この方法は、遺伝子調節のメカニズムや異なるクロマチン調節要素間の因旨と結果関係などのエピジェネティクス分野の主要な質問に答える助けとなる。この技術の主な利点は、初めて生理学的に関連する内因性酵素を有するクロマチン遺伝子座をモジュール化することができる点である。一般的に、この方法に新しい個人は、マウスのESL培養は、この技術の訓練を受けていない人にとって本質的に困難であるため、苦労します。

この方法のさらなるデモンストレーションは、細胞ウイルス感染ステップが学習することが困難であるため、重要である。研究者は、細胞培養の2つの別々のラインを時間を計る必要があり、これらのステップ中に安全を警戒して監視する必要があります。プロトコルを開始するために、50センチメートルプレートあたり293T HEK細胞の1800万個を通過させる。

古い培地を吸引し、1つのXリン酸緩衝生理食塩水、またはPBSの10ミリリットルを加える。PBSを吸引し、0.05%トリプシンの3ミリリットルを追加します。トリプシン中の細胞を摂氏37度で8分間インキュベートする。

ロックし、インキュベーションの途中で細胞をタップします。翌日、細胞が60〜80%の合流率に達した時、ポリエチレニミン、またはPEI、トランスフェクションを行う。次に、DNA、PEI、トランスフェクション媒体を15ミリリットル円錐形チューブにそっと混ぜます。

室温で15分間インキュベートします。インキュベーション後、溶液を15センチメートルプレートに滴下して添加します。次いで、5%の二酸化炭素を用いて摂氏37度インキュベーターで16時間サンプルをインキュベートする。

翌日、メディアを吸引し、15センチメートルのプレートに事前に温まった新鮮な293 HEKメディアにそっと交換します。培地交換後、5%の二酸化炭素を37°Cインキュベーターで48時間培養します。ヘモサイトメーターで細胞を数えます。

パッセージは、以前にmESCを12ウェルプレートフォーマットに調製し、感染の前日に1日あたり100,000細胞を有する。10センチメートルの形式で成長した細胞の場合は、古い培地を吸引し、1つのX PBSを5ミリリットル加え、PBSを吸引し、0.25%トリプシンの1ミリリットルを加える。トリプシン中の細胞を摂氏37度で8分間インキュベートし、インキュベーションの途中で細胞をタップします。

メディア交換の48時間後、293T HEK細胞の上清を50ミリリットル円錐形チューブに移します。遠心分離物は、細胞の破片をペレット化するために5分間Gの300倍の上清を。次に、上清を0.45ミクロンの膜を通して濾過する。

SW32ローターで超遠心分離機を介してウイルスを濃縮し、摂氏4度で2時間半、72,000倍Gでサンプルを回転させます。ウイルスは超遠心分離の下で集中するが、ポリブレンのミリリットル当たり5マイクログラムを含む新鮮な胚性茎またはES培地で12ウェルプレートのCIA mESCを治療する。ウイルス濃度が終了したら、上清を慎重に吸引し、過剰な気泡を避けるために100マイクロリットルの100マイクロリットルでウイルスペレットを慎重に懸濁させる。

ウイルスと1つのX PBSを1.5ミリリットルマイクロフュージチューブに加えます。ウイルスを完全に中断するために最も低い設定でチューブを渦。気泡を取り除くために5〜10秒間ミニ卓上遠心分離機でチューブを回転させます。

12ウェルプレートの各ウェルにウイルスの30マイクロリットルを追加します。プレートを旋回し、サンプルをGの1000倍に20分間遠心します。12ウェルプレートを摂氏37度のインキュベーターに一晩戻します。

翌朝、新鮮なESメディアとメディアを交換し、感染を48時間行います。48時間の感染後、適切な抗生物質を添加してウイルスプラスミドを統合した細胞を選択する。メディアを毎日変更します。

選択培地を細胞上に72〜96時間保持し、摂氏37度のインキュベーターで5%の二酸化炭素を使用します。化学エピジェネティック修飾剤、またはCEM、粉末CEMおよびジメチルスルホキシド、またはDMSOを1ミリモルのストック濃度および100マイクロモルの作業濃度に懸濁させて治療を継続する。セルが72〜96時間選択された後、mESCを12ウェル形式に分割し、ウェルあたり100,000個のセルを使用します。

24時間5%の二酸化炭素を用いて37°Cインキュベーターで細胞をインキュベートする。インキュベーション後、ES培地で100ナノモルCEMの培地溶液を調製する。メディアを使用して、CIA mESCに1ミリリットルの井戸を供給します。

コントロールとして機能する CEM を追加せずにセルのウェルを維持します。.次に、古いメディアを吸引し、実験期間中24時間ごとに、調製した新しいCEMまたはCEMフリーES培地を1回1ミリリットルずつ添加してメディアを交換する。48時間のCEM処理後、蛍光顕微鏡を用いて100ナノモルCEMで処理した細胞内でCEM処理を行わずに細胞を画像化します。

位相または明視野を使用して代表的な画像を撮り、10〜40倍の倍率でmESC形態を記録します。細胞は、いくつかの分化された細胞を持つコロニーの周りに形成されているはずです。FITC蛍光チャネルの下で、両方の細胞状態を画像化する。

次に、培地を吸引し、1つのX PBSで細胞を洗浄し、PBSを1ミリリットルで洗浄し、0.25ミリリットルの0.25%トリプシンをEDTAで8〜10分間添加することによって、フローサイトメトリー用のコントロールおよびCEM処理細胞を分離する。20倍の倍率を使用して顕微鏡を通して細胞が大きな塊に束ねられなくなったことを確認します。細胞が単一の細胞懸濁液にないように見える場合は、P1000ピペットで上下にピペットを軽くピペットし、細胞を完全にトリプシン化します。

新鮮な培地の1ミリリットルでトリプシンをクエンチし、細胞が単一の細胞懸濁液になるまで血清学的ピペットで高速で細胞を再懸濁する。その後、室温で5分間Gの300倍の細胞を回転させます。上清を吸引し、1つのXPBSで細胞を洗浄し、細胞を遠心分離する。

PBS上清を吸引し、FACSバッファーの200マイクロリットルで細胞ペレットを再懸濁する。約50,000個以上の細胞に対して浮遊細胞量計を行い、毎秒約5,000細胞のシース速度でサンプルを実行します。最後に、データをエクスポートしてさらに分析します。

10月4日の遺伝子座およびCIA mESCのCEMシステムの位相画像は、CEM23の100ナノモルまたは未治療細胞で48時間の治療後に画像化され、特定のGFP抑制を示す。蛍光画像は、コントロール細胞における明るいGFP発現と、CEM23で処理されたmESCでのGFP発現の低下を示す。フローサイトメトリーは、一貫して48時間のCEM23の100ナノモルで処理されたCIA mESCのGFP発現の30%以上の減少を明らかにした。

クロマチン免疫沈降、またはCHIPは、CEM23の100ナノモルでの治療の48時間が対照細胞と比較して標的座でH3K27acのレベルを減少させたことを明らかにした。この手順を試みる間、マウス胚性幹細胞に注意することが重要です。プロトコル中に区別する場合、結果は無効になります。

その開発後、この技術は、合成生物学の分野の研究者が哺乳類ゲノムの生体内メカニズムを探求する道を開いた。