この作品はまた、JSBにR01GM103655を付与ウェルチ財団助成F1155およびNIHによってサポートされていました衛生研究所（NIH）の国立研究所からの補助金のAI064184およびAI76322によっておよびMSTの調査に陸軍研究室からの助成金61789-MA-MURによってサポートされていました

利害の対立が宣言されていません。

このプロトコルでは、細菌の全細胞由来の脂質A種の単離を詳述し、かつ化学的に、この単離された物質を特徴付けるためにTLCまたはMSベースの分析方法を記載している。タンデム質量分析法は、生物学的化合物の新たな構造解析のための強力な戦略であり、自然の中で観察されたリピドA分子の盛装の化学的特性のために非常に貴重です。 CIDとUVPD脂質A分子のキーフィンガープリントを...

リポ多糖（LPS）は、ほぼすべてのグラム陰性菌の主要外表面分子であり、3つの分子のドメインで構成されています。遠位O抗原多糖、コアオリゴ糖、および膜結合脂質ドメインの外葉の上に堆積外膜二重層1,2。脂質ドメインは、リピドAは、温和な酸加水分解の際に1 LPSのクロロホルム可溶性部分として定義することができる3 -デオキシ-D-マンノ-オクト-2 - ulosonic（のKdo）残基および脂質分子種から構成され2。モデル生物大腸菌（E.coli）1,2で観察され、主要なリピドA種と一致して、標準的な脂質分子は、化学的にアシル化ヘキサ-およびビス -リン酸化されdiglucosamineバックボーンとして定義することができる。グラム陰性菌を通じて保存ナイン構成的に発現される遺伝子は、ドメイン（ 図1）1,2脂質の産生に関与している。ほとんどの細菌は、脂質3のさらなる化学修飾に参加系統発生の保存度が異なる遺伝子の追加セットを持っています。脱リン酸化、アシル鎖の除去、およびそのようなアミノ糖（ 例えば、アミノアラビノース）及び/又はホスホエタノールアミンなどの化学部分の付加は、最も一般的に観察された活性（ 図1）である。脂質修飾に関与する酵素の多くは、直接そのような二価の陽イオンのような環境シグナルによって活性化される、またはそれらの発現は二成分応答調節因子系3により調節される。 宿主自然免疫系による脂質A種の認識は、Toll様受容体4/myeloid分化因子2（TLR4/MD2）共受容体4により媒介される。 MD2および脂質のアシル鎖間、ならびにTLR4および脂質Aの1および4 &#39;リン酸基間の疎水性力は、リップの強い会合を促進TLR4/MD2 4,5にID Aに。自然免疫応答の認識と下流刺激アシル化状態や脂質の負電荷の影響TLR4/MD2ベースの脂質を変化させる改変は、NF-κBおよびそのようなTNFαおよびIL1-β6,7などの炎症のメディエーターを活性化剤。リピドAの負の電荷をマスキング修飾はまた、細胞表面3,8のグラム陰性への結合から殺菌カチオン性抗菌性ペプチドを防止する。多くのリピドA修飾は、ヒト宿主の内部または生態的地位のように、特定の環境条件下で細菌の適応度を高めることが仮定される。この理由のために多くの修飾酵素は、抗菌性化合物の合理的開発における魅力的な標的である。リピドA構造の化学的多様性は、生物および/または環境、およびこれらの多様な構造の生物学的意味に対してリピドAの構造的特徴のtにおいて重要な努力をする彼は、グラム陰性菌の研究。 全細菌からのリピドA分子の単離は、最終的な精製手順9-11、続いて細菌細胞表面からのLPSの抽出、リピドAを遊離させる加水分解工程を伴う。最も頻繁に引用されたLPS抽出手順は、第ウェストファールとジャン10によって導入され、熱フェノール水抽出法である。抽出後、全体LPSは、化学的にリピドA（ 図1）の遠位グルコサミン糖の6&#39;-ヒドロキシルからのKdoを分離軽度酸加水分解に供される。多数の落とし穴は、高い危険性試薬の使用を含む熱水フェノール手順のために共抽出された核酸およびタンパク質を分解する必要性が存在し、数日間は、プロトコル10を完了するために必要とされる。 最初CaroffとRaetz 12,13によって開発されたように私たちの研究室では、脂質Aの抽出および単離を開発しました。熱フェノール水手順と比較して、ここに提示した方法は、より迅速かつ効率的で、そして5mlから複数リットルの培養容量の広い範囲を収容する。また、ホットフェノール水抽出とは異なり、我々の方法は、リピドA種の最適な回復を提供する、LPSのラフや滑らかなタイプで選択されません。我々のプロトコルでは、全細菌細胞の化学的溶解は、LPSを遠心分離によりペレット化することができる、クロロホルム、メタノールおよび水の混合物を用いて行われる。マイルド酸加水分解、溶媒抽出（ブライ - ダイアー）の組み合わせは、共有結合した多糖からリピドAを遊離するために使用される。ブライとダイアーのメソッドが最初に14組織が ​​、動物や植物の様々な脂質種の抽出に適用されるこの最終分離工程中の脂質Aから加水分解された多糖類を分離するために、ここで変更された、クロロホルム可溶性の脂質は、選択的に下層の有機に分配相。さらに、リピドAを精製するには、逆相又は陰イオン交換カラムクロマトグラフィーは、12を用いることができる。 全細胞由来の脂質A種の単離後、分析方法の数は、NMR、TLC及びMSベースの分析のような単離された物質の化学構造を特徴付けるために使用することができる。 NMRは非破壊構造解明を可能にし、グリコシド結合、アシル鎖位置の明確な割り当て、およびアミノアラビノースまたはホスホエタノールアミン15〜17のような脂質Aの変更のための結合部位の割り当てに関連した構造的な詳細を提供します。リピドAのNMR分析は、我々のプロトコル内で議論されていないが、別の場所15,16十分に記載されている。迅速な分析のためにTLCの方法が頻繁に使用され基づいているが、微細な化学構造に関する直接的な情報を提供することができない。 MSベースのプロトコルは、脂質A構造18,19を特徴付けるために最も頻繁に使用される方法である。マトリックス支援レーザー脱離イオン化（MALDI）-MSは、しばしば、最初に無傷のリピドA種を調査するために使用される。単一荷電イオンは、我々の分析物の抽出手順に従って調製から生成される。より細かい構造解析が必要とされるように、MS / MSベースの方法は、MALDI-MSのより多くの情報を証明する。単独で（ESI）をエレクトロスプレーイオン又は前駆イオンは、さらに構造的に有益な生成物イオンの18,20,21を生成するために、衝突誘起解離（CID）又は紫外光解離（UVPD）によって断片化された荷電脂質を乗算する結合されている。前駆体イオンを、脂質からニュートラルロス製品も頻繁に構造情報の追加レイヤを提供し、ESI-MSの間に生成される。 タンデム質量分析（MS / MS）は、リピドA構造の解明に不可欠で汎用性の高い方法であることが証明されている。 MS / MSの間に、イオンは、前駆イオンの構造を解明するために使用することができる診断フラグメンテーションパターンを生成するために活性化される。最も広くAVAilable MS / MS法は、CIDである。この方法は、解離を導くエネルギーの堆積をもたらす、不活性ガスをターゲットと選択された前駆イオンの衝突を介してフラグメントイオンを生成する。 CIDは細菌種22-33広範囲のリピドA構造の割り当てにおいて重要なツールであることが分かっている。 CIDは最も普遍的に実装され、MS / MS法であるが、生成物イオンの限定された配列を生成します。 193nmのUVPD代替相補MS / MS法である。この方法は、イオンを照射するレーザーを使用し、光子の吸収は、イオン解離及びその後の通電をもたらす。この高いエネルギーMS / MS技術は、CIDよりも生成物イオンのより多様なアレイを生成するため、より有益な断片化パターンを提供する。特に、UVPDはグリコシド、アミン、アシルおよびCC連動債で切断18,21,34に基づいてリピドA種の微妙な変化についての情報を与える。

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C607</td>
			<td>HPLC Grade</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A452</td>
			<td>HPLC Grade</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Teflon FEP Centrifuge Bottles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-562-21</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Silica Gel 60 TLC Plates</td>
			<td>EMD Biosciences</td>
			<td>5626-6</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Grade No. 3MM Chromatography Paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>3030700</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Orbitrap Elite</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mass Spectrometer</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>ExciStar XS Excimer Lasrer</td>
			<td>Coherent Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PicoTip Nanospray ESI emitters</td>
			<td>New Obectives</td>
			<td></td>
			<td>&ge; 30 &mu;m to reduce clogging</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Model 505 Pulse/Delay Generator</td>
			<td>Berkeley Nucleonics Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hot Plate Thermoylne 2200</td>
			<td>Barnstead/Thermolyne</td>
			<td>HPA2235MQ</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>16x125 mm GPI 15-415 Threaded Disposable Borosilicate Culture Tubes</td>
			<td>Corning Pyrex</td>
			<td>99449-16X</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Reusable Threaded PTFE screw caps GPI 45-415</td>
			<td>Corning </td>
			<td>9999-152</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Personal Molecular Imager System (phosphorimager)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-9400</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Autoradiography Cassette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FBCS810</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Phosphorscreen SO230</td>
			<td>Kodak</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Peptide Mass Standards Kit</td>
			<td>Sequazyme</td>
			<td>P2-3143-00</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sonifier S250-A</td>
			<td>Branson</td>
			<td>101063196</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1.5 ml 12x32 mm Tapered Base Screw Thread Vial</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C4000-V1</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

isolation and chemical characterization of lipid a from gram-negative bacteria

リポ多糖（LPS）は、外膜二重層の外側リーフレット上に堆積されたグラム陰性菌の主要な細胞表面分子である。 LPSは、三つのドメインに細分することができる。遠位O-多糖、コアオリゴ糖、脂質および脂質からなるドメイン分子種および3 - デオキシ-D-マンノ - オクト-2 - ulosonic酸残基（のKdo）。リピドAドメインは、細菌細胞の生存に必須で唯一の成分である。その合成後、リピドAに化学的抗生物質化合物に対する耐性を促進するために、例えばpHまたは温度のような環境ストレスに応答して変更され、宿主自然免疫応答のメディエーターによる認識を回避する。以下のプロトコールは、グラム陰性細菌からのリピドAの小規模および大規模な単離を詳述する。単離された物質は、その後、化学的薄層クロマトグラフィー（TLC）または質量分析（MS）によって特徴付けられる。 fはマトリックス支援レーザー脱離/イオン化時間に加えて、光（MALDI-TOF）MSは、我々はまた、衝突誘起解離（CID）に結合されたエレクトロスプレーイオン化（ESI）および新たに採用紫外光解離（UVPD）の方法を用いて脂質の分子種を分析するため、タンデムMSプロトコルを記載している。我々のMSプロトコルは、一意又は新規な化学修飾を含むリピドA分子の特徴付けに最も重要な、化学構造の明確な決定を可能にする。また、TLCによる分析のために細菌細胞からの脂質Aの放射性同位体標識、およびその後の単離を記載する。 MSベースのプロトコルに対して、TLCは、より経済的で迅速な特徴付け方法を提供するが、明確に知られている化学構造の基準を使用することなく、化学構造脂質を割り当てるために使用することができない。過去20年間の脂質Aの単離および特徴は、抗生物質抵抗のメカニズムをグラム陰性細菌の生理学の理解を改善している多数の刺激的な発見につながっているインダクタンス、人間の自然免疫応答、および抗菌性化合物の開発には多くの新しいターゲットを提供してきました。

Eの標準的な脂質Aおよび4 &#39;位- 大腸菌やサルモネラ菌血清型菌は、ヘキサ-アシル化1でのリン酸基とグルコサミンの二糖である。リッチメディア（ 例えばルリアブロス）での成長中にリピドAの部分は、 トリス -リン酸化された種は36（ 図1）を得た1位のピロリン酸基を含む。 KDO（3 -デオキシ-D- マンノ -オクツロソン酸）、6&#39;-?...

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Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

グラム陰性菌からのリポ多糖（LPS）のリピドAドメインの単離および特徴は、細胞表面の抗生物質耐性のベースのメ​​カニズム、細菌の生存やフィットネス、そしてどのように化学的に多様な脂質分子種が差ホスト自然免疫応答を調節への洞察を提供します。

グラム陰性菌からの単離とリピドAの化学特性評価

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

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31.4K ビュー.  The University of Texas at Austin. グラム陰性菌からのリポ多糖（LPS）のリピドAドメインの単離および特徴は、細胞表面の抗生物質耐性のベースのメ​​カニズム、細菌の生存やフィットネス、そしてどのように化学的に多様な脂質分子種が差ホスト自然免疫応答を調節への洞察を提供します。 

ビデオ: Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Free Radicals in Chemical Biology: from Chemical Behavior to Biomarker Development

The involvement of free radicals in life sciences has constantly increased with time and has been connected to several physiological and pathological processes. This subject embraces diverse scientific areas, spanning from physical, biological and bioorganic chemistry to biology and medicine, with applications to the amelioration of quality of life, health and aging. Multidisciplinary skills are required for the full investigation of the many facets of radical processes in the biological environment and chemical knowledge plays a crucial role in unveiling basic processes and mechanisms. We developed a chemical biology approach able to connect free radical chemical reactivity with biological processes, providing information on the mechanistic pathways and products. The core of this approach is the design of biomimetic models to study biomolecule behavior (lipids, nucleic acids and proteins) in aqueous systems, obtaining insights of the reaction pathways as well as building up molecular libraries of the free radical reaction products. This context can be successfully used for biomarker discovery and examples are provided with two classes of compounds: mono-trans isomers of cholesteryl esters, which are synthesized and used as references for detection in human plasma, and purine 5',8-cyclo-2'-deoxyribonucleosides, prepared and used as reference in the protocol for detection of such lesions in DNA samples, after ionizing radiations or obtained from different health conditions.

Radical-based biomimetic chemistry has been applied to building-up libraries necessary for biomarker development.

ケミカルバイオロジーのフリーラジカル：化学的挙動からバイオマーカー探索·開発へ

The involvement of free radicals in life sciences has constantly increased with time and has been connected to several physiological and pathological ...

化学

Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both stimuli and cargo can be tailored according to specific needs. Here we describe the DNA nanorobot fabrication protocol, with the use of the DNA origami technique. The procedure initiates by mixing short single-strand DNA staples into a stock mixture which is then added to a long, circular, single-strand DNA scaffold in presence of a folding buffer. A standard thermo cycler is programmed to gradually lower the mixing reaction temperature to facilitate the staples-to-scaffold annealing, which is the guiding force behind the folding of the nanorobot. Once the 60 hr folding reaction is complete, excess staples are discarded using a centrifugal filter, followed by visualization via agarose-gel electrophoresis (AGE). Finally, successful fabrication of the nanorobot is verified by transmission electron microscopy (TEM), with the use of uranyl-formate as negative stain.

DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).

DNA折り紙からバイオ応答ロボットの折りたたみとキャラクタリゼーション

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both ...

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

The traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the use of solid-phase synthesis by appending suitably modified phosphoramidite precursors to the nascent chain. However, the conditions used during the synthesis and the restriction to rather short sequences hamper the applicability of this methodology. On the other hand, modified nucleoside triphosphates are activated building blocks that have been employed for the mild introduction of numerous functional groups into nucleic acids, a strategy that paves the way for the use of modified nucleic acids in a wide-ranging palette of practical applications such as functional tagging and generation of ribozymes and DNAzymes. One of the major challenges resides in the intricacy of the methodology leading to the isolation and characterization of these nucleoside analogues.
	
	In this video article, we present a detailed protocol for the synthesis of these modified analogues using phosphorous(III)-based reagents. In addition, the procedure for their biochemical characterization is divulged, with a special emphasis on primer extension reactions and TdT tailing polymerization. This detailed protocol will be of use for the crafting of modified dNTPs and their further use in chemical biology.

The protocol described herein aims to explain and abridge the numerous obstacles in the way of the intricate route leading to modified nucleoside triphosphates. Consequently, this protocol facilitates both the synthesis of these activated building-blocks and their availability for practical applications.

ヌクレオシド三リン酸 - 合成からの生化学的特徴付けへ

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

An Inverse Analysis Approach to the Characterization of Chemical Transport in Paints

The ability to directly characterize chemical transport and interactions that occur within a material (i.e., subsurface dynamics) is a vital component in understanding contaminant mass transport and the ability to decontaminate materials. If a material is contaminated, over time, the transport of highly toxic chemicals (such as chemical warfare agent species) out of the material can result in vapor exposure or transfer to the skin, which can result in percutaneous exposure to personnel who interact with the material. Due to the high toxicity of chemical warfare agents, the release of trace chemical quantities is of significant concern. Mapping subsurface concentration distribution and transport characteristics of absorbed agents enables exposure hazards to be assessed in untested conditions. Furthermore, these tools can be used to characterize subsurface reaction dynamics to ultimately design improved decontaminants or decontamination procedures. To achieve this goal, an inverse analysis mass transport modeling approach was developed that utilizes time-resolved mass spectroscopy measurements of vapor emission from contaminated paint coatings as the input parameter for calculation of subsurface concentration profiles. Details are provided on sample preparation, including contaminant and material handling, the application of mass spectrometry for the measurement of emitted contaminant vapor, and the implementation of inverse analysis using a physics-based diffusion model to determine transport properties of live chemical warfare agents including distilled mustard (HD) and the nerve agent VX.

In this paper, a procedure for quantifying the mass transport parameters of chemicals in various materials is presented. This process involves employing an inverse-analysis based diffusion model to vapor emission profiles recorded by real-time, mass spectrometry in high vacuum.

塗料中の化学輸送のキャラに逆解析アプローチ

The ability to directly characterize chemical transport and interactions that occur within a material (i.e., subsurface dynamics) is a vital component in ...

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and technological applications. Their signature property is their ultrahigh porosity, which however imparts a series of challenges when it comes to both constructing them and working with them. Securing desired MOF chemical and physical functionality by linker/node assembly into a highly porous framework of choice can pose difficulties, as less porous and more thermodynamically stable congeners (e.g., other crystalline polymorphs, catenated analogues) are often preferentially obtained by conventional synthesis methods. Once the desired product is obtained, its characterization often requires specialized techniques that address complications potentially arising from, for example, guest-molecule loss or preferential orientation of microcrystallites. Finally, accessing the large voids inside the MOFs for use in applications that involve gases can be problematic, as frameworks may be subject to collapse during removal of solvent molecules (remnants of solvothermal synthesis). In this paper, we describe synthesis and characterization methods routinely utilized in our lab either to solve or circumvent these issues. The methods include solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries, and materials activation (cavity evacuation) by supercritical CO2 drying. Finally, we provide a protocol for determining a suitable pressure region for applying the Brunauer-Emmett-Teller analysis to nitrogen isotherms, so as to estimate surface area of MOFs with good accuracy.

Synthesis, activation, and characterization of intentionally designed metal-organic framework materials is challenging, especially when building blocks are incompatible or unwanted polymorphs are thermodynamically favored over desired forms. We describe how applications of solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries and activation via supercritical CO2 drying, can address some of these challenges.

官能化有機金属構造体の合成とキャラクタリゼーション

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over large or small sample areas. It has been applied in many areas of science, including materials science, geoscience, studying works of cultural heritage, and in chemical biology. In the case of chemical biology, for example, visualizing the metal distributions within cells allows us to study both naturally-occurring metal ions in the cells, as well as exogenously-introduced metals such as drugs and nanoparticles. Due to the fully hydrated nature of nearly all biological samples, cryo-fixation followed by imaging under cryogenic temperature represents the ideal imaging modality currently available. However, under the circumstances that such a combination is not easily accessible or practical, aldehyde based chemical fixation remains useful and sometimes inevitable. This article describes in as much detail as possible in the preparation of adherent mammalian cells by chemical fixation for X-ray fluorescent imaging.

Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays.

化学固定することによりX線蛍光イメージングのための接着細胞の準備

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical properties for applications in photonics, drug delivery and coating technology. Here we present a new family of colloidal building blocks, coined supramolecular colloids, whose self-assembly is controlled through surface-functionalization with a benzene-1,3,5-tricarboxamide (BTA) derived supramolecular moiety. Such BTAs interact via directional, strong, yet reversible hydrogen-bonds with other identical BTAs. Herein, a protocol is presented that describes how to couple these BTAs to colloids and how to quantify the number of coupling sites, which determines the multivalency of the supramolecular colloids. Light scattering measurements show that the refractive index of the colloids is almost matched with that of the solvent, which strongly reduces the van der Waals forces between the colloids. Before photo-activation, the colloids remain well dispersed, as the BTAs are equipped with a photo-labile group that blocks the formation of hydrogen-bonds. Controlled deprotection with UV-light activates the short-range hydrogen-bonds between the BTAs, which triggers the colloidal self-assembly. The evolution from the dispersed state to the clustered state is monitored by confocal microscopy. These results are further quantified by image analysis with simple routines using ImageJ and Matlab. This merger of supramolecular chemistry and colloidal science offers a direct route towards light- and thermo-responsive colloidal assembly encoded in the surface-grafted monolayer.

A protocol for the synthesis and characterization of colloids coated with supramolecular moieties is described. These supramolecular colloids undergo self-assembly upon the activation of the hydrogen-bonds between the surface-anchored molecules by UV-light.

超分子コロイドの合成とキャラクタリゼーション

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

Microfluidic Dry-spinning and Characterization of Regenerated Silk Fibroin Fibers

The protocol demonstrates a method for mimicking the spinning process of silkworm. In the native spinning process, the contracting spinning duct enables the silk proteins to be compact and ordered by shearing and elongation forces. Here, a biomimetic microfluidic channel was designed to mimic the specific geometry of the spinning duct of the silkworm. Regenerated silk fibroin (RSF) spinning doped with high concentration, was extruded through the microchannel to dry-spin fibers at ambient temperature and pressure. In the post-treated process, the as-spun fibers were drawn and stored in ethanol aqueous solution. Synchrotron radiation wide-angle X-ray diffraction (SR-WAXD) technology was used to investigate the microstructure of single RSF fibers, which were fixed to a sample holder with the RSF fiber axis normal to the microbeam of the X-ray. The crystallinity, crystallite size, and crystalline orientation of the fiber were calculated from the WAXD data. The diffraction arcs near the equator of the two-dimensional WAXD pattern indicate that the post-treated RSF fiber has a high orientation degree.

A protocol for the microfluidic spinning and microstructure characterization of regenerated silk fibroin monofilament is presented.

マイクロ流体ドライ回転と再生絹フィブロイン繊維の特性

The protocol demonstrates a method for mimicking the spinning process of silkworm. In the native spinning process, the contracting spinning duct enables ...

Synthesis and Evaluation of a Ruthenium-based Mitochondrial Calcium Uptake Inhibitor

We detail the synthesis and purification of a mitochondrial calcium uptake inhibitor, [(OH2)(NH3)4Ru(&#181;-O)Ru(NH3)4(OH2)]5+. The optimized synthesis of this compound commences from [Ru(NH3)5Cl]Cl2 in 1 M NH4OH in a closed container, yielding a green solution. Purification is accomplished with cation-exchange chromatography. This compound is characterized and verified to be pure by UV-vis and IR spectroscopy. The mitochondrial calcium uptake inhibitory properties are assessed in permeabilized HeLa cells by fluorescence spectroscopy.

A protocol for the synthesis, purification, and characterization of a ruthenium-based inhibitor of mitochondrial calcium uptake is presented. A procedure to evaluate its efficacy in permeabilized mammalian cells is demonstrated.

ルテニウムによるミトコンドリアのカルシウム吸収阻害剤の合成と評価

We detail the synthesis and purification of a mitochondrial calcium uptake inhibitor, [(OH2)(NH3)4Ru(&#181;-O)Ru(NH3)4(OH2)]5+. The optimized synthesis of ...

An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling

DNA methylation is a stable and heritable epigenetic modification in the mammalian genome and is involved in regulating gene expression to control cellular functions. The reversal of DNA methylation, or DNA demethylation, is mediated by the ten-eleven translocation (TET) protein family of dioxygenases. Although it has been widely reported that aberrant DNA methylation and demethylation are associated with developmental defects and cancer, how these epigenetic changes directly contribute to the subsequent alteration in gene expression or disease progression remains unclear, largely owing to the lack of reliable tools to accurately add or remove DNA modifications in the genome at defined temporal and spatial resolution. To overcome this hurdle, we designed a split-TET2 enzyme to enable temporal control of 5-methylcytosine (5mC) oxidation and subsequent remodeling of epigenetic states in mammalian cells by simply adding chemicals. Here, we describe methods for introducing a chemical-inducible epigenome remodeling tool (CiDER), based on an engineered split-TET2 enzyme, into mammalian cells and quantifying the chemical inducible production of 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) with immunostaining, flow cytometry or a dot-blot assay. This chemical-inducible epigenome remodeling tool will find broad use in interrogating cellular systems without altering the genetic code, as well as in probing the epigenotype&#8722;phenotype relations in various biological systems.

Detailed protocols for introducing an engineered split-TET2 enzyme (CiDER) into mammalian cells for chemical inducible DNA hydroxymethylation and epigenetic remodeling are presented.