この作品は、とP30（博士ゲイリーオレゴン健康科学大学/ OHSUのバンカーに）国立衛生研究所（NIH）2 R15 GM061539-02（BASへ）を付与し、2 R15 NS40425-03（JEL）は、MH 66179によってサポートされていましたNS061800（OHSUの博士スーアイヒャーまで）​​。私たちは、海馬ニューロンの文化との広範なサポートのためにバーバラSmoodyに感謝し、博士。この原稿の重要な読書のためのブライアン·ロングとジェームズアブニー。

1。サンプルの調製<ol><li>標準的な分子生物学的技術を用いて、DCVSに標的photoconvertible又は光活性化キメラをコードするDNAを調製する。 注意：一つの可能​​性は、組織プラスミノーゲン活性化因子-Dendra2キメラ因子（tPA-Dendra2）をコードするDNAである。 Dendra2紫外光12に曝露されると緑色から赤色の発光に切り替えるphotoconvertibleタンパク質である。 </li><li>高性能＃1.5カバーの培養海馬ニューロンは、標準的なプロトコル13以下、〜5-10日のためにスリップ。 </li><li>カチオン性脂質試薬を用いて海馬ニューロンを現像トランスフェ。 注意：ウイルス媒介感染は、成熟した神経細胞のためのより効果的である。この代替アプローチは、他の箇所14で詳細に記載されている。 <ol><li> 〜1μgのDNAおよび最小必須培地（MEM）とカチオン性脂質試薬の4μLと250μLを含む第二の1.5mlチューブを250μlを含む1.5 mlチューブを準備しますMEMの。 </li><li> 5分のためのソリューションをインキュベートする。 </li><li>二つの溶液を混合し、さらに30分間、得られた混合物をインキュベートする。 </li><li>インキュベーション中、培地の数mlを含有する皿を37℃に温め調製</li><li>優しく温かい培地を含む皿に神経細胞を含むカバースリップを転送し、トランスフェクション混合物を追加します。 </li><li>そっとお皿を傾け、その後90分間37℃のインキュベーターに入れてください。 </li><li>彼らの &quot;ホームディッシュ」に神経細胞を戻し、〜12月18日時間を待つ。 </li></ol></li><li> 37℃に加温し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS、pH7.4）中4％パラホルムアルデヒド/ 4％スクロース中で45分間細胞を固定 注：PALM実験では、超微細構造の良好な保存を達成するために重要であり、免疫蛍光染色に使用される標準的なホルムアルデヒド固定プロトコルは、典型的には15不十分である。貧困層の構造的保存のための1つの重要な理由は、不十分であるFixation時間ホルムアルデヒド固定は、付加物形成およびタンパク質の架橋を伴い、後者のプロセスは非常に遅いので、16である。 45分固定は、蛍光の検出可能なoverfixation誘発性の損失でこの問題を緩和するのに役立ちます。 </li><li>洗浄カバーをろ過し、PBSで〜10倍にスリップ。 注意：これは蛍光汚染物質を低減します。サンプル画像は、比較的迅速に固定後。光を通さない容器内に濾過したPBS中で4℃、その間、店舗細胞。 </li><li>濾過したPBS中のチャンバー内のニューロンを含む、マウントカバースリップ。 注：サンプルは、全内部反射蛍光（TIRF）ベースの照明を実現するために、ガラスの屈折率よりも低い屈折率を用いて、PBSのように、水性媒体中に取り付けなければならない。唯一のカバースリップ近位のフルオロフォアが励起され、バックグラウンドの蛍光17の大きな関連するドロップがあるので、TIRFベースの照明は非常に便利です。 </li></ol> 2。画像取得&lt;/ pの&gt; <ol><li>超解像イメージングシステムの電源をオンにします。 <ol><li>アークランプをオンにします。 </li><li>への（電源のリモートスイッチ上の）「システム/ PC」と「成分」のスイッチフリップ「ON」にしてください。 </li><li> （顕微鏡制御後のタブレット/ドッキングステーションが点灯）コンピュータの電源を入れます。 注：ドッキングステーションは、光学系と光路の多くの属性、対物レンズと焦点特に選択を制御および監視するために使用することができる。 </li><li>ダブルソフトウェアのアイコンをクリックして、ログインダイアログの「システムの起動」オプションを選択します。 </li></ol></li><li>サンプルを調べます。 <ol><li>レーザー安全キャビネットの前面と上部アクセスパネルを開きます。 </li><li>舞台と目標をアクセスするために、透過光の腕を傾ける。 </li><li>アルファプランアポクロマート100X開口数/ NA = 1.46（TIRF）客観的に油を入れてください。 注：63X高NA対物レンズは100Xの代わりに使用することができる。 </li><li>ステージにサンプルをマウントし、目を上げるサンプルに向けてE目標。 </li><li>ドッキングステーションのXYZ関数を用いてレンズ位置を監視する。レンズは、焦点の球場（ 例えば 、Z〜2.50ミリメートル）のときに停止します。 </li><li>完全にアクセスパネルを閉じます。 注意：レーザー安全に係合する。 </li><li>微調整見つけるタブに接眼レンズとボタンを使用して焦点。 注意：タブは、アーク灯ベース照明を作り出すのボタンへのアクセスを提供し、接眼レンズで試料を直接観察を容易に検索します。同様に、取得]タブには、レーザーベース照明を生産し、カメラによる画像取り込みを促進するツールにアクセスできます。 <ol><li>探しタブに移動し、選択した「トランスオン。」 </li><li>眼のエキスパンション·シンボルをクリックします。 注意：これは、光路の概略が表示されます。光パスの属性は、左図に適切なアイコンをクリックするか、ドッキングステーション上のタッチスクリーンを使用することによって変更することができる。例えば、フィルタDendra2からの発光を観察する場合に適切な反射器は、リボルバーアイコンを使用して選択することができる。 </li><li>接眼レンズに見て、ガイドとして、ドッキングステーションを使用して焦点に細胞をもたらす。 注：海馬神経細胞がトランスフェクトすることは困難であるため、サンプルでは、​​非常にまばらに蛍光細胞が設定されます、そして、それは、このように反射した照明を使用して焦点を合わせるために少し注意が必要です。この場合、ガイドとして透過照明とドッキングステーションのz読み取りを使用する。 </li><li>ピントを合わせたあと、「オフ」光を切り替える。 </li></ol></li></ol></li><li>かなり明るい点状の蛍光を示し、良好な健康状態の指標である古典的な形態を有する細胞を特定します。 <ol><li>反射光とDendra2から緑色の発光を観察するためのフィルタの適切なを選択します。 </li><li>低強度の励起光を用いてDendra2キメラを発現する細胞のカバースリップをスキャンする。 </li></ol></li><li> ACQに切り替えるuisitionタブ。 <ol><li>適切に設計されたか、簡単に修正されるPALM取得フィギュレーションをロードするために &quot;実験マネージャ」を使用してください。 注：そのような実験が存在しない場合には、ガイドとして次の設定を使用して起動実験的な構成を設計します。レーザーパワースライダー：405 nmの（50 mWのレーザー用〜0.01％）; 488 nmの（100 mWのレーザーのための〜10％）; 561 nmの（100 mWのレーザーのための〜40％）;露出時間：〜50ミリ秒;カメラゲイン：〜200;多次元買収：時系列（サイクル= 30,000間隔= 0）;トラック：落射照明と488 nmであり、TIRFベースの照明と561ナノメートル（ステップ2.5.1を参照のこと）;目的：100X（NA = 1.46）; TIRF角スライダー：入射角〜67-72°;ピクセルサイズ：100ナノメートル;視野：TIRF（代替選択肢は、より高いレーザー強度が得られるし、漂白するのがより困難である蛍光プローブのために使用されます）。 </li><li>ポップアップメニューがレーザーのスイッチを入れるの問い合わせと表示されたら「はい」をクリックしてください。 </li></ol></li><li>イメージを持って来るカメラ平面でのフォーカスへの細胞の。 <ol><li> 488nmの落射照明レーザートラックを選択してください。 注意：トラックは、撮像中に使用されるビームの構成です。ここで、トラック名、カメラに渡される発光を生成する励起波長によって決定される。例えば、561 nmのトラックは405と561 nmのレーザーラインの両方を使用しますが、フィルターキューブは、カメラへの561 nmの光で励起さphotoconverted Dendra2から発光のみを通過させる。 </li><li> 「連続」取得ボタンを使用してカメラの細胞の画像の焦点を合わせる。 </li></ol></li><li>従来の広視野画像を収集しています。 <ol><li> 「スナップ」ボタンを使用します。 </li><li> 「ファイル」メニューに移動し、選択して画像を保存」で保存/保存します。 &quot; </li></ol></li><li> TIRFベース照明をセットアップします。 <ol><li> 488トラックを選択し、EPI / TIRFボタンを使用して、「全反射」に切り替えます。 </li><li> 「連続」の取得を選択します。 </li><li> Tを調整彼は、TIRFベース照明スライダー。 注：TIRF背景の突然の黒ずみがある場合に達成されるAND検体がONE面18に集束することができる。新機能は、サン​​プルに分かれて集中を通じて明らかになる場合は、TIRFに焦点面を1面のみが存在するため、入射角が低すぎる。 </li><li>ダブル405 nmのレーザーで561トラックを使用した全反射角を確認して「オフ」 </li><li> PALM実験を開始する前に」の「背面405 nmのレーザーをオンにします。 </li></ol></li><li> PALMデータを収集。 <ol><li> 「実験を開始します。「ヒット 注：必要に応じて、「オンライン処理オプション」タブを開き、生のデータ収集中に再構成されたPALM画像を監視する（実験を開始する前に）「オンライン処理PALM」と「フィットGauss2D &quot;をチェック。これは、データの品質および比較的時間のかかるデータ収集プロセスを継続従って価値の評価を容易にする。 </li><li>視覚的に光変換を監視します。 </li><li> 405 nmの（通常は〜万RAW画像の取得後）（photoconverting）レーザーDendra2光変換減少するにつれての強度を高める。 </li><li>光変換が増加した場合の実験を続ける。それ以外の場合は、「停止」、現在のステップボタンを押すことで（データの損失なし）の実験を停止します。 </li><li>データ収集が（〜15分後）が完了したときの画像を保存します。 </li></ol></li></ol> 3。画像処理、表示、および分析<ol><li>オンライン処理がない場合には、RAW画像を処理するには、ディスクに保存されたこと。 <ol><li> 、[処理]タブをクリックし、メソッドタブを開き、選択し、 &quot;手のひらを。&quot; </li><li> 4サブオプションから再び「PALM」を選択します。 </li><li>オープンは、[ファイル]メニューに移動し、関心のあるファイルを表示し、ヒット &quot;を選択します。&quot; </li><li>ヒット」が適用されます。 &quot; 注意：これは、デフォルトの最適ピーク/蛍光体の発見とピークのローカライズを開始しますアドオン。必要に応じて、ピークはまた、「PAL-グループ」タブを使用してグループ化することができます。グループ化は、ピーク座標が十分に類似している場合は、単一の分子に複数の連続した​​フレームに表示されたピークが割り当てられます。また、データは、ソフトウェアのモデルベースの​​ドリフト配置オプションを使用して、サンプルのドリフトを補正することができる。 </li></ol></li><li>ピークローカライズされたデータに難局在化し、不十分なサンプリングされたコンポーネントを除外する。 <ol><li>ローカリゼーション精度で蛍光団を破棄、σ、&gt;「PAL-FILTER」ツールを使用して35ナノメートル。 </li><li>ピーク間の平均距離の分野で蛍光団を破棄し、D、直径の小胞を解決するには大きすぎる、D. <ol><li>ローカリゼーション精度ヒストグラムから、σ、平均ローカライズ精度を抽出します。 </li><li> = D =σに基づいて、Dの最大許容値を計算し、20 R解像度近似に具体化として、シャノン·ナイキストは、19を criteron[（2.35σ）2 +（2d）の2] 1/2。 </li><li>半径D / 2の円内πD2 /（4D 2）近隣諸国よりも少ないに囲まれたピークを削除するには」PALMの外れ値を削除」ツールでしきい値を設定します。 </li></ol></li><li> 「PAL-レンダリング」ツールを使用してPALM画像に加工PALMデータを変換する; 図1を参照してください。 </li><li> 「プロファイル」機能を選択することで、サイズと分離を定量化する。 <ol><li>関連する行とテーブルオプションをチェックして、画像内の所望の方向に沿って線を引きます。 </li><li>最大半減の強度で完全な幅を決定することにより、直径を定量化する。 </li><li>強度プロファイルのピーク·ツー·ピークの間隔を決定することによって分離を定量化する。 </li></ol></li></ol></li></ol>

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著者らは、開示することは何もありません。

PALMおよび関連する超解像蛍光顕微鏡技術は、最近、光学顕微鏡および電子顕微鏡（EM）22-24の良好に確立された形態に貴重な補体として浮上している。手のひらの正の属性は、比較的単純なサンプル調製と最小限のサンプル摂動が含まれています。原理的には、PALMはまた、生きた細胞を研究するために使用することができる。おそらく、PALMの主負属性が有意に生細胞におけるより高...

細胞プロセスの数は、特定の細胞内の宛先への生体分子の正確で効率的な小胞が介在する人身売買に依存しています。一顕著な例は、神経細胞体における生物発生の現場から、潜在的に遠位の前と後シナプスのサイト1へのシナプスの構成成分の長期であった、小胞を介した送達に先行されるシナプスアセンブリである。 蛍光顕微鏡は、小胞輸送を研究する強力かつ一般的な方法です。技術の強みは、感度、特異性、およびライブイメージング2との互換性があります。残念ながら、比較的最近まで、技術は〜250ナノメートルより小さい寸法の構造の研究を妨げる一つの大きな弱点、回折限界分解能2、苦しんでいる。近年、蛍光顕微鏡の横解像度は、超解像蛍光マイルの導入により回折限界を超えパーム3などcroscopy技術。手のひらの横方向の解像度が、数十ナノメートルは、通常、50〜250ナノメートル〜4の範囲に寸法を有する小胞の研究に最適です。これは、特定の細胞内のサイトへの人身売買のいくつかの側面を含む小胞の以前にアクセス不能な属性、のスペクトルを解明するために、その無数の強みと、蛍光を使用するようになりましたが可能である。 Palmは実装するのは簡単ではなく、成功した戦略は、多くの場合、研究対象のシステムのタイプに合わせて調整する必要があります。ここでは、小胞構造の掌の研究を実装する方法を説明し、私たちは海馬ニューロンにおけるDCVS例のための我々のアプローチの有効性を示す。特に、我々は、海馬ニューロンにおけるシナプスへのDCVSの人身売買は、DCVクラスタ5-8によって媒介されるという仮説に対応するために手のひらを使用しています。 Nの開発にシナプス小胞へのクラスタ媒介人身売買euronsそれは急速なシナプスの安定化およびアセンブリ9,10を容易にすることができるので、魅力的な可能性である。 DCVSのクラスタ化された人身売買の支持者は、クラスタリング6を支持する証拠として、外因性のDCV貨物を保有シナプス外蛍光涙の大見かけの大きさを挙げている。しかしながら、これらの斑点は、クラスタリングから生じるものからの回折に起因する特徴的なサイズ効果に適していない回折限界の蛍光顕微鏡技術を用いて生成された画像に現れる。 この問題を解決するために、我々は、従来の広視野蛍光とDCVSを対象とキメラを表現する海馬ニューロンの手のひらの画像を収集した。これらの画像の解析は、従来の画像中の推定シナプス外のDCVクラスターの&gt; 92パーセントが80 nmのPALM画像内の（個々のDCVサイズ）11涙点として解決されることを明らかにした。 hippoca開発にDCVSに適用されるしたがって、これらのデータは、大部分のクラスタリング仮説を無効MPALニューロン。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1105">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Zeiss PALM</td>
			<td style="width:169px;">Carl Zeiss, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">Elyra PS.1</td>
			<td style="width:572px;">With Zeiss Efficient Navigation (ZEN) software and fluorescence filter Set 77 HE GFP/mRFP/Alexa633&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:245px;">Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td style="width:169px;">Life Technoligies</td>
			<td style="width:119px;">11668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Minimum Essential Medium</td>
			<td style="width:169px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11095-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:169px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:245px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:169px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">19208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Sucrose</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S-8501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">growth glass coverslips 18mm 1.5D</td>
			<td style="width:169px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC0059095</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution imaging of neuronal dense-core vesicles

<html>蛍光の検出は、現代の生物学的および医学的用途に使用多くの広く利用され、急速に進展顕微鏡技術の基盤を提供します。蛍光の強さは、その感度、特異性、およびライブイメージングとの互換性があります。残念ながら、蛍光顕微鏡の従来の形態は、約250ナノメートルよりも小さな寸法を有する構造の研究を妨げる撮像面における1つの主要な弱点、回折限界分解能、苦しむ。最近では、この制限は、このような光活性化局在化顕微鏡法（PALM）のような超解像蛍光顕微鏡技術の導入により克服された。その従来の対応とは異なり、Palmは数十ナノメートルの横方向の解像度を有する画像を生成することができる。それは、細胞の構造と組織の以前にアクセス不能な属性のスペクトルを解明するために、その無数の強みと、蛍光を使用するようになりましたが可能である。 _content &quot;&gt;残念ながら、Palmは、実装が簡単ではありません、そして成功した戦略は、多くの場合、研究対象のシステムのタイプに合わせて調整する必要があります。この記事では、我々は固定、培養神経細胞内小胞構造の単色ヤシの研究を実装する方法を示しています。 PALMは、理想的には50〜250ナノメートル〜から。我々のアプローチにおける重要なステップが含ま通常、ある範囲の寸法を有し、小胞の研究に適しているとまばらにサンプリングされたRAW画像を集め、photoconvertible（赤と緑）小胞の貨物のキメラで神経細胞を標識し超解像顕微鏡システム、及び高解像度のPALM画像を生成する生の画像を処理する。また反論培養海馬ニューロンにおける高密度コア小胞（DCVS）の非常に良好に解像画像を提示することによって、我々のアプローチの有効性を実証DCVSのシナプス人身売買は、DCVクラスタで主に媒介されるという仮説。

図1は、撮像処理の一端生成物を示す。このPALM画像では、ローカライズされたフルオロフォアの横座標は、重心の表示モードを使用して示されており、関連したDCVの超解像は、ガウス表示モードを使用して示されている。 図2Aは、類似広視野およびTPA-Dendra2を表現体外海馬ニューロンにおける 8日間の相馬と近位プロセスの手のひら...

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Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

我々は、光活性化ローカライゼーション顕微鏡（PALM）ベースの固定、培養神経細胞内の小胞の研究を実装する方法について説明します。我々のプロトコルの主要な構成要素は、photoconvertibleキメラで小胞を標識する超解像顕微鏡システムでまばらにサンプリングされた生の画像を収集し、超解像画像を生成するために生の画像を処理挙げられる。

神経高密度コア小胞の超解像イメージング

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

super-resolution-imaging-of-neuronal-dense-core-vesicles

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.6K ビュー.  Lewis & Clark College. 我々は、光活性化ローカライゼーション顕微鏡（PALM）ベースの固定、培養神経細胞内の小胞の研究を実装する方法について説明します。我々のプロトコルの主要な構成要素は、photoconvertibleキメラで小胞を標識する超解像顕微鏡システムでまばらにサンプリングされた生の画像を収集し、超解像画像を生成するために生の画像を処理挙げられる。 

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In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

Cの生体内神経カルシウムイメージングでエレガンス

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

神経科学

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of stress-induced plasticity is the dauer stage of C. elegans. Dauers are an alternative developmental larval stage formed under conditions of low concentrations of bacterial food and high concentrations of a dauer pheromone. Dauers display extensive developmental and behavioral plasticity. For example, a set of four inner-labial quadrant (IL2Q) neurons undergo extensive reversible remodeling during dauer formation. Utilizing the well-known environmental pathways regulating dauer entry, a previously established method for the production of crude dauer pheromone from large-scale liquid nematode cultures is demonstrated. With this method, a concentration of 50,000 - 75,000 nematodes/ml of liquid culture is sufficient to produce a highly potent crude dauer pheromone. The crude pheromone potency is determined by a dose-response bioassay. Finally, the methods used for in vivo time-lapse imaging of the IL2Qs during dauer formation are described.

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

CのDauer固有の神経リモデリングのin vivoイメージングエレガンス

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the experimental time, and increases the number of animals that are utilized per study. This limitation specifically impacts protocols such as calcium imaging that require prolonged pre-incubation with bath-applied dyes. Exponential bacterial growth within 3 - 4 h after slicing is tightly correlated with a decrease in tissue health. This study describes a method for&#160;limiting the proliferation of bacteria in acute preparations to maintain viable neuronal tissue for prolonged periods of time (&#62;24 h) without the need for antibiotics, sterile procedures, or tissue culture media containing growth factors. By cycling the extracellular fluid through UV irradiation and keeping the tissue in a custom holding chamber at 15 - 16 &#176;C, the tissue shows no difference in electrophysiological properties, or calcium signaling through intracellular calcium dyes at &#62;24 h postdissection. These methods will not only extend experimental time for those using acute neuronal tissue, but will reduce the number of animals required to complete experimental goals, and will set a gold standard for acute neuronal tissue incubation.

Once removed from the body, neuronal tissue is greatly affected by environmental conditions, leading to eventual degradation of the tissue after 6 - 8 h. Using a unique incubation method, which closely monitors and regulates the extracellular environment of the tissue, tissue viability can be significantly extended for &#62;24 h.

電気生理学およびカルシウムイメージングのための急性神経組織の長期のインキュベーション

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and columns to facilitate brain wiring during development and information processing in developed animals. Postsynaptic neurons elaborate dendrites in type-specific patterns in specific layers to synapse with appropriate presynaptic terminals. The fly medulla neuropil is composed of 10 layers and about 750 columns; each column is innervated by dendrites of over 38 types of medulla neurons, which match with the axonal terminals of some 7 types of afferents in a type-specific fashion. This report details the procedures to image and analyze dendrites of medulla neurons. The workflow includes three sections: (i) the dual-view imaging section combines two confocal image stacks collected at orthogonal orientations into a high-resolution 3D image of dendrites; (ii) the dendrite tracing and registration section traces dendritic arbors in 3D and registers dendritic traces to the reference column array; (iii) the dendritic analysis section analyzes dendritic patterns with respect to columns and layers, including layer-specific termination and planar projection direction of dendritic arbors, and derives estimates of dendritic branching and termination frequencies. The protocols utilize custom plugins built on the open-source MIPAV (Medical Imaging Processing, Analysis, and Visualization) platform and custom toolboxes in the matrix laboratory language. Together, these protocols provide a complete workflow to analyze the dendritic routing of Drosophila medulla neurons in layers and columns, to identify cell types, and to determine defects in mutants.

Here, we show how to analyze dendritic routing of Drosophila medulla neurons in columns and layers. The workflow includes a dual-view imaging technique to improve the image quality and computational tools for tracing, registering dendritic arbors to the reference column array and for analyzing the dendritic structures in 3D space.

列およびレイヤーで樹状形態を分析します

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

脳スライスにおける神経樹状突起における 2 光子カルシウム イメージング

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans

Toxicity of misfolded proteins and mitochondrial dysfunction are pivotal factors that promote age-associated functional neuronal decline and neurodegenerative disease across species. Although these neurotoxic challenges have long been considered to be cell-intrinsic, considerable evidence now supports that misfolded human disease proteins originating in one neuron can appear in neighboring cells, a phenomenon proposed to promote pathology spread in human neurodegenerative disease.
C. elegans adult neurons that express aggregating proteins can extrude large (~4 &#181;m) membrane-surrounded vesicles that can include the aggregated protein, mitochondria, and lysosomes. These large vesicles are called &#8220;exophers&#8221; and are distinct from exosomes (which are about 100x smaller and have different biogenesis). Throwing out cellular debris in exophers may occur by a conserved mechanism that constitutes a fundamental, but formerly unrecognized, branch of neuronal proteostasis and mitochondrial quality control, relevant to processes by which aggregates spread in human neurodegenerative diseases.
While exophers have been mostly studied in animals that express high copy transgenic mCherry within touch neurons, these protocols are equally useful in the study of exophergenesis using fluorescently tagged organelles or other proteins of interest in various classes of neurons.
Described here are the physical features of C. elegans exophers, strategies for their detection, identification criteria, optimal timing for quantitation, and animal growth protocols that control for stresses that can modulate exopher production levels. Together, details of protocols outlined here should serve to establish a standard for quantitative analysis of exophers across laboratories. This document seeks to serve as a resource in the field for laboratories seeking to elaborate molecular mechanisms by which exophers are produced and by which exophers are reacted to by neighboring and distant cells.

Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans

This protocol describes approaches for detection and quantitation of large aggregate and/or organelle extrusions (~4 &#181;m) produced by C. elegans cells in the form of membrane-bound exophers. We describe strains, growth conditions, scoring criteria, timing, and microscopy considerations needed to facilitate dissection of this debris expulsion mechanism.

C.エレガンスにおける大エキソファー小胞における生体内ニューロン集合体およびオルガネラ押出におけるスコアリングのための定量的アプローチ

Toxicity of misfolded proteins and mitochondrial dysfunction are pivotal factors that promote age-associated functional neuronal decline and ...

Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. Imaging studies are widely used to investigate their function and plasticity in physiological and pathological conditions. Because of their size and structure, localization studies of proteins require high-resolution imaging techniques. In this protocol, we describe a procedure to study in primary neurons the co-localization of target proteins with synaptic markers at a super-resolution level using structured illumination microscopy (SIM). SIM is a patterned-light illumination technique that doubles the spatial resolution of wide-field microscopy, reaching a detail of around 100 nm. The protocol indicates the required controls and settings for robust co-localization studies and an overview of the statistical methods to analyze the imaging data properly.

This protocol shows how to employ super-resolution microscopy to study protein co-localization in primary neuronal cultures.

一次ニューロンにおけるタンパク質とシナプスマーカーの共局在化を研究する超分解能イメージング

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are optimized to minimize their impact on behavior. This is first achieved by using a holder that minimizes movement hindrances. The back of the fly&#8217;s head is glued to this holder at an angle that allows optical access to the whole brain while retaining the fly&#8217;s ability to walk, groom, smell, taste and see. The back of the head is dissected to remove tissues in the optical path and muscles responsible for head movement artefacts. The fly brain can subsequently be imaged to record brain activity, for instance using calcium or voltage indicators, during specific behaviors such as walking or grooming, and in response to different stimuli. Once the challenging dissection, which requires considerable practice, has been mastered, this technique allows to record rich data sets relating whole brain activity to behavior and stimulus responses.

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method specifically tailored to image the whole brain of adult Drosophila during behavior and in response to stimuli. The head is positioned to allow optical access to the whole brain, while the fly can move its legs and the antennae, the tip of the proboscis, and the eyes can receive sensory stimuli.

行動と刺激反応の間に全脳イメージングのための成人ショ ウジョウバエメラノガスター を準備する

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...

ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the different ROS, hydrogen peroxide (H2O2) is best characterized with respect to roles in cellular signaling. H2O2 has been implicated during the development in several species. For example, a transient increase in H2O2 has been detected in zebrafish embryos during the first days following fertilization. Furthermore, depleting an important cellular H2O2 source, NADPH oxidase (NOX), impairs nervous system development such as the differentiation, axonal growth, and guidance of retinal ganglion cells (RGCs) both in&#160;vivo and in vitro. Here, we describe a method for imaging intracellular H2O2 levels in cultured zebrafish neurons and whole larvae during development using the genetically encoded H2O2-specific biosensor, roGFP2-Orp1. This probe can be transiently or stably expressed in zebrafish larvae. Furthermore, the ratiometric readout diminishes the probability of detecting artifacts due to differential gene expression or volume effects. First, we demonstrate how to isolate and culture RGCs derived from zebrafish embryos that transiently express roGFP2-Orp1. Then, we use whole larvae to monitor H2O2 levels at the tissue level. The sensor has been validated by the addition of H2O2. Additionally, this methodology could be used to measure H2O2 levels in specific cell types and tissues by generating transgenic animals with tissue-specific biosensor expression. As zebrafish facilitate genetic and developmental manipulations, the approach demonstrated here could serve as a pipeline to test the role of H2O2 during neuronal and general embryonic development in vertebrates.

This protocol describes the use of a genetically encoded hydrogen peroxide (H2O2)-biosensor in cultured zebrafish neurons and larvae for assessing the physiological signaling roles of H2O2 during nervous system development. It can be applied to different cell types and modified with experimental treatments to study reactive oxygen species (ROS) in general development.

ニューロン開発中のROSライブ細胞イメージング

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.