この作品は、NIHディレクターの新しいイノベーター賞DP2OD006466(K.C.H.)によって支えられていました。 著者らは、この方法の実践的なデモンストレーションと科学的な議論のためにラッセル・モンズに感謝する。

1. 一晩で2.5 mlの培地で細菌培養を成長させる
バック希釈培養 1:100 から 250 ml の新鮮な培地に、0.7-0.8 の OD600 に成長します。6%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)の溶液を水中に調製する。
注意:SDS粉末は危険です - SDS粉末を吸入しないでください。鼻と口の上にマスクを着用してください。
2. 1日目 - 細菌培養を一日と一晩にわたって行う
<ol><li>希釈された培養物が成長している間、1 Lビーカーのホットプレートに熱湯浴を設置します。水が沸騰したら、6%SDSのアリコート6mlを50mlポリプロピレンチューブに加え、各チューブに小さな炒め棒を1つ加え、チューブの蓋を指密に固定し、チューブを水浴に入れ、ホットプレートで500rpmに攪拌します。</li>
	<li>室温で10分間5,000×gで250ml培養物を収穫し、3mlの培地または1xリン酸緩衝生理食塩水でペレットを再懸濁します。ピペットセルは、6%の沸騰SDSで50mlチューブにゆっくりとピペットセル懸濁液を使用して細胞をライスし(最終濃度4%SDS)、チューブは沸騰水浴中に沈み、蓋を指密に再密閉します。細胞懸濁液は、再懸濁後に沸騰SDSに素早く移す必要があります。突然の環境変化は、細胞壁構造の誤った変化を引き起こす可能性がありますので、避けるべきです。
</li>
	<li>沸騰水浴を覆い、細胞が3時間沸騰させ、定期的に水位をチェックし、必要に応じて水浴を補充します。3時間後、ホットプレートの発熱体をオフにし、500rpmで一晩撹拌し続ける。</li>
</ol>3. 2日目 - 酵素消化は1日の間に行われます
<ol><li>SDSが一晩50mlチューブに沈殿した場合は、水浴を1〜2時間沸騰させます。ヒートブロックを60°Cに切り上げる。 10 mM Tris-HCl (pH 7.2) + 0.06% w/v NaClでプロナーゼEの1mg/mlストックを準備し、少なくとも30分間60°CでプロナーゼEを活性化します。</li>
	<li>400,000×gに設定された超遠心分離機を使用して、大きなPGポリマーをペレット化し、他の細胞成分から精製するために、室温で20分間サンプルを回転させます。上清を慎重に取り出し、室温超純水中の各ペレットを再懸濁します。注:再懸濁液の量は、使用される超遠心チューブの体積に依存します。チューブを少なくとも半分の方法で満たすが、チューブの最大体積を超えないボリュームを使用してください。再懸濁中に水が気泡を形成しなくなるまで遠心分離/洗浄を繰り返し、SDSが完全に除去されたことを示します(通常は3回の洗浄)。白色の沈殿物が形成された場合はペレットの洗浄を中止し、これは、サキュリが一緒に凝集していることを示している。凝集は壊滅的ではありませんが、塊はプラスチックやガラス製品に非常に強く結合し、大きなサンプル損失を引き起こします。この場合、束状のサキュリサンプルを用いてプロトコルを進める。</li>
	<li>最後の遠心分離/洗浄ステップで、サンプルを10 mM Tris-HCl(pH 7.2)+0.06%w/v NaClの900 μlで再中断し、以前に小さな針で上部に穴を開けて突いた2mlチューブに移します。各サンプルに1mg/ml活性化プロナーゼE(100μg/ml最終濃度)の100 μlを加え、60°Cで2時間インキュベートします。別のヒートブロックを100°Cに設定します。</li>
	<li>プロナーゼEの消化を各サンプルに200 μlの6%SDSを加えて、100°Cのヒートブロックで30分間沸騰させます。異なるヒートブロックを37°Cに設定し、50 mMリン酸緩衝液(pH 4.9)に1mg/mlのムラミドーゼ(ムタノリシン)ストックを作ります。</li>
	<li>ステップ3.2のように、400,000×gに設定された超遠心分離機を使用して、室温で20分間サンプルを回転させ、SDSが完全に除去されるまで室温の超純水で洗浄します(通常は3回の洗浄)。リサスペンションの体積は、使用される超遠心管の体積に依存します。チューブを少なくとも半分の方法で満たすが、チューブの最大体積を超えないボリュームを使用してください。</li>
	<li>最後の遠心分離/洗浄ステップで、サンプルを50 mMリン酸ナトリウムバッファー(pH 4.9)の200 μlで再中断します。この体積は、試料中のペプチドグリカンの量に応じて調整することができ、種依存であってもよい。対象となる種のHPLC分析に関する報告が以前に公表されている場合、この量は、これらの定量に基づいて推定することができます(HPLC PG研究のコンパイルは、参照7の補足情報で見つけることができます)。他の種の場合、このステップまでサキュラスの準備を実行することができ、PGが溶液にとどまることを可能にする最小量を決定するために、サンプルを複製するために異なる量の再懸濁液量を追加することができます(さらなる推定値については、議論を参照)。サンプルにペプチドグリカンが多く含まれている場合は、再懸濁液の体積を増やします。サンプルにペプチドグリカンがほとんどない場合は、再懸濁液の体積を最低50 μlに減らします。</li>
	<li>サンプルを1.5mlチューブに移し、1mg/mlのムラミデを加え、最終濃度40μg/mlを与えます。6-8時間または37°Cで一晩インキュベートする。</li>
</ol>4. 3日目 - UPLCのサンプルの準備は最終日に行われます
<ol><li>ヒートブロックを100°Cに切り上げる。 SDSを使用せずにサンプルを5分間煮て、ムラミドーゼの消化を止めます。遠心分離機サンプルを室温で16,000×gで10分間、上清(ムロペプチドは現在溶けやすい)を13mm x 100mmのガラス管に移します。できるだけ多くの上清を回復してみてください, それを乱すことなく、ペレットに非常に近づく.</li>
	<li>500 mM ホウ酸塩バッファー (pH 9) をサンプルに加えて、最終濃度の 100 mM のホウ酸塩バッファーを調整します。ホウ酸塩緩衝液は、還元剤のホウ水素化ナトリウムと相性がある。1~2粒のホウ水素化ナトリウムを加えて各試料を減らし、室温で少なくとも30分間反応を進めます。注意:水素化水素ナトリウムは非常に反応性が高く、取り扱いに危険です - 皮膚との接触を避け(手袋を着用)、目との接触を避けてください(安全眼鏡を着用)。</li>
	<li>pHインジケーター用紙で測定したpH 6まで20μlの増分を使用して50%v/vオルトリン酸を用いてpH 3-4(ムロペプチド等電点は〜3.5)にサンプルを調整し、2 μlインクリメントを使用します。注意:オルソリン酸は腐食性であり、扱いに危険です - 皮膚との接触を避け(手袋を着用)、目との接触を避けてください(安全眼鏡を着用)。サンプルは、オルトリン酸の添加に応答して気泡する必要があります。サンプルがバブリングを停止すると、通常は pH 6 に達したことを示します。試料中にバブリングが起こらない場合、これは、添加されたホウ化水素ナトリウムの量が少なすぎることを示している可能性がある。この場合、pHの低下を止め、1粒または2粒のホウ化水素ナトリウムを慎重に加え、5〜10分間反応させてから、pH調整を再開する。</li>
	<li>0.22 μmのシリンジフィルターを通して、サンプルをUPLCバイアルに直接フィルターします。沈殿物が形成された場合は、濾過する前に炎を通していくつかのパスでチューブを加熱します。サンプルが一日以内にUPLC装置に注入されない場合は、一晩で-20°Cで凍結してください。サンプルは-80 °Cで1年間まで保存することができます。 試料は、炎を数回通過させることによって解凍することができます。</li>
	<li>各サンプルの10 μlを、C18 1.7 μm反転相カラムと202-208 nmを監視するように設定された吸光度検出器を備えたUPLC機器に注入します。サンプルは順次注入されますが、オートサンプラー機能を使用すると、最大 96 個のサンプルをバッチで処理できます。50 mM リン酸ナトリウム (pH 4.35) + 0.4% v/v 溶媒のアジドナトリウム、75 mM リン酸ナトリウム (pH 4.95) + 15% v/v メタノールを溶媒 B.流れを0.25 ml/minに設定し、25分以上の線形勾配を使用して、100%の溶媒Bと30分以内のムロペプチドの順次溶出を達成します。UPLC後のムロペプチドを特徴付けるために質量分析を使用する場合は、分画集電体で目的のピークの分画を収集し、遠心エバポレーターを使用して分画を乾燥させます。</li>
</ol>

<ol>
	<li>den Blaauwen, T., de Pedro, M. A., Nguyen-Disteche, M., Ayala, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+of+rod-shaped+sacculi.">Morphogenesis of rod-shaped sacculi.</a> FEMS Microbiol. Rev. 32, 321-344 (2008).</li><li>Holtje, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+the+stress-bearing+and+shape-maintaining+murein+sacculus+of+Escherichia+coli.">Growth of the stress-bearing and shape-maintaining murein sacculus of Escherichia coli.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62, 181-203 (1998).</li><li>Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. 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A., Vazquez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Penicillin+binding+proteins:+role+in+initiation+of+murein+synthesis+in+Escherichia+coli.">Penicillin binding proteins: role in initiation of murein synthesis in Escherichia coli.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 5632-5635 (1985).</li><li>Kandler, O., Schleifer, K. H., Dandl, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Streptococcus+faecalis+Andrewes+and+Horder+and+Streptococcus+faecium+Orla-Jensen+based+on+the+amino+acid+composition+of+their+murein.">Differentiation of Streptococcus faecalis Andrewes and Horder and Streptococcus faecium Orla-Jensen based on the amino acid composition of their murein.</a> J. Bacteriol. 96, 1935-1939 (1968).</li><li>Kumar, A., Saini, G., Nair, A., Sharma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UPLC:+a+preeminent+technique+in+pharmaceutical+analysis.">UPLC: a preeminent technique in pharmaceutical analysis.</a> Acta Poloniae Pharmaceutica. 69, 371-380 (2012).</li><li>Wilson, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+&amp;#34;ultra+performance&amp;#34;+liquid+chromatography+coupled+to+oa-TOF+mass+spectrometry+as+a+tool+for+differential+metabolic+pathway+profiling+in+functional+genomic+studies.">High resolution &amp;#34;ultra performance&amp;#34; liquid chromatography coupled to oa-TOF mass spectrometry as a tool for differential metabolic pathway profiling in functional genomic studies.</a> J. Proteome Res. 4, 591-598 (2005).</li><li>Wieser, A., Schneider, L., Jung, J., Schubert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-TOF+MS+in+microbiological+diagnostics-identification+of+microorganisms+and+beyond+(mini+review).">MALDI-TOF MS in microbiological diagnostics-identification of microorganisms and beyond (mini review).</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 93, 965-974 (2012).</li></ol>

この記事の生産コストはウォーターズコーポレーションが後援しました。

この手順の重要なステップは、サンプル調製の2日目のステップ3.1です。SDSが一晩沈殿した場合、またはサンプルが室温で数週間4%のSDSに保存されている場合、サンプルを再溶解させるために少なくとも1時間再沸騰させる必要があります。SDS沈殿の一般的な原因はカリウム塩を含む培地の使用であるため、可能であればカリウムは培地で避けるべきです。代表結果セクションで述べたように、...

本明細書に記載されている方法の目的は、無傷の細菌細胞壁(sacculi)を分離し、超高性能液体クロマトグラフィー(UPLC)がムロペプチド成分の同一性とその濃度、グリカン鎖の平均長さ、および鎖間の架橋に関与する材料の割合などの情報を提供するために使用できるようにペプチドグリカン(PG)を消化することです。PG生化学およびムロペプチド種の詳細な議論のために、PG構造および感染、抵抗性、形態形成、および成長におけるその役割を1〜6に記述するいくつかの優れたレビューがある。PG分析のための高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)は、1980年代にグラナーとシュワルツによって最初に開発され、最近ではミゲル・デ・ペドロとワルデマール・ヴォルマーの研究室で広く強化され、適用されています。これまでの方法では、アミノ酸分析またはペーパークロマトグラフィー、細胞壁成分の正確または完全な評価を得ない時間と退屈な技術を使用しました。
UPLC分析は、超遠心分離機やUPLCにアクセスできる基礎研究所で簡単に実装できます。以下に提示するUPLC法は、完全なサキュリを分離し、その中のすべての化学種に関する包括的かつ定量的な情報を提供する。この方法は、20分UPLCラン内のすべての細菌集団にわたってすべてのムロペプチドの正確な定量化をもたらす。この方法の実装は、材料に多額の財政的投資をすることなく、基本的な実験室のスキルのみを含みます。この方法のステップを実行するためには、研究者はピペット処理、バッファーおよび酵素の調製、およびpHの調整に熟練するだけで、幅広い科学的分野にアクセス可能になります。このプロトコルで使用される酵素の選択は、分析される細菌の種に依存します。ここで説明するプロトコルは 、大腸菌に有用であり、一般的に他のグラム陰性生物からサキュリを単離するのに適していることが分かってきた。グラム陽性菌にこの方法を適用する場合は、文献との相談をお勧めします。これらの種では、伝統的に糖分精製がより困難であった。特に、この方法は、グラム陽性菌のテイコ酸などの厚い壁および補助ポリマーに対応するために、酵素の選択および消化時間の長さの点で変更されなければならない。このプロトコルの最初の酵素は、外膜リポタンパク質(ブラウンのリポタンパク質、またはLppなど)をペプチドグリカンに切断し、それによって細胞壁からLppのC末端ジ(またはトリ)ペプチドを除くすべてを放出する。このステップは腸内細菌を調べるときに必要ですが、他の多くのグラム陰性菌にはLpp相当物がないため、このステップはスキップできます。第2酵素は、ペプチドグリカンのムラミン酸成分の後に特異的に切断し、ムロペプチド種を形成する二糖サブユニットを可溶化する。PGのアーキテクチャの正確な評価を提供するために、クロスブリッジまたはペプチドステムの他の部分の切断を防ぐために、サキュリを消化する際に注意する必要があります。
100種以上の菌種からペプチドグリカンの化学組成をHPLCで分析したが、UPLC技術では分析は行われていない。さらに、以前の研究では、細菌ドメインのごく一部からペプチドグリカンを特徴付けており、一部はHPLCのスループットによって制限されています。したがって、この方法をできるだけ多くの研究者に広め、UPLCプラットフォーム上での実施は、ペプチドグリカンがまだ分類されていない細菌種の大部分の生理学的研究を促進するために重要である。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="640">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">Pronase E</td>
			<td style="width:115px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">E629</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mutanolysin from Streptomyces</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M9901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Sodium borohydride (NaBH4)&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">452882</td>
			<td>Sodium borohydride is highly reactive and dangerous to handle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Orthophosphoric acid&#160;</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">79607</td>
			<td>Orthophosphoric acid is corrosive and dangerous to handle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boric acid</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">31146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium azide</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2002</td>
			<td>Sodium azide is a poison</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium tetraborate</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">221732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Millex 0.22 &#956;m syringe filters</td>
			<td style="width:115px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">SLGVR04NL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pH strips (pH range 0-6)</td>
			<td style="width:115px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">M95863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ml polypropylene Falcon tubes</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21008-951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">13 mm x 100 mm glass tubes</td>
			<td style="width:115px;">Kimble Chase</td>
			<td style="width:119px;">60CM13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:240px;">12 mm x 32 mm screw neck glass recovery vial</td>
			<td style="width:115px;">Waters</td>
			<td style="width:119px;">186000327C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td style="width:115px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM9820</td>
			<td>SDS powder is hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">Instrumentation</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Waters Acquity UPLC H-Class system, including:</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Acquity UPLC H-Class Sample Manager FTN</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Acquity UPLC H-Class Quaternary Solvent Manager</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Acquity UPLC BEH C18 1.7 &#181;m column</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acquity UPLC PDA Detector</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Waters Fraction Collector III</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Acquity UPLC 30 cm Column Heater/Cooler</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and preparation of bacterial cell walls for compositional analysis by ultra performance liquid chromatography

細菌細胞壁は、成長および分裂時の細胞形状の決定に重要であり、大きさの複数の雰囲気のターゴール圧力に直面して細胞の機械的完全性を維持する。細菌の王国の多様な形状と大きさにわたって、細胞壁は、短いペプチドによって架橋された糖鎖の高分子ネットワークであるペプチドグリカンで構成されています。細菌生理学におけるペプチドグリカンの中心的な重要性は、抗生物質標的としての使用の根底にあり、成長と分裂の間にどのように強固に組み立てられるかの遺伝的、構造的、細胞生物学的研究を動機づけている。それにもかかわらず、ペプチドグリカン合成における主要な酵素活性と細菌細胞壁の化学組成を完全に特徴付けるためには、依然として広範な調査が必要である。ハイパフォーマンス液体クロマトグラフィー(HPLC)は、様々な環境・遺伝的条件下で増殖する細菌の壁の化学組成の違いを定量化するための強力な分析方法ですが、そのスループットは、多くの場合、制限されています。ここでは、HPLC用6,000 psiと比較して、ポンプを利用して最大15,000 psiの超高圧を供給するHPLCの拡張であるHPLCおよび超高性能液体クロマトグラフィー(UPLC)を介したペプチドグリカンの生物学的分析のための細菌細胞壁の単離および調製のための簡単な手順を提示します。ここで紹介する細菌細胞壁の調製と組み合わせて、少量のサンプルインジェクター、高いサンプリングレート、より小さいサンプル量、およびUPLCの短い実行時間を備えた検出器は、超遠心分離機およびUPLCへのアクセスを持つほとんどの生物学的実験室でのペプチドグリカン組成物および基本的な細菌細胞生物学の新しい発見のための高解像度およびスループットを可能にする。

図1に示す手順を使用して、最終的なサンプルは、UPLCバイアルに直接フィルタリングされた少なくとも200 μlのクリアソリューションで構成されている必要があります(ステップ4.4)。細菌サンプル中の様々なムロペプチドのUPLC分離は、液体移動相とカラムの静止相との間の相対的な溶解性に依存する。逆相C18カラムは、疎水性およびサイズ8に基づいてムロペプチド種を分?...

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Isolation and Preparation of Bacterial Cell Walls for Compositional Analysis by Ultra Performance Liquid Chromatography

細菌細胞壁はペプチドによって架橋された糖鎖の高分子ネットワークであるペプチドグリカンで構成される。超高性能液体クロマトグラフィーは、ペプチドグリカン組成物の新しい発見に高解像度とスループットを提供します。細胞壁(sacculi)の分離とUPLCによる分析のためのその後の準備のための手順を提示する。

超高性能液体クロマトグラフィーによる組成解析のための細菌細胞壁の分離と調製

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

16.0K ビュー.  Stanford University. 細菌細胞壁はペプチドによって架橋された糖鎖の高分子ネットワークであるペプチドグリカンで構成される。超高性能液体クロマトグラフィーは、ペプチドグリカン組成物の新しい発見に高解像度とスループットを提供します。細胞壁(sacculi)の分離とUPLCによる分析のためのその後の準備のための手順を提示する。

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Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. The approach offers an unbiased and in-depth analysis that can enable the development of diagnostic tests, novel therapies, and further our understanding of disease processes. The inherent chemical diversity of the metabolome creates significant analytical challenges and there is no single experimental approach that can detect all metabolites. Additionally, the biological variation in individual metabolism and the dependence of metabolism on environmental factors necessitates large sample numbers to achieve the appropriate statistical power required for meaningful biological interpretation. To address these challenges, this tutorial outlines an analytical workflow for large scale non-targeted metabolite profiling of serum by UPLC-MS. The procedure includes guidelines for sample organization and preparation, data acquisition, quality control, and metabolite identification and will enable reliable acquisition of data for large experiments and provide a starting point for laboratories new to non-targeted metabolite profiling by UPLC-MS.

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry UPLC-MS

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to investigate metabolism. This article outlines a typical workflow utilized for non-targeted metabolite profiling of serum including sample organization and preparation, data acquisition, data analysis, quality control, and metabolite identification.

超高速液体クロマトグラフィー - 質量分析（UPLC-MS）による血清中の大規模非標的メタボロームプロファイリング

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

化学

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first separated into polar and non-polar fractions by a liquid-liquid phase extraction, and partially purified to facilitate downstream analysis. Both aqueous (polar metabolites) and organic (non-polar metabolites) phases of the initial extraction are processed to survey a broad range of metabolites. Metabolites are separated by different liquid chromatography methods based upon their partition properties. In this method, we present microflow ultra-performance (UP)LC methods, but the protocol is scalable to higher flows and lower pressures. Introduction into the mass spectrometer can be through either general or compound optimized source conditions. Detection of a broad range of ions is carried out in full scan mode in both positive and negative mode over a broad m/z range using high resolution on a recently calibrated instrument. Label-free differential analysis is carried out on bioinformatics platforms. Applications of this approach include metabolic pathway screening, biomarker discovery, and drug development.

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Untargeted metabolomics provides a hypothesis generating snapshot of a metabolic profile. This protocol will demonstrate the extraction and analysis of metabolites from cells, serum, or tissue. A range of metabolites are surveyed using liquid-liquid phase extraction, microflow ultraperformance liquid chromatography/high-resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS) coupled to differential analysis software.

ウルトラパフォーマンス液体クロマトグラフィー - 高分解能質量分析（UPLC-HRMS）を使用した生物源から非標的メタボロミクス

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

The Use of Gas Chromatography to Analyze Compositional Changes of Fatty Acids in Rat Liver Tissue during Pregnancy

Gas chromatography (GC) is a highly sensitive method used to identify and quantify the fatty acid content of lipids from tissues, cells, and plasma/serum, yielding results with high accuracy and high reproducibility. In metabolic and nutrition studies GC allows assessment of changes in fatty acid concentrations following interventions or during changes in physiological state such as pregnancy. Solid phase extraction (SPE) using aminopropyl silica cartridges allows separation of the major lipid classes including triacylglycerols, different phospholipids, and cholesteryl esters (CE). GC combined with SPE was used to analyze the changes in fatty acid composition of the CE fraction in the livers of virgin and pregnant rats that had been fed various high and low fat diets. There are significant diet/pregnancy interaction effects upon the omega-3 and omega-6 fatty acid content of liver CE, indicating that pregnant females have a different response to dietary manipulation than is seen among virgin females.

Pregnancy leads to significant changes to the fatty acid composition of maternal tissues. Lipid profiles can be obtained via gas chromatography to allow identification and quantification of fatty acids in individual lipid classes among rats fed various high and low fat diets during pregnancy.

妊娠中にラット肝組織中の脂肪酸の組成変化を分析するために、ガスクロマトグラフィーの使用

Gas chromatography (GC) is a highly sensitive method used to identify and quantify the fatty acid content of lipids from tissues, cells, and plasma/serum, ...

Synthesis and Catalytic Performance of Gold Intercalated in the Walls of Mesoporous Silica

As a promising catalytically active nano reactor, gold nanoparticles intercalated in mesoporous silica (GMS) were successfully synthesized and properties of the materials were investigated. We used a one pot sol-gel approach to intercalate gold nano particles in the walls of mesoporous silica. To start with the synthesis, P123 was used as template to form micelles. Then TESPTS was used as a surface modification agent to intercalate gold nano particles. Following this process, TEOS was added in as a silica source which underwent a polymerization process in acid environment. After hydrothermal processing and calcination, the final product was acquired. Several techniques were utilized to characterize the porosity, morphology and structure of the gold intercalated mesoporous silica. The results showed a stable structure of mesoporous silica after gold intercalation. Through the oxidation of benzyl alcohol as a benchmark reaction, the GMS materials showed high selectivity and recyclability.

Here, we present a protocol with a sol-gel process to synthesize gold intercalated in the walls of mesoporous materials (GMS), which is confirmed to possess a mesoporous matrix with gold intercalated in the walls imparting great stability and recyclability.

合成とメソポーラスシリカの壁に金インターカレーの触媒性能

As a promising catalytically active nano reactor, gold nanoparticles intercalated in mesoporous silica (GMS) were successfully synthesized and properties ...

Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented. A major difficulty in adapting PCD to modern HPLC systems and columns is the need for large volume reaction coils that enable reagent mixing and then the derivatization reaction to take place. This large post column dead volume leads to band broadening, which results in a loss of observed separation efficiency and indeed detection in sensitivity. In reaction flow post column derivatization (RF-PCD) the derivatization reagent(s) are pumped against the flow of mobile phase into either one or two of the outer ports of the reaction flow column where it is mixed with column effluent inside a frit housed within the column end fitting. This technique allows for more efficient mixing of the column effluent and derivatization reagent(s) meaning that the volume of the reaction loops can be minimized or even eliminated altogether. It has been found that RF-PCD methods perform better than conventional PCD methods in terms of observed separation efficiency and signal to noise ratio. A further advantage of RF-PCD techniques is the ability to monitor effluent coming from the central port in its underivatized state. RF-PCD has currently been trialed on a relatively small range of post column reactions, however, there is currently no reason to suggest that RF-PCD could not be adapted to any existing one or two component (as long as both reagents are added at the same time) post column derivatization reaction.

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

反応フロー高速液体クロマトグラフィー用カラムを使用したポストカラム誘導体化

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular identity and function. Each of the seven PtdInsPs varies in their distribution and abundance, which are tightly regulated by specific kinases and phosphatases. The abundance of PtdInsPs can change abruptly in response to various signaling events or disturbance of the regulatory machinery. To understand how these events lead to changes in the amount of PtdInsPs and their resulting impact, it is important to quantify PtdInsP levels before and after a signaling event or between control and abnormal conditions. However, due to their low abundance and similarity, quantifying the relative amounts of each PtdInsP can be challenging. This article describes a method for quantifying PtdInsP levels by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, which is incorporated into PtdInsPs. Phospholipids are then precipitated and deacylated. The resulting soluble 3H-glycero-inositides are further extracted, separated by high-performance liquid chromatography (HPLC), and detected by flow scintillation. The labeling and processing of yeast samples is described in detail, as well as the instrumental setup for the HPLC and flow scintillator. Despite losing structural information regarding acyl chain content, this method is sensitive and can be optimized to concurrently quantify all seven PtdInsPs in cells.

Phosphoinositides are signaling lipids whose relative abundance rapidly changes in response to various stimuli. This article describes a method to measure the abundance of phosphoinositides by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, followed by extraction and deacylation. Extracted glycero-inositides are then separated by high-performance liquid chromatography and quantified by flow scintillation.

高速液体クロマトグラフィー結合フローシンチレーションにより放射性標識およびホスホイノシチドの細胞レベルの定量化

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans. De-starched wheat endosperm cell walls were isolated as an alcohol-insoluble residue (AIR)1 and sequentially extracted with water (W-sol Fr) and 1 M KOH containing 1% NaBH4 (KOH-sol Fr) as described by Ratnayake et al. (2014)2. Two different approaches (see summary in Figure 1) are adopted. In the first, intact W-sol AXs are treated with 2AB to tag the original RE backbone chain sugar residue and then treated with an endoxylanase to generate a mixture of 2AB-labelled RE and internal region reducing oligosaccharides, respectively. In a second approach, the KOH-sol Fr is hydrolyzed with endoxylanase to first generate a mixture of oligosaccharides which are subsequently labelled with 2AB. The enzymically released ((un)tagged) oligosaccharides from both W- and KOH-sol Frs are then methylated and the detailed structural analysis of both the native and methylated oligosaccharides is performed using a combination of MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS and ESI-MSn. Endoxylanase digested KOH-sol AXs are also characterized by nuclear magnetic resonance (NMR) that also provides information on the anomeric configuration. These techniques can be applied to other classes of polysaccharides using the appropriate endo-hydrolases.

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the structural characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans by tagging the RE with 2 aminobenzamide prior to enzymatic (endoxylanase) hydrolysis and then analysis of the resultant oligosaccharides using mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR).

酵素的、化学（メチル化）と物理（質量分析、核磁気共鳴）技術を用いた植物の壁ヘテロキシランのシーケンシング

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

An HS-MRM Assay for the Quantification of Host-cell Proteins in Protein Biopharmaceuticals by Liquid Chromatography Ion Mobility QTOF Mass Spectrometry

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring high sensitivity and a wide dynamic range. Mass spectrometry-based quantification assays for proteins typically involve protein digestion followed by the selective reaction monitoring/multiple reaction monitoring (SRM/MRM) quantification of peptides using a low-resolution (Rs ~1,000) tandem quadrupole mass spectrometer. One of the limitations of this approach is the interference phenomenon observed when the peptide of interest has the "same" precursor and fragment mass (in terms of m/z values) as other co-eluting peptides present in the sample (within a 1-Da window). To avoid this phenomenon, we propose an alternative mass spectrometric approach, a high selectivity (HS) MRM assay that combines the ion mobility separation of peptide precursors with the high-resolution (Rs ~30,000) MS detection of peptide fragments. We explored the capabilities of this approach to quantify low-abundance peptide standards spiked in a monoclonal antibody (mAb) digest and demonstrated that it has the sensitivity and dynamic range (at least 3 orders of magnitude) typically achieved in HCP analysis. All six peptide standards were detected at concentrations as low as 0.1 nM (1 femtomole loaded on a 2.1-mm ID chromatographic column) in the presence of a high-abundance peptide background (2 &#181;g of a mAb digest loaded on-column). When considering the MW of rabbit phosphorylase (97.2 kDa), from which the spiked peptides were derived, the LOQ of this assay is lower than 50 ppm. Relative standard deviations (RSD) of peak areas (n = 4 replicates) were less than 15% across the entire concentration range investigated (0.1-100 nM or 1-1,000 ppm) in this study.

Here, we describe a chromatographic assay coupled with the ion mobility separation of peptide precursors followed by the high-resolution (~30,000) MS-detection of peptide fragments for the quantification of spiked peptide standards in a monoclonal antibody digest.

液体クロマトグラフィーによるイオン移動 QTOF 質量分析法によるタンパク質のバイオ医薬品の宿主細胞蛋白質の定量化のための HS MRM アッセイ

The analysis of low-level (1-100 ppm) protein impurities (e.g., host-cell proteins (HCPs)) in protein biotherapeutics is a challenging assay requiring ...

A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography (HPLC)

Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil quality, food flavoring, and human health. The biological activity of glucosinolates is released upon tissue damage, when they are mixed with the enzyme myrosinase. This results in the formation of pungent and toxic breakdown products, such as isothiocyanates and nitriles. Currently, more than 130 structurally different glucosinolates have been identified. The chemical structure of the glucosinolate is an important determinant of the product that is formed, which in turn determines its biological activity. The latter may range from detrimental (e.g., progoitrin) to beneficial (e.g., glucoraphanin). Each glucosinolate-containing plant species has its own specific glucosinolate profile. For this reason, it is important to correctly identify and reliably quantify the different glucosinolates present in brassicaceous leaf, seed, and root crops or, for ecological studies, in their wild relatives. Here, we present a well-validated, targeted, and robust method to analyze glucosinolate profiles in a wide range of plant species and plant organs. Intact glucosinolates are extracted from ground plant materials with a methanol-water mixture at high temperatures to disable myrosinase activity. Thereafter, the resulting extract is brought onto an ion-exchange column for purification. After sulfatase treatment, the desulfoglucosinolates are eluted with water and the eluate is freeze-dried. The residue is taken up in an exact volume of water, which is analyzed by high-pressure liquid chromatography (HPLC) with a photodiode array (PDA) or ultraviolet (UV) detector. Detection and quantification are achieved by conducting comparisons of the retention times and UV spectra of commercial reference standards. The concentrations are calculated based on a sinigrin reference curve and well-established response factors. The advantages and disadvantages of this straightforward method, when compared to faster and more technologically advanced methods, are discussed here.

A Straightforward Method for Glucosinolate Extraction and Analysis with High-pressure Liquid Chromatography HPLC

Here, we describe in great detail an established and robust protocol for the extraction of glucosinolates from ground plant materials. After an on-column sulfatase treatment of the extracts, the desulfoglucosinolates are eluted and analyzed by high-pressure liquid chromatography.

高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）とグルコシノレートの抽出および分析のための簡単な方法

Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil ...

Liquid-cell Transmission Electron Microscopy for Tracking Self-assembly of Nanoparticles

Drying a nanoparticle dispersion is a versatile way to create self-assembled structures of nanoparticles, but the mechanism of this process is not fully understood. We have traced the trajectories of individual nanoparticles using liquid-cell transmission electron microscopy (TEM) to investigate the mechanism of the assembly process. Herein, we present the protocols used for liquid-cell TEM studies of the self-assembly mechanism. First, we introduce the detailed synthetic protocols used to produce uniformly sized platinum and lead selenide nanoparticles. Next, we present the microfabrication processes used to produce liquid cells with silicon nitride or silicon windows and then describe the loading and imaging procedures of the liquid-cell TEM technique. Several notes are included to provide helpful tips for the entire process, including how to manage the fragile cell windows. The individual motions of nanoparticles tracked by liquid-cell TEM revealed that changes in the solvent boundaries caused by evaporation affected the self-assembly process of nanoparticles. The solvent boundaries drove nanoparticles to primarily form amorphous aggregates, followed by flattening of the aggregates to produce a 2-dimensional (2D) self-assembled structure. These behaviors are also observed for different nanoparticle types and different liquid-cell compositions.

Here we introduce experimental protocols for the real-time observation of a self-assembly process using liquid-cell transmission electron microscopy.

ナノ粒子の自己集合の追跡のため液晶セルの透過電子顕微鏡観察

Drying a nanoparticle dispersion is a versatile way to create self-assembled structures of nanoparticles, but the mechanism of this process is not fully ...