著者編集者の支援のため Gráinne ティアニーを感謝したいです。

プロトコルは、IRST 人間研究倫理委員会のガイドラインに従います。
注: この手順はひと新鮮凍結組織 cDNA 分子の数が少ないを検出するため設計します。以前に検証済みの患者由来の胃腫瘍や正常組織サンプルから、まだ凍結中、ドライアイス、ティッシュ セクションをカットされています。
1. RNA の分離及び精製
<ol><li>
RNA の抽出 メモ: RNA の隔離は特定の製品を使用してフードの下で実行されます (材料の表を参照してください)。しかし、様々 な絶縁キット市販されています。<ol>
<li>均質化 RNA 分離試薬と渦の 1 mL と 1.5 mL チューブに細かく切られた新鮮凍結組織サンプルの 50 〜 100 mg 精力的に 15 s. 加温の-80 ° c 管一晩。</li>
		<li>15 ボルテックスによって管内常温 5 分のミックス サンプルをインキュベート s。</li>
		<li>氷の上の管を保つ、クロロホルム、および 15 は積極的に渦を 200 μ l 添加 s。</li>
		<li>室温 60 s 管、4 ° C で 15 分間、12,000 × g で遠心分離を孵化させなさい</li>
		<li>1.5 mL チューブの水相を転送し、グリコーゲンの 20 μ g を追加します。 注意: 慎重に汚染を減らすために中間期または有機層の転送を避けるために重要です。</li>
		<li>500 μ L のイソプロパノール、ミックス、氷上で 10 分間インキュベートしてチューブを反転を追加します。</li>
		<li>RNA の沈殿物に 4 ° C で 15 分間 12,000 × g でチューブを遠心します。 注: RNA 側と遠心分離後はよく見えない、管の下部にゲル状のペレットになります。</li>
		<li>沈殿物を乱すことがなく上澄みを除去し、ピペッティングで 75% エタノール 1 mL で洗います。</li>
		<li>4 ° C で 5 分間 7,500 x g でチューブを遠心し、ペレットを乱すことがなく、上清を除去します。</li>
		<li>沈殿物は透明になるまで乾燥し、RNase フリー水の 50 μ L に溶解、ペレットをしましょう。</li>
		<li>-80 ° c 少なくとも一晩定量化する前にサンプルを凍結します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ゲノム DNA と RNA の浄化 注: 列に基づく RNA 精製に続いて DNase 消化手順を汚染 DNA を消化するために低豊富なターゲットの分析にお勧め。<ol>
<li>凍結乾燥の DNase 私 (1,500 Kunitz 台) RNase フリー 550 μ L では水を注射すると、静か、バイアルを反転でミックスを使用して、再構成された原液を因数に分割を溶解します。</li>
		<li>1.5 mL チューブでの転送の RNA の 15 μ g のサンプルの計算された容積、DNase 消化の 10 μ L はマイク在庫ソリューション キット (に記載されている材料の表)、DNase の 2.5 μ L からバッファー、100 μ L に水 RNase フリー室温で 10 分間加温。</li>
		<li>組織換散バッファーの 350 μ L を追加 (キットの材料表を参照してください)、ピペッティングで混ぜます。</li>
		<li>ピペッティングで 250 μ L の 100% エタノールとミックスを追加します。</li>
		<li>新しいスピン列および 15、12,000 × g で遠心分離にボリューム全体 (700 μ L) を転送 s。</li>
		<li>新しいコレクションの管にフィルターを転送、列、12,000 × g で遠心する 2 分 80% エタノール 500 μ L を追加します。</li>
		<li>フィルターを乾燥する新しいコレクション チューブとスピン列、12,000 × g で 5 分間遠心するのふたを開けるフィルターを 1.5 mL チューブに転送します。</li>
		<li>[フィルター] 列、12,000 × g で 1 分間遠心に直接 RNase フリー水の 14 μ L を追加します。</li>
		<li>氷のサンプルを保つとベンチトップ分光光度計で 2 μ L のサンプルを使用して定量化に進むか、使用するまで-80 ° C で RNA を保存します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. cDNA 合成
<ol><li>RNA、マスター ミックスの 4 μ、1 μ L の逆転写酵素と RNase フリー水滅菌 PCR チューブで 20 μ L の最終巻の場所 1,000 ng。穏やかに混合し、スピンダウンします。</li>
	<li>サーマルサイクラー、次の条件を適用することで反応混合物を孵化させなさい: 25 ° C、42 ° C、85 ° C で 5 分で 30 分で 5 分</li>
	<li>簡単にチューブを遠心、dPCR 解析に進むか、必要になるまでの-20 ° C で保存します。</li>
</ol>3. デジタル PCR の反作用のセットアップ
<ol><li>
dPCR 反応ミックス及び試料調製方法
	<ol>
<li>マスター ミックスと、少なくとも 20 分間室温でアッセイを解凍します。</li>
		<li>300 の濃度に cDNA サンプルを希釈水の 6 μ L で ng。</li>
		<li>優しく渦マスターはミックスし、11.4 μ L の最終巻のマスター ミックスの 8.7 μ L、 CDH1aカスタム設計されたアッセイ プライマー 0.87 μ ヌクレアーゼ フリー水の 1.83 μ L と生殖不能の管にミックスを準備します。 注: CDH1aカスタム設計された分析入門詳細は、材料表を参照してください。</li>
		<li>希薄化後の cDNA サンプル準備ミックス 11.4 μ に転送、優しく、ミックス、簡潔に遠心分離機します。 注: ボリュームは、ピペッティングからボリュームの損失を補うため 20% 過剰を含まれます。すべてのサンプルとないのテンプレートのコントロール (NTC) のミックスを準備します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
チップの準備 注: 最適な結果を得るのためにチップをできるだけ早くロードします。<ol>
<li>チップ ローダーをプラグインし、インジケータ ランプが緑色に点灯するまで待ちます。</li>
		<li>プランジャーを軽く引いて浸漬液シリンジのキャップを削除 1-2 mm とこの手順を容易にするため、チップと交換にそれを解放します。</li>
		<li>新しいチップを取るし、サンプルに関連付ける蓋に書かれたコードのメモを取る。</li>
		<li>その側で慎重に蓋を保持、保護フィルムをはがすし、を正しい向きで粘着性がある顔をしてふたを配置します。</li>
		<li>慎重に内部の部品に触れるように注意して、チップをピックアップし、クランプを開くにはレバーを押すことによって正しい位置にチップ巣積載します。</li>
		<li>ローダーに新しい読み込みブレードを読み込み、優しくしっかりと場所にあることを確認するそれをプッシュします。</li>
		<li>空気の泡をせずに読み込みブレード dPCR 反作用の組合せの 14.5 μ L を転送またはチップ上のボリュームを配布するボタンの読み込み黒どのプレス後、ブレードを偏向します。</li>
		<li>浸漬液の注射器を使用すると、先端の表面に触れないように世話チップ表面に約 20 滴を転送します。 注: エッジ上液をこぼさず全体の表面をカバーするために重要です。</li>
		<li>チップと接触し、15 の押しふたをするローダーのアームを回転させる s。</li>
		<li>チップをリリースし、その位置に腕を返すふたのボタンを押します。</li>
		<li>45 ° の角度で組み立てられたチップを保持して慎重に充填ポートを通して注射器と浸漬液を分注、気泡がないかどうかを確認する少しのチップを回転させるし、滅菌ワイプで任意の余分な水分を削除します。</li>
		<li>少なくとも 5 充填ポート上アウェイ チップふた押しの上にラベルが優しく剥離でチップの場合はシール s。</li>
		<li>熱 cycler でロードする準備ができるまで、暗闇の中でチップを格納します。 注: 準備のチップは、2 時間以内使用する必要があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
dPCR 反応
	<ol>
<li>蓋を開き、1 つのブロックを使用した場合でも、両方のブロックにアダプターをインストールします。</li>
		<li>サンプル ブロックを正しい位置にチップを置きます。 注: 入力ポートはチップのウィンドウを乱すことがなく上部に浮動する空気の泡を許可する高い位置でサーマルサイクラーの前面に向かって指向になりません。空のチップを使用して、2 つのブロックをバランスします。</li>
		<li>チップを完全にカバーするサンプル ブロックにサーマル パッドを置きます。</li>
		<li>ふたを閉じるし、次の条件を適用する実行、PCR を開始: 10 分; 96 ° c を保持60 ° C 2 分の 98 ° C の 30 のサイクル 45 s;2 分の 60 ° C に保持します。4 ° C で保持します。熱 cycler の電源を切り、少なくとも 10 分間室温でチップを解凍します。 注: 1 時間以内チップ解析を実行する必要があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
チップ解析
	<ol>
<li>計測器のふたを開けてとサーマル パッドを削除し、アダプターからチップを削除します。 注: は、分析まで暗い、きれいな場所でチップを保存します。</li>
		<li>イソプロパノールと滅菌ワイプ チップ表面をきれいにします。 注: 各チップがリークまたは潜在的な問題を調べます。</li>
		<li>データを保存する検出器システムに USB を挿入します。</li>
		<li>検出器システムのチップ トレイを開きロードの正しい位置にチップ フェイス アップ トレイを閉じてください。</li>
		<li>30 を待つ処理 s チップを削除し、次のいずれかを挿入します。</li>
		<li>分析処理のすべてのチップを完了し、ファイルを転送するコンピューターに USB を挿入するを待ちます。 注: 分析の所要時間は約 3 分/チップに 2 です。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. データの解析と解釈
<ol><li>すべての下流解析の実施に必要なクラウド ベースのソフトウェア プラットフォームに接続します。</li>
	<li>プロジェクトを作成し、目的のチップのすべてのデータ ファイルをインポートします。</li>
	<li>サンプル名を入力してください。染料と「チップの定義」タブで使用される測定を選択します。</li>
	<li>「レビュー データ」タブで、チェック方法徹底的サンプル チップに読み込まれ、どのように多くのデータ ポイントが評価可能な可視化チップが許容できるかどうかを決定します。 注: は、評価可能なデータ ポイントを未満 13,000 チップを拒否します。</li>
	<li>画面の右側にある選択されたチップの散布に移動します。すべてのチップにフルオレセイン amidite (FAM) レポーター色素信号 (y 軸) のための 6,000 のしきい値を適用します。 注: を設定するしきい値は使用法に基づいて異なる場合があります。</li>
	<li>散布の相対的な場所を選択することにより偽陽性の結果を防ぐために怪しげな肯定的な信号をプロット「未定義」でを押すとなげなわツールを使用して削除います。残りのすべての肯定的なスポットは、まれなターゲット分析の cDNA コピーの存在を示します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>van Roy, F., Berx, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell-cell+adhesion+molecule+E-cadherin.">The cell-cell adhesion molecule E-cadherin.</a> Cell Mol Life Sci. 65 (23), 3756-3788 (2008).</li><li>Carneiro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin+dysfunction+in+gastric+cancer:+cellular+consequences,+clinical+applications+and+open+questions.">E-cadherin dysfunction in gastric cancer: cellular consequences, clinical applications and open questions.</a> FEBS Lett. 586 (18), 2981-2989 (2012).</li><li>Corso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutations+and+deletions+of+the+E-cadherin+gene+predict+poor+survival+of+patients+with+gastric+cancer.">Somatic mutations and deletions of the E-cadherin gene predict poor survival of patients with gastric cancer.</a> J Clin Oncol. 31 (7), 868-875 (2013).</li><li>Pinheiro, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+initiation+arising+from+E-cadherin/CDH1+intron2:+a+novel+protein+isoform+that+increases+gastric+cancer+cell+invasion+and+angiogenesis.">Transcription initiation arising from E-cadherin/CDH1 intron2: a novel protein isoform that increases gastric cancer cell invasion and angiogenesis.</a> Hum Mol Genet. 21 (19), 4253-4269 (2012).</li><li>Abou Khouzam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+identifies+changes+in+CDH1+(E-cadherin)+transcription+pattern+in+intestinal-type+gastric+cancer.">Digital PCR identifies changes in CDH1 (E-cadherin) transcription pattern in intestinal-type gastric cancer.</a> Oncotarget. 8 (12), 18811-18820 (2017).</li><li>Taylor, S. 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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+newly+produced+T+and+B+lymphocytes+by+digital+PCR+in+blood+stored+dry+on+nylon+flocked+swabs.">Detection of newly produced T and B lymphocytes by digital PCR in blood stored dry on nylon flocked swabs.</a> J.Transl.Med. 15 (1), (2017).</li><li>Sho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+Improves+mutation+analysis+in+pancreas+fine+needle+aspiration+biopsy+specimens.">Digital PCR Improves mutation analysis in pancreas fine needle aspiration biopsy specimens.</a> PLoS One. 12 (1), e0170897 (2017).</li><li>Conte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+to+detect+microRNAs+using+chip-based+QuantStudio+3D+digital+PCR.">Novel method to detect microRNAs using chip-based QuantStudio 3D digital PCR.</a> BMC Genomics. 16, 849 (2015).</li><li>Sanders, R., Mason, D. J., Foy, C. A., Huggett, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+digital+PCR+for+absolute+RNA+quantification.">Evaluation of digital PCR for absolute RNA quantification.</a> PLoS One. 8 (9), e75296 (2013).</li></ol>

この作業のための利益相反報告なし。

dPCR は、DNA 分子測定10、11,12,13マイクロ Rna、RNA 転写産物5の定量化のためのこの技術は適応時間にもともと開発されました 14,15。このプロトコルでは、新鮮凍結組織サンプルから派生したまれな転写産物の検出機能を搭載する?...

CDH1遺伝子は、E-カドヘリン、細胞接着、生存、増殖、および移行1の規制による正常胃上皮の維持に関与する重要な要因のエンコードします。有害な生殖の結果として E-カドヘリン蛋白質の損失またはCDH1の身体の変化は、GC2,3の開発に関連付けられています。2 遺伝子のイントロンから生じる非正規議事録では、胃癌4、5の役割を果たすこともという仮説を立てた。特に、このようなコピーは、 CDH1a、GC セルラインで表現が示されているにはない通常胃4から。最近 GC 組織サンプル チップ ベースの dPCR5を使用して GC 患者からCDH1aを検出しました。 dPCR は、初めて、 CDH1a遺伝子転写腸 GC と正常組織でのプレゼンスの評価に使用されました。
遺伝子の発現を決定する金本位法は、リアルタイム定量 PCR (qPCR) です。ただし、結果のデータは、変数をすることができます時々、質の悪い、特に、サンプルでターゲットのレベルが低い。この変動は、ポリメラーゼ活性およびプライマーアニー リングを阻害する非特異的増幅と競争力のある側の反応6につながる、汚染物質によって引き起こされることができます。
DPCR の基本的な生化学的原則が qPCR のそれらに類似している dPCR がゲノム DNA (gDNA) の非常に精密な測定を可能にするいくつかの利点を示しています/相補的 dna (cDNA)。確かに、dPCR は、それぞれはよくゼロまたは単一のターゲット分子を含む何千もの井戸にサンプルの校正分割に依存するエンドポイント反応です。増幅はターゲットのコピーを含んでいる井戸でのみ発生し、蛍光信号によって示されます。元のサンプルのターゲット分子の絶対数は、二項分布のポアソン統計7を使用して合計パーティションに正の比を決定することによって計算できます。
また、dPCR 技術標準曲線を実行する必要があると、それゆえ、関連付けられたバイアスと変動、ターゲット8,9; の直接定量を可能にします。汚染物質とその耐力阻害剤10; による効率とは関係なくより正確で再現性のある結果を出すそれより敏感な qPCR より特定と珍しいターゲットを検出するための信頼性の高い方法は。最後に、背景の分子が付いている競争を減らす複数の反応に、試料の分割と増幅を可能と gDNA/cDNA6 の単一の分子の検出を促進するターゲット検出限界を向上させる.検出とチップを使った dPCR による核酸の定量化はますますコピー数多型に適用されている、DNA の定量化の断片、および突然変異分析11,12,13、与えられた、精度と低材料は入力メソッドの要件です。さらに、dPCR は最近両方マイクロ Rna 遺伝子と14成績証明書5,15の解析に統合されています。

<table><tbody><tr><td>TRIazol Reagent</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen 20 mg/ml</td><td>ROCHE</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MinElute Cleanup kit</td><td>QIAGEN</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA Synthesis kit</td><td>BioRad</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 3D Digital PCR Master Mix v2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A26358</td><td></td></tr><tr><td>CDH1a IDT custom designed assay</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td>NA</td><td>F) GCTGCAGTTTCACTTTTAGTG&lt;br/&gt; (R) ACTTTGAATCGGGTGTCGAG&lt;br/&gt; (P)/FAM/CGGTCGACAAAGGACAGCCTATT/TAMRA/&lt;br/&gt; [dPCR optimized assay concentrations: 900 nM (F),&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 900 nM (R), 250 nM (P)]</td></tr><tr><td>QuantStudio 3D Digital PCR 20K Chip Kit v2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A26316</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Biofuge Fresco</td><td>Thermo&amp;nbsp; Scientific</td><td>75002402</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler (Labcycler)</td><td>Sensoquest</td><td>011-103</td><td></td></tr><tr><td>GeneAmp PCR System 9700</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N805-0200</td><td></td></tr><tr><td>Dual Flat Block Sample Module</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4425757</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 3D Tilt Base for Dual Flat Block GeneAmp PCR System 9700</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4486414</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 3D Digital PCR Chip Adapter Kit for Flat Block Thermal Cycler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4485513</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 3D Digital PCR Chip Loader</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4482592</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 3D Digital PCR Instrument with power cord</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4489084</td><td></td></tr></tbody></table>

detection of a cdh1 rare transcript variant in fresh-frozen gastric cancer tissues by chip-based digital pcr

それは存在しないに対しいくつかの胃癌 (GC) セルの行で表されるに発見されましたCDH1a、 CDH1遺伝子の非正規コピー正常な胃粘膜に。最近では、GC 患者から得られた新鮮凍結腫瘍組織のCDH1a転写バリアントを検出しました。デジタル PCR (dPCR) のチップを使ったアプローチがここに提示してこの変形組織サンプルでの発現を調べた。dPCR は核酸の正確、堅牢で、高感度測定の可能性を提供しています、さまざまな分野で多くのアプリケーションの活用がますます。dPCR は珍しいターゲットを検出さらに、dPCR は、校正器、標準曲線を必要とせず核酸の絶対かつ正確な定量化のための可能性を提供しています。実際には、パーティション分割反応阻害剤耐性と増幅効率を向上させる背景からターゲットを富ませます。このような特徴は、dPCR CDH1aまれなトラン スクリプトの検出のための最適なツールを作る。

ここに示す手順を使用して、我々 は胃新鮮凍結組織でまれな転写バリアントCDH1aの式のチェック。DPCR による解析を行った 21 ペア正常と癌組織サンプルその 11 追加腫瘍サンプル。CDH1aは、正常組織サンプルは、このまれなトラン スクリプト5の存在を示さなかったに対し 15 のうち 32 (47%) の腫瘍の検出でした。非均一荷重チップはあたか...

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Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

チップを使ったデジタル PCR による新鮮凍結胃癌組織内CDH1まれなトラン スクリプト変種の検出

原稿では、新鮮凍結ノーマルに珍しいCDH1転写バリエーション (CDH1a) および胃癌患者から得られた腫瘍組織を検出するチップを使ったデジタル PCR 法について説明します。

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

detection-cdh1-rare-transcript-variant-fresh-frozen-gastric-cancer

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

6.1K ビュー.  Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS. 原稿では、新鮮凍結ノーマルに珍しいCDH1転写バリエーション (CDH1a) および胃癌患者から得られた腫瘍組織を検出するチップを使ったデジタル PCR 法について説明します。

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Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We developed an in vitro fully human preclinical model of a co-culture of breast cancer cells and monocytes undergoing differentiation towards osteoclasts. We optimized a model of osteoclastogenesis starting from a sample of peripheral blood collected from healthy donors. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were first separated by density gradient centrifugation, seeded at a high density and induced to differentiate by adding two growth factors (GFs): receptor activator of nuclear factor-&#954;B ligand (RANKL) and macrophage colony-stimulating factor (MCSF). The cells were left in culture for 14 days and then fixed and analyzed by downstream analysis. In osteolytic bone metastases, one of the effects of cancer cell arrival in bone is the induction of osteoclastogenesis. We thus challenged our model with co-cultures of breast cancer cells to study the differentiation power of cancer cells with respect to GFs. A straightforward way of studying cancer cell-osteoclast interaction is to perform indirect co-cultures based on the use of conditioned medium collected from breast cancer cell cultures and mixed with fresh medium. This mixture is then used to induce osteoclast differentiation. We also optimized a method of direct co-culture in which cancer cells and monocytes undergoing differentiation share the medium and exchange secreted factors. This is a significant improvement over the original indirect co-culture method as researchers can observe the reciprocal interactions of the two cell types and perform downstream analyses for both cancer cells and osteoclasts. This method enables us to study the effect of drugs on the metastatic bone microenvironment and to seed cell lines other than those derived from breast cancer. The model can also be used to study other diseases such as osteoporosis or other bone conditions.

This protocol describes development of an in vitro human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes cultured with breast cancer cell lines to mimic the cancer cell-osteoclast interaction. The model could be used to further our understanding of bone metastasis formation and improve therapeutic options.

破骨細胞形成乳房癌細胞と共培養末梢血単球からの人間の前臨床モデルの開発

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

がん研究

Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. However, the application of this method is challenging due to its low sensitivity in analyzing the trace amount of ctDNA in the blood. Furthermore, the method may generate false positive and negative results from this sequencing and subsequent analysis. To improve the feasibility and reliability of ctDNA detection in the clinic, here we present a technique which enriches rare mutations for sequencing, Enrich Rare Mutation Sequencing (ER-Seq). ER-Seq can distinguish a single mutation out of 1 x 107 wild-type nucleotides, which makes it a promising tool to detect extremely low frequency genetic alterations and thus will be very useful in studying disease heterogenicity. By virtue of the unique sequencing adapter&#39;s ligation, this method enables an efficient recovery of ctDNA molecules, while at the same time correcting for errors bidirectionally (sense and antisense). Our selection of 1021 kb probes enriches the measurement of target regions that cover over 95% of the tumor-related driver mutations in 12 tumors. This cost-effective and universal method enables a uniquely successful accumulation of genetic data. After efficiently filtering out background error, ER-seq can precisely detect rare mutations. Using a case study, we present a detailed protocol demonstrating probe design, library construction, and target DNA capture methodologies, while also including the data analysis workflow. The process to carry out this method typically takes 1-2 days.

This manuscript describes a technique for detecting mutations of low frequency in ctDNA, ER-Seq. This method is differentiated by its unique use of two-directional error correction, a special background filter, and efficient molecular acquirement.

次世代シーケンシングによる葉緑体の稀な遺伝子変異の検出

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. ...

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, and prediction of treatment resistance. Starting from the hypothesis that androgen receptor (AR) gene copy number (CN) gain is a frequent event in metastatic castration resistance prostate cancer (mCRPC), we propose to analyze this event in cfDNA as a potential predictive biomarker.
We evaluated AR CN in cfDNA using 2 different real-time PCR assays and 2 reference genes (RNaseP and AGO1). DNA amount of 60 ng was used for each assay combination. AR CN gain was confirmed using Digital PCR as a more accurate method. CN variation analysis has already been demonstrated to be informative for the prediction of treatment resistance in the setting of mCRPC, but it could be useful also for other purposes in different patient settings. CN analysis on cfDNA has several advantages: it is non-invasive, rapid and easy to perform, and it starts from a small volume of serum or plasma material.

This manuscript describes the copy number variation analysis performed in serum or plasma DNA using real-time PCR approach. This method is suitable for the prediction of drug resistance in castration resistant prostate cancer patients, but it could be informative also for other diseases.

血清およびリアルタイム PCR を用いたプラズマ コピー数検出

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as tumors. Because digital polymerase chain reactions (PCR) enable the precise quantification of DNA copy number variants, they are becoming an essential tool for detecting rare genetic variations, such as drug-resistant mutations. It is expected that molecular diagnoses using digital PCR (dPCR) will be available in clinical practice in the near future; thus, how to efficiently conduct dPCR with human genetic material is a hot topic. Here, we introduce a method to detect Adenomatous polyposis coli (APC) somatic mosaicism using dPCR with the chip-in-a-tube format, which allows eight dPCR reactions to be simultaneously conducted. Care should be taken when filling and sealing the reaction mixture on the chips. This article demonstrates how to avoid the over- and underestimation of positive partitions. Furthermore, we present a simple procedure for collecting the dPCR product from the partitions on the chips, which can then be used to confirm the specific amplification. We hope that this methods report will help promote the dPCR with the chip-in-a-tube method in genetic research.

Digital polymerase chain reaction (PCR) is a useful tool for the high-sensitivity detection of single nucleotide variants and DNA copy number variants. Here, we demonstrate key considerations for measuring rare variants in the human genome using digital PCR with the chip-in-a-tube format.

チップ チューブ形式を使用して散発的な家族性大腸腺腫症患者の遺伝的変異のデジタル ポリメラーゼ連鎖反応分析

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Elastic Staining on Paraffin-embedded Slides of pT3N0M0 Gastric Cancer Tissue

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and eosin (H&amp;E) staining but can be visualized through elastic staining. One of the important benefits of elastic staining is that it makes it easy to determine whether tumor cells have invaded beyond the elastic lamina. This helps in examining the extent of peritoneal surface invasion, thereby distinguishing the pT3 and pT4 stages in gastrointestinal cancer. In this study, we present a protocol to identify elastic fibers in the formalin-fixed, paraffin-embedded pT3N0M0 gastric cancer tissue sections. We prepare 5-&#181;m paraffin sections fixed on slides, and then all the slides are deparaffinated and rehydrated during the staining procedure. Subsequently, all the sections are oxidized by potassium permanganate, bleached by oxalic acid, stained by elastic staining, and counterstained by Van Gieson's. Finally, we examine the effect of staining; elastic lamina is stained blue-black and collagen fibers are stained red, while the cancer cells are stained in varying shades of yellow. We also describe in detail the methods used for determining the positional relationship between cancer cells and elastic lamina. This method is simple, low-cost, and widely applicable in the identification of peritoneal surface invasion in gastrointestinal cancer because of its outstanding selectivity for elastic fibers and authentic results.

Here, we present a protocol of elastic staining to identify elastic fibers in pT3N0M0 gastric cancer tissues on formalin-fixed, paraffin-embedded sections. Subsequently, we describe a method to determine whether tumor cells invade beyond the elastic lamina.

pT3N0M0胃癌組織のパラフィン埋め込みスライド上の弾性染色

The elastic lamina, which is usually located in the sub-mesothelial layer, adjacent to the peritoneum mesothelial cells, is amphiphilic on hematoxylin and ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular sub-classification and temporal monitoring of tumor response to therapy. Here, we describe our dPCR-based method for the detection of tumor somatic mutations in cell free DNA (cfDNA), readily available in&#160;patient biofluids. Although limited in the number of mutations that can be tested for in each assay, this method provides a high level of sensitivity and specificity. Monitoring of mutation abundance, as calculated by MAF, allows for the evaluation of tumor response to therapy, thereby providing a much-needed supplement to radiographic imaging.

Here, we present a protocol to detect tumor somatic mutations in circulating DNA present in patient biological fluids (biofluids). Our droplet digital polymerase chain reaction (dPCR)-based method enables quantification of the tumor mutation allelic frequency (MAF), facilitating a minimally invasive complement to diagnosis and temporal monitoring of tumor response.

患者の生体流体における腫瘍関連循環DNAの検出とモニタリング

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Genome-Wide Analysis of DNA Methylation in Gastrointestinal Cancer

DNA methylation is an important epigenetic change that is biologically meaningful and a frequent focus of cancer research. Genome-wide DNA methylation is a useful measure to provide an accurate analysis of the methylation status of gastrointestinal (GI) malignancies. Given the multiple potential translational uses of DNA methylation analysis, practicing clinicians and others new to DNA methylation studies need to be able to understand step by step how these genome-wide analyses are performed. The goal of this protocol is to provide a detailed description of how this method is used for the biomarker identification in GI malignancies. Importantly, we describe three critical steps that are needed to obtain accurate results during genome-wide analysis. Clearly and concisely written, these three methods are often lacking and not noticeable to those new to epigenetic studies. We used 48 samples of a GI malignancy (gastric cancer) to highlight practically how genome-wide DNA methylation analysis can be performed for GI malignancies.

Herein, we describe a procedure for genome-wide analysis of DNA methylation in gastrointestinal cancers. The procedure is of relevance to studies that investigate relationships between methylation patterns of genes and factors contributing to carcinogenesis in gastrointestinal cancers.

消化器癌におけるDNAメチル化のゲノムワイド解析

DNA methylation is an important epigenetic change that is biologically meaningful and a frequent focus of cancer research. Genome-wide DNA methylation is ...

イオントレントシーケンシングを使用した胃癌におけるSNPガイド下5-FU療法

Multi-Gene Single Nucleotide Polymorphism Detection in Gastric Cancer Based on Ion Semiconductor Sequencing Platform

Gastric cancer is a common heterogeneous tumor. Most patients have advanced gastric cancer at the time of diagnosis and often need chemotherapy. Although 5-fluorouracil (5-FU) is widely used for treatment, its therapeutic sensitivity and drug tolerance still need to be determined, which emphasizes the importance of individualized administration. Pharmacogenetics can guide the clinical implementation of individualized treatment. Single nucleotide polymorphisms (SNPs), as a genetic marker, contribute to the selection of appropriate chemotherapy regimens and dosages. Some SNPs are associated with folate metabolism, the therapeutic target of 5-FU. Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) rs1801131 and rs1801133, dihydrofolate reductase (DHFR) rs1650697 and rs442767, methionine synthase (MTR) rs1805087, gamma-glutamyl hydrolase (GGH) rs11545078 and solute carrier family 19 member 1 (SLC19A1) rs1051298 have been investigated in different kinds of cancers and antifolate antitumor drugs, which have potential forecasting and guiding significance for application of 5-FU. The ion torrent next-generation semiconductor sequencing technology can rapidly detect gastric cancer-related SNPs. Each time a base is extended in a DNA chain, an H+ will be released, causing local pH changes. The ionic sensor detects pH changes and converts chemical signals into digital signals, achieving sequencing by synthesis. This technique has low sample requirement, simple operation, low cost, and fast sequencing speed, which is beneficial for guiding individualized chemotherapy by SNPs.

著者スポットライト:胃がんにおけるフルオロウラシル応答の遺伝的プロファイリング

This protocol proposes holistic laboratory procedures required to detect single nucleotide polymorphisms in gastric cancer samples based on an ion semiconductor sequencing platform. The target sequences, ligating adapters, library amplification and purification, and quality control criteria are also described in detail.

イオン半導体シーケンシングプラットフォームに基づく胃癌における多遺伝子一塩基多型検出

Gastric cancer is a common heterogeneous tumor. Most patients have advanced gastric cancer at the time of diagnosis and often need chemotherapy. Although ...

チップを使ったデジタル PCR による新鮮凍結胃癌組織内CDH1まれなトランスクリプト変種の検出

要約

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破骨細胞形成乳房癌細胞と共培養末梢血単球からの人間の前臨床モデルの開発

次世代シーケンシングによる葉緑体の稀な遺伝子変異の検出

血清およびリアルタイム PCR を用いたプラズマコピー数検出

チップチューブ形式を使用して散発的な家族性大腸腺腫症患者の遺伝的変異のデジタルポリメラーゼ連鎖反応分析

pT3N0M0胃癌組織のパラフィン埋め込みスライド上の弾性染色

患者の生体流体における腫瘍関連循環DNAの検出とモニタリング

消化器癌におけるDNAメチル化のゲノムワイド解析

イオン半導体シーケンシングプラットフォームに基づく胃癌における多遺伝子一塩基多型検出

イオン半導体シーケンシングプラットフォームに基づく胃癌における多遺伝子一塩基多型検出

イオン半導体シーケンシングプラットフォームに基づく胃癌における多遺伝子一塩基多型検出

チップを使ったデジタル PCR による新鮮凍結胃癌組織内CDH1まれなトラン スクリプト変種の検出

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破骨細胞形成乳房癌細胞と共培養末梢血単球からの人間の前臨床モデルの開発

次世代シーケンシングによる葉緑体の稀な遺伝子変異の検出

血清およびリアルタイム PCR を用いたプラズマ コピー数検出

チップ チューブ形式を使用して散発的な家族性大腸腺腫症患者の遺伝的変異のデジタル ポリメラーゼ連鎖反応分析

pT3N0M0胃癌組織のパラフィン埋め込みスライド上の弾性染色

患者の生体流体における腫瘍関連循環DNAの検出とモニタリング

消化器癌におけるDNAメチル化のゲノムワイド解析

イオン半導体シーケンシングプラットフォームに基づく胃癌における多遺伝子一塩基多型検出

イオン半導体シーケンシングプラットフォームに基づく胃癌における多遺伝子一塩基多型検出

イオン半導体シーケンシングプラットフォームに基づく胃癌における多遺伝子一塩基多型検出

チップを使ったデジタル PCR による新鮮凍結胃癌組織内CDH1まれなトランスクリプト変種の検出

血清およびリアルタイム PCR を用いたプラズマコピー数検出

チップチューブ形式を使用して散発的な家族性大腸腺腫症患者の遺伝的変異のデジタルポリメラーゼ連鎖反応分析