我々 は金融に感謝健康の国民の協会からのサポートを許可 (YZ に R01GM112003)、ウェルチ財団 (YZ には BE-1913 年)、テキサス州の研究所、アメリカの癌協会 (YZ に RSG-16-215-01 TBE) がん予防 (YH、まで RR140053RP170660 YZ) には、アメリカ心臓協会 (YH まで 16IRG27250155)、ジョン s. ダン財団共同研究賞プログラム。

1. 細胞培養、プラスミド トランスフェクションと化学的誘導
<ol>
	<li>文化、付着性のセル (例えば、ヒト胚の腎臓 HEK293T 細胞) の行ダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM) 10% 熱不活化牛胎児血清、100 U/mL ペニシリンとストレプトマイシン 5% CO2と 37 ° C で補われます。</li>
	<li>サイダーのプラスミドを持つセルを transfect します。
	<ol>
		<li>トランスフェクション前に少なくとも 18 h、につき適切な DMEM の 2.5 mL の種子 0.3 x 106セル 6 ウェル プレートでよく、60-80% の confluency に到達する 37 ° C は一晩でセルを孵化させなさい。</li>
		<li>事前のトランスフェクション試薬を使用する前に室温を暖めます。</li>
		<li>生殖不能の管に無血清培地の場所 250 μ L。 注: この金額が 80% の confluency に 6 ウェル プレートに合わせて調整されます。必要な場合、板や細胞数のサイズによると培地量は比例的に調整します。</li>
		<li>サイダー18または TET2 の触媒ドメイン エンコード プラスミドの 2.5 μ g を追加 (肯定的な制御として TET2CD)12,13無血清培地にゆっくりとピペッティングで混ぜます。</li>
		<li>希薄化後の DNA の混合物にトランスフェクション試薬の 7.5 μ L を追加し、軽くピペッティングで混ぜます。</li>
		<li>20-30 分の室温で混合物を孵化させなさい。</li>
		<li>予め温めておいたメディアを変更したり、drop-wise、井戸に混合物を追加し、トランスフェクション試薬と DNA の混合物を均等に分散させる細胞培養プレートを軽く振る。</li>
		<li>細胞との混合物を一晩インキュベートし、2 ml の新鮮な完全な DMEM のメディアを含むトランスフェクション試薬を置き換えます。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>化学的誘導
	<ol>
		<li>ラパマイシン株式 (DMSO に溶解) 適切な完全培地で 20 μ M の濃度の希釈の 2 mM。</li>
		<li>2 mL 中 200 の最終濃度に到達する維持 transfected セルに希薄ラパマイシンの 20 μ L を追加 nM。 注: 48 時間培養後の細胞、5hmC 世代の定量化や他のダウン ストリーム アプリケーションの準備ができて。必要な場合、誘導効率を細胞以下のとおりさらに 5hmC 定量化のためのすべての 3 h を取ることによって監視および図 1に示すようにできます。</li>
		<li>5hmC 誘導効率のよりよい定量化のため種子は 3 時間おきにセルを監視する井戸を区切ります。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 免疫染色によるラパマイシン誘導 5hmC 生産の定量化
<ol>
	<li>5hmC 免疫蛍光染色 注: は、プレートのすべてのセルをカバーする 3 N HCl で PBS で (トリトン X-100) など 0.2% を界面活性剤 4% パラホルムアルデヒドの固定の解決の十分な量を追加します。たとえば、ソリューションの 500 μ L は 6 ウェル プレートでも十分でしょう。室温ですべての手順を実行します。<ol>
		<li>セルを修正するには、周囲温度で 15 分間ラパマイシン処理細胞を PBS で 4% パラホルムアルデヒドを追加します。コントロール グループのラパマイシン標的治療せず mCherry サイダーを発現する細胞を使用します。揺り動かしてはいけない。 注意: パラホルムアルデヒドは有毒です。適切な保護具を着用します。</li>
		<li>固定液を破棄します。細胞膜を permeabilize の 30 分間、PBS の 0.2% を界面活性剤で固定セルを孵化させなさい。</li>
		<li>透過ソリューションを破棄します。グリセリンのセルに 3 N 塩酸を追加し、DNA を変性する 15 分間インキュベートします。</li>
		<li>PH の中和のため 10 分のセルに対する塩酸追加 100 mM トリス塩酸バッファー (pH 8.0) を破棄します。</li>
		<li>すべてのソリューションを破棄します。洗浄セル、PBS で徹底的に 3-5 回。PBS を徹底的に削除します。 注: は、すべて洗浄ステップの PBS の十分な量を追加します。たとえば、1 mL の PBS は、十分 6 ウェル プレートです。</li>
		<li>穏やかな揺れで 1 時間 PBS で (トゥイーン 20) など界面活性剤の 0.05% 1 %bsa を有しブロック バッファーを追加してセルをブロックします。</li>
		<li>ブロッキング液を破棄します。セルに希釈 5hmC 抗体 (レバレッジ) を追加し、室温で 2 時間または 4 ° C で一晩インキュベート</li>
		<li>3 回 15 分間 PBS のセルを洗浄します。</li>
		<li>希釈した蛍光体 (FITC) を追加-共役二次抗体 (レバレッジ) セルに、1 時間インキュベートします。</li>
		<li>洗浄は PBS のセル 3 回広範囲に残留抗体を削除します。</li>
		<li>5 分削除染色液 250 ng/mL の 4', 6-diamidino-2-phenylindole 核を染色する (DAPI) を追加します。</li>
		<li>共焦点レーザー顕微鏡のための immunostained 細胞をスライドまたはガラス底培養皿をマウントします。代表的な結果は、図 1 bに示されました。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>フローサイトメトリー 注: は、次のプロシージャを汚すの 96 ウェル丸底プレートを使用します。通常、試薬の 150 μ L の各ウェルに十分です。<ol>
		<li>FACS バッファー (1 %bsa、2 ミリメートルの EDTA を用いた PBS) のトランスフェクションとラパマイシン誘導細胞を再懸濁します。コントロール グループのラパマイシン標的治療せずサイダー発現細胞を使用します。</li>
		<li>修正し、手順 2.1 で説明されるように、セルを permeabilize します。</li>
		<li>2 N 塩酸を 10 分の DNA を変性するセルに追加します。</li>
		<li>塩酸 Neutralize を破棄し、ステップ 2.1 で説明されているように、細胞をブロックします。</li>
		<li>セルに希釈の抗 5hmC 抗体 (レバレッジ) を追加し、室温でまたは一晩 4 ° C で 1 時間インキュベート</li>
		<li>FACS バッファーを持つセルを 3 回洗浄します。徹底的に FACS バッファーを削除します。</li>
		<li>希釈した蛍光体 (FITC) を追加-共役二次抗体 (1: 400) 蛍光活性化セル (FACS) 分析を並べ替えのため、室温で 1 時間インキュベートします。</li>
		<li>FACS バッファーを持つセルを 3 回洗浄します。</li>
		<li>サンプルは、FACS 解析のため準備ができています。図 1-Dの代表的な結果を示した。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. ドット ・ ブロット分析 5hmC、5-メチルシトシン (5mC) を定量化する金額
<ol>
	<li>商業 DNA 抽出キットを使用して transfected およびラパマイシン誘導細胞からゲノム DNA を分離します。コントロール グループのラパマイシン標的治療せずサイダー transfected セルを使用します。</li>
	<li>ダブル蒸留 H2O にし、10 分のクエン酸塩ナトリウム (SSC) バッファー x 6 の 80 ° C および事前ソーク硝酸セルロースの膜を真空のオーブンを熱します。</li>
	<li>96 ウェル PCR プレートに等しい量の DNA (TE バッファーの合計 2 μ g) の 60 μ L をロードします。残りの井戸に TE バッファー (10 mM トリス塩酸、1 ミリメートルの EDTA、pH 8.0) の 30 μ L を追加します。</li>
	<li>行 1 の行 2 の列の同じ位置に転送してソリューションの 30 μ L で、96 ウェル プレートで垂直方向に 2 倍シリアル希薄を作る。再び混ぜるし、30 μ L のソリューションを境界に達するまで、後続の行で井戸に転送します。</li></ol>最後に 30 μ L を削除します。
	<li>各ウェルに 1 M 水酸化ナトリウムと 10 mM EDTA の 20 μ L を追加、プレート シール、完全に dna を変性する 95 ° C で 10 分間の混合物を加熱します。</li>
	<li>すぐに氷のサンプルを冷やす冷たい 2 M 酢酸アンモニウム (pH 7.0) の 50 μ L を追加し、氷上で 10 分間加温します。 注: 手順 3.7 3.10 は、真空の使用を含みます。</li>
	<li>漬け膜とドットのしみ装置を組み立てるし、完全な真空を使用して残留バッファーを削除します。</li>
	<li>ドットのしみ装置の各ウェルに TE バッファーの 200 μ L を追加することによって、膜を洗浄します。TE バッファーを削除するために真空をオンにします。</li>
	<li>ドットのしみ装置の各ウェルに変性 DNA (前の手順 3.1 3.6 で準備) をロードします。ソリューションを削除するために真空をオンにします。</li>
	<li>真空を使用して完全に SSC と削除の残留ソリューション x 2 の 200 μ L を追加することによって、膜を洗浄します。</li>
	<li>ドットのしみ装置を分解、膜を取り出し、すすぎを 20 mL 2 の全体の膜 x SSC。</li>
	<li>20 分間膜を空気乾燥します。</li>
	<li>2 時間のための真空下 80 ° C で膜を焼きます。</li>
	<li>膜にブロッキング液 (TBST で 5% 脱脂乳) を追加し、室温で 1 時間インキュベートします。</li>
	<li>ブロッキング液を破棄します。希釈 5hmC (1:5, 000) または 5mC (1:1, 000) 追加膜に対する抗体と 4 ° C で一晩インキュベート</li>
	<li>残留抗体を削除する 10 分間 3 回 tbst 膜を洗浄します。TBST を徹底的に削除します。</li>
	<li>HRP 標識二次抗体を追加 (1:10, 000 抗家兎 HRP(5hmC) または膜に抗マウス HRP(5mC)) の 1:3,000 し、室温で 1 時間インキュベートします。</li>
	<li>10 分間 3 回 tbst 膜を洗います。</li>
	<li>ECL ウェスタンブロッティング化学発光検出器を用いた 5hmC 信号の可視化用の膜基板を追加します。図 1Eの代表的な結果を示した。</li>

<ol>
	<li>Li, E., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+mammals.">DNA methylation in mammals.</a> Cold Spring Harbor Perspectv Biol. 6 (5), a019133 (2014).</li><li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1.">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324 (5929), 930-935 (2009).</li><li>He, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet-mediated+formation+of+5-carboxylcytosine+and+its+excision+by+TDG+in+mammalian+DNA.">Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA.</a> Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).</li><li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet+proteins+can+convert+5-methylcytosine+to+5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine.">Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine.</a> Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).</li><li>Spruijt, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+readers+for+5-(hydroxy)methylcytosine+and+its+oxidized+derivatives.">Dynamic readers for 5-(hydroxy)methylcytosine and its oxidized derivatives.</a> Cell. 152 (5), 1146-1159 (2013).</li><li>Lio, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet2+and+Tet3+cooperate+with+B-lineage+transcription+factors+to+regulate+DNA+modification+and+chromatin+accessibility.">Tet2 and Tet3 cooperate with B-lineage transcription factors to regulate DNA modification and chromatin accessibility.</a> eLife. 5, e18290 (2016).</li><li>Kellinger, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine+reduce+the+rate+and+substrate+specificity+of+RNA+polymerase+II+transcription.">5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription.</a> Nat Struct Mol Biol. 19 (8), 831-833 (2012).</li><li>Su, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Formylcytosine+Could+Be+a+Semipermanent+Base+in+Specific+Genome+Sites.">5-Formylcytosine Could Be a Semipermanent Base in Specific Genome Sites.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 55 (39), 11797-11800 (2016).</li><li>Ko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+hydroxylation+of+5-methylcytosine+in+myeloid+cancers+with+mutant+TET2.">Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2.</a> Nature. 468 (7325), 839-843 (2010).</li><li>Huang, Y., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connections+between+TET+proteins+and+aberrant+DNA+modification+in+cancer.">Connections between TET proteins and aberrant DNA modification in cancer.</a> Trends Genet. 30 (10), 464-474 (2014).</li><li>Lu, X., Zhao, B. S., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TET+family+proteins:+oxidation+activity,+interacting+molecules,+and+functions+in+diseases.">TET family proteins: oxidation activity, interacting molecules, and functions in diseases.</a> Chem Rev. 115 (6), 2225-2239 (2015).</li><li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+TET2-DNA+complex:+insight+into+TET-mediated+5mC+oxidation.">Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation.</a> Cell. 155 (7), 1545-1555 (2013).</li><li>Hashimoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+Naegleria+Tet-like+dioxygenase+in+complex+with+5-methylcytosine+DNA.">Structure of a Naegleria Tet-like dioxygenase in complex with 5-methylcytosine DNA.</a> Nature. 506 (7488), 391-395 (2014).</li><li>Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+FKBP.rapamycin.FRB+ternary+complex.">Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex.</a> J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).</li><li>Clackson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redesigning+an+FKBP-ligand+interface+to+generate+chemical+dimerizers+with+novel+specificity.">Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10437-10442 (1998).</li><li>Ibrahimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+multicistronic+lentiviral+vectors+with+peptide+2A+sequences.">Highly efficient multicistronic lentiviral vectors with peptide 2A sequences.</a> Hum Gene Ther. 20 (8), 845-860 (2009).</li><li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+cleavage+efficiency+of+a+2A+peptide+derived+from+porcine+teschovirus-1+in+human+cell+lines,+zebrafish+and+mice.">High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice.</a> PLoS One. 6 (4), e18556 (2011).</li><li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+Split-TET2+Enzyme+for+Inducible+Epigenetic+Remodeling.">Engineered Split-TET2 Enzyme for Inducible Epigenetic Remodeling.</a> J Am Chem Soc. 139 (13), 4659-4662 (2017).</li><li>Huang, Y., Pastor, W. A., Zepeda-Mart&#237;nez, J. A., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anti-CMS+technique+for+genome-wide+mapping+of+5-hydroxymethylcytosine.">The anti-CMS technique for genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nat Protoc. 7 (10), 1897-1908 (2012).</li><li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATAC-seq:+A+Method+for+Assaying+Chromatin+Accessibility+Genome-Wide.">ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide.</a> Curr Protoc Mol Biol. 109 (21.29), 1-9 (2015).</li></ol>

著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。

ここで我々 は DNA hydroxymethylation の時間的制御を達成するために設計された分割型 TET2 酵素の使用を説明しています。5 methycytosine ジオキシゲナーゼのテト家族の発見、多くの研究を行った TET タンパク質とその主要な触媒製品 5hmC1,2,の3、生体の機能を解読するには 4,5...

DNA のメチル化は大抵 5-メチルシトシン (5mC) を形成するシトシンの炭素 5 位置へメチル グループの付加を指し、DNA メチルのトランスフェラーゼ (種) によって触媒されます。5mC は、しばしば信号転写抑制、x 染色体不活性化とトランスポゾンのサイレンシング1哺乳類のゲノムの主要なエピジェネティックなマークとして機能します。DNA のメチル化の逆転は、10 エルフ転座 (テト) 蛋白質家族によって媒介されます。テト酵素は鉄 (II) に属する、2-オキソグルタル酸依存 dioxygenases 5-ヒドロキシメチルシトシン (5hmC)、5 formylcytosine (5 fC) および 5-carboxycytosine (5caC) 5mC の連続的な酸化を触媒します。テトを介した 5mC 酸化は、哺乳類のゲノム上のエピジェネティックな制御の追加層を課しています。テトの発見は、TET タンパク質の生物学的機能とその主要な触媒製品 5hmC を発表するエピジェネティックな分野に強い関心を呼んでいます。5hmC はテトを介したアクティブな DNA 脱メチル化2,3,4中の中間だけではないが、安定したエピジェネティックな行為が5,6,7,8 をマークするも.DNA hydroxymethylation の変更がいくつかの人間の疾患9,10,11, 因果関係に関連付けられている DNA hydroxymethylation 遺伝子の発現と相関性の異常がエピジェネティック修飾 dna と表現型の間おく確立への挑戦、時空に定義されて正確にゲノムの DNA の変更を削除追加する信頼性の高いツールの不足にすることができます部分的に帰される解像度。
ここで化学誘導性エピゲノム DNA hydroxymethylation および遺伝子のトランスクリプションの間ツールの因果関係の研究が直面しているハードルを克服するために (サイダー) を改造の使用を報告します。デザインが仮定に基づいている TET2 の触媒ドメイン (TET2CD) は、哺乳類細胞で発現したとき 2 つのアクティブでないフラグメントに分割でき、酵素としての働きを化学的に誘導性二量体化アプローチ (によって復元できます図 1 a)。分割 TET2CD システムを確立するには、システイン豊富な地域と二重鎖 β ヘリックス (DSBH) 倍、低複雑さ領域12を欠いている TET2 DNA 複合体の報告された結晶構造から成る TET2CD の六つのサイトを選択します。合成遺伝子ラパマイシン誘導二量体化モジュール FK506 結合タンパク質 12 (FKBP12) およびラパマイシン14,の15割自己ペプチド T2A とともに哺乳類ターゲットの FKBP ラパマイシン結合ドメイン (FRB)ポリペプチド順序16,17は、TET2CD 内の選択した分割のサイトに個別に挿入されました。当社のエンジニア リングの対象として TET2 の選択は、次の考慮事項に基づきます。骨髄性疾患癌10、使用を避けるために敏感なサイトに有用な情報を提供するなどの人間の疾患でしばしば DNA hydroxymethylation の併用削減と TET2 最初、体細胞変異が観測されます。挿入。第二に、複雑性が低い地域では特に TET2 触媒ドメインの大部分は酵素の機能12、こうして誘導エピジェネティック修飾の最小分割 TET2 をクラフトする私たちを有効にするために不可欠です。以上 15 構造をスクリーニングした後哺乳類システムでその酵素活性の高いラパマイシン誘導復元を展示構成は選択、サイダー18に指定します。ここ誘導型 DNA hydroxymethylation およびラパマイシンのエピジェネティックな改造を達成するためにタグ付きの mCherry サイダーの使用を記述し、HEK293T 細胞系における 5hmC のサイダーを介した生産を検証するための 3 つの方法を提示します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>37094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% Solution</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100503-916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0694-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0369-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, Bovine</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0777-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) antibody (pAb)</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>39769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,6-Diamidino-2-phenylindolde (DAPI)</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>40043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SVAC1E SHEL LAB Economy Vacuum Oven, 0.6 Cu.Ft. (17 L)</td>
			<td>SHEL LAB</td>
			<td>SVAC1E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure SSC, 20X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15557036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Dot Apparatus</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1706545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-5-methylcytosine (5mC) Antibody, clone 33D3</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABE146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7076S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7074S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>West-Q Pico Dura ECL Solution</td>
			<td>Gendepot</td>
			<td>W3653-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an engineered split-tet2 enzyme for chemical-inducible dna hydroxymethylation and epigenetic remodeling

DNA メチル化は、哺乳類のゲノムの安定性と遺伝性のエピジェネティックな修飾と細胞機能を制御する遺伝子発現の調節に関与しています。DNA のメチル化や DNA 脱メチル化の逆転は、dioxygenases の 10-11 転流 (テト) 蛋白質家族によって媒介されます。異常な DNA のメチル化および脱メチル化、発育障害や癌に関連付けられて広く報告されたが、どのようにこれらのエピジェネティックな変化に直接貢献遺伝子発現や疾患の進行の後の変化正確に定義された時間的・空間的解像度でゲノムの DNA の変更を削除追加する信頼性の高いツールの不足が主原因、不明のまま。このハードルを克服するためには、5-メチルシトシン (5mC) の酸化反応の時間的制御と化学物質を追加するだけで哺乳類細胞におけるエピジェネティックな状態のそれに続く改造する分割型 TET2 酵素を設計されています。ここで、哺乳類細胞との 5-ヒドロキシメチルシトシン (5hmC) の化学誘導生産の定量化に設計された分割型 TET2 酵素に基づく化学誘導性エピゲノム改造ツール (サイダー) を導入するための方法を説明します。免疫染色、フローサイトメトリーやドット ・ ブロット分析。遺伝コードを変更することがなくセルラー システムを尋問でだけでなく、epigenotype−phenotype の関係を様々 な生物系の調査に、この化学誘導性エピゲノムの改造ツールは広い使用を見つけます。

化学誘導 5mC-5hmC 変換は、単一細胞レベルや流れフローサイトメトリー解析 (mCherry 陽性) 細胞集団により定量ドット ・ ブロット法図 1に示すように免疫染色によって検証できます。TET2、または TET2CD の触媒ドメインは、研究を通して肯定的な制御として使用されました。5hmC とクロマチンのアクセシビリティの参照 18 20 ラパマイシンによる変化?...

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An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling

化学誘導型 DNA Hydroxymethylation およびエピジェネティックな改造のために設計された分割型 TET2 酵素

哺乳類細胞化学誘導型 DNA hydroxymethylation およびエピジェネティックな改造のために設計された分割型 TET2 酵素 (サイダー) を導入するための詳細なプロトコルが表示されます。

DNA methylation is a stable and heritable epigenetic modification in the mammalian genome and is involved in regulating gene expression to control ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

6.5K ビュー.  Texas A&M University. 哺乳類細胞化学誘導型 DNA hydroxymethylation およびエピジェネティックな改造のために設計された分割型 TET2 酵素 (サイダー) を導入するための詳細なプロトコルが表示されます。

ビデオ: An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization of OGG1 is undertaken to measure the rates of 8-oxoG excision and product release. When the OGG1 concentration is lower than substrate DNA, time courses of product formation are biphasic; a rapid exponential phase (i.e. burst) of product formation is followed by a linear steady-state phase. The initial burst of product formation corresponds to the concentration of enzyme properly engaged on the substrate, and the burst amplitude depends on the concentration of enzyme. The first-order rate constant of the burst corresponds to the intrinsic rate of 8-oxoG excision and the slower steady-state rate measures the rate of product release (product DNA dissociation rate constant, koff). Here, we describe steady-state, pre-steady-state, and single-turnover approaches to isolate and measure specific steps during OGG1 catalytic cycling. A fluorescent labeled lesion-containing oligonucleotide and purified OGG1 are used to facilitate precise kinetic measurements. Since low enzyme concentrations are used to make steady-state measurements, manual mixing of reagents and quenching of the reaction can be performed to ascertain the steady-state rate (koff). Additionally, extrapolation of the steady-state rate to a point on the ordinate at zero time indicates that a burst of product formation occurred during the first turnover (i.e. y-intercept is positive). The first-order rate constant of the exponential burst phase can be measured using a rapid mixing and quenching technique that examines the amount of product formed at short time intervals (&lt;1 sec) before the steady-state phase and corresponds to the rate of 8-oxoG excision (i.e. chemistry). The chemical step can also be measured using a single-turnover approach where catalytic cycling is prevented by saturating substrate DNA with enzyme (E&gt;S). These approaches can measure elementary rate constants that influence the efficiency of removal of a DNA lesion.

Time courses for the glycosylase activity of 8-oxoguanine DNA glycosylase are biphasic exhibiting a burst of product formation and a linear steady-state phase. Utilizing quench-flow techniques, the burst and the steady-state rates can be measured, which correspond to excision of 8-oxoguanine and release of the glycosylase from the product DNA, respectively.

DNAグリコシラーゼ活性の定常状態、プレ定常状態、およびシングルターンオーバー速度論的測定

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

化学

Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both stimuli and cargo can be tailored according to specific needs. Here we describe the DNA nanorobot fabrication protocol, with the use of the DNA origami technique. The procedure initiates by mixing short single-strand DNA staples into a stock mixture which is then added to a long, circular, single-strand DNA scaffold in presence of a folding buffer. A standard thermo cycler is programmed to gradually lower the mixing reaction temperature to facilitate the staples-to-scaffold annealing, which is the guiding force behind the folding of the nanorobot. Once the 60 hr folding reaction is complete, excess staples are discarded using a centrifugal filter, followed by visualization via agarose-gel electrophoresis (AGE). Finally, successful fabrication of the nanorobot is verified by transmission electron microscopy (TEM), with the use of uranyl-formate as negative stain.

DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).

DNA折り紙からバイオ応答ロボットの折りたたみとキャラクタリゼーション

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both ...

Self-assembly of Complex Two-dimensional Shapes from Single-stranded DNA Tiles

Current methods in DNA nano-architecture have successfully engineered a variety of 2D and 3D structures using principles of self-assembly. In this article, we describe detailed protocols on how to fabricate sophisticated 2D shapes through the self-assembly of uniquely addressable single-stranded DNA tiles which act as molecular pixels on a molecular canvas. Each single-stranded tile (SST) is a 42-nucleotide DNA strand composed of four concatenated modular domains which bind to four neighbors during self-assembly. The molecular canvas is a rectangle structure self-assembled from SSTs. A prescribed complex 2D shape is formed by selecting the constituent molecular pixels (SSTs) from a 310-pixel molecular canvas and then subjecting the corresponding strands to one-pot annealing. Due to the modular nature of the SST approach we demonstrate the scalability, versatility and robustness of this method. Compared with alternative methods, the SST method enables a wider selection of information polymers and sequences through the use of de novo designed and synthesized short DNA strands.

DNA tiling is an effective approach to make programmable nanostructures. We describe the protocols to construct complex two-dimensional shapes by the self-assembly of single-stranded DNA tiles.

一本鎖DNAタイルから複雑な2次元形状の自己集合

Current methods in DNA nano-architecture have successfully engineered a variety of 2D and 3D structures using principles of self-assembly. In this ...

Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of these applications require interaction with and adhesion of DNA nanostructures to a substrate. Due to its atomically flat and easily cleaned nature, mica has been the substrate of choice for DNA origami experiments. However, the practical applications of mica are relatively limited compared to those of semiconductor substrates. For this reason, a straightforward, stable, and repeatable process for DNA origami adhesion on derivatized silicon oxide is presented here. To promote the adhesion of DNA nanostructures to silicon oxide surface, a self-assembled monolayer of 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) is deposited from an aqueous solution that is compatible with many photoresists. The substrate must be cleaned of all organic and metal contaminants using Radio Corporation of America (RCA) cleaning processes and the native oxide layer must be etched to ensure a flat, functionalizable surface. Cleanrooms are equipped with facilities for silicon cleaning, however many components of DNA origami buffers and solutions are often not allowed in them due to contamination concerns. This manuscript describes the set-up and protocol for in-lab, small-scale silicon cleaning for researchers who do not have access to a cleanroom or would like to incorporate processes that could cause contamination of a cleanroom CMOS clean bench. Additionally, variables for regulating coverage are discussed and how to recognize and avoid common sample preparation problems is described.

Reproducible cleaning processes for substrates used in DNA origami research are described, including bench-top RCA cleaning and derivatization of silicon oxide. Protocols for surface preparation, DNA origami deposition, drying parameters, and simple experimental set-ups are illustrated.

DNA折り紙解析と実験のためのマイカとシリコン基板の作製

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of ...

An Aptamer-based Sensor for Unchelated Gadolinium(III)

A method for determining the presence of unchelated trivalent gadolinium ion (Gd3+) in aqueous solution is demonstrated. Gd3+ is often present in samples of gadolinium-based contrast agents as a result of incomplete reactions between the ligand and the ion, or as a dissociation product. Since the ion is toxic, its detection is of critical importance. Herein, the design and usage of an aptamer-based sensor (Gd-sensor) for Gd3+ are described. The sensor produces a fluorescence change in response to increasing concentrations of the ion, and has a limit of detection in the nanomolar range (~100 nM with a signal-to-noise ratio of 3). The assay may be run in an aqueous buffer at ambient pH (~7 - 7.4) in a 384-well microplate. The sensor is relatively unreactive toward other physiologically relevant metal ions such as sodium, potassium, and calcium ions, although it is not specific for Gd3+ over other trivalent lanthanides such as europium(III) and terbium(III). Nevertheless, the lanthanides are not commonly found in contrast agents or the biological systems, and the sensor may therefore be used to selectively determine unchelated Gd3+ in aqueous conditions.

An Aptamer-based Sensor for Unchelated GadoliniumIII

The use of polydeoxynucleotide (44-mer aptamer) molecules for sensing unchelated gadolinium(III) ion in an aqueous solution is described. The presence of the ion is detected via an increase in the fluorescence emission of the sensor.

非キレート化ガドリニウム（III）のためのアプタマーベースのセンサー

A method for determining the presence of unchelated trivalent gadolinium ion (Gd3+) in aqueous solution is demonstrated. Gd3+ is often present in samples ...

Phthalic Acid Ester-Binding DNA Aptamer Selection, Characterization, and Application to an Electrochemical Aptasensor

Phthalic acid esters (PAEs) areone of the major groups of persistent organic pollutants. The group-specific detection of PAEs is highly desired due to the rapid growing of congeners. DNA aptamers have been increasingly applied as recognition elements on biosensor platforms, but selecting aptamers toward highly hydrophobic small molecule targets, such as PAEs, is rarely reported. This work describes a bead-based method designed to select group-specific DNA aptamers to PAEs. The amino group functionalized dibutyl phthalate (DBP-NH2) as the anchor target was synthesized and immobilized on the epoxy-activated agarose beads, allowing the display of the phthalic ester group at the surface of the immobilization matrix, and therefore the selection of the group-specific binders. We determined the dissociation constants of the aptamer candidates by quantitative polymerization chain reaction coupled with magnetic separation. The relative affinities and selectivity of the aptamers to other PAEs were determined by the competitive assays, where the aptamer candidates were pre-bounded to the DBP-NH2 attached magnetic beads and released to the supernatant upon incubation with the tested PAEs or other potential interfering substances. The competitive assay was applied because it provided a facile affinity comparison among PAEs that had no functional groups for surface immobilization. Finally, we demonstrated the fabrication of an electrochemical aptasensor and used it for ultrasensitive and selective detection of bis(2-ethylhexyl) phthalate. This protocol provides insights for the aptamer discovery of other hydrophobic small molecules.

A protocol for the in vitro selection and characterization of group-specific phthalic acid ester- binding DNA aptamers is presented. The application of the selected aptamer in an electrochemical aptasensor is also included.

フタル酸エステル結合 DNA アプタマーの選択、評価、および電気化学 Aptasensor への応用

Phthalic acid esters (PAEs) areone of the major groups of persistent organic pollutants. The group-specific detection of PAEs is highly desired due to the ...

Membrane Remodeling of Giant Vesicles in Response to Localized Calcium Ion Gradients

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local variations in calcium ion concentration. The main molecular components involved in these processes have been identified; however, the specific interplay between calcium ion gradients and the lipids within the cell membrane is far less known, mainly due to the complex nature of biological cells and the difficultly of observation schemes. To bridge this gap, a synthetic approach is successfully implemented to reveal the localized effect of calcium ions on cell membrane mimics. Establishing a mimic to resemble the conditions within a cell is a severalfold problem. First, an adequate biomimetic model with appropriate dimensions and membrane composition is required to capture the physical properties of cells. Second, a micromanipulation setup is needed to deliver a small amount of calcium ions to a particular membrane location. Finally, an observation scheme is required to detect and record the response of the lipid membrane to the external stimulation. This article offers a detailed biomimetic approach for studying the calcium ion-membrane interaction, where a lipid vesicle system, consisting of a giant unilamellar vesicle (GUV) connected to a multilamellar vesicle (MLV), is exposed to a localized calcium gradient formed using a microinjection system. The dynamics of the ionic influence on the membrane were observed using fluorescence microscopy and recorded at video frame rates. As a result of the membrane stimulation, highly curved membrane tubular protrusions (MTPs) formed inside the GUV, oriented away from the membrane. The described approach induces the remodeling of the lipid membrane and MTP production in an entirely contactless and controlled manner. This approach introduces a means to address the details of calcium ion-membrane interactions, providing new avenues to study the mechanisms of cell membrane reshaping.

We present a technique for contactless micromanipulation of vesicles, using localized calcium ion gradients. Microinjection of a calcium ion solution, in the vicinity of a giant lipid vesicle, is utilized to remodel the lipid membrane, resulting in the production of membrane tubular protrusions.

ローカライズされたカルシウム イオン勾配に対応した膜小胞の膜を改造

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local ...

Methionine Functionalized Biocompatible Block Copolymers for Targeted Plasmid DNA Delivery

Reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization integrates the advantages of radical polymerization and living polymerization. This work presents the preparation of methionine functionalized biocompatible block copolymers via RAFT polymerization. Firstly, N,N-bis(2-hydroxyethyl)methacrylamide-b-N-(3-aminopropyl)methacrylamide (BNHEMA-b-APMA, BA) was synthesized via RAFT polymerization using 4,4&#8217;-azobis(4-cyanovaleric acid) (ACVA) as an initiating agent and 4-cyanopentanoic acid dithiobenzoate (CTP) as the chain transfer agent. Subsequently, N,N-bis(2-hydroxyethyl)methacrylamide-b-N-(3-guanidinopropyl)methacrylamide (methionine grafted BNHEMA-b-GPMA, mBG) was prepared by modifying amine groups in APMA with methionine and guanidine groups. Three kinds of block polymers, mBG1, mBG2, and mBG3, were synthesized for comparison. A ninhydrin reaction was used to quantify the APMA content; mBG1, mBG2, and mBG3 had 21%, 37%, and 52% of APMA, respectively. Gel permeation chromatography (GPC) results showed that BA copolymers possess molecular weights of 16,200 (BA1), 20,900(BA2), and 27,200(BA3) g/mol. The plasmid DNA (pDNA) complexing ability of the obtained block copolymer gene carriers was also investigated. The charge ratios (N/P) were 8, 16, and 4 when pDNA was complexed completely with mBG1, mBG2, mBG3, respectively. When the N/P ratio of mBG/pDNA polyplexes was higher than 1, the Zeta potential of mBG was positive. At an N/P ratio between 16 and 32, the average particle size of mBG/pDNA polyplexes was between 100-200 nm. Overall, this work illustrates a simple and convenient protocol for the block copolymer carrier synthesis.

This work presents the preparation of methionine functionalized biocompatible block copolymers (mBG) via the reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) method. The plasmid DNA complexing ability of the obtained mBG and their transfection efficiency were also investigated. The RAFT method is very beneficial for polymerizing monomers containing special functional groups.

標的プラスミドDNA送達に対するメチオニン機能性生体適合性共重合体

Reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization integrates the advantages of radical polymerization and living polymerization. This ...

Stable DNA Motifs, 1D and 2D Nanostructures Constructed from Small Circular DNA Molecules

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D DNA nanostructures. Over decades, the rapid development of DNA nanotechnology is attributed to the use of linear DNAs as the source materials. For example, the DAO (double crossover, antiparallel, odd half-turns) tile is well-known as a building block for construction of 2D DNA lattices; the core structure of DAO is made from two linear single-stranded (ss) oligonucleotides, like two ropes making a right hand granny&#160;knot. Herein, a new type of DNA tiles called cDAO (coupled DAO) are built using a small circular ss-DNA of c64nt or c84nt (circular 64 or 84 nucleotides) as the scaffold strand and several linear ss-DNAs as the staple strands. Perfect 1D and 2D nanostructures are assembled from cDAO tiles: infinite nanowires, nanospirals, nanotubes, nanoribbons; and finite nano-rectangles. Detailed protocols are described: 1) preparation by T4 ligase and purification by denaturing PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) of small circular oligonucleotides, 2) annealing of stable circular tiles, followed by native PAGE analysis, 3) assembling of infinite 1D nanowires, nanorings, nanospirals, infinite 2D lattices of nanotubes and nanoribbons, and finite 2D nano-rectangles, followed by AFM (Atomic Force Microscopy) imaging. The method is simple, robust, and affordable for most labs.

This article presents a detailed protocol for T4 ligation and denaturing PAGE purification of small circular DNA molecules, annealing and native PAGE analysis of circular tiles, assembling and AFM imaging of 1D and 2D DNA nanostructures, as well as agarose gel electrophoresis and centrifugation purification of finite DNA nanostructures.

ナノ構造構築小さな環状 DNA 分子から安定した DNA モチーフ、1 D および 2 D

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D ...

Gene-therapy Inspired Polycation Coating for Protection of DNA Origami Nanostructures

DNA origami nanostructures hold an immense potential to be used for biological and medical applications. However, low-salt conditions and nucleases in physiological fluids induce denaturation and degradation of self-assembled DNA nanostructures. In non-viral gene delivery, enzymatic degradation of DNA is overcome by the encapsulation of the negatively charged DNA in a cationic shell. Herein, inspired by gene delivery advancements, a simple, one-step and robust methodology is presented for the stabilization of DNA origami nanostructures by coating them with chitosan and linear polyethyleneimine. The polycation coating efficiently protects DNA origami nanostructures in Mg-depleted and nuclease-rich media. This method also preserves the full addressability of enzyme- and aptamer-based functionalization of DNA nanostructures.

Here, a protocol for the protection of DNA origami nanostructures in Mg-depleted and nuclease-rich media using natural cationic polysaccharide chitosan and synthetic linear polyethyleneimine (LPEI) coatings is presented.

遺伝子療法ポリカチオン コーティングに影響を与えた DNA 折り紙ナノ構造体の保護

DNA origami nanostructures hold an immense potential to be used for biological and medical applications. However, low-salt conditions and nucleases in ...

化学誘導型 DNA Hydroxymethylation およびエピジェネティックな改造のために設計された分割型 TET2 酵素

要約

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DNAグリコシラーゼ活性の定常状態、プレ定常状態、およびシングルターンオーバー速度論的測定

DNA折り紙からバイオ応答ロボットの折りたたみとキャラクタリゼーション

一本鎖DNAタイルから複雑な2次元形状の自己集合

DNA折り紙解析と実験のためのマイカとシリコン基板の作製

非キレート化ガドリニウム（III）のためのアプタマーベースのセンサー

フタル酸エステル結合 DNA アプタマーの選択、評価、および電気化学 Aptasensor への応用

ローカライズされたカルシウムイオン勾配に対応した膜小胞の膜を改造

標的プラスミドDNA送達に対するメチオニン機能性生体適合性共重合体

ナノ構造構築小さな環状 DNA 分子から安定した DNA モチーフ、1 D および 2 D

遺伝子療法ポリカチオンコーティングに影響を与えた DNA 折り紙ナノ構造体の保護

化学誘導型 DNA Hydroxymethylation およびエピジェネティックな改造のために設計された分割型 TET2 酵素

要約

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DNA折り紙からバイオ応答ロボットの折りたたみとキャラクタリゼーション

一本鎖DNAタイルから複雑な2次元形状の自己集合

DNA折り紙解析と実験のためのマイカとシリコン基板の作製

非キレート化ガドリニウム（III）のためのアプタマーベースのセンサー

フタル酸エステル結合 DNA アプタマーの選択、評価、および電気化学 Aptasensor への応用

ローカライズされたカルシウム イオン勾配に対応した膜小胞の膜を改造

標的プラスミドDNA送達に対するメチオニン機能性生体適合性共重合体

ナノ構造構築小さな環状 DNA 分子から安定した DNA モチーフ、1 D および 2 D

遺伝子療法ポリカチオン コーティングに影響を与えた DNA 折り紙ナノ構造体の保護

ローカライズされたカルシウムイオン勾配に対応した膜小胞の膜を改造

遺伝子療法ポリカチオンコーティングに影響を与えた DNA 折り紙ナノ構造体の保護