この作品は、健康グラントNS-024572（RSW）の米国国立研究所によってサポートされていました。

1。超生体色素で準備を染色<ol><li>ガーターヘビ解剖プロトコルの場合スチュワートらを参照してください。5とテンら 6爬虫類組織は、より長い時間、低温度に保た少ない細菌汚染、（下記参照）で、生理学的のまま。哺乳動物組織は、通常、室温以上に維持される。 </li><li>リソソーム生体色素染色のために、冷たい爬虫類リンゲル液1:5,000（0.2μM）に色素を溶解する。 15分間4℃でインキュベートする。冷たいリンゲルで数回洗浄します。なるべく早く画像。 </li><li>塩化カリウム刺激を使用して、FM1-43染色のために、高塩化カリウムリンガー1:500（7μM）に色素を希釈する。 30〜60秒、最大4℃でインキュベートする。 〜1分/すすぎ、冷たいリンガーで素早く3回洗浄する。なるべく早く画像。 </li><li>高張（ショ糖）の刺激を使用して、FM1-43染色のために、上記のように0.5 Mショ糖リンガー色素を希釈する。 4＆＃でインキュベートする176; 2〜5分間のためのC。冷たいリンガー上記工程1.3と同様に洗浄する。なるべく早く画像。 </li><li> FM1-43染色のために電気刺激を介して、テンら 6を参照して簡単に説明すると、製剤は、生理食塩水、色素を含有する皿が配置されている。神経を200秒の矩形パルス（〜7 V、30 Hzで、18秒）のあらかじめプログラムされた電車で刺激される。冷たいリンガー上記工程1.3と同様に洗浄する。なるべく早く画像。 </li></ol> 2。イメージングのための準備を設定します<ol><li>東洋近隣の構造は、顕微鏡対物レンズにできるだけ近くなるように調製。 </li><li>倒立顕微鏡を使用する場合は、その底部の薄い丸いカバースリップを含有するチャンバを利用する。一般的に、撮影室が中心で25ミリメートル、直径1位厚ガラスカバースリップで、薄いステンレス製の底部を持っている必要があります。正立顕微鏡を使用する場合は、底部カバーガラスは必要なく、有用であるれていない透過光による画像撮影を可能にするために（ 例えば微分干渉コントラスト、DIC）は、試験片の方向を、目的のオブジェクトを検索します。 </li><li>可能な限り最高の3D解像度を得るために、適切な目標を選択します。開口間のトレードオフ（NA）、作動距離、倍率、レンズの種類（乾燥、水溶性および油浸）がある。組織培養物のような薄い準備のため、オイルの目標は最高です。正立顕微鏡を使用して、水性浴上にカバースリップをフロートし、カバースリップの上部と客観の間の液浸油を使用しています。 </li><li>デコンボリューションソフトウェアを使用する場合、ベンダは、特定の目的のための所定の点広がり関数（PSFの）を提供するかもしれない。そのような情報が提供されていない場合、またはサポートされていない目的が選択された場合、蛍光マイクロドットまたは類似の回折限界のオブジェクト7,8を撮影したPSFを決定する。 </li></ol> 3。目的のフィールドの深度およびIMAの数を確立タイムラプスフレームあたり希望GES <ol><li>彼らはz方向に移動するように関心のある構造の移動や相互作用が消失するか、焦点の外に出ないように、フィールドの全深さを選択します。 Z-フィールドは、わずかに撮像されている細胞または細胞プロセスの垂直寸法を超えている必要があります。脊椎動物のモータ端子の場合は、15から20程度が一般的である。 </li><li>焦点の各増分に必要なz軸ステップを計算します。 z軸に沿った分解能は、対物レンズの特性に依存して変化する;それはxy平面の解像度の約4分の1である。共焦点イメージングまたはデコンボリューションソフトウェアのいずれかが使用される場合、z軸の解像度が向上する。 z方向5における意図的なオーバーサンプリングすることにより、最終解像度を向上させるだけでなく、下記の3.3のステップを参照してください。典型的なステップ間隔は40-100Xの目的のため400-1,500 nmの範囲である。光が各z段階の画像との間でオフシャッターべきである。 </li><li> zスタックあたりの画像数を選択し、すなわち、所望の被写界深度は、分割されたステップ間隔による。典型的なzスタックが完了するまでの時間は1〜10秒です。高速移動体（100ナノメートル/秒）は、各画像面は、わずかに異なる時刻に対応するので、3D画像スタックにぼやけて見えることができる。また、それぞれの追加のイメージは光退色し、可能な光毒性（説明を参照）に貢献しています。どちらの状況が関係する場合は、スタックごとに少ない画像を収集するために、より大きなZ-ステップを選択します。画像補間ソフトウェア（以下のステップ6.3）を使用して、後で補う。 </li></ol> 4。タイムラプスフレームレートを選択します。 スムーズな動き、相互作用または融合現象9などの経時変化を解決するだけで十分である割合を実験によって選択します。オーバーサンプリングは、不必要に光への露出を増加させながらサンプリングの下で​​は、モーションアーチファクト（サンプリング誤差）が生じることがあります。単一の長いシーケンスまたは同じ調製、比較的小さな総時間間隔でそれぞれの（からのいくつかの反復配列のいずれかを収集する<eM&gt;例えば10時間点X 30秒間隔= 5分）。可能な場合は、およそ存在する場合、製剤全体のドリフトを含め、移動速度を推定するために継続的なエピ蛍光照明との準備を表示します。 5。特定の調製のためのすべてのライブイメージングを完了爬虫類の製剤は、一般的に冷却し、より長い場合には、約1〜2時間、堅調に推移。 6。、所望の用途に応じてデータを分析<ol><li>すべての生データファイルを保持します。デジタルストレージは通常は問題ありませんが、処理時間があっても、高速のパーソナルコンピュータまたはワークステーションと有意である。関心のある領域へのこの理由のために、作物のイメージ[ROI]。関心領域全体が全時間経過時にトリミングされたウィンドウ内にあることを保証する。 </li><li>デコンボリューション画像は、適切なソフトウェアと適切な点広がり関数を用いてスタック。その解像度が向上して確認しているというアーティファクトによって生成されていないデコンボリューションアルゴリズム。 図3は、例示的な画像を示す。 </li><li> z軸見かけの解像度を拡大する補間アルゴリズムを使用してください。見かけ0.25μmの分離への実際1.5ミクロンの像面分離から6Xの拡大が示唆されている。あるいは、いくつかのオーバーサンプリングの組み合わせ（ステップ3.2）および補間を使用しています。 </li><li>所望であればコントラスト、明るさ、ノイズフィルタリング、光退色および他の典型的な画像処理調整を行う。画像操作基準は、ほとんどの科学的研究のために、それは、同じ修正がスタック内の異なる時点で両方、すべての画像に適用することが適切であることを指示する。特定の調整の結果、すべての画像9の中で評価されるべきである。 </li><li>データのエクスポートのための特定の表示モードを選択します。最も簡単な表示が緑、赤または赤青のアナグリフ（ 図3の例）、ステレオペア、または交互のいずれかを使用してステレオビデオですRIGH /左シャッターメガネとTアイフレーム。アナグリフは、単一色に制限されています。 z軸視覚解像度を向上させるために、所望であれば明ら​​かな画像深度を向上させる。 </li><li>様々なフィルタリングと画像強調技術を試してみてください。例えば、ラプラシアンフィルタ処理は、バックグラウンドの上の小さな構造のコントラストを向上させることが有用である。周辺の明るさを低減しつつ実行されているウィンドウの中心の画素の輝度が向上する。いくつかのフィルタリング方法を組み合わせてうまく機能しないことに注意してください。 </li><li>経時的な製剤の実質的な動きがある場合、ドリフト補正を適用する。このような動きは、薬は、活動電位とシナプス電位を抑制するために添加してもして、筋肉を生きているでは一般的です。ピクセル合わせアルゴリズム（ 例えば 。IMARIS、アドビ後遺症、ImageJのためTurboRegプラグイン）は、タイムラプス画像を整列させ、減少させることができるが、通常は完全に、このような運動を排除しない。 </li></ol>

<ol>
	<li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+microscopy-tips+and+tools.">Live-cell microscopy-tips and tools.</a> J. Cell Sci. 122 (6), 753-767 (2009).</li><li>Tinevez, J. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+method+for+measuring+phototoxicity+of+a+live+cell+imaging+microscope.">A quantitative method for measuring phototoxicity of a live cell imaging microscope.</a> Meth. Enzymol. 506, 291-309 (2012).</li><li>Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+evaluating+colocalization+in+biological+microscopy.">A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 300, (2011).</li><li>Snapp, E. L., Hegde, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+and+evaluation+of+FRETexperiments+to+measure+proteinproximities+in+cells.">Rational design and evaluation of FRETexperiments to measure proteinproximities in cells.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. 17, (2006).</li><li>Stewart, R. S., Teng, H., Wilkinson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late"+macroendosomes+and+acidic+endosomes+in+vertebrate+motor+nerve+terminals.">Late" macroendosomes and acidic endosomes in vertebrate motor nerve terminals.</a> J. Comp. Neurol. 520, 4275-4293 (2012).</li><li>Teng, H., Lin, M. Y., Wilkinson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macroendocytosis+and+endosome+processing+in+snake+motor+boutons.">Macroendocytosis and endosome processing in snake motor boutons.</a> J. Physiol. 582, 243-262 (2007).</li><li>McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+by+deconvolution+microscopy.">Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy.</a> Methods. 19, 373-385 (1999).</li><li>Swedlow, J. R., Platani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+using+wide-field+microscopy+and+deconvolution.">Live cell imaging using wide-field microscopy and deconvolution.</a> Cell Struct. Funct. 27, 335-341 (2002).</li><li>Cromey, D. W., Taatjes, D. J., Roth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+images+are+data:+and+should+be+treated+as+such.">Digital images are data: and should be treated as such.</a> Methods Mol. Biol. 931, 1-27 (2013).</li><li>Teng, H., Wilkinson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin-mediated+endocytosis+near+active+zones+in+snake+motor+terminals.">Clathrin-mediated endocytosis near active zones in snake motor terminals.</a> J. Neurosci. 20 (21), 7986-7993 (2000).</li><li>Teng, H., Cole, J. C., Roberts, R. L., Wilkinson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+active+zones:+hot+spots+for+endocytosis+in+vertebrate+nerve+terminals.">Endocytic active zones: hot spots for endocytosis in vertebrate nerve terminals.</a> J. Neurosci. 19 (12), 4855-4866 (1999).</li><li>Tan, T. T. T., Khaw, C., Ng, M. M. L., Mendez-Vilas, A., Diaz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+recent+advances+in+live+cell+bioimaging.">Challenges and recent advances in live cell bioimaging.</a> Microscopy: Science, Technology, Applications and Education. , 1495-1505 (2010).</li><li>Verbrugghe, K. J. C., Chan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+C.+elegans+embryos+using+an+epifluorescent+microscope+and+open+source+software.">Imaging C. elegans embryos using an epifluorescent microscope and open source software.</a> J. Vis. Exp. (49), (2011).</li></ol>

著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。

4Dイメージングの最も重要な側面は、露光の期間と強度の管理である。光退色は、画像の信号対雑音比を減少させ、フルオロフォアの選択を含む種々の要因に応じて、問題であってもなくてもよい。生体組織（光毒性）に対する非特異的損傷は、光退色に関連して、時には目的のために2,12又は微分干渉コントラスト（DIC）のような適切な明視野光学系を有する形態学の検査により設?...

生体組織のタイムラプスイメージングは​​、単一の時点で撮像され、固定または住んで調剤に理解されることができない力学構造と機能の関係を視覚的にアクセスを提供します。しかし、多くの場合、一時的な情報へのアクセスのためのトレードオフは、光学解像度の低下である。高開口数油浸対物レンズは、代替として水浸漬またはドライの目標を残しているため、焦点の彼らの狭い範囲の生体組織に非実用的である。さらに、共焦点光学系によってもたらさ高解像度照明比較的高レベルの1,2必要から、光毒性に起因するいくつかの生体調製物中で利用することができない。最後に、いくつかのリアルタイムまたは時間経過の光学技術が利用可能であるが強化された解像度を提供することが、その適用は、関心のある構造は対物レンズ1の数百ナノメートル内に配置することができる製剤に限定されている。方法について説明比較的低コストの機器を利用した汎用性のある、さらにより一般的に使用されるタイムラプス技術と比較して改良された解像度を提供しています。なお、各施設ならびに撮像施設での使用を意図している。 この方法は高感度デジタルカメラで、迅速に、わずかに異なる焦点面（Zスタック）で画像のセットを取得するために設計されたハードウェアと組み合わせて、従来の落射蛍光顕微鏡を利用しています。それぞれのzスタックはデジタル分解能を高めるためにデコンボリューションされる。 3Dタイムラプス（4D）画像の特徴の一つは、細胞小器官または他の構造の移動を正確に追跡している。適切に設定すると、画像化された構造は、フォーカスの外に出ないし、すべての3方向の動きを観察し、定量化することができる。染色された構造は、単に狭い焦点面の上または下に漂流して、1つ以上の時間経過フレームにわたって消滅するためにこのように、それは不可能です。この方法はまた、相互作用し、可能FUを評価するための高感度なツールとして機能します小さな構造のシオン。回折限界（数百nm）の近くで、従来の落射蛍光または構造の共焦点画像がマージされた画像は、それぞれのラベル3の重なりを見せても融合を確認していません。融合は示唆し、それは、オブジェクトが回折限界未満である距離だけ水平方向または垂直方向に分離されている可能性が残る。三又は四次元イメージングは​​、対照的に、3つの直交方向のそれぞれにおいてオブジェクトの表示が可能になる。すべての3つのビューにおける融合の外観は、確実性のレベルを増加させる。そして、いくつかの生きた標本で、指向性または両方のラベルは、時間に一緒に移動すると推定される融合されたオブジェクトのブラウン運動は、さらなる証拠を提供しています。もちろん、とき回折限界の背景から、こだわりの構造における確実性のレベル、またはそれらが2色素（融合）が含まれていることを示すの近くに、絶対的なものではない。例えば、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）のような該当する場合、専門的な技術が、4は 、より適切である。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:720px;" width="720">
	<colgroup>
		<col span="4" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:42px;width:180px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:180px;">Company</td>
			<td style="width:180px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:180px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Reagents:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SGC5</td>
			<td>Biotium [Hayward, CA]</td>
			<td>70057</td>
			<td>Final conc:10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FM1-43FX</td>
			<td>Invitrogen [Carlsbad, CA]</td>
			<td>F35335</td>
			<td>Final conc:7 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LysoTracker Red</td>
			<td>Invitrogen [Carlsbad, CA]</td>
			<td>L7528</td>
			<td>Final conc:0.2 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Solutions:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reptilian Ringers pH 7.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>145 mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td>2.5&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td>3.6&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">MgSO4</td>
			<td>1.8&#160; mM</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">KH2PO4 (Dibasic)</td>
			<td>1.0&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>5.0&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="2" height="20" style="height:21px;">High KCL Reptilian Ringers pH 7.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>&#160;86&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td>&#160;60&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td>3.6&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">MgSO4</td>
			<td>1.8&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">KH2PO4 (Dibasic)</td>
			<td>1.0&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>5.0&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="2" height="20" style="height:21px;">High Sucrose Ringers pH 7.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl</td>
			<td>145 mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td>2. 5 mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td>3.6&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">MgSO4</td>
			<td>1.8&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;">KH2PO4 (Dibasic)</td>
			<td>1.0&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>5.0&#160; mM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sucrose</td>
			<td>0.5 M (17.1 gm/50 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Equipment:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Comments</td>
			<td>Comments(website)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Axioplan 200 inverted microscope</td>
			<td colspan="2">Carl Zeiss [Thornwood, NY]</td>
			<td><a href="http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">N-Achroplan 63X water objective; n.a.=0.9; Working distance=2.4mm&#160;</td>
			<td colspan="2">Carl Zeiss [Thornwood, NY]</td>
			<td><a href="http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">DG4 combination light source/excitation filterwheel switcher</td>
			<td>Sutter instruments [Novato, CA]</td>
			<td>175W Xenon arc lamp</td>
			<td><a href="http://www.sutter.com/">www.sutter.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;">Lambda 10-2&#160; emission filterwheel switcher</td>
			<td colspan="2">Sutter instruments [Novato, CA]</td>
			<td><a href="http://www.sutter.com/">www.sutter.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sensicam CCD camera</td>
			<td colspan="2">Cooke Instruments [Tonawanda, NY]</td>
			<td><a href="http://www.cookecorp.com/">www.cookecorp.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cascade 512 CCD camera</td>
			<td colspan="2">Photometrics [Tucson, AZ]</td>
			<td><a href="http://www.photometrics.com/">www.photometrics.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;">Imaging dishes- made in-house-11cm dia.; 25 mm dia. #1 coverslip embedded; magnetic pins</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Software:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Comments</td>
			<td>Comments(website)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slidebook 5.0</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovations [Denver, CO]</td>
			<td>Deconvolution; Drift correction;3D and 4D data presentation</td>
			<td><a href="http://www.intelligent-imaging.com/">www.intelligent-imaging.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IMARIS 7.5.2</td>
			<td>Bitplane [South Windsor, CT]</td>
			<td>Drift correction; 3D and 4D data presentation</td>
			<td><a href="http://www.bitplane.com/">www.bitplane.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AfterEffects CS6</td>
			<td>Adobe [San Jose, CA]</td>
			<td>Drift correction</td>
			<td><a href="http://www.adobe.com/">www.adobe.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ 1.46</td>
			<td>National Institutes of Health [Bethesda, MD]</td>
			<td>Multiple plugins available;Stereo pair construction</td>
			<td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij">http://rsbweb.nih.gov/ij</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeiss LSM</td>
			<td>Carl Zeiss [Thornwood, NY]</td>
			<td>Stereo pair construction</td>
			<td><a href="http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of endosome dynamics in living nerve terminals with four-dimensional fluorescence imaging

四次元（4D）光イメージングは​​、ガーターヘビの薄い腹横筋筋の運動神経終末内の小さな構造の挙動を研究するために使用されている。生データは、3Dのz-スタックの経時的配列を含む。各スタックは400-1,500 nmの区切られた焦点面でのエピ蛍光光学系を用いて取得4月20日の画像が含まれています。このようなフォーカスの調整などの画像スタックの取得の手順は、励起波長の切り替え、及びデジタルカメラの動作は、画像レートを最大化し、光露光から組織の損傷を最小限に抑えるために可能な限り自動化されている。取得後、画像スタックのセットは、空間分解能を向上させるためにデコンボリューションされ、所望の3Dフォーマットに変換され、4D「映画」ことが求められる実験データに応じて、コンピュータベースの様々な分析に適しているの作成に使用される。 1つのアプリケーションが、神経末端-macroendosomes（MES）で見つかったエンドソームの二つのクラスの動的挙動の研究であるおよび（有害事象）、サイズが（両方のタイプの200〜800 nm）の酸性エンドソームは、回折限界またはその付近である。各時点での3次元情報へのアクセスは、従来のタイムラプス撮影に比べていくつかの利点を提供する。特に、構造物の動きの大きさと速度は、鮮明な焦点を失うことなく経時的に定量することができる。 4Dイメージングからのデータの例は、MEは、それらがエキソサイトーシスではなく、単に垂直方向に離れて単焦点面から移動していることを示唆し、原形質膜に接近し、消滅することが明らかになった。また、各3正射影で見たように、2つの色素を含有する構造体の間の重複の視覚化によって、有害事象のMEとの推定上の融合で明らかにした。

示されたデータは、（ 図3に低域と高倍率のビューを参照してください。エンドサイトーシスの色素は（FM1-43）の取り込みは、各繊維末端を埋めるヘイズが作成されます）ヘビ神経筋端末からのものであり、特に、macroendosomes（MES）と酸性エンドソーム（AES）これらの端子5。のMEは、神経活動10中に大エンドサイトーシスによって作成され、活動が6を停止?...

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Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

四次元（4D）画像化は、脊椎動物の神経末端を生体内エンドソームの2種類のうちの挙動および相互作用を研究するために利用される。これらの小さな構造の移動は、例えばエンドソーム融合およびエキソサイトーシスなどのイベントの確認を可能にする、三次元を特徴としている。

4次元蛍光イメージングと住んでいる神経末端におけるエンドソームダイナミクスの可視化

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

visualization-endosome-dynamics-living-nerve-terminals-with-four

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.9K ビュー.  Washington University School of Medicine. 四次元（4D）画像化は、脊椎動物の神経末端を生体内エンドソームの2種類のうちの挙動および相互作用を研究するために利用される。これらの小さな構造の移動は、例えばエンドソーム融合およびエキソサイトーシスなどのイベントの確認を可能にする、三次元を特徴としている。 

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Preparation of Living Isolated Vertebrate Photoreceptor Cells for Fluorescence Imaging

In the vertebrate retina, phototransduction, the conversion of light to an electrical signal, is carried out by the rod and cone photoreceptor cells1-4. Rod photoreceptors are responsible for vision in dim light, cones in bright light. Phototransduction takes place in the outer segment of the photoreceptor cell, a specialized compartment that contains a high concentration of visual pigment, the primary light detector. The visual pigment is composed of a chromophore, 11-cis retinal, attached to a protein, opsin. A photon absorbed by the visual pigment isomerizes the chromophore from 11-cis to all-trans. This photoisomerization brings about a conformational change in the visual pigment that 
initiates a cascade of reactions culminating in a change in membrane potential, and bringing about the transduction of the light stimulus to an electrical signal. The 
recovery of the cell from light stimulation involves the deactivation of the intermediates activated by light, and the reestablishment of the membrane potential. Ca2+ modulates the activity of several of the enzymes involved in phototransduction, and its concentration is reduced upon light stimulation. In this way, Ca2+ plays an important role in the recovery of the cell from light stimulation and its adaptation to background light.
Another essential part of the recovery process is the regeneration of the visual pigment that has been destroyed during light-detection by the 
photoisomerization of its 11-cis chromophore to all-trans5-7. This regeneration begins with the release of all-trans retinal by 
the photoactivated pigment, leaving behind the apo-protein opsin. The released all-trans retinal is rapidly reduced in a reaction utilizing NADPH to all-
trans retinol, and opsin combines with fresh 11-cis retinal brought into the outer segment to reform the visual pigment. All-trans retinol is 
then transferred out of the outer segment and into neighboring cells by the specialized carrier Interphotoreceptor Retinoid Binding Protein (IRBP).
Fluorescence imaging of single photoreceptor cells can be used to study their physiology and cell biology. Ca2+-sensitive fluorescent dyes can be used to examine in detail the interplay between outer 
segment Ca2+ changes and response to light8-12 as well as the role of inner segment Ca2+ stores in Ca2+ homeostasis13,14. 
Fluorescent dyes can also be used for measuring Mg2+ concentration15, pH, and as tracers of aqueous and membrane compartments16. 
Finally, the intrinsic fluorescence of all-trans retinol (vitamin A) can be used to monitor the kinetics of its formation and removal in single 
photoreceptor cells17-19.

A method is described for the preparation of single living photoreceptor cells from different vertebrate species for fluorescence imaging. The method can be used to image the fluorescence of endogenous fluorophores, such as NADH or vitamin A, or that of exogenously added fluorescent dyes sensitive to Ca2+ or other factors.

蛍光イメージングのための生活絶縁脊椎動物視細胞の調製

In the vertebrate retina, phototransduction, the conversion of light to an electrical signal, is carried out by the rod and cone photoreceptor cells1-4.  ...

神経科学

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate retina. Two classes of retinal neurons, photoreceptors and bipolar cells, accomplish this by using ribbon-type active zones, which enable sustained and high-throughput neurotransmitter release over long time periods. ON-type mixed bipolar cell (Mb) terminals in the goldfish retina, which depolarize to light stimuli and receive mixed rod and cone photoreceptor input, are suitable for the study of ribbon-type synapses both due to their large size (~10-12 &mu;m diameter) and to their numerous lateral and reciprocal synaptic connections with amacrine cell dendrites. Direct access to Mb bipolar cell terminals in goldfish retinal slices with the patch-clamp technique allows the measurement of presynaptic Ca2+ currents, membrane capacitance changes, and reciprocal synaptic feedback inhibition mediated by GABAA and GABAC receptors expressed on the terminals. Presynaptic membrane capacitance measurements of exocytosis allow one to study the short-term plasticity of excitatory neurotransmitter release 14,15. In addition, short-term and long-term plasticity of inhibitory neurotransmitter release from amacrine cells can also be investigated by recordings of reciprocal feedback inhibition arriving at the Mb terminal 21. Over short periods of time (e.g. ~10 s), GABAergic reciprocal feedback inhibition from amacrine cells undergoes paired-pulse depression via GABA vesicle pool depletion 11. The synaptic dynamics of retinal microcircuits in the inner plexiform layer of the retina can thus be directly studied.
The brain-slice technique was introduced more than 40 years ago but is still very useful for the investigation of the electrical properties of neurons, both at the single cell soma, single dendrite or axon, and microcircuit synaptic level 19. Tissues that are too small to be glued directly onto the slicing chamber are often first embedded in agar (or placed onto a filter paper) and then sliced 20, 23, 18, 9. In this video, we employ the pre-embedding agar technique using goldfish retina. Some of the giant bipolar cell terminals in our slices of goldfish retina are axotomized (axon-cut) during the slicing procedure. This allows us to isolate single presynaptic nerve terminal inputs, because recording from axotomized terminals excludes the signals from the soma-dendritic compartment. Alternatively, one can also record from intact Mb bipolar cells, by recording from terminals attached to axons that have not been cut during the slicing procedure. Overall, use of this experimental protocol will aid in studies of retinal synaptic physiology, microcircuit functional analysis, and synaptic transmission at ribbon synapses.

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Here we describe a protocol for the preparation of agar-embedded retinal slices that are suitable for electrophysiology and Ca2+ imaging. This method allows one to study ribbon-type synapses in retinal microcircuits using direct patch-clamp recordings of single presynaptic nerve terminals.

パッチクランプキャパシタンス測定とCa 2 +</sup網膜スライスにおける単一神経終末で>イメージング

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

でProprioceptorsの可視化<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫および蛹

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Deep Brain Stimulation with Simultaneous fMRI in Rodents

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for using blood oxygen level dependent (BOLD) functional magnetic resonance imaging (fMRI) to image rodents with simultaneous DBS. DBS fMRI presents a number of technical challenges, including accuracy of electrode implantation, MR artifacts created by the electrode, choice of anesthesia and paralytic to minimize any neuronal effects while simultaneously eliminating animal motion, and maintenance of physiological parameters, deviation from which can confound the BOLD signal.&#160;Our laboratory has developed a set of procedures that are capable of overcoming most of these possible issues. For electrical stimulation, a homemade tungsten bipolar microelectrode is used, inserted stereotactically at the stimulation site in the anesthetized subject. In preparation for imaging, rodents are fixed on a plastic headpiece and transferred to the magnet bore. For sedation and paralysis during scanning, a cocktail of dexmedetomidine and pancuronium is continuously infused, along with a minimal dose of isoflurane; this preparation minimizes the BOLD ceiling effect of volatile anesthetics. In this example experiment, stimulation of the subthalamic nucleus (STN) produces BOLD responses which are observed primarily in ipsilateral cortical regions, centered in motor cortex. Simultaneous DBS and fMRI allows the unambiguous modulation of neural circuits dependent on stimulation location and stimulation parameters, and permits observation of neuronal modulations free of regional bias. This technique may be used to explore the downstream effects of modulating neural circuitry at nearly any brain region, with implications for both experimental and clinical DBS.

This protocol describes a standard method for simultaneous functional magnetic resonance imaging and deep brain stimulation in the rodent. The combined use of these experimental tools allows for the exploration of global downstream activity in response to electrical stimulation at virtually any brain target.

げっ歯類での同時のfMRIと脳深部刺激

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for ...

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

The rodent visual system encompasses retinal ganglion cells and their axons that form the optic nerve to enter thalamic and midbrain centers, and postsynaptic projections to the visual cortex. Based on its distinct anatomical structure and convenient accessibility, it has become the favored structure for studies on neuronal survival, axonal regeneration, and synaptic plasticity. Recent advancements in MR imaging have enabled the in vivo visualization of the retino-tectal part of this projection using manganese mediated contrast enhancement (MEMRI). Here, we present a MEMRI protocol for illustration of the visual projection in mice, by which resolutions of (200 &#181;m)3 can be achieved using common 3 Tesla scanners. We demonstrate how intravitreal injection of a single dosage of 15 nmol MnCl2 leads to a saturated enhancement of the intact projection within 24 hr. With exception of the retina, changes in signal intensity are independent of coincided visual stimulation or physiological aging. We further apply this technique to longitudinally monitor axonal degeneration in response to acute optic nerve injury, a paradigm by which Mn2+ transport completely arrests at the lesion site. Conversely, active Mn2+ transport is quantitatively proportionate to the viability, number, and electrical activity of axon fibers. For such an analysis, we exemplify Mn2+ transport kinetics along the visual path in a transgenic mouse model (NF-&#954;B p50KO) displaying spontaneous atrophy of sensory, including visual, projections. In these mice, MEMRI indicates reduced but not delayed Mn2+ transport as compared to wild type mice, thus revealing signs of structural and/or functional impairments by NF-&#954;B mutations.
In summary, MEMRI conveniently bridges in vivo assays and post mortem histology for the characterization of nerve fiber integrity and activity. It is highly useful for longitudinal studies on axonal degeneration and regeneration, and investigations of mutant mice for genuine or inducible phenotypes.

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

This video illustrates a method, using a clinical 3 T scanner, for contrast-enhanced MR imaging of the na&#239;ve mouse visual projection and for repetitive and longitudinal in vivo studies of optic nerve degeneration associated with acute optic nerve crush injury and chronic optic nerve degeneration in knock-out mice (p50KO).

マウスにおける造影MRIによる視神経線維の整合性in vivoイメージング

The rodent visual system encompasses retinal ganglion cells and their axons that form the optic nerve to enter thalamic and midbrain centers, and ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

イメージングカルシウム<sup&gt; 2+</supマウス網膜の光受容コーン軸索末端で&gt;ダイナミクス

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles in the skin of the mouse pinna. The preparation is simple and relatively fast, reliably yielding extensive regions of multiple labeled units of living nerve terminals to study uptake and release of styryl pyridinium dyes extensively used in studies of vesicle recycling. Subdividing the preparations before labeling allows test vs. control comparisons in the same ear from a single individual. Helpful tips are given for improving the quality of the preparation, the labeling and the imaging parameters. This new system is suitable for assaying pharmacologically and mechanically-induced uptake and release of these vital dyes in lanceolate terminals in both wild-type and genetically modified animals. Examples of modulatory influences on labeling intensity are given.

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.

の毛包披針形語尾に神経末端標識リビングの光監視<em&gt; ex vivoで</em&gt;マウスの耳皮膚

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

蛍光プローブを用いた培養ニューロンにおけるエンドソームおよびリソソームの動力学の定量

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Visualization of Amyloid &#946; Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

The neuropathology of Alzheimer&#39;s disease (AD) is characterized by the accumulation and aggregation of amyloid &#946; (A&#946;) peptides into extracellular plaques of the brain. The A&#946; peptides, composed of 40 amino acids, are generated from amyloid precursor proteins (APP) by &#946;- and &#947;-secretases. A&#946; is deposited not only in cerebral parenchyma but also in leptomeningeal and cerebral vessel walls, known as cerebral amyloid angiopathy (CAA). While a variety of A&#946; peptides were identified, the detailed production and distribution of individual A&#946; peptides in pathological tissues of AD and CAA have not been fully addressed. Here, we develop a protocol of matrix-assisted laser desorption/ionization-based imaging mass spectrometry (MALDI-IMS) on human autopsy brain tissues to obtain comprehensive protein mapping. For this purpose, human cortical specimens were obtained from the Brain Bank at the Tokyo Metropolitan Institute of Gerontology. Frozen cryosections are cut and transferred to indium-tin-oxide (ITO)-coated glass slides. Spectra are acquired using the MALDI system with a spatial resolution up to 20 &#181;m. Sinapinic acid (SA) is uniformly deposited on the slide using either an automatic or a manual sprayer. With the current technical advantages of MALDI-IMS, a typical data set of various A&#946; species within the same sections of human autopsied brains can be obtained without specific probes. Furthermore, high-resolution (20 &#181;m) imaging of an AD brain and severe CAA sample clearly shows that A&#946;1-36 to A&#946;1-41 were deposited into leptomeningeal vessels, while A&#946;1-42 and A&#946;1-43 were deposited in cerebral parenchyma as senile plaque (SP). It is feasible to adopt MALDI-IMS as a standard approach in combination with clinical, genetic, and pathological observations in understanding the pathology of AD, CAA, and other neurological diseases based on the current strategy.

Visualization of Amyloid &amp;#946; Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

Molecular imaging with matrix-assisted laser desorption/ionization-based imaging mass spectrometry (MALDI-IMS) allows the simultaneous mapping of multiple analytes in biological samples. Here, we present a protocol for the detection and visualization of amyloid &#946; protein on brain tissues of Alzheimer&#39;s disease and cerebral amyloid angiopathy samples using MALDI-IMS.

マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量顕微鏡を用いたひと脳のアミロイド β の堆積物の可視化

The neuropathology of Alzheimer&#39;s disease (AD) is characterized by the accumulation and aggregation of amyloid &#946; (A&#946;) peptides into ...

Preparation of Newborn Rat Brain Tissue for Ultrastructural Morphometric Analysis of Synaptic Vesicle Distribution at Nerve Terminals

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial organization of synaptic vesicles. In order to obtain high-quality electron micrographs that can yield the degree of morphological detail necessary for quantitative analysis of pre-synaptic vesicle distribution, optimal specimen preparation is critical. Chemical fixation is the first step in the process of specimen preparation, and of utmost importance to preserve fine ultrastructure. Vascular fixation with a glutaraldehyde-formaldehyde solution, followed by treatment of vibratome-sectioned specimens with osmium tetroxide, stabilizes the maximum number of molecules, especially proteins and lipids, and results in superior conservation of ultrastructure. Tissue is then processed with counterstaining, sequential dehydration and resin-embedding. En bloc staining with uranyl acetate (i.e., staining of vibratome-sectioned tissue before resin embedding) enhances endogenous contrast and stabilizes cell components against extraction during specimen processing. Contrast can be further increased by applying uranyl acetate as a post-stain on ultrathin sections. Double-staining of ultrathin sections with lead citrate after uranyl acetate treatment also improves image resolution, by intensifying electron-opacity of nucleic acid-containing structures through selective binding of lead to uranyl acetate. Transmission electron microscopy is a powerful tool for characterization of the morphological details of synaptic vesicles and quantification of their size and spatial organization in the terminal bouton. However, because it uses fixed tissue, transmission electron microscopy can only provide indirect information regarding living or evolving processes. Therefore, other techniques should be considered when the main objective is to study dynamic or functional aspects of synaptic vesicle trafficking and exocytosis.

We describe procedures for processing newborn rat brain tissue to obtain high-resolution electron micrographs for morphometric analysis of synaptic vesicle distribution at nerve terminals. The micrographs obtained with these methods can also be used to study the morphology of a number of other cellular components and their dimensional structural relationships.