著者は、プロセス開発、デバイス作製の貴重なサポート ChiLab ・ マイクロ システム研究室 - トリノ工科大学 - 教授 C F Pirri、博士 M Cocuzza、博士 S L Marasso の人に DISAT を確認します。Quantacell からビクター ラシーンは、議論と画像処理の支援を感謝いたします。GFP LifeAct マウスと私たちを提供するため、マウスのためのサポートのための Institut キュリーとパブロ ・ バルガスとアナ · マリア ・ レノン (Institut キュリー) の動物施設からイザベル グランジャンとマノン変わって感謝しております。蛍光除外法の理解で彼らの助けのための Institut ランジュバンとクロティルデ Cadart、ラリサ Venkova インスティトゥート キュリー - umr を 144 からマチュー Piel からオリビエ Thouvenin に感謝しております。最後に、我々 は微細加工の彼らのサポートのための Institut ピエール ・ ジル de Gennes (CNRS UMS 3750) の技術プラットフォームを感謝します。この作品は一部、欧州研究評議会高度なグラント号 321107「チェロ」によって支えられた PSL ユニヴェルシテ (SwithNeuroTrails プロジェクト)、ANR Investissement d'Avenir 地球 Labex と Equipex。

<ol>
	<li>Jun, S., Taheri-Araghi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-size+maintenance:+universal+strategy+revealed.">Cell-size maintenance: universal strategy revealed.</a> Trends Microbiol. 23 (1), 4-6 (2015).</li><li>Zlotek-Zlotkiewicz, E., Monnier, S., Cappello, G., Le Berre, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+volume+and+mass+measurements+show+that+mammalian+cells+swell+during+mitosis.">Optical volume and mass measurements show that mammalian cells swell during mitosis.</a> J. Cell Biol. 211 (4), 765-774 (2015).</li><li>Kim, G. H., Kosterin, P., Obaid, A. L., Salzberg, B. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+graphene+based+nanocomposite+for+application+in+3D+flexible+micro-supercapacitors.">A novel graphene based nanocomposite for application in 3D flexible micro-supercapacitors.</a> Materials Research Express. 3 (6), 065001 (2016).</li><li>Welch, C. C., Goodyear, A. L., Wahlbrink, T., Lemme, M. C., Mollenhauer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+etch+process+options+for+micro-and+nanotechnology+using+inductively+coupled+plasmas.">Silicon etch process options for micro-and nanotechnology using inductively coupled plasmas.</a> Microelectronic Engineering. 83 (4), 1170-1173 (2006).</li><li>Fath, T., Ke, Y. D., Gunning, P., G&#246;tz, J., Ittner, L. 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著者は利益相反を宣言しません。

ニューロンのボリューム イメージングは、これらの細胞の長くて細い拡張のための FXm 技術の挑戦を構成します。このプロトコルでは、ニューロン イメージングへ専用マイクロ流体デバイスの同じ型の変形について説明します。
マイクロ流体設計の側面と横にある目的の選択は蛍光の排除のための基本でありトレードオフ水平解像度と画像の鮮明さを意味します。これは、商工会議所の高さより小さい焦点深度につながる高 NA なかったこと容積測定の精密のため有害なフォーカスでイメージングを行った、私のオブジェクトの輪郭間に十分な余白が残っている場合13に示されています。暴騰と積分面の境界。ただし、商工会議所の焦点深度よりもはるかに高いは、関心のオブジェクトのエッジが滑らかになり、光子拡散による画像の鮮明さを損ないます。この横方向のぶれを軽減の 3 μ m の高い部屋の作製と高 NA を使用しても非常によく定義された蛍光除外画像を提供した (0.8) 40 X 目標高い空間分解能と神経の枝を視覚化します。
チップ組立が重要なステップ、特に 3 μ m の高い部屋の場合が、慎重に操作 4.1.2 の説明に従って屋根の崩壊を回避できます。これらの薄い部屋に関連付けられた容積の比率に高い表面に時間をかけてデキストラン濃度の安定性の問題も発生します。我々 は、インキュベーションの 1 泊後、デキストランの表面の吸収はごくわずかだったことをチェックしている: PBS によるデキストランを交換した後柱と背景の強度の違いは初期強度のコントラストの 1000 人あたり約 1デキストランの存在下でのこれらの 2 つの領域。下部 coverslip と PDMS 屋根の両方神経細胞が付着することに注意してください。この効果は、コーティングとしてパターン coverslips (すなわち我々 は PDMS チャンバ内接着分子を孵化しない場合) を使用して、ローカライズ チャンバーの底に厳密にしたがってときに消えます。
法、すなわちデキストラン エンドサイトーシスの主要な限定の 1 つは非常に限られたという事実のために、その挑戦的な形態から離れてニューロンではなく FXm に適しているこれらの細胞で。我々 は、10 を選択して長期的に抑える kDa の定式化の範囲 (時間) すべて表示エンドサイトーシスの現象。
FXm の概念的なシンプルさのバランスが取れて議定書、ナノメートルの PDMS の粗さやミクロ室高さの凹凸を補正するためのバック グラウンド補正などにより解決されている実験の問題の結論として、柱間 PDMS の天井。ただし、蛍光メジウムを閉じ込めるに近い流体チャンバーの使用によって効果的な表面の細胞接着、または中央から相馬を除外する必要を下げるサポート柱の必要性のようないくつかの特定の制約高分解能観察にアクセス可能なセルの領域を制限する最高の明快さと神経の拡張を観察する商工会議所。このメソッドの 1 つの可能な進化は光一で交換するこの物理的な監禁をなくすでしょう。光シート顕微鏡の新展開が有利と組み合わせる FXm、将来的に。

細胞容積の正確な知識は、セルの大きさの恒常性単一 celled の微生物1とより一般的に細胞分裂の細胞2の問題によって駆動される最後の年に増加した注目を集めています。しかし、細胞容積の質問は分裂細胞、ニューロンが、典型的な例を構成するものにも関連します。
ボリュームは確かに不可逆的に電気的活動 (ミリ秒) 3に関連付けられている一時的な軸索の変形から、神経の人生のスケールが異なると時間点で生理学的および病理学的イベントの重要な署名神経変性疾患 (年間人間の) 4の段階で無症候性神経腫脹発生。しかし、最大のボリューム変更に数日または神経成長中 (考慮される有機体) によって数週間の中間の時間スケールで発生します。ニューロンの拡張と複雑な形態を発生させる倍数問題、その中でセルのサイズの規則。軸索の長さと直径規制実にきっちりと生体内で、各神経タイプ5,6に固有の値です。
これらの問題に対処するため生体内で、複雑な簡単な方法で対処できます体外。その目的の容積測定に専用の高速メソッド十分成長ダイナミクス (すなわち分の時間スケールで) と互換性のある時間または数日間の観察に従うことが必要です。複数の方法は細胞容積体外への直接的または間接的なアクセスを提供するために長年にわたって開発されています。共焦点イメージングからセルの再構成は、それらの 1 つが、このメソッドは約 500 nm 7の限られた軸の解像度を見せながら光にラベリング反復暴露を意味します。これらの 2 つの最後の欠点は、格子ライト シート顕微鏡8をというより高度な最近のメソッドによって克服部分的に注意してください。この走査法はゆっくりと退屈な本質が原子間力顕微鏡は使用される9にしました。さらに、それでセルは、物理的な接触はニューロンの10の極端な柔らかさを考慮した計測と干渉する可能性があります。別のセルタイプを11の不十分な拡張接着細胞ニューロンのようなインピー ダンスまたは共鳴を用いた間接的手法が採用されています。
最も有望な方法の一つは、蛍光色素で満ちていた近い区域の細胞の排除体積の測定に基づいています。蛍光方式 (FXm) ラベル、必要ないとその原理はシンプルで、高速、長期的潜在的サブ光軸の解像度を持つ細胞集団の光イメージングに適しています。いくつかノイズの源を制限するこの究極の解像度がより正確に、z の解像度はカメラのダイナミック レンジで割った値 (すなわち細胞に欠けている地域の) 培養室で最大蛍光強度に依存します。このメソッドは、移行する付着性のセル12の量に従うまたは徹底的に13に記載されている、哺乳類細胞の有糸分裂の間の体積変化を研究する非常に強力なされています。しかし、ニューロンは fxm サブ ミクロ プロセスに彼らの広範な分枝を考慮した方法論的課題を構成します。
高精度ボリュームと神経の枝と成長円錐のような神経細胞の成長に関与する動的構造体の高さにアクセスする滑らかな FXm チャンバーの作製につながる方法をご紹介します。
部屋軸の解像度を最適化するために測定するオブジェクトより同じような高さが必要です。したがって、3 つの異なる高さの中央測定室によって特徴付けられるさまざまな FXm デバイスを考案しました。神経突起の測定に、薄 (3 μ m の高さ) を専用: この低い高さ除く相馬近く 15 μ m の高い中間チャンバー内に残る。厚い中央室 (10 と 12 μ m) が全体の細胞の成長に十分に高いです。デバイスには、中央の部屋のどちら側に位置する 2 つの貯水池も含まれています。4 つの注入穴 (IH) ため実装されています、次のように示される: 入口と出口、チップに細胞懸濁液を紹介し、他の 2 つは、貯水池をフィードに対しサービスします。
我々 は知られているジオメトリのフォトレジスト構造を使用した高さ測定の最初の試作した校正 coverslips あります。接着のマイクロ パターンに無料成長ニューロン、しかしまた形態学的制約付きニューロン、イメージしています。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmalab System 100</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>To perform DRIE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MJB4 mask aligner</td>
			<td>SUSS MicroTec</td>
			<td></td>
			<td>SU-8 photolithography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NXQ 4006 Mask aligner</td>
			<td>Neutronix Quintel</td>
			<td></td>
			<td>Photolithography associated to DRIE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Diener Electronic</td>
			<td>Pico PCCE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture hood</td>
			<td>ADS Laminaire</td>
			<td>Optimale 12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Heraeus Multifuge X1R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator 37 &#176;C 5% CO2</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MCO-170AICUVH-PE IncuSafe CO2 Incubator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS Oven between 65 and 80 &#176;C</td>
			<td>Memmert</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical profilometer</td>
			<td>Veeco</td>
			<td>Dektak 6M Stylus Profiler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical profilometer</td>
			<td>Veeco</td>
			<td>Wyko NT9100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Verrerie Villeurbanaise (Kartel Labware)</td>
			<td>230KAR</td>
			<td>Diameter 200 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath sonicator</td>
			<td>Labo Moderne</td>
			<td>SHE1000</td>
			<td>Volume of the bath: 0.8 liter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate</td>
			<td>Stuart SD162</td>
			<td>SD162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRIE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Su8 Mask 1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Su8 Mask 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Su8 Mask 3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1805 calibration stripes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small laboratory equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm hole puncher</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>29002519 (US reference)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel or razor blade</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9&#34; Stainless Steel Flat Spatula with Spoon</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82027-532</td>
			<td>To demold PDMS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top Lip Wafer Handling</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>63042-096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tweezer</td>
			<td>FST</td>
			<td>Dumont #7 Forceps - Standard / Dumoxel</td>
			<td>To manipulate glass coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer</td>
			<td>Prolog Semicor Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24x24 mm glass coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresists and developpers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 1518 positive photoresist</td>
			<td>Microchemicals GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Before DRIE process, thicknes 1.8 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ 351B developer</td>
			<td>Microchemicals GmbH</td>
			<td></td>
			<td>To develop positive AZ 1518 photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2007</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2025</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2050</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGMA developer</td>
			<td>Technic</td>
			<td></td>
			<td>To develop SU-8 negative photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microposit S1805 resist</td>
			<td>Chimie Tech Services</td>
			<td></td>
			<td>Positive photoresist used to obtain 0.5&#181;m high structures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MF 26A developer</td>
			<td>Chimie Tech Services</td>
			<td></td>
			<td>To develop positive S1805 photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable plastic pipette 3 mL</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P100 Petri dishes</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS+20ES1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent scotch tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square wipes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>115-2148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>DUTSCHER</td>
			<td>90260</td>
			<td>Plastic paraffin film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Methacryloxypropyl)trichlorosilane</td>
			<td>abcr</td>
			<td>AB 109004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS and curing agent Sylgard 184</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>761036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropanol</td>
			<td></td>
			<td>W292907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957 - 50 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>02865</td>
			<td>99.8%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-methacryloxypropyl-trimethoxysilane</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>M6514-25ML</td>
			<td>(C4H5O2)-(CH2)3- Si(OCH3)3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>71251-5ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 10kW conjugated with Alexa488</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>D22910</td>
			<td>Absoprtion at 488 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran 10kW conjugated with Alexa647</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>D22914</td>
			<td>Absoprtion at 647 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>21090-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>12587-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax 200 mM</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate GIBCO 100 mM</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>15710-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 10x</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>14180-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes 1M</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>59418C-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal without phenol red</td>
			<td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td>
			<td>12348-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Routine in Matlab for background normalization</td>
			<td>Quantacell</td>
			<td>Contact Victor Racine: victor.racine@quantacell.com</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To select specific ROI for image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Routine</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Routine</td>
			<td>Matlab</td>
			<td></td>
			<td>Supplementary data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution volume imaging of neurons by the use of fluorescence exclusion method and dedicated microfluidic devices

ボリュームは、異なるタイム スケールでニューロンの生理学的および病理学的特性に関する重要なパラメーターです。ニューロンはその拡張区分された形態に関する非常にユニークなセルであり、したがって体積測定のためのいくつかの方法論的課題を上げます。生体外で神経成長の特定のケースで選択した方法論は分からに時間または数日間の時間スケールでの全視野観察と組み合わせてサブ ミクロの軸解像度を含める必要があります。共焦点レーザー顕微鏡、電気ベースの測定あるいは原子間力顕微鏡を用いた細胞形状復元のような他の方法とは異なり最近開発された蛍光方式 (FXm) これらの課題を満たすために可能性があります。しかし、神経細胞の高解像度 FXm の実装をその原理でシンプルながら、複数の調整と専用の方法論が必要です。蛍光除外、低粗度多区画マイクロ流体デバイス、そして神経のローカル ボリュームの生体外の測定を達成するために微細の組み合わせに基づいてメソッドをご紹介します。デバイスの高解像度では、神経突起 (突起) のローカル ボリュームと成長円錐 (GCs) など、神経細胞の成長に関与するいくつかの特定の構造の量を測定することができました。

図 1 aのイメージによって作製セクション 1 と 2 で説明されているプロセスの結果を示す-1 bと図 1の曲線。図 1の表には、PDMS チップ、すなわち中央と 20 μ m 高次中間室の 2 つの異なる代表的なエリアの粗さの値が表示されます。SU 8 フォトレジストの代わりにエッチングの Si ウェハを使用して、約 7 倍の粗さの減少が得られました。その後、FXm は最初、10 μ m の高い商工会議所内知られているジオメトリ (図 2 a) のフォトレジスト ストライプに適用されました。画像処理と強度高さ変換後 (図 2 bのグラフを参照)、このストライプ (図 2) に沿って 2 次元断面に対して FXm プロファイル提供希望の高さプロファイル (図 2 D)。図 2 Dは、機械的形状測定と FXm メソッドを使用して取得したプロファイルの比較を示しています。エッジと高原の値を含め、これらのプロファイルが非常に似ている方法を検証します。FXm データの散乱が、さらに図 3および図 4、評価法の究極的な解決の代表ではないことに注意してくださいが、低強度からの結果が非常に弱いの可能な効果を避けるために採用GFP チャネルでのフォトレジストの自家蛍光。
その後、3 μ m と 10 μ m 高室 (図 3) の神経突起を見ました。バック グラウンド ノイズの標準偏差は約 18 nm 高さの変換とバック グラウンドの補正に強度の後。この値はシリコン表面にキャストした PDMS 表面の物理的な粗さよりわずかに高い (12 nm、図 1の表を参照) PDMS で測定された粗さが SU 8 金型から得られたよりもはるかに低いが。これらの結果は、シリコンウェハーに井戸を掘削するのではなく、柱をキャストする SU 8 フォトレジストに穴が開いての付加価値を強調表示します。このような低値は、図 3 aで表示されるなどボリュームの非常に鮮明な画像とノイズ比の高い信号をことができます。このようなイメージから取得できるデータの例として我々 は 1.6 μ m (すなわち10 ピクセル) ワイド神経突起のボリュームを計算 (図 3 bのグラフを参照してください) をスライスします。約 400 の平均神経突起の高さの値を与える最初の近似でこれらのデータの線形フィットを使用して nm、例えば軸索直径の 500 nm、10 日脳梁5内の古い子犬と比較します。我々 はまた接着における出力直列 2 μ m と 30 μ m の長さの 6 μ m の広い縞から成るのと FXm を組み合わせます。私たちの目的は神経突起の幅がその 3次元形状に及ぼす影響を研究するだった。図 3は、10 μ m の高い部屋で得られた全体のニューロン イメージの偽色の 3 D の表現を示しています。最大のストライプの極みに、相馬があるに対し、神経突起は 2 μ m と 6 μ m の広い縞、広がっています。3 つの異なる断面の高さプロファイルを描いた。図 3 aに表示されるグラフとの一貫性、表面 (図 3 D) 神経突起幅断面増加に統合されています。
成長円錐 (GC) の立体構造にも着目。図 4A Bプロファイルが表示されます 2 つ異なる GC 3 μ m の高い部屋で得られた彼らの分岐部分の構造を強調します。さらに、我々 は 12 μ m の高い部屋で Gc がボリュームのダイナミクスに従うタイムラプス実験を行った。図 4には、数十分の時間スケール内で指定された GC の再活性化と縮小のサイクルが表示されます。Lifeact GFP マウスの使用のおかげで成長円錐に GFP の発光波長ローカライズされた (510 nm) のアクチンの高濃度から。波長で特定されるサーフェスは 647 でデキストラン発光波長にわたって統合に使用された GC の体積を計算する nm。図 4は最終的に約 6 μ m3の値を中心とした 3 つの異なるニューロンに異なる時点および場所で GC のボリュームの分布を示します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig1v2.jpg"> 図 1: FXm PDMS チャンバ。(A)最終型につながる微細加工の 4 つの主な手順のスキーム。入口、出口、貯水池の場所が示されます。バーをスケール: 1 mm。(B)光学測定機を用いて PDMS FXm 室の画像。この画像は、10 μ m 高柱の 3 つの行と高さは 20、50、90 μ m の中間室を含む中央の部屋を示します。スケール バー: 500 μ m。 (C) (B) に描かれた 2 本の破線に沿ってチップの断面図。イエロー/ゴールド: 青の柱に沿って断面: 断面柱の間。(D) PDMS の粗さの値は実測 50 × 成形シリコンと 20 μ m 高 SU 8 中間室 50 μ m2のエリアを意味する (これらの区域の場所の矢印を参照)。平均値は、3 つの異なる分野の測定から得られました。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig1v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig2.jpg"> 図 2: FXm 用いたフォトレジスト ストライプの興味の対象としての校正します。(A) 10 μ m の高い部屋で撮影した GFP 蛍光画像 10,000 MW デキストラン 488 で吸収でいっぱい nm 1 mg/mL で。(B: 背景、p: 柱)。乾燥 40 X ナ 0.8 目的の観察。スケール バー: 2 色の四角形の (A) に表示されている青い点線のレベルで得られる A. (C)蛍光強度分布に示すようにフォトレジストを渡る平均強度から得られる(B)線形校正法 50 μ m。ストライプ (0.45 μ m 高ポジ型フォトレジスト)。(D) (B) (青い点) のデータの高さの転換へ強度後機械的測定機 (黒い点) や FXm から得られるプロファイルの比較。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig3.jpg"> 図 3: 神経突起ボリューム イメージングします。(A)の突起が次に 15 μ m の中間室にある相馬から中央の 3 μ m 高の室に拡張します。488 で吸収 10,000 MW デキストランを用いてイメージング nm と 40 X、NA 0.8 乾燥目的。はめ込み式バック グラウンド低減ルーチンの使用は 2 つの突起をハイライトした後を取得し、右側のグラフをプロットすることを選択。スケール バー: 30 μ m。( B) (A) に示す 22 プロファイル (10 ピクセル、すなわち1.6 μ m「神経突起スライス」の上平均) から得られた神経突起幅の関数として突起スライス ・ ボリューム。実線は、原点を通る傾き 0.4 μ m の線形フィットを表します。(C)接着ストライプにパターン化されたニューロンの偽色のイメージから成って連続 2 μ m と 6 μ m の広い切り株 (白で表されます)。10,000 MW デキストラン 647 で吸収で満ちていた 10 μ m の高い区域で測定を行い nm と 40 x NA を用いた 0.8 乾燥目的。(D)色の破線 (C) に示すように、同じ維持に対応する高さプロファイルは色コードです。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig4.jpg"> 図 4: 静的および動的成長円錐イメージングします。(B)成長円錐の高さプロファイル強度関連画像に表示される黄色の線に沿って高さ変換後 3 μ m の高い商工会議所で得られました。488 で吸収 10,000 MW デキストランと塗りつぶしを用いて観測 nm と 40 X、NA 0.8 乾燥目的。(C) 12 μ m の高い部屋で全体のニューロン イメージング 10,000 MW デキストラン 647 で吸収でいっぱい nm。観測は、2 つの蛍光チャネルで行われている: GFP 成長円錐 (黄色破線)、および CY5 蛍光除外から GC の体積を計算します。黄色破線で含まれている表面は、GC の体積を計算する使用されました。グラフでは、2 つの代表的な異なる時点で GFP および cy5 の組合せの両方のチャンネルで GC 量の時間、および関連付けられている形態上の変化を示します。40 x NA を使用してすべてのデータを取得した 0.8 乾燥目的すべての 3 分のスケール バー: 10 μ m.<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ステップ</td>
			<td>1:8 μ m の層をマスクします。</td>
			<td>マスク 2:30 μ m の層</td>
			<td>マスク 3:40 μ m の層</td>
		</tr>
<tr>
<td>SU 8 型</td>
			<td>2007</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>コーティング</td>
			<td>30 s 2000 rpm @</td>
			<td>30 s 3050 rpm @</td>
			<td>30 s 3250 rpm @</td>
		</tr>
<tr>
<td>ソフト焼き</td>
			<td>95 ° C @ 3 分</td>
			<td>65 ° C + 6 分 @ @ 95 ° C 2 分</td>
			<td>65 ° C + 7 分 95 ° C @ @ 3 分</td>
		</tr>
<tr>
<td>照射エネルギー量</td>
			<td>110 mJ/cm2
</td>
			<td>155 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>露光後ベーク</td>
			<td>4 分 @ 95 ° C</td>
			<td>65 ° C + 6 分 @ @ 95 ° C 1 分</td>
			<td>65 ° C + 7 分 @ @ 95 ° C 2 分</td>
		</tr>
<tr>
<td>開発</td>
			<td>2 分 30 秒</td>
			<td>5 分</td>
			<td>6 分</td>
		</tr>
<tr>
<td>ハード ディスク焼く (オプション)</td>
			<td>@ 200 ° C 3-5 分</td>
			<td>@ 200 ° C 3-5 分</td>
			<td>@ 200 ° C 3-5 分</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: 高さ 12 μ m の中央の部屋を含むデバイスを構築するフォトリソグラフィの手順を実行します。中間室の高さ: 20、50、90 μ m。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ステップ</td>
			<td>マスク 1:10 μ m の層</td>
			<td>マスク 2:30 μ m の層</td>
			<td>マスク 3:40 μ m の層</td>
		</tr>
<tr>
<td>SU 8 型</td>
			<td>2007</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>コーティング</td>
			<td>30 s 1500 rpm @</td>
			<td>30 s 3050 rpm @</td>
			<td>30 s 3250 rpm @</td>
		</tr>
<tr>
<td>ソフト焼き</td>
			<td>95 ° C @ 3 分</td>
			<td>65 ° C + 6 分 @ @ 95 ° C 2 分</td>
			<td>65 ° C + 7 分 95 ° C @ @ 3 分</td>
		</tr>
<tr>
<td>照射エネルギー量</td>
			<td>125 mJ/cm2
</td>
			<td>155 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>露光後ベーク</td>
			<td>4 分 @ 95 ° C</td>
			<td>65 ° C + 6 分 @ @ 95 ° C 1 分</td>
			<td>65 ° C + 7 分 @ @ 95 ° C 2 分</td>
		</tr>
<tr>
<td>開発</td>
			<td>2 分 30 秒</td>
			<td>5 分</td>
			<td>6 分</td>
		</tr>
<tr>
<td>ハード ディスク焼く (オプション)</td>
			<td>@ 200 ° C 3-5 分</td>
			<td>@ 200 ° C 3-5 分</td>
			<td>@ 200 ° C 3-5 分</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2: 10 μ m の高さの中央の部屋を含むデバイスを構築するフォトリソグラフィの手順を実行します。中間室の高さ: 20、50、90 μ m。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ステップ</td>
			<td>マスク 1:12 μ m の層</td>
			<td>マスク 2:32 μ m の層</td>
			<td>マスク 3:40 μ m の層</td>
		</tr>
<tr>
<td>SU 8 型</td>
			<td>2015</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>コーティング</td>
			<td>30 s 3250 rpm @</td>
			<td>30 s 2500 rpm @</td>
			<td>30 s 3250 rpm @</td>
		</tr>
<tr>
<td>ソフト焼き</td>
			<td>95 ° C @ 3 分</td>
			<td>65 ° C + 5 分 @ @ 95 ° C 2 分</td>
			<td>65 ° C + 7 分 95 ° C @ @ 3 分</td>
		</tr>
<tr>
<td>露光時間</td>
			<td>140 mJ/cm2
</td>
			<td>157 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>露光後ベーク</td>
			<td>4 分 @ 95 ° C</td>
			<td>65 ° C + 5 分 @ @ 95 ° C 1 分</td>
			<td>65 ° C + 7 分 @ @ 95 ° C 2 分</td>
		</tr>
<tr>
<td>開発</td>
			<td>3 分</td>
			<td>5 分</td>
			<td>6 分</td>
		</tr>
<tr>
<td>ハード ディスク焼く (オプション)</td>
			<td>@ 200 ° C 3-5 分</td>
			<td>@ 200 ° C 3-5 分</td>
			<td>@ 200 ° C 3-5 分</td>
		</tr>
</tbody></table>テーブル 3: 3 μ m の高さの中央の部屋を含むデバイスを構築するフォトリソグラフィの手順を実行します。中間室の高さ: 18、50、90 μ m。
補足データ1: masks_neuron_volume_chips.tiff。(DRIE マスクとマスク 1-3) PDMS のデバイスを作製するためのマスクの模式図。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/masks_neuron_volume_chips.tiff">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
補足データ 2:ファイル"masks_neuron_volume_chips.dxf"。電子ファイル DRIE マスクとマスク 1-3 を作製することができます。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/masks_neuron_volume_chips.dxf">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
補足資料 3: 「Mask_Photoresist stripes.dxf」。電子ファイルは、フォトレジストのストライプのフォトリソグラフィーに使用されるマスクを作製することができます。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/Mask_Photoresist-stripes.dxf">このファイルをダウンロードするここをクリックしてください</a>。
補足資料 4: conversion_mattotiff.m ファイル<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/conversion_mattotiff.m">ファイルのダウンロードは、こちらをご覧ください</a>。
補足資料 5: importfilevol.m ファイル<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/importfilevol.m">ファイルのダウンロードは、こちらをご覧ください</a>。

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High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices

ボリュームは、細胞の生理学的および病理学的特徴に関する重要なパラメーターです。神経突起および暗黙の神経成長の動的構造の分析に必要なサブ ミクロ軸分解能生体外で神経ボリュームの全視野計測を可能にする蛍光排除法について述べる。

高解像度ボリューム イメージングのニューロンを蛍光使用排除法によってと専用マイクロ流体デバイス

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of neurons at different time scales. Neurons are quite unique ...

high-resolution-volume-imaging-neurons-use-fluorescence-exclusion

Research

JoVE Journal

Neuroscience

7.0K ビュー.  Université PSL, CNRS. ボリュームは、細胞の生理学的および病理学的特徴に関する重要なパラメーターです。神経突起および暗黙の神経成長の動的構造の分析に必要なサブ ミクロ軸分解能生体外で神経ボリュームの全視野計測を可能にする蛍光排除法について述べる。

ビデオ: High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

出生後の脳における神経細胞の移動の高分解能タイムラプスイメージングのための器官型スライスアッセイ

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

神経科学

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are characteristic to neurons in both normal and diseased brain. Towards this, a great deal of effort has been placed on building high-resolution neuroanatomical maps1-3. With the expansion of molecular genetics and advances in light microscopy has come the ability to query not only neuronal morphologies, but also the molecular and cellular makeup of individual neurons and their associated networks4. Major advances in the ability to mark and manipulate neurons through transgenic and gene targeting technologies in the rodent now allow investigators to 'program' neuronal subsets at will5-6. Arguably, one of the most influential contributions to contemporary neuroscience has been the discovery and cloning of genes encoding fluorescent proteins (FPs) in marine invertebrates7-8, alongside their subsequent engineering to yield an ever-expanding toolbox of vital reporters9. Exploiting cell type-specific promoter activity to drive targeted FP expression in discrete neuronal populations now affords neuroanatomical investigation with genetic precision.
Engineering FP expression in neurons has vastly improved our understanding of brain structure and function. However, imaging individual neurons and their associated networks in deep brain tissues, or in three dimensions, has remained a challenge. Due to high lipid content, nervous tissue is rather opaque and exhibits auto fluorescence. These inherent biophysical properties make it difficult to visualize and image fluorescently labelled neurons at high resolution using standard epifluorescent or confocal microscopy beyond depths of tens of microns. To circumvent this challenge investigators often employ serial thin-section imaging and reconstruction methods10, or 2-photon laser scanning microscopy11. Current drawbacks to these approaches are the associated labor-intensive tissue preparation, or cost-prohibitive instrumentation respectively.
Here, we present a relatively rapid and simple method to visualize fluorescently labelled cells in fixed semi-thick mouse brain slices by optical clearing and imaging. In the attached protocol we describe the methods of: 1) fixing brain tissue in situ via intracardial perfusion, 2) dissection and removal of whole brain, 3) stationary brain embedding in agarose, 4) precision semi-thick slice preparation using new vibratome instrumentation, 5) clearing brain tissue through a glycerol gradient, and 6) mounting on glass slides for light microscopy and z-stack reconstruction (Figure 1).
For preparing brain slices we implemented a relatively new piece of instrumentation called the 'Compresstome' VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). This instrument is a semi-automated microtome equipped with a motorized advance and blade vibration system with features similar in function to other vibratomes. Unlike other vibratomes, the tissue to be sliced is mounted in an agarose plug within a stainless steel cylinder. The tissue is extruded at desired thicknesses from the cylinder, and cut by the forward advancing vibrating blade. The agarose plug/cylinder system allows for reproducible tissue mounting, alignment, and precision cutting. In our hands, the 'Compresstome' yields high quality tissue slices for electrophysiology, immunohistochemistry, and direct fixed-tissue mounting and imaging. Combined with optical clearing, here we demonstrate the preparation of semi-thick fixed brain slices for high-resolution fluorescent imaging.

Here we describe a rapid and simple method to image fluorescently labeled cells in semi-thick brain slices. By fixing, slicing, and optically clearing brain tissue we describe how standard epifluorescent or confocal imaging can be used to visualize individual cells and neuronal networks within intact nervous tissue.

セミ厚い脳スライスにおける高解像度蛍光イメージングへの迅速なアプローチ

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon measuring activity on the surface of cerebral cortex rather than in subcortical regions such as midbrain and brainstem. Subcortical fMRI must overcome two challenges: spatial resolution and physiological noise. Here we describe an optimized set of techniques developed to perform high-resolution fMRI in human SC, a structure on the dorsal surface of the midbrain; the methods can also be used to image other brainstem and subcortical structures.
High-resolution (1.2 mm voxels) fMRI of the SC requires a non-conventional approach. The desired spatial sampling is obtained using a multi-shot (interleaved) spiral acquisition1. Since, T2* of SC tissue is longer than in cortex, a correspondingly longer echo time (TE ~ 40 msec) is used to maximize functional contrast. To cover the full extent of the SC, 8-10 slices are obtained. For each session a structural anatomy with the same slice prescription as the fMRI is also obtained, which is used to align the functional data to a high-resolution reference volume.
In a separate session, for each subject, we create a high-resolution (0.7 mm sampling) reference volume using a T1-weighted sequence that gives good tissue contrast. In the reference volume, the midbrain region is segmented using the ITK-SNAP software application2. This segmentation is used to create a 3D surface representation of the midbrain that is both smooth and accurate3. The surface vertices and normals are used to create a map of depth from the midbrain surface within the tissue4.
Functional data is transformed into the coordinate system of the segmented reference volume. Depth associations of the voxels enable the averaging of fMRI time series data within specified depth ranges to improve signal quality. Data is rendered on the 3D surface for visualization.
In our lab we use this technique for measuring topographic maps of visual stimulation and covert and overt visual attention within the SC1. As an example, we demonstrate the topographic representation of polar angle to visual stimulation in SC.

This article describes techniques to perform high-resolution functional magnetic resonance imaging with 1.2 mm sampling in human midbrain and subcortical structures using a 3T scanner. Use of these techniques to resolve topographic maps of visual stimulation in the human superior colliculus (SC) is given as an example.

人間の中脳の高解像度機能的磁気共鳴画像法

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central nervous system (CNS). Although much is known about the molecular mechanisms that pattern the spinal cord and elicit neuronal differentiation1, 2, we lack a deep understanding of these early events at the level of cell behavior. It is thus critical to study the behavior of neural progenitors in real time as they undergo neurogenesis.
In the past, real-time imaging of early embryonic tissue has been limited by cell/tissue viability in culture as well as the phototoxic effects of fluorescent imaging. Here we present a novel assay for imaging such tissue for long periods of time, utilizing a novel ex vivo slice culture protocol and wide-field fluorescence microscopy (Fig. 1). This approach achieves long-term time-lapse monitoring of chick embryonic spinal cord progenitor cells with high spatial and temporal resolution.
This assay may be modified to image a range of embryonic tissues3, 4 In addition to the observation of cellular and sub-cellular behaviors, the development of novel and highly sensitive reporters for gene activity (for example, Notch signaling5) makes this assay a powerful tool with which to understand how signaling regulates cell behavior during embryonic development.

Imaging embryonic tissue in real-time is challenging over long periods of time. Here we present an assay for monitoring cellular and sub-cellular changes in chick spinal cord for long periods with high spatial and temporal resolution. This technique can be adapted for other regions of the nervous system and developing embryo.

開発神​​経上皮における細胞挙動の高解像度のライブイメージング

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has been heavily studied. While many imaging studies treat the hippocampus as a single unitary neuroanatomical structure, it is, in fact, composed of several subfields that have a complex three-dimensional geometry. As such, it is known that these subfields perform specialized functions and are differentially affected through the course of different disease states. Magnetic resonance (MR) imaging can be used as a powerful tool to interrogate the morphology of the hippocampus and its subfields. Many groups use advanced imaging software and hardware (&#62;3T) to image the subfields; however this type of technology may not be readily available in most research and clinical imaging centers. To address this need, this manuscript provides a detailed step-by-step protocol for segmenting the full anterior-posterior length of the hippocampus and its subfields: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus (DG), strata radiatum/lacunosum/moleculare (SR/SL/SM), and subiculum. This protocol has been applied to five subjects (3F, 2M; age 29-57, avg. 37). Protocol reliability is assessed by resegmenting either the right or left hippocampus of each subject and computing the overlap using the Dice&#39;s kappa metric. Mean Dice&#39;s kappa (range) across the five subjects are: whole hippocampus, 0.91 (0.90-0.92); CA1, 0.78 (0.77-0.79); CA2/CA3, 0.64 (0.56-0.73); CA4/dentate gyrus, 0.83 (0.81-0.85); strata radiatum/lacunosum/moleculare, 0.71 (0.68-0.73); and subiculum 0.75 (0.72-0.78). The segmentation protocol presented here provides other laboratories with a reliable method to study the hippocampus and hippocampal subfields in vivo using commonly available MR tools.

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The goal of this manuscript is to study the hippocampus and hippocampal subfields using MRI. The manuscript describes a protocol for segmenting the hippocampus and five hippocampal substructures: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus, strata radiatum/lacunosum/moleculare, and subiculum.

高解像度<em&gt;インビボ</em&gt; 3T磁気共鳴画像を用いたヒト海馬サブフィールドのためのマニュアルセグメンテーションプロトコル

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena are not well understood yet. In particular, the role of innervation in tooth development and regeneration is neglected.
Several in vivo studies have provided important information about the patterns of innervation of dental tissues during development and repair processes of various animal models. However, most of these approaches are not optimal to highlight the molecular basis of the interactions between nerve fibres and target organs and tissues.
Co-cultures constitute a valuable method to investigate and manipulate the interactions between nerve fibres and teeth in a controlled and isolated environment. In the last decades, conventional co-cultures using the same culture medium have been performed for very short periods (e.g., two days) to investigate the attractive or repulsive effects of developing oral and dental tissues on sensory nerve fibres. However, extension of the culture period is required to investigate the effects of innervation on tooth morphogenesis and cytodifferentiation.
Microfluidics systems allow co-cultures of neurons and different cell types in their appropriate culture media. We have recently demonstrated that trigeminal ganglia (TG) and teeth are able to survive for a long period of time when co-cultured in microfluidic devices, and that they maintain in these conditions the same innervation pattern that they show in vivo.
On this basis, we describe how to isolate and co-culture developing trigeminal ganglia and tooth germs in a microfluidic co-culture system.This protocol describes a simple and flexible way to co-culture ganglia/nerves and target tissues and to study the roles of specific molecules on such interactions in a controlled and isolated environment.

Co-cultures represent a valuable method to study the interactions between nerves and target tissues and organs. Microfluidic systems allow co-culturing ganglia and whole developing organs or tissues in different culture media, thus representing a valuable tool for the in vitro study of the crosstalk between neurons and their targets.

マイクロ流体共培養装置の使用歯胚神経支配の開発の分析

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of structural MRI in vivo is ultimately limited by physiological noise, including pulsation, respiration and head movement. Although imaging hardware continues to improve, it is still difficult to resolve structures on the millimeter scale. For example, the primary visual sensory pathways synapse at the lateral geniculate nucleus (LGN), a visual relay and control nucleus in the thalamus that normally is organized into six interleaved monocular layers. Neuroimaging studies have not been able to reliably distinguish these layers due their small size that are less than 1 mm thick.
The resolving limit of structural MRI, in a postmortem brain was tested using multiple images averaged over a long duration (~24 h). The purpose was to test whether it was possible to resolve the individual layers of the LGN in the absence of physiological noise. A proton density (PD)1 weighted pulse sequence was used with varying resolution and other parameters to determine the minimum number of images necessary to be registered and averaged to reliably distinguish the LGN and other subcortical regions. The results were also compared to images acquired in living human brains. In vivo subjects were scanned in order to determine the additional effects of physiological noise on the minimum number of PD scans needed to differentiate subcortical structures, useful in clinical applications.

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

Here we present a protocol to determine the minimum number images that needed to be registered and averaged to resolve subcortical structures and test whether the individual layers of the LGN could be resolved in the absence of physiological noise.

ヒト皮質下の高分解能構造磁気共鳴イメージング<I&gt;インビボ</I&gt;と死後

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible are badly known. Excitotoxicity, a process believed to contribute to neuron damage induced by both insults, is mediated by activation of glutamate receptors that promotes Ca2+ influx and mitochondrial Ca2+ overload. A substantial change in intracellular Ca2+ homeostasis or remodeling of intracellular Ca2+ homeostasis may favor neuron damage in old neurons. For investigating Ca2+ remodeling in aging we have used live cell imaging in long-term cultures of rat hippocampal neurons that resemble in some aspects aged neurons in vivo. For this end, hippocampal cells are, in first place, freshly dispersed from new born rat hippocampi and plated on poli-D-lysine coated, glass coverslips. Then cultures are kept in controlled media for several days or several weeks for investigating young and old neurons, respectively. Second, cultured neurons are loaded with fura2 and subjected to measurements of cytosolic Ca2+ concentration using digital fluorescence ratio imaging. Third, cultured neurons are transfected with plasmids expressing a tandem of low-affinity aequorin and GFP targeted to mitochondria. After 24 hr, aequorin inside cells is reconstituted with coelenterazine and neurons are subjected to bioluminescence imaging for monitoring of mitochondrial Ca2+ concentration. This three-step procedure allows the monitoring of cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to relevant stimuli as for example the glutamate receptor agonist NMDA and compare whether these and other responses are influenced by aging. This procedure may yield new insights as to how aging influence cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to selected stimuli as well as the testing of selected drugs aimed at preventing neuron cell death in age-related diseases.

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.

細胞内のCaの蛍光と生物発光イメージング<sup&gt; 2+</sup&gt;高齢者における海馬ニューロン

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

網膜リボンシナプスにおける膜受容体の高分解能定量的イムノゴールド分析

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. Transcytosis across the BBB regulates the delivery of hormones, metabolites, and therapeutic antibodies to the brain parenchyma. Here, we present a protocol that combines immunofluorescence of free-floating sections with laser scanning confocal microscopy and image analysis to visualize subcellular organelles within endothelial cells at the BBB. Combining this data-set with 3D image analysis software allows for the semi-automated segmentation and quantification of capillary volume and surface area, as well as the number and intensity of intracellular organelles at the BBB. The detection of mouse endogenous immunoglobulin (IgG) within intracellular vesicles and their quantification at the BBB is used to illustrate the method. This protocol can potentially be applied to the investigation of the mechanisms controlling BBB transcytosis of different molecules in vivo.

Here we present a microscopy-based protocol for high-resolution imaging and a three-dimensional reconstruction of the mouse neurovascular unit and blood-brain barrier using brain free-floating sections. This method allows for the visualization, analysis, and quantification of intracellular organelles at the BBB.

血液-脳関門の高分解能共焦点イメージング: イメージング、三次元、トランスサイトーシスの定量化

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

高解像度ボリューム イメージングのニューロンを蛍光使用排除法によってと専用マイクロ流体デバイス

高解像度ボリュームイメージングのニューロンを蛍光使用排除法によってと専用マイクロ流体デバイス