are applicable to other disease models for the characterization of understudied pathways.

Identifizierung von Nukleolar-Faktoren während der HIV-1-Replikation durch Rev-Immunpräzipitation und Massenspektrometrie

The HIV-1 infectious cycle requires viral protein interactions with host factors to facilitate viral replication, packaging, and release. The infectious ...