אנו מודים הפיננסי תומך של מכוני הבריאות הלאומיים הענק (R01GM112003 כדי yz ימאהה), קרן Welch (להיות-1913 על yz ימאהה) האגודה האמריקנית לסרטן (TBE RSG-16-215-01 כדי yz ימאהה), מניעת סרטן, מכון המחקר של טקסס (RR140053 ל יד הנדיב, RP170660 כדי yz ימאהה), איגוד הלב האמריקאי (16IRG27250155 על יד הנדיב), לבין התוכנית פרס קרן דן ג'ון ס מחקר משותף.

1. תא תרבות, פלסמיד תרביות תאים, אינדוקציה כימי
<ol>
	<li>תרבות תא חסיד קו (למשל, האדם מתחלקים הכליה תא HEK293T) הנשר של Dulbecco ששונה בינוני (DMEM), בתוספת 10% לא פעיל חום העובר שור סרום 100 פניצילין U/mL, סטרפטומיצין ב 37 ° C עם 5% CO2.</li>
	<li>Transfect תאים עם פלסמיד סיידר.
	<ol>
		<li>לפחות 18 h לפני תרביות תאים, זרע 0.3 x 106 תאים 2.5 מ של DMEM המתאים לכל טוב בצלחת 6-ובכן, דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי להגיע confluency 60-80%.</li>
		<li>לחמם הכימית תרביות תאים לטמפרטורת החדר לפני השימוש.</li>
		<li>µL 250 במקום ללא סרום בינוני בשפופרת סטרילי. הערה: סכום זה הוא מותאם לצלחת 6-ובכן עם 80% confluency. אם יש צורך, באופן פרופורציונלי להתאים את הכמויות בינוני לפי הגדלים של צלחות או מספרי הטלפון הנייד.</li>
		<li>להוסיף 2.5 µg של פלסמיד קידוד סיידר18 או את תחום קטליטי TET2 (TET2CD כפקד חיובי)12,13 בתוך המדיום ללא סרום, בעדינות לערבב על ידי pipetting.</li>
		<li>מוסיפים את µL 7.5 של תרביות תאים ריאגנט לתערובת DNA מדולל ומערבבים בעדינות על-ידי pipetting.</li>
		<li>דגירה התערובת בטמפרטורת החדר למשך 20-30 דקות.</li>
		<li>שנה מדיה מראש ומחוממת, להוסיף את התערובת drop-wise הבארות ולאחר לנער בעדינות את הצלחת תרבות תא לפיזור אחיד של תרביות תאים ריאגנט של ה-DNA תערובת.</li>
		<li>דגירה התאים ואת תערובת בין לילה, ולאחר מכן החלף הכימית תרביות תאים המכילים מדיה עם 2 מ של טרי DMEM מלאה.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>אינדוקציה כימי
	<ol>
		<li>שתדללו 2 מ מ של המניה rapamycin (מומס דימתיל סולפוקסיד) ריכוז של 20 מיקרומטר המתאים בינוני מלא.</li>
		<li>להוסיף 20 µL של rapamycin מדולל לתאים transfected בהשתתפות 2 mL בינוני להגיע ריכוז סופי של 200 ננומטר. הערה: לאחר דגירה של 48 שעות, תאים הם מוכנים כימות של דור 5hmC או יישומים אחרים במורד הזרם. במידת הצורך, אינדוקציה יכול להיות במעקב על ידי הוצאת תאי כל 3 שעות על 5hmC כימות עוד יותר, כפי שמתואר להלן ויעילות המוצג באיור1.</li>
		<li>על כימות יותר של יעילות אינדוקציה 5hmC, זרע נפרדים בארות כדי לעקוב אחר תאים כל 3 שעות.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. כימות של ייצור Rapamycin-induced 5hmC על ידי Immunostaining
<ol>
	<li>5hmC immunofluorescence מכתים הערה: להוסיף כמויות מספיקות של הפתרון קיבעון, המורכבת paraformaldehyde 4%, 0.2% חומרים פעילי שטח (כגון טריטון X-100) ב- PBS עם HCl N 3, כדי לכסות את כל התאים בצלחת. לדוגמה, µL 500 של פתרון יהיה מספיק טוב בצלחת 6-. טוב. בצע את כל השלבים בטמפרטורת החדר.<ol>
		<li>כדי לתקן תאים, להוסיף paraformaldehyde 4% ב- PBS לתאים שטופלו rapamycin למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. עבור קבוצת בקרה, להשתמש בתאים המבטאים mCherry-סיידר ללא טיפול rapamycin. לא להתסיס. התראה: Paraformaldehyde הוא רעיל. לענוד הגנה הולמת.</li>
		<li>למחוק פתרון מקבע. דגירה תאים קבוע עם חומרים פעילי שטח 0.2% ב- PBS למשך 30 דקות כדי permeabilize את קרום התא.</li>
		<li>למחוק פתרון permeabilization. להוסיף 3 N HCl תאים permeabilized, תקופת דגירה של 15 דקות denature את ה-DNA.</li>
		<li>להתעלם HCl. הוסף 100 מ מ טריס-HCl מאגר (pH 8.0) על התאים במשך 10 דקות על נטרול של pH.</li>
		<li>למחוק את כל הפתרון. לשטוף את התאים ביסודיות עם PBS במשך 3 - 5 פעמים. הסר PBS ביסודיות. הערה: להוסיף כמויות מספיקות של PBS על כל צעד לשטוף. לדוגמה, 1 מ"ל של PBS מספיקה צלחת 6-. טוב.</li>
		<li>לחסום תאים על-ידי הוספת המאגר חסימה הכוללת BSA 1% ל- 0.05% של חומרים פעילי שטח (כגון Tween 20) ב- PBS עבור h 1 ברעידות עדין.</li>
		<li>לבטל את הפתרון חסימה. להוסיף הנוגדן 5hmC מדולל (1:200) התאים, תקופת דגירה של 2 h בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 º C.</li>
		<li>לשטוף את התאים עם PBS שלוש פעמים למשך 15 דקות.</li>
		<li>להוסיף על fluorophore מדולל (FITC)-מצומדת נוגדנים משניים (1:200) על התאים ואת תקופת דגירה של 1 h.</li>
		<li>לשטוף את התאים עם PBS שלוש פעמים בהרחבה כדי להסיר שאריות נוגדנים.</li>
		<li>להוסיף 250 ננוגרם למ"ל של 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) כדי להכתים את הגרעין של 5 דק. הסר הפתרון מוכתמים.</li>
		<li>הר המנה תרבות שקופיות או זכוכית-התחתון עם immunostained תאים עבור הדמיה קונפוקלי. תוצאה נציג היה באיור איור 1B.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cytometry זרימה הערה: השתמש צלחת תחתית עגולה 96-ובכן מכתימים שהפרוצדורה הבאה. בדרך כלל, µL 150 של ריאגנטים מספיקה עבור כל טוב.<ol>
		<li>Resuspend תאים transfected ו הנוצרות על-ידי rapamycin במאגר FACS (PBS עם BSA 1%, 2 מ מ EDTA). עבור קבוצת בקרה, השתמש לבטא סיידר תאים ללא טיפול rapamycin.</li>
		<li>לתקן, permeabilize את התאים כפי שמתואר בשלב 2.1.</li>
		<li>להוסיף 2 N HCl לתאים כדי denature את ה-DNA למשך 10 דקות.</li>
		<li>למחוק HCl. נטרול וחסום את התאים כפי שמתואר בשלב 2.1.</li>
		<li>להוסיף של נוגדן anti מדולל-5hmC (1:200) התאים, תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר או ללון ב- 4 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>לשטוף את התאים באמצעות מאגר FACS שלוש פעמים. הסר את מאגר FACS ביסודיות.</li>
		<li>להוסיף על fluorophore מדולל (FITC)-מצומדת נוגדנים משניים (1:400) עבור תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) ניתוח ולאחר תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>לשטוף את התאים באמצעות מאגר FACS שלוש פעמים.</li>
		<li>דוגמאות מוכנים לניתוח FACS. תוצאה נציג היה באיור איור 1C-D.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. dot-כתם Assay לכמת 5hmC ו- 5-methylcytosine (5mC) סכומים
<ol>
	<li>לבודד דנ א גנומי מתאי transfected ו הנוצרות על-ידי rapamycin באמצעות ערכת חילוץ DNA מסחרי. עבור קבוצת בקרה, השתמש transfected סיידר תאים ללא טיפול rapamycin.</li>
	<li>מחממים תנור ואקום ל 80 ° C ומשרים קדם ממברנה ניטרוצלולוזה מזוקק פעמיים H2O ואחר ב 6 x מאגר תמיסת מלח-נתרן ציטראט (האס) למשך 10 דקות.</li>
	<li>לטעון µL 60 של כמויות שוות של DNA (סה כ 2 µg במאגר טה) על צלחת PCR 96-ובכן. להוסיף 30 µL טה מאגר (10 מ מ טריס-HCl, 1 מ"מ EDTA, pH 8.0) הבארות מנוחה.</li>
	<li>להפוך דילולים טורי כפולה אנכית על הצלחת 96-ובכן על-ידי העברת 30 µL של פתרון בשורה 1 לאותו מיקום עמודה בשורה 2. לערבב שוב, להעביר 30 µL של פתרון הבארות בשורה הבאים עד שהגיע לגבול.</li></ol>הסר את µL בשלושים.
	<li>להוסיף 20 µL של EDTA NaOH ו- 10 מ"מ 1 מ' מכל קידוח, לאטום את הצלחת, מחממים את התערובת למשך 10 דקות ב 95 ° C כדי לחלוטין denature דופלקס של ה-DNA.</li>
	<li>מיד לקרר את הדוגמאות על קרח, להוסיף 50 µL של 2 מ' הקר אמוניום אצטט (pH 7.0), דגירה על קרח למשך 10 דקות. הערה: השלבים 3.7-3.10 כרוכה בשימוש של ואקום.</li>
	<li>להרכיב את המנגנון חשופה נקודה עם ממברנה טרום רטוב ולהסיר שיורית המאגר באמצעות ואקום מלא.</li>
	<li>לשטוף את הקרום על-ידי הוספת 200 µL טה מאגר כל טוב של המנגנון חשופה נקודה. הפעל ואקום להסיר את מאגר טה.</li>
	<li>לטעון denatured דנ א (להכין השלבים הקודמים 3.1-3.6) כל טוב של המנגנון חשופה נקודה. הפעל ואקום להסיר את הפתרון.</li>
	<li>לשטוף את הקרום על-ידי הוספת µL 200 של 2 x פתרונות שיורית האס ולהסיר לחלוטין באמצעות ואקום.</li>
	<li>לפרק את המנגנון חשופה נקודה, להוציא את הקרום ולשטוף את הקרום כל 20 מ של 2 x SSC.</li>
	<li>מילה נהדרת קרום כעשרים דקות.</li>
	<li>אופים את הקרום ב 80 ° C תחת ואקום כבר שעתיים.</li>
	<li>הוסף את הפתרון חסימה (5% חלב רזה TBST) למוח, תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לבטל את הפתרון חסימה. הוספת 5hmC מדולל (1:5, 000) או 5mC (1:1, 000) נוגדנים למוח דגירה בין לילה ב 4 º C.</li>
	<li>לשטוף את הקרום עם TBST שלוש פעמים במשך 10 דקות להסיר את שאריות נוגדנים. הסר TBST ביסודיות.</li>
	<li>הוספת נוגדן משני מצומדת HRP (1:10, 000 עבור אנטי-ארנב HRP(5hmC) או 1:3,000 על העכבר אנטי HRP(5mC)) למוח דגירה לשעה בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לשטוף את הקרום עם TBST שלוש פעמים במשך 10 דקות.</li>
	<li>הוסף ECL המערבי סופג המצע למוח על ויזואליזציה של אותות 5hmC באמצעות גלאי chemiluminescence. תוצאה נציג היה באיור איור 1E.</li>

<ol>
	<li>Li, E., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+mammals.">DNA methylation in mammals.</a> Cold Spring Harbor Perspectv Biol. 6 (5), a019133 (2014).</li><li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1.">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324 (5929), 930-935 (2009).</li><li>He, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet-mediated+formation+of+5-carboxylcytosine+and+its+excision+by+TDG+in+mammalian+DNA.">Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA.</a> Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).</li><li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet+proteins+can+convert+5-methylcytosine+to+5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine.">Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine.</a> Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).</li><li>Spruijt, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+readers+for+5-(hydroxy)methylcytosine+and+its+oxidized+derivatives.">Dynamic readers for 5-(hydroxy)methylcytosine and its oxidized derivatives.</a> Cell. 152 (5), 1146-1159 (2013).</li><li>Lio, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tet2+and+Tet3+cooperate+with+B-lineage+transcription+factors+to+regulate+DNA+modification+and+chromatin+accessibility.">Tet2 and Tet3 cooperate with B-lineage transcription factors to regulate DNA modification and chromatin accessibility.</a> eLife. 5, e18290 (2016).</li><li>Kellinger, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine+reduce+the+rate+and+substrate+specificity+of+RNA+polymerase+II+transcription.">5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription.</a> Nat Struct Mol Biol. 19 (8), 831-833 (2012).</li><li>Su, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Formylcytosine+Could+Be+a+Semipermanent+Base+in+Specific+Genome+Sites.">5-Formylcytosine Could Be a Semipermanent Base in Specific Genome Sites.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 55 (39), 11797-11800 (2016).</li><li>Ko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+hydroxylation+of+5-methylcytosine+in+myeloid+cancers+with+mutant+TET2.">Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2.</a> Nature. 468 (7325), 839-843 (2010).</li><li>Huang, Y., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connections+between+TET+proteins+and+aberrant+DNA+modification+in+cancer.">Connections between TET proteins and aberrant DNA modification in cancer.</a> Trends Genet. 30 (10), 464-474 (2014).</li><li>Lu, X., Zhao, B. S., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TET+family+proteins:+oxidation+activity,+interacting+molecules,+and+functions+in+diseases.">TET family proteins: oxidation activity, interacting molecules, and functions in diseases.</a> Chem Rev. 115 (6), 2225-2239 (2015).</li><li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+TET2-DNA+complex:+insight+into+TET-mediated+5mC+oxidation.">Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation.</a> Cell. 155 (7), 1545-1555 (2013).</li><li>Hashimoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+Naegleria+Tet-like+dioxygenase+in+complex+with+5-methylcytosine+DNA.">Structure of a Naegleria Tet-like dioxygenase in complex with 5-methylcytosine DNA.</a> Nature. 506 (7488), 391-395 (2014).</li><li>Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+FKBP.rapamycin.FRB+ternary+complex.">Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex.</a> J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).</li><li>Clackson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redesigning+an+FKBP-ligand+interface+to+generate+chemical+dimerizers+with+novel+specificity.">Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10437-10442 (1998).</li><li>Ibrahimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+multicistronic+lentiviral+vectors+with+peptide+2A+sequences.">Highly efficient multicistronic lentiviral vectors with peptide 2A sequences.</a> Hum Gene Ther. 20 (8), 845-860 (2009).</li><li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+cleavage+efficiency+of+a+2A+peptide+derived+from+porcine+teschovirus-1+in+human+cell+lines,+zebrafish+and+mice.">High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice.</a> PLoS One. 6 (4), e18556 (2011).</li><li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+Split-TET2+Enzyme+for+Inducible+Epigenetic+Remodeling.">Engineered Split-TET2 Enzyme for Inducible Epigenetic Remodeling.</a> J Am Chem Soc. 139 (13), 4659-4662 (2017).</li><li>Huang, Y., Pastor, W. A., Zepeda-Mart&#237;nez, J. A., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anti-CMS+technique+for+genome-wide+mapping+of+5-hydroxymethylcytosine.">The anti-CMS technique for genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nat Protoc. 7 (10), 1897-1908 (2012).</li><li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATAC-seq:+A+Method+for+Assaying+Chromatin+Accessibility+Genome-Wide.">ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide.</a> Curr Protoc Mol Biol. 109 (21.29), 1-9 (2015).</li></ol>

המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

כאן אנחנו יש מאויר השימוש של אנזים פיצול מהונדסים-TET2 כדי להשיג שליטה הטמפורלי של דנ א hydroxymethylation. בעקבות הגילוי של משפחת ט 5-methycytosine dioxygenase, בוצעו מחקרים רבים לפענח בפונקציות ביולוגיות של חלבונים ט ו שלהם מוצר קטליטי גדולה 5hmC1,2,3, <sup class...

מתילציה DNA, בעיקר מתייחס התוספת של קבוצת מתיל למיקום פחמן 5 של ציטוזין לטופס 5-methylcytosine (5mC), על ידי ה-DNA מתיל-transferases (DNMTs). 5mC משמש סימן epigenetic הגדולות הגנום יונקים כי לעיתים קרובות אותות עבור דיכוי גנים ברמת השעתוק, שמושרש איון transposon להשתיק1. ההיפוך של מתילציה DNA מתווך על ידי משפחת חלבונים 10-העלפים טרנסלוקציה (ט). אנזימים ט שייכים הברזל (II) ו- 2-oxoglutarate dioxygenases תלויים אשר לעודד חמצון רצופים של 5mC 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), 5-carboxycytosine (5caC). 5mC בתיווך ט חמצון כופה על שכבה נוספת של שליטה epigenetic על הגנום יונקים. גילוי ט עוררה עניין אינטנסיבי בתחום epigenetic לחשוף את תפקודים ביולוגיים של חלבונים ט ו 5hmC מוצר קטליטי גדולה שלהם. 5hmC אינה רק ביניים במהלך בתיווך ט הפעיל DNA demethylation2,3,4, אלא גם פועלת כמו אורווה epigenetic לסמן5,6,7,8 . למרות hydroxymethylation ה-DNA הוא מאוד מתואם עם ביטוי גנים וסוטה שינויים ב- DNA hydroxymethylation משויכים כמה הפרעות האדם9,10,11, הקשרים סיבתי בין שינויים epigenetic על ה-DNA על הפנוטיפים לעיתים קרובות להישאר מאתגר שתוקם, אשר יכול להיות חלקית המיוחס חוסר כלי אמין במדויק להוסיף או להסיר שינויים DNA הגנום-שהוגדרו הטמפורלי, מרחבית רזולוציה.
כאן אנחנו מדווחים על השימוש epigenome כימית-inducible שיפוץ כלי (סיידר) להתגבר על המשוכה מול מחקרים של קשרים סיבתי בין שעתוק DNA hydroxymethylation, ג'ין. העיצוב מבוסס על ההנחה כי תחום קטליטי של TET2 (TET2CD) ניתן לפצל לשני מקטעים שאינם פעילים כשאני לידי ביטוי בתרבית של תאים, תפקידה אנזימטי ניתן לשחזר על-ידי נקיטת גישה dimerization כימית inducible ( איור 1A). להקים מערכת פיצול-TET2CD, בחרנו 6 אתרי ב TET2CD, מורכב של אזור עשיר Cys קיפול כפול גדילי β-סליל (DSBH), על בסיס מבנה קריסטל המדווחת של מתחם TET2-DNA חסר מורכבות נמוכה באזור12. גן סינתטי קידוד dimerization rapamycin-inducible מודול FK506 מחייב חלבון 12 (FKBP12) ובתחום FKBP rapamycin מחייב (FRB) של מטרת יונקים rapamycin14,15, יחד עם פפטיד שהפריד עצמית T2A מפוליפפטיד רצף16,17, הוכנס בנפרד האתרים שנבחרו פיצול בתוך TET2CD. הבחירה של TET2 המטרה הנדסה מבוססת על השיקולים הבאים. מוטציות הראשון, סומאטית TET2 עם צמצום והמצוות DNA hydroxymethylation הם נצפו לעתים קרובות בהפרעות האנושי, כולל הפרעות מיאלואידית סרטן10, אשר מספק מידע שימושי באתרי רגיש כדי להימנע במשך ההכנסה. שנית, חלק גדול של התחום קטליטי TET2, במיוחד באזור מורכבות נמוכה, היא לוותר על הפונקציה אנזימטי12, ובכך מאפשר לנו מלאכה של TET2-פיצול הממוזערת עבור שינויים epigenetic inducible. לאחר הקרנת בונה מעל 15, מבנה זה הציג שחזור rapamycin-inducible הגבוהה של פעילותה אנזימטי למערכת יונקים היה נבחר, כמנהל סיידר18. אנחנו מתארים בזאת את השימוש מתויג mCherry סיידר כדי להשיג inducible DNA hydroxymethylation ובניה epigenetic עם rapamycin, להציג שלוש שיטות אימות 5hmC בתיווך סיידר ייצור מערכת סלולרית דגם HEK293T.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapamycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>37094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% Solution</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100503-916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0694-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0369-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin, Bovine</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0777-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) antibody (pAb)</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>39769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,6-Diamidino-2-phenylindolde (DAPI)</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>40043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SVAC1E SHEL LAB Economy Vacuum Oven, 0.6 Cu.Ft. (17 L)</td>
			<td>SHEL LAB</td>
			<td>SVAC1E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure SSC, 20X</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15557036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Dot Apparatus</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1706545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-5-methylcytosine (5mC) Antibody, clone 33D3</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABE146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7076S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>7074S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>West-Q Pico Dura ECL Solution</td>
			<td>Gendepot</td>
			<td>W3653-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an engineered split-tet2 enzyme for chemical-inducible dna hydroxymethylation and epigenetic remodeling

מתילציה DNA הוא שינוי epigenetic heritable ויציבה הגנום יונקים, והוא מעורב בוויסות ביטוי גנים לשלוט תאיים. ההיפוך של מתילציה DNA, או ה-DNA demethylation, מתווך על ידי משפחת חלבונים 10-11 טרנסלוקציה (ט) dioxygenases. למרות נרחב דווח כי חריגה מתילציה DNA ו demethylation קשורים עם ליקויים התפתחותיים, סרטן, כמה שינויים epigenetic אלה תורמות בצורה ישירה משינוי עוקבות בהתקדמות ביטוי או מחלה ג'ין עדיין לא ברור, בעיקר בשל העדר כלי אמין במדויק להוסיף או להסיר שינויים DNA הגנום ברזולוציה שהוגדרו הטמפורלי, מרחבית. כדי להתגבר על המשוכה הזו, תיכננו אנזים פיצול-TET2 כדי לאפשר שליטה הטמפורלי של חמצון 5-methylcytosine (5mC) ו שיפוץ עוקבות של הברית epigenetic בתרבית של תאים על-ידי פשוט הוספת כימיקלים. כאן, אנו מתארים שיטות היכרות עם כלי שיפוץ epigenome כימית-inducible (סיידר), המבוסס על אנזים פיצול מהונדסים-TET2, לתוך תאים בתרבית של וכימות הייצור inducible כימי של 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) עם immunostaining, cytometry זרימה או וזמינותו של נקודה-כתם. כלי זה epigenome כימית-inducible שיפוץ תוכלו למצוא לשימוש נרחב חוקר מערכות סלולריות מבלי לשנות את הקוד הגנטי, וכן בודק את הקשרים epigenotype−phenotype במערכות ביולוגיות שונות.

המרה כימית 5mC-אל-5hmC inducible הניתנים לאימות על ידי immunostaining ברמה תא בודד, ניתוח cytometry זרימה על אוכלוסיות transfected תא (mCherry-חיוביים), או assay דוט-חשופה יותר כמותיים כמופיע באיור1. תחום קטליטי של TET2, או TET2CD, שימשו לאורך כל תקופת המחקר כפקד חיובי. ראה הפניות 18-20 פרטים נוספ?...

Watch this Scientific Journal Video about An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling at JoVE.com

An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling

אנזים פיצול-TET2 הנדסה כימית-inducible DNA Hydroxymethylation, שיפוץ Epigenetic

פרוטוקולים מפורט ידביקו אנזים פיצול מהונדסים-TET2 (סיידר) בתרבית של תאים עבור hydroxymethylation כימיים של הדנ א inducible ובניה epigenetic מוצגים.

DNA methylation is a stable and heritable epigenetic modification in the mammalian genome and is involved in regulating gene expression to control ...

an-engineered-split-tet2-enzyme-for-chemical-inducible-dna

Research

JoVE Journal

Chemistry

6.5K Views.  Texas A&M University. פרוטוקולים מפורט ידביקו אנזים פיצול מהונדסים-TET2 (סיידר) בתרבית של תאים עבור hydroxymethylation כימיים של הדנ א inducible ובניה epigenetic מוצגים.

Video: An Engineered Split-TET2 Enzyme for Chemical-inducible DNA Hydroxymethylation and Epigenetic Remodeling

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization of OGG1 is undertaken to measure the rates of 8-oxoG excision and product release. When the OGG1 concentration is lower than substrate DNA, time courses of product formation are biphasic; a rapid exponential phase (i.e. burst) of product formation is followed by a linear steady-state phase. The initial burst of product formation corresponds to the concentration of enzyme properly engaged on the substrate, and the burst amplitude depends on the concentration of enzyme. The first-order rate constant of the burst corresponds to the intrinsic rate of 8-oxoG excision and the slower steady-state rate measures the rate of product release (product DNA dissociation rate constant, koff). Here, we describe steady-state, pre-steady-state, and single-turnover approaches to isolate and measure specific steps during OGG1 catalytic cycling. A fluorescent labeled lesion-containing oligonucleotide and purified OGG1 are used to facilitate precise kinetic measurements. Since low enzyme concentrations are used to make steady-state measurements, manual mixing of reagents and quenching of the reaction can be performed to ascertain the steady-state rate (koff). Additionally, extrapolation of the steady-state rate to a point on the ordinate at zero time indicates that a burst of product formation occurred during the first turnover (i.e. y-intercept is positive). The first-order rate constant of the exponential burst phase can be measured using a rapid mixing and quenching technique that examines the amount of product formed at short time intervals (&lt;1 sec) before the steady-state phase and corresponds to the rate of 8-oxoG excision (i.e. chemistry). The chemical step can also be measured using a single-turnover approach where catalytic cycling is prevented by saturating substrate DNA with enzyme (E&gt;S). These approaches can measure elementary rate constants that influence the efficiency of removal of a DNA lesion.

Time courses for the glycosylase activity of 8-oxoguanine DNA glycosylase are biphasic exhibiting a burst of product formation and a linear steady-state phase. Utilizing quench-flow techniques, the burst and the steady-state rates can be measured, which correspond to excision of 8-oxoguanine and release of the glycosylase from the product DNA, respectively.

מדידת מצב יציב, טרום מצב יציב, וחד מחזור קינטי לפעילות ה-DNA Glycosylase

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both stimuli and cargo can be tailored according to specific needs. Here we describe the DNA nanorobot fabrication protocol, with the use of the DNA origami technique. The procedure initiates by mixing short single-strand DNA staples into a stock mixture which is then added to a long, circular, single-strand DNA scaffold in presence of a folding buffer. A standard thermo cycler is programmed to gradually lower the mixing reaction temperature to facilitate the staples-to-scaffold annealing, which is the guiding force behind the folding of the nanorobot. Once the 60 hr folding reaction is complete, excess staples are discarded using a centrifugal filter, followed by visualization via agarose-gel electrophoresis (AGE). Finally, successful fabrication of the nanorobot is verified by transmission electron microscopy (TEM), with the use of uranyl-formate as negative stain.

DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).

מתקפל ואפיון של רובוט ביו-תגובה מה- DNA אוריגמי

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both ...

Self-assembly of Complex Two-dimensional Shapes from Single-stranded DNA Tiles

Current methods in DNA nano-architecture have successfully engineered a variety of 2D and 3D structures using principles of self-assembly. In this article, we describe detailed protocols on how to fabricate sophisticated 2D shapes through the self-assembly of uniquely addressable single-stranded DNA tiles which act as molecular pixels on a molecular canvas. Each single-stranded tile (SST) is a 42-nucleotide DNA strand composed of four concatenated modular domains which bind to four neighbors during self-assembly. The molecular canvas is a rectangle structure self-assembled from SSTs. A prescribed complex 2D shape is formed by selecting the constituent molecular pixels (SSTs) from a 310-pixel molecular canvas and then subjecting the corresponding strands to one-pot annealing. Due to the modular nature of the SST approach we demonstrate the scalability, versatility and robustness of this method. Compared with alternative methods, the SST method enables a wider selection of information polymers and sequences through the use of de novo designed and synthesized short DNA strands.

DNA tiling is an effective approach to make programmable nanostructures. We describe the protocols to construct complex two-dimensional shapes by the self-assembly of single-stranded DNA tiles.

עצמי הרכבה של צורות דו-ממדיות מורכבות מחד-גדילי דנ&quot;א אריחים

Current methods in DNA nano-architecture have successfully engineered a variety of 2D and 3D structures using principles of self-assembly. In this ...

Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of these applications require interaction with and adhesion of DNA nanostructures to a substrate. Due to its atomically flat and easily cleaned nature, mica has been the substrate of choice for DNA origami experiments. However, the practical applications of mica are relatively limited compared to those of semiconductor substrates. For this reason, a straightforward, stable, and repeatable process for DNA origami adhesion on derivatized silicon oxide is presented here. To promote the adhesion of DNA nanostructures to silicon oxide surface, a self-assembled monolayer of 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) is deposited from an aqueous solution that is compatible with many photoresists. The substrate must be cleaned of all organic and metal contaminants using Radio Corporation of America (RCA) cleaning processes and the native oxide layer must be etched to ensure a flat, functionalizable surface. Cleanrooms are equipped with facilities for silicon cleaning, however many components of DNA origami buffers and solutions are often not allowed in them due to contamination concerns. This manuscript describes the set-up and protocol for in-lab, small-scale silicon cleaning for researchers who do not have access to a cleanroom or would like to incorporate processes that could cause contamination of a cleanroom CMOS clean bench. Additionally, variables for regulating coverage are discussed and how to recognize and avoid common sample preparation problems is described.

Reproducible cleaning processes for substrates used in DNA origami research are described, including bench-top RCA cleaning and derivatization of silicon oxide. Protocols for surface preparation, DNA origami deposition, drying parameters, and simple experimental set-ups are illustrated.

הכנת מצעים נציץ והסיליקון לDNA אוריגמי ניתוח וניסויים

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of ...

An Aptamer-based Sensor for Unchelated Gadolinium(III)

A method for determining the presence of unchelated trivalent gadolinium ion (Gd3+) in aqueous solution is demonstrated. Gd3+ is often present in samples of gadolinium-based contrast agents as a result of incomplete reactions between the ligand and the ion, or as a dissociation product. Since the ion is toxic, its detection is of critical importance. Herein, the design and usage of an aptamer-based sensor (Gd-sensor) for Gd3+ are described. The sensor produces a fluorescence change in response to increasing concentrations of the ion, and has a limit of detection in the nanomolar range (~100 nM with a signal-to-noise ratio of 3). The assay may be run in an aqueous buffer at ambient pH (~7 - 7.4) in a 384-well microplate. The sensor is relatively unreactive toward other physiologically relevant metal ions such as sodium, potassium, and calcium ions, although it is not specific for Gd3+ over other trivalent lanthanides such as europium(III) and terbium(III). Nevertheless, the lanthanides are not commonly found in contrast agents or the biological systems, and the sensor may therefore be used to selectively determine unchelated Gd3+ in aqueous conditions.

An Aptamer-based Sensor for Unchelated GadoliniumIII

The use of polydeoxynucleotide (44-mer aptamer) molecules for sensing unchelated gadolinium(III) ion in an aqueous solution is described. The presence of the ion is detected via an increase in the fluorescence emission of the sensor.

חיישן מבוסס-Aptamer עבור Unchelated גדוליניום (III)

A method for determining the presence of unchelated trivalent gadolinium ion (Gd3+) in aqueous solution is demonstrated. Gd3+ is often present in samples ...

Phthalic Acid Ester-Binding DNA Aptamer Selection, Characterization, and Application to an Electrochemical Aptasensor

Phthalic acid esters (PAEs) areone of the major groups of persistent organic pollutants. The group-specific detection of PAEs is highly desired due to the rapid growing of congeners. DNA aptamers have been increasingly applied as recognition elements on biosensor platforms, but selecting aptamers toward highly hydrophobic small molecule targets, such as PAEs, is rarely reported. This work describes a bead-based method designed to select group-specific DNA aptamers to PAEs. The amino group functionalized dibutyl phthalate (DBP-NH2) as the anchor target was synthesized and immobilized on the epoxy-activated agarose beads, allowing the display of the phthalic ester group at the surface of the immobilization matrix, and therefore the selection of the group-specific binders. We determined the dissociation constants of the aptamer candidates by quantitative polymerization chain reaction coupled with magnetic separation. The relative affinities and selectivity of the aptamers to other PAEs were determined by the competitive assays, where the aptamer candidates were pre-bounded to the DBP-NH2 attached magnetic beads and released to the supernatant upon incubation with the tested PAEs or other potential interfering substances. The competitive assay was applied because it provided a facile affinity comparison among PAEs that had no functional groups for surface immobilization. Finally, we demonstrated the fabrication of an electrochemical aptasensor and used it for ultrasensitive and selective detection of bis(2-ethylhexyl) phthalate. This protocol provides insights for the aptamer discovery of other hydrophobic small molecules.

A protocol for the in vitro selection and characterization of group-specific phthalic acid ester- binding DNA aptamers is presented. The application of the selected aptamer in an electrochemical aptasensor is also included.

חומצה פתלית אסתר מחייב DNA Aptamer ובחירת, אפיון, ליישום Aptasensor אלקטרוכימי

Phthalic acid esters (PAEs) areone of the major groups of persistent organic pollutants. The group-specific detection of PAEs is highly desired due to the ...

Membrane Remodeling of Giant Vesicles in Response to Localized Calcium Ion Gradients

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local variations in calcium ion concentration. The main molecular components involved in these processes have been identified; however, the specific interplay between calcium ion gradients and the lipids within the cell membrane is far less known, mainly due to the complex nature of biological cells and the difficultly of observation schemes. To bridge this gap, a synthetic approach is successfully implemented to reveal the localized effect of calcium ions on cell membrane mimics. Establishing a mimic to resemble the conditions within a cell is a severalfold problem. First, an adequate biomimetic model with appropriate dimensions and membrane composition is required to capture the physical properties of cells. Second, a micromanipulation setup is needed to deliver a small amount of calcium ions to a particular membrane location. Finally, an observation scheme is required to detect and record the response of the lipid membrane to the external stimulation. This article offers a detailed biomimetic approach for studying the calcium ion-membrane interaction, where a lipid vesicle system, consisting of a giant unilamellar vesicle (GUV) connected to a multilamellar vesicle (MLV), is exposed to a localized calcium gradient formed using a microinjection system. The dynamics of the ionic influence on the membrane were observed using fluorescence microscopy and recorded at video frame rates. As a result of the membrane stimulation, highly curved membrane tubular protrusions (MTPs) formed inside the GUV, oriented away from the membrane. The described approach induces the remodeling of the lipid membrane and MTP production in an entirely contactless and controlled manner. This approach introduces a means to address the details of calcium ion-membrane interactions, providing new avenues to study the mechanisms of cell membrane reshaping.

We present a technique for contactless micromanipulation of vesicles, using localized calcium ion gradients. Microinjection of a calcium ion solution, in the vicinity of a giant lipid vesicle, is utilized to remodel the lipid membrane, resulting in the production of membrane tubular protrusions.

ממברנה שיפוץ של שלפוחית ענקית בתגובה מעברי צבע יון סידן לשפות אחרות

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local ...

Methionine Functionalized Biocompatible Block Copolymers for Targeted Plasmid DNA Delivery

Reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization integrates the advantages of radical polymerization and living polymerization. This work presents the preparation of methionine functionalized biocompatible block copolymers via RAFT polymerization. Firstly, N,N-bis(2-hydroxyethyl)methacrylamide-b-N-(3-aminopropyl)methacrylamide (BNHEMA-b-APMA, BA) was synthesized via RAFT polymerization using 4,4&#8217;-azobis(4-cyanovaleric acid) (ACVA) as an initiating agent and 4-cyanopentanoic acid dithiobenzoate (CTP) as the chain transfer agent. Subsequently, N,N-bis(2-hydroxyethyl)methacrylamide-b-N-(3-guanidinopropyl)methacrylamide (methionine grafted BNHEMA-b-GPMA, mBG) was prepared by modifying amine groups in APMA with methionine and guanidine groups. Three kinds of block polymers, mBG1, mBG2, and mBG3, were synthesized for comparison. A ninhydrin reaction was used to quantify the APMA content; mBG1, mBG2, and mBG3 had 21%, 37%, and 52% of APMA, respectively. Gel permeation chromatography (GPC) results showed that BA copolymers possess molecular weights of 16,200 (BA1), 20,900(BA2), and 27,200(BA3) g/mol. The plasmid DNA (pDNA) complexing ability of the obtained block copolymer gene carriers was also investigated. The charge ratios (N/P) were 8, 16, and 4 when pDNA was complexed completely with mBG1, mBG2, mBG3, respectively. When the N/P ratio of mBG/pDNA polyplexes was higher than 1, the Zeta potential of mBG was positive. At an N/P ratio between 16 and 32, the average particle size of mBG/pDNA polyplexes was between 100-200 nm. Overall, this work illustrates a simple and convenient protocol for the block copolymer carrier synthesis.

This work presents the preparation of methionine functionalized biocompatible block copolymers (mBG) via the reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) method. The plasmid DNA complexing ability of the obtained mBG and their transfection efficiency were also investigated. The RAFT method is very beneficial for polymerizing monomers containing special functional groups.

מתיונין מתפקד ביולוגית ביויוננים בלוק תואם למשלוח דנ א ממוקד

Reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization integrates the advantages of radical polymerization and living polymerization. This ...

Stable DNA Motifs, 1D and 2D Nanostructures Constructed from Small Circular DNA Molecules

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D DNA nanostructures. Over decades, the rapid development of DNA nanotechnology is attributed to the use of linear DNAs as the source materials. For example, the DAO (double crossover, antiparallel, odd half-turns) tile is well-known as a building block for construction of 2D DNA lattices; the core structure of DAO is made from two linear single-stranded (ss) oligonucleotides, like two ropes making a right hand granny&#160;knot. Herein, a new type of DNA tiles called cDAO (coupled DAO) are built using a small circular ss-DNA of c64nt or c84nt (circular 64 or 84 nucleotides) as the scaffold strand and several linear ss-DNAs as the staple strands. Perfect 1D and 2D nanostructures are assembled from cDAO tiles: infinite nanowires, nanospirals, nanotubes, nanoribbons; and finite nano-rectangles. Detailed protocols are described: 1) preparation by T4 ligase and purification by denaturing PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) of small circular oligonucleotides, 2) annealing of stable circular tiles, followed by native PAGE analysis, 3) assembling of infinite 1D nanowires, nanorings, nanospirals, infinite 2D lattices of nanotubes and nanoribbons, and finite 2D nano-rectangles, followed by AFM (Atomic Force Microscopy) imaging. The method is simple, robust, and affordable for most labs.

This article presents a detailed protocol for T4 ligation and denaturing PAGE purification of small circular DNA molecules, annealing and native PAGE analysis of circular tiles, assembling and AFM imaging of 1D and 2D DNA nanostructures, as well as agarose gel electrophoresis and centrifugation purification of finite DNA nanostructures.

המוטיבים אן יציב, 1 י ו- 2D Nanostructures בנוי מולקולות DNA מעגלי קטן

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D ...

Gene-therapy Inspired Polycation Coating for Protection of DNA Origami Nanostructures

DNA origami nanostructures hold an immense potential to be used for biological and medical applications. However, low-salt conditions and nucleases in physiological fluids induce denaturation and degradation of self-assembled DNA nanostructures. In non-viral gene delivery, enzymatic degradation of DNA is overcome by the encapsulation of the negatively charged DNA in a cationic shell. Herein, inspired by gene delivery advancements, a simple, one-step and robust methodology is presented for the stabilization of DNA origami nanostructures by coating them with chitosan and linear polyethyleneimine. The polycation coating efficiently protects DNA origami nanostructures in Mg-depleted and nuclease-rich media. This method also preserves the full addressability of enzyme- and aptamer-based functionalization of DNA nanostructures.

Here, a protocol for the protection of DNA origami nanostructures in Mg-depleted and nuclease-rich media using natural cationic polysaccharide chitosan and synthetic linear polyethyleneimine (LPEI) coatings is presented.

ריפוי גנטי בהשראת Polycation ציפוי הגנה על ה-DNA אוריגמי Nanostructures

DNA origami nanostructures hold an immense potential to be used for biological and medical applications. However, low-salt conditions and nucleases in ...