彼らの科学的なサポート、ジェニファー フェイントをかけるとウルシュラ Zarzenska に感謝します。この仕事はキャリア統合許可 (CIG、PCIG14-ジョージア州-2013-63 0734) 第 7 フレームワーク プログラム、LFF GK06 'DELIGRAH' (Landesforschungsförderung ハンブルク)、グラントと DFG グラント (DFG KE 856_6-1) 内にある欧州委員会によって財政上支えられるJK に授与。

1. サンプリングやナタネから師管液の準備植物4,8,20
<ol><li>サンプリング、師部樹液植えた 8 週齢を使用してナタネ植物花粉の汚染を防ぐためにそのショーの唯一の初期開花。</li>
	<li>注射針を使用して (Ø 0.8 mm) および点状花房茎数回。いくつかの他の花房の茎と十分な師部 sap (図 2 a) を取得する他の植物を繰り返します。 メモ: 複素解析の勧め師部樹液の少なくとも 600 μ L で開始します。4 に 5 の植物師管液の 200 と 700 μ L の間になります。</li>
	<li>ろ紙を負傷したサイトから最初のドロップをふき取りなさい。これらの低下は主に負傷した組織の周囲から高汚染物質を含むし、破棄する必要があります。</li>
	<li>ピペッティングで次の滴を収集し、凍らない冷却システムを用いた-20 ° C であらかじめ冷やして円錐 1.5 mL の反応管内の収集した滲出液を格納します。</li>
	<li>さらにドロップ形成される観察可能なしかし、もはや 1 時間以上まで収集を継続します。収集した師管液の重要な損失することがなく 2 日後、この手順を繰り返すことができます。 注: 収集した師管液することができますすぐに使用または将来の分析のための-80 ° C で保存します。-80 ° C のストレージの衝撃-凍結反応チューブ液体窒素で。</li>
	<li>分子量 10,000 ダルトン (Da) のカット (MWCO) を用いた遠心コンセントレーター最初のボリュームの約 1/6thに師部サンプルを集中します。4 ° C とダスト粒子を除去する、少なくとも 15 分間 20,000 × g の集中のサンプルを遠心します。 注: 師部 sap 濃度は蛋白質の低下にはつながらない。</li>
	<li>その後の複雑な分析手順 3.1 に進みます。</li>
</ol>2. 師部 sap 純度制御逆転写 PCR (RT-PCR) 4,8,20を使用して
<ol><li>師管液液体材料の標準的な RNA 抽出法を使用してからの総 RNA の隔離 (例えばTRIzol またはフェノール-クロロホルム抽出に続いた水相洗浄手順によるとエタノールからイソプロパノールの沈殿物によって、製造元のプロトコル)。 注意: フェノール クロロホルムは有毒です。適切な個人的な保護装置のフードの下で動作します。6 ヶ月間-80 ° c のエタノールで抽出した RNA を保存できます。</li>
	<li>DNA の DNase と消化による汚染を削除私は 37 ° C で 45 分間 (1 u/μ g) EDTA を最終濃度 5 mM に追加することによって、酵素を不活性化し、75 ° C 10 分でサンプルをインキュベートします。</li>
	<li>純粋な RNA 浄化し、もう一歩浄化 (例えばRNA のクリーンアップ キット、製造元の指示に従ってを使用して) このサンプルを集中します。</li>
	<li>逆転写 PCR (RT-PCR) を共演 150 を使用して cDNA 合成キット cDNA の合成純粋な RNA の ng はメーカーで指定されているプロトコル 's。 注: cDNA は-20 ° C でさらに使用するまで格納できます。</li>
	<li>コンパートメント特定の成績証明書を増幅し、アガロース電気泳動でチェックにテンプレートとしての製造元によって指定された標準 PCR の反作用のための cDNA の 5 μ L を使用します。例えば rubisco 小サブユニット、チオレドキシン h、および花粉外被蛋白質 (表 1図 1 b) のプライマーを使用して篩部試料の純度を確認してください。</li>
</ol>3. 青ネイティブ ページ4,25,26,31
<ol><li>27または商業 Bis トリス グラデーション ジェルに従って別の場所でどちらかの自己注がれたネイティブ勾配ゲルを使用します。</li>
	<li>負荷のゲルのウェルあたり高濃度タンパク質サンプルの 20 に 30 μ g を少なくともトリプリケートします。</li>
	<li>4 ° C および 150 V でゲルを実行サンプル (約20 〜 30 分、図 3 a) ゲルの 1/3rdを渡されるまで、暗い青カソード バッファー B と陽極バッファー (表 2) を使用しています。 注: 北しみが付くこと、単一ゲル レーンで十分中、3 D ページおよびより少なく豊富な蛋白質を集中する最大 10 個のゲル レーンから同じバンドを組み合わせることをお勧めは質量分析によるタンパク質組成分析のためです。</li>
	<li>光青カソードと交換暗い青陰極バッファー B B/10 (表 2) をバッファーの実行や、実行を一時停止します。ゲル (ca. 120 に 180 分、図 3 a) ゲルから溶出するブルーのフロントの起動時に実行を終了します。 注: 完成した青ネイティブ ゲルは 4 ° C で少なくとも 1 週間保存できます。長期の保管はバンドをびまん性につながることができ、避けるべきであります。暗い青バッファー B は再利用できます。</li>
</ol>4. ブルー ネイティブ北しみが付く4を使用して RNA を検出するオプション:
<ol><li>明瞭なバンドをカット、ネイティブ ブルージェルから全体のゲルのレーンを使用または半乾燥する 60 分の 3.5 mA/cm2でしみが付くことによってナイロン膜にそれらを転送し、膜 (図 4 a) に鉛筆で上限と下限のゲルの境界線をマークします。</li>
	<li>ブロッティング後 DEPC 処理水の膜を洗浄し、2 つのフィルター ペーパーの乾燥します。</li>
	<li>120,000 μ J/cm2でブロッティング膜の紫外架橋を実行 (85 sテーブルの材料で、架橋剤を使用している場合)。</li>
	<li>前ハイブリダイゼーション オーブン (図 4 a) で 68 ° C で 60 分間交配バッファー (市販または自作) の 6 mL で膜を交配させます。</li>
	<li>3'-ビオチン化プローブの 4 μ L を含む交配バッファーの追加 1 mL を追加 (100 nM)。</li>
	<li>37 ° c. に 68 の ° C からオーブンを冷却しながら一晩、プローブと膜を孵化します。</li>
	<li>不特定にバインドされているプローブを削除する部屋の温度で 5 分間、2 x SSC と 0.1 %sds を格納するバッファーで膜を洗浄します。 注意: SDS は、炎症を引き起こす可能性が。SDS とソリューションを含む SDS を使用するときは、手袋、白衣を着用します。</li>
	<li>西洋わさびペルオキシダーゼ (HRP) 基板、高感度化学発光反応 (図 4 a) の結果として、膜などストレプトアビジン-HRP-共役とルミノールの 3'-ビオチン化プローブの検出を実行します。</li>
</ol>5. 2 番目の寸法: トリス トリシン尿素ページ4,28
<ol><li>青ネイティブ ゲルから単一のバンドを切除します。さらに複雑なタンパク質 (図 5) 濃度を達成するために車線を並列で実行サンプルからバンドを結合します。 注: 摘出バンドに格納できる単一反応管 4 ° C でさらに使用するまで</li>
	<li>12% トリス トリシン尿素ゲルを注ぎなさい (厚さ 1 mm、6.8 × 8.6 cm (幅 × 長さ))。(表 2)、分離ゲルのゲル溶液の 10 mL を準備 2 つのガラス板とイソプロパノールとオーバーレイの間注ぐ。重合終了後、イソプロパノールを取り外し、ゲルと、10 もくし挿入にスタッキングのゲルのゲル液 B (表 2) の 4 つの mL。 注意: 未重合アクリルアミドは神経毒性することができます、TEMED 吸入すると有害。常に個人保護具を着用し、フードの下で働きます。</li>
	<li>1.5 mL の反応管に摘出したゲルのバンドを転送し、ゲル部分 (図 5表 2) 平衡の SDS サンプルバッファー x 2 の 1 mL を追加します。<ol>
<li>暖房のブロック (95 ° C) または電子レンジで沸騰する前に、室温で 10 分間のサンプルをインキュベートし、さらに 15 分の室温で再度サンプルをインキュベートします。</li>
		<li>1 つの単一のゲルのポケットに同じ建物を表すいくつかの平衡ゲル部分をスタックします。</li>
		<li>アノードとカソード 45 ~ 60 分の 150 V でバッファーを実行するを使用して電気泳動を行い、全体のゲル レーンを消費税します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>酸性バッファー (100 mM 100 mM 酢酸トリス) で 20 分間カット レーンをインキュベートし、125 mm トリス-HCl、別の 20 分 (図 5) の 6.8 pH 平衡します。</li>
</ol>6. 3 次元: SDS ページ4,32
<ol><li>塩化物イオンと32によるとゲルの分離 15 %sds を注ぐ (厚さ: 1.5 ミリメートル、6.8 × 8.6 cm (幅 × 長さ)) (表 2)、ゲル上のスタック 4% の薄い層を追加。 注意: SDS、アクリルアミド、TEMED が有毒、有害であります。フードの下で働くし、個人用保護具を着用します。</li>
	<li>SDS ゲルの平衡ゲル レーンを転送し、ブロモフェノール ブルー (図 5) の微量を添加したバッファーを実行する 1 x SDS の 0.5% (w/w) agarose のゲルをカバーします。</li>
	<li>電子レンジでの agarose が付いてのバッファーをゲルにロード前に実行中の SDS を沸騰させます。</li>
	<li>単一成分の分子量を推定するためのタンパク質マーカーを実行、agarose が固化するまで一枚のゲルの 1 つの端にフィルター紙を挿入または通常 IPG ゲルに使用されます特殊な櫛を使用します。</li>
	<li>150 V 60 分と汚れでゲルを実行コロイド Coomassie、銀染色のいずれか、またはその他のゲル染色法以降の質量分析に適した。</li>
	<li>分析のようなマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法によるアプローチを使用して目に見える蛋白スポット飛行時間 (MALDI-TOF) やクロマトグラフィー-タンデム質量質量分析法。 注: 染色としてすでに記載されている33コロイド Coomassie を使用する勧めします。私たちの手でより豊富な蛋白質十分に染色することができますを使用することができ、合理的なデータ品質の質量分析。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kempers, R., van Bel, A. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symplasmic+connections+between+sieve+element+and+companion+cell+in+the+stem+phloem+ofVicia+faba+L.+have+a+molecular+exclusion+limit+of+at+least+10+kDa.">Symplasmic connections between sieve element and companion cell in the stem phloem ofVicia faba L. have a molecular exclusion limit of at least 10 kDa.</a> Planta. 201 (2), 195-201 (1997).</li><li>Stadler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+GFP-fusions+in+Arabidopsis+companion+cells+reveals+non-specific+protein+trafficking+into+sieve+elements+and+identifies+a+novel+post-phloem+domain+in+roots.">Expression of GFP-fusions in Arabidopsis companion cells reveals non-specific protein trafficking into sieve elements and identifies a novel post-phloem domain in roots.</a> Plant J. 41 (2), 319-331 (2005).</li><li>Imlau, A., Truernit, E., Sauer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+and+long-distance+trafficking+of+the+green+fluorescent+protein+in+the+phloem+and+symplastic+unloading+of+the+protein+into+sink+tissues.">Cell-to-cell and long-distance trafficking of the green fluorescent protein in the phloem and symplastic unloading of the protein into sink tissues.</a> Plant Cell. 11 (3), 309-322 (1999).</li><li>Ostendorp, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+Brassica+napus+phloem+protein+and+ribonucleoprotein+complexes.">Functional analysis of Brassica napus phloem protein and ribonucleoprotein complexes.</a> New Phytol. 214 (3), 1188-1197 (2017).</li><li>Paultre, D. S. G., Gustin, M. -. P., Molnar, A., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lost+in+Transit:+Long-Distance+Trafficking+and+Phloem+Unloading+of+Protein+Signals+in+Arabidopsis+Homografts.">Lost in Transit: Long-Distance Trafficking and Phloem Unloading of Protein Signals in Arabidopsis Homografts.</a> Plant Cell. 28 (9), 2016-2025 (2016).</li><li>Sali, A., Glaeser, R., Earnest, T., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+words+to+literature+in+structural+proteomics.">From words to literature in structural proteomics.</a> Nature. 422 (6928), 216-225 (2003).</li><li>Lin, M. -. K., Lee, Y. -. J., Lough, T. J., Phinney, B. S., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Pumpkin+Phloem+Proteome+Provides+Insights+into+Angiosperm+Sieve+Tube+Function.">Analysis of the Pumpkin Phloem Proteome Provides Insights into Angiosperm Sieve Tube Function.</a> Mol. Cell. Proteomics. 8 (2), 343-356 (2008).</li><li>Giavalisco, P., Kapitza, K., Kolasa, A., Buhtz, A., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+proteome+of+Brassica+napus+phloem+sap.">Towards the proteome of Brassica napus phloem sap.</a> Proteomics. 6 (3), 896-909 (2006).</li><li>Lucas, W. J., Yoo, B. C., Kragler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+as+a+long-distance+information+macromolecule+in+plants.">RNA as a long-distance information macromolecule in plants.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Bio. 2 (11), 849-857 (2001).</li><li>Dinant, S., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sampling+and+Analysis+of+Phloem+Sap.">Sampling and Analysis of Phloem Sap.</a> Plant Mineral Nutrients. 953, 185-194 (2013).</li><li>Kennedy, J. S., Mittler, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+of+obtaining+Phloem+Sap+via+the+Mouth-parts+of+Aphids.">A Method of obtaining Phloem Sap via the Mouth-parts of Aphids.</a> Nature. 171 (4351), 528 (1953).</li><li>King, R. W., Zeevaart, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+Phloem+exudation+from+cut+petioles+by+chelating+agents.">Enhancement of Phloem exudation from cut petioles by chelating agents.</a> Plant Physiol. 53 (1), 96-103 (1974).</li><li>Alosi, M. C., Melroy, D. L., Park, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+gelation+of+Phloem+exudate+from+cucurbita+fruit+by+dilution,+glutathione,+and+glutathione+reductase.">The regulation of gelation of Phloem exudate from cucurbita fruit by dilution, glutathione, and glutathione reductase.</a> Plant Physiol. 86 (4), 1089-1094 (1988).</li><li>Dinant, S., Bonnemain, J. -. L., Girousse, C., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phloem+sap+intricacy+and+interplay+with+aphid+feeding.">Phloem sap intricacy and interplay with aphid feeding.</a> Comptes rendus biologies. 333 (6-7), 504-515 (2010).</li><li>Tetyuk, O., Benning, U. F., Hoffmann-Benning, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collection+and+analysis+of+Arabidopsis+phloem+exudates+using+the+EDTA-facilitated+Method.">Collection and analysis of Arabidopsis phloem exudates using the EDTA-facilitated Method.</a> J Vis Exp. (80), e51111 (2013).</li><li>Kovalskaya, N., Owens, R., Baker, C. J., Deahl, K., Hammond, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+modified+EDTA-mediated+exudation+technique+and+guttation+fluid+analysis+for+Potato+spindle+tuber+viroid+RNA+detection+in+tomato+plants+(Solanum+lycopersicum).">Application of a modified EDTA-mediated exudation technique and guttation fluid analysis for Potato spindle tuber viroid RNA detection in tomato plants (Solanum lycopersicum).</a> J. Virol. Methods. 198, 75-81 (2014).</li><li>Rodriguez-Medina, C., Atkins, C. A., Mann, A. J., Jordan, M. E., Smith, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+composition+of+phloem+exudate+from+white+lupin+(Lupinus+albus+L).">Macromolecular composition of phloem exudate from white lupin (Lupinus albus L).</a> BMC Plant Biol. 11 (1), 36 (2011).</li><li>Taylor, J. S., Thompson, B., Pate, J. S., Atkins, C. A., Pharis, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinins+in+the+Phloem+Sap+of+White+Lupin+(Lupinus+albus+L.).">Cytokinins in the Phloem Sap of White Lupin (Lupinus albus L.).</a> Plant Physiol. 94 (4), 1714-1720 (1990).</li><li>Yoo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Systemic+Small+RNA+Signaling+System+in+Plants.">A Systemic Small RNA Signaling System in Plants.</a> Plant Cell. 16 (8), 1979-2000 (2004).</li><li>Buhtz, A., Springer, F., Chappell, L., Baulcombe, D. C., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+small+RNAs+from+the+phloem+of+Brassica+napus.">Identification and characterization of small RNAs from the phloem of Brassica napus.</a> Plant J. 53 (5), 739-749 (2008).</li><li>Chalhoub, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+genetics.+Early+allopolyploid+evolution+in+the+post-Neolithic+Brassica+napus+oilseed+genome.">Plant genetics. Early allopolyploid evolution in the post-Neolithic Brassica napus oilseed genome.</a> Science. 345 (6199), 950-953 (2014).</li><li>Sasaki, T., Chino, M., Hayashi, H., Fujiwara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+several+mRNA+species+in+rice+phloem+sap.">Detection of several mRNA species in rice phloem sap.</a> Plant Cell Phys. 39 (8), 895-897 (1998).</li><li>Doering-Saad, C., Newbury, H. J., Bale, J. S., Pritchard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+aphid+stylectomy+and+RT-PCR+for+the+detection+of+transporter+mRNAs+in+sieve+elements.">Use of aphid stylectomy and RT-PCR for the detection of transporter mRNAs in sieve elements.</a> J Exp. Bot. 53 (369), 631-637 (2002).</li><li>Ruiz-Medrano, R., Xoconostle-C&#225;zares, B., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phloem+long-distance+transport+of+CmNACP+mRNA:+implications+for+supracellular+regulation+in+plants.">Phloem long-distance transport of CmNACP mRNA: implications for supracellular regulation in plants.</a> Dev. 126 (20), 4405-4419 (1999).</li><li>Sch&#228;gger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis.">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal. Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li><li>Sch&#228;gger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form.">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal. Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li><li>Fiala, G. J., Schamel, W. W. A., Blumenthal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(BN-PAGE)+for+analysis+of+multiprotein+complexes+from+cellular+lysates.">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates.</a> J Vis Exp. (48), e2164 (2011).</li><li>Rais, I., Karas, M., Sch&#228;gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+electrophoresis+for+the+isolation+of+integral+membrane+proteins+and+mass+spectrometric+identification.">Two-dimensional electrophoresis for the isolation of integral membrane proteins and mass spectrometric identification.</a> Proteomics. 4 (9), 2567-2571 (2004).</li><li>Sch&#228;gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tricine-SDS-PAGE.">Tricine-SDS-PAGE.</a> Nature protocols. 1 (1), 16-22 (2006).</li><li>Wittig, I., Braun, H. -. P., Sch&#228;gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+PAGE.">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li><li>Eubel, H., Braun, H. -. P., Millar, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue-native+PAGE+in+plants:+a+tool+in+analysis+of+protein-protein+interactions.">Blue-native PAGE in plants: a tool in analysis of protein-protein interactions.</a> Plant Methods. 1 (1), 11 (2005).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Dyballa, N., Metzger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+sensitive+colloidal+coomassie+G-250+staining+for+proteins+in+polyacrylamide+gels.">Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels.</a> J Vis Exp. (30), (2009).</li><li>Turnbull, C. G. N., Lopez-Cobollo, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heavy+traffic+in+the+fast+lane:+long-distance+signalling+by+macromolecules.">Heavy traffic in the fast lane: long-distance signalling by macromolecules.</a> New Phytol. 198 (1), 33-51 (2013).</li><li>Hall, S. M., Baker, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+composition+of+Ricinus+phloem+exudate.">The chemical composition of Ricinus phloem exudate.</a> Planta. 106 (2), 131-140 (1972).</li><li>Barnes, A., Bale, J., Constantinidou, C., Ashton, P., Jones, A., Pritchard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+protein+identity+from+sieve+element+sap+in+Ricinus+communis+L.+by+quadrupole+time+of+flight+(Q-TOF)+mass+spectrometry.">Determining protein identity from sieve element sap in Ricinus communis L. by quadrupole time of flight (Q-TOF) mass spectrometry.</a> J. Exp. Bot. 55 (402), 1473-1481 (2004).</li><li>Walz, C., Giavalisco, P., Schad, M., Juenger, M., Klose, J., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+of+curcurbit+phloem+exudate+reveals+a+network+of+defence+proteins.">Proteomics of curcurbit phloem exudate reveals a network of defence proteins.</a> Phytochemistry. 65 (12), 1795-1804 (2004).</li><li>Walz, C., Juenger, M., Schad, M., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+the+presence+and+activity+of+a+complete+antioxidant+defence+system+in+mature+sieve+tubes.">Evidence for the presence and activity of a complete antioxidant defence system in mature sieve tubes.</a> Plant J. 31 (2), 189-197 (2002).</li><li>Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phloem+sap+proteins:+their+identities+and+potential+roles+in+the+interaction+between+plants+and+phloem-feeding+insects.">Phloem sap proteins: their identities and potential roles in the interaction between plants and phloem-feeding insects.</a> J Exp. Bot. 57 (4), 767-774 (2006).</li><li>Ham, B. -. K., Brandom, J. L., Xoconostle-C&#225;zares, B., Ringgold, V., Lough, T. J., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+polypyrimidine+tract+binding+protein,+pumpkin+RBP50,+forms+the+basis+of+a+phloem-mobile+ribonucleoprotein+complex.">A polypyrimidine tract binding protein, pumpkin RBP50, forms the basis of a phloem-mobile ribonucleoprotein complex.</a> Plant Cell. 21 (1), 197-215 (2009).</li><li>Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotinylation+of+protein+complexes+may+lead+to+aggregation+as+well+as+to+loss+of+subunits+as+revealed+by+Blue+Native+PAGE.">Biotinylation of protein complexes may lead to aggregation as well as to loss of subunits as revealed by Blue Native PAGE.</a> J. Immunol. Methods. 252 (1-2), 171-174 (2001).</li><li>Zhang, S., Sun, L., Kragler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phloem-delivered+RNA+pool+contains+small+noncoding+RNAs+and+interferes+with+translation.">The phloem-delivered RNA pool contains small noncoding RNAs and interferes with translation.</a> Plant Physiol. 150 (1), 378-387 (2009).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

師部は高利のコンパートメント、深水の主要交通ルートを構成する、別の植物の部品9,20,34、間長距離シグナル伝達に必須でも 35。小さな分子に加えてタンパク質と Rna のような高分子は師部メンテナンスとシグナリング4,7,8関与しています。師部組成の分析は、ほとんど植物の師部サンプルに限られたアクセシビリティによって制限されます。昆虫スタイレット手法は広く適用が実験的に厳しいと師部サンプル11の非常に少量の結果します。師部をサンプリングするために使用される 1 つの簡単なテクニックは、EDTA 促進溶出12です。EDTA はカルシウムのような二価イオンをキレートおよび P 蛋白質およびカロースによる篩板の閉鎖を防止すること。それは使いやすいが、損傷した細胞による汚染しやすい、サンプルを希釈します。EDTA による二価イオンの破壊も、既存の複合体の破壊に 。ただし、それはモデル植物シロイヌナズナ15を含む種の広い範囲からのサンプリングができます。師部樹液の自発的な滲出物は、植物種の小さい数でのみ発生します。植物組織10の重大な傷害を伴う侵襲的な方法です。我々 は最近の長距離輸送4,8,20を研究モデル種としてナタネを設立しました。ここで、師管液楽しめます小さな切開から負傷の影響と汚染源を軽減できます。
別のサンプリング技術を使用して、別の植物種から採取された師部のプロテオームを近年7,8,17,36,37,で検討されている38,39。これらのプロテオーム研究蛋白質で抽出、条件の変化の下で沈殿蛋白質: 蛋白質および蛋白質についての結論を許可しないため、: 核酸相互作用が原産の条件の下に存在します。Co-免疫沈降 (CoIP) とオーバーレイの試金示されるカボチャ40、師部樹液の主要なリボ核蛋白質の複雑ながありますが、内のネイティブの条件の下で任意の高分子複合体が存在することを認められなかった、師部システム。
Schäggerらによって導入された、青ネイティブ ページ26日以降高解像度ゲル電気泳動手順との組み合わせでは、大規模なタンパク質複合体の個々 のコンポーネントの分離を有効にします。ネイティブナタネの 3 D ページ解析を使用して, 篩部の滲出液が最近ことを示すいくつかの高分子量蛋白質: 蛋白質と RNP 複合体師部サンプルに存在が酵素によって実行中4。サイズ排除クロマトグラフィーのような蛋白質の複合体として結合を分離する方法は存在するが、BN ページと比較した場合は解像度の面で失敗する可能性があります。さらに、複雑な分離の合理的な品質、サイズ排除列行列は調査されている全体的な複雑な分子量に応じて対応しなければなりません。異なるサイズの複合体を分析、したがって集中的なコストは、BN ページとして高い焦点を力として可能にしない列の種類を要求します。
ナタネから複合体を分析するための重要なステップは、師管液の開始材料として使用を含めます。師部サンプルの少なくとも 600 μ L 必要し、5 つ植えた植物から得られます。3 D ページおよび BN 北しみが付くことの師部サンプルの十分な量の初期の BN ゲルを開始する必要が。これを達成するには、師部サンプル集中している蛋白質の 20 に 30 μ g は、よく、少なくともそれぞれに読み込まれることができますまで並列で実行される同じサンプルのトリプリケートします。低すぎるか高すぎる濃度を減らす複合体 (図 3) の検出。師部のサンプルは、氷の上の反応管に収集する必要があります、タンパク質分解と売り上げ高を避けるために後で使用できるフリーズされて保存されるべきであります。プロテアーゼ阻害剤は、すべて師部プロテオーム解析で発見されているが、ナタネ4の師部の完全にアクティブなプロテアソームがまた記述されていた。さらに、ボリュームと師部サンプル組成依存サンプリング時点で環境条件10。したがって同じような条件の下で一日の同じ時間で収集するためには注意が必要があります。ストレス治療 (干ばつなど) は収集できる師部の量を減らすことができます。質量分析法による単一蛋白質を識別するために、すべての時間の手袋を装着して可能なケラチン汚染を制限する必須です。ケラチンは質量スペック解析時に追加の信号につながるし、タンパク質の同定を妨げません。高電圧や周囲温度で BN ページで実行すると、壊れやすい複合体の分解が生じるゲルの加熱につながります。
ここで提示されたプロトコルは蛋白質: 蛋白質複合体の解析に適しています。また、使用と並列の複合体に含まれている特定の Rna を検出できますが.これを達成するには、最近 BN 北部4しみが付くことのためのプロトコルを導入しました。Rna は、RNAse 汚染による劣化になりやすいです。このような劣化を抑える DEPC 処理水使用してください。
本手法の主な制限は、移行動作サイズ、形状とも複合体31、翻訳後修飾によって異なりますので BN-PAGE - で区切られたタンパク質の分子量の推定 41。RNP 複合体のサイズ推定は移行挙動に及ぼす核酸が原因も複雑です。それも防止できない同じサイズの複合体は共同 1 つの単一バンドに移行。これは複雑な組成の誤った予測につながることができます。例えば機能アッセイ4、したがって、相補的な手法で観測された相互作用を検証するは必要で 。蛋白質だけ弱いか一過性高分子複合体に関連付けられている使用される BN バッファー失われる可能性があります。これを避けるためには、サンプルが架橋、成果物につながることができますか、タンパク質同定を防ぐことができるまたはバッファー条件を最適化することができます。
古典的な 2 D のページとは対照的組み合わせ尿素-SDS-PAGE の疎水性と等電点 (pI) と分子量28ではなく分子量に従って分離し、蛋白質の分離は制限されません、特定の pI の範囲です。古典に類似した 2 D ページ、分離タンパク質シングル スポットとして表示されますが、対角線上線4,28 (図 5, 図 6)。ライン28下より親水性タンパク質が見つかったに対し、この対角線上のスポットで多くの疎水性タンパク質が表示されます。このプロトコルで使用されるポリアクリルアミド濃度は 25 に 80 kDa のタンパク質をよく分離されます。小さいまたは大きいタンパク質の分離、ポリアクリルアミドを許可するように濃度を変えることができるまたは勾配ゲルを 3 番目のディメンションで使用できます。3 D ページ (図 6) で区切られた複雑な IV (図 3) のコンポーネントは、トリプシン消化、および質量分析法による分析をカットされました。これは、いくつかの tRNA のリガーゼの特定につながった。他の複合体のコンポーネントをされている最近、 4を公開します。当社の 3 D ページには、異なるリガーゼ、すなわちアスパラギン酸、アスパラギン、スレオニン、リジン、グリシンのリガーゼ、同じような分子量 (表 3) との分離が有効になります。メチオニン tRNA 特定プローブを使用して、我々 は複雑な IV 内可能性がありますバインドされた tRNA を検出することができたが、フルレングス tRNA または tRNA 断片が、複雑な場合は使用プローブと差別されることはできません。プロテアーゼ消化師部 sap である核酸は本当にコンプレックス内連結および共同移行ではない場合、チェックするには、サンプルは適切なマイグレーション制御として役立つかもしれない。
それは師部篩管内でタンパク質翻訳することができます行われる師部サンプル4,7で伸長因子と同様、全体のリボソームのほとんどのコンポーネントが検出されましたので以前推測されています。TRNA と tRNA のリガーゼの私達の見つけることはこの考えを支持するようです。しかし、カボチャから篩部のサンプルで現在の tRNA 断片が翻訳42の強力な阻害剤に示されている、機能的なリボゾーム欠席4翻訳が場所を取ることができないことを示唆するように見えます。
一緒に取られて、ここで提示されたプロトコルは、高解像度の個々 のコンポーネントのネイティブ蛋白質: 蛋白質および師部のサンプルと分離からも RNP 複合体の分離と同定をことができます。このメソッドのアプリケーションは新規タンパク質と師部サンプル RNP 複合体の検出を有効し、したがってこの専門性の高い工場区画の新機能を解明することができます。

師部の長距離導管高等植物の有機性栄養素の配分に欠かせないが成長と発展、病原体の防御と悪影響への適応の重要な多くの異なるプロセスに関与するも環境条件。イオン、植物ホルモン、または自分自身の代謝物のような小さなエフェクタは、ほかのタンパク質と Rna のような高分子最近潜在的な信号として浮上しています。
研究は、蛋白質の師部読み込みがサイズ依存と伴細胞 (CC) の接続孔 plasmodesmal 単位のサイズ排除限界 (SEL) で制御したことを示されているふるいの要素 (SE) に 10 の範囲に通常ある、> 67 kDa の1,2,3しかし、にもかかわらずこれらのサイズ制限より大きい蛋白質および蛋白質の複合体は、サイズ排除4のアイデアに挑戦師部システム内発見されている、推奨5 、CC からタンパク質が SE にも非特異的失われて。.
物質として大きなリボ核蛋白質複合体は、生合成・ セル6の構造の整合性の維持に極めて重要な役割を再生します。4、7を師部携帯タンパク質とリボ核蛋白質複合体に存在する証拠があるが、その機能についてはほとんど知られている日付に。篩ふるいの要素: タンパク質と RNP 複合体が関与している長距離輸送および/または信号8,9。その組成変動を受ける環境を勉強して転体の機能の解明や、ストレス条件が必要です。そのためには、ネイティブ複合体を分離する必要があり、そのコンポーネントは、十分な解像度と分離しなければなりません。
師部から高分子量複合体を分離、十分な質と量の sap サンプルを取得するの先決です。師部をサンプリングするために使用できる手法は、興味の植物種に依存します。師管液を取得する 3 つの主な方法存在10: 昆虫 stylectomy11、EDTA 促進溶出12、および自発的な滲出物13。
シロイヌナズナ(a)、研究所、世界中で主要なモデル プラントからの師部のサンプルは、EDTA 促進溶出やアブラムシ stylectomy14,15でのみ取得できます。両方のメソッドは、非常に希釈師部 sap または非常に低いサンプル量に します。EDTA 促進溶出も汚染しやすい、実際師部組成16を表さないことがあります。自発師部滲出物は、植物の部分を切断は簡単に収集した13,17,18をすることができます師部樹液の自然放出につながる、ウリ、ルピナス、ユッカなど植物に限定 19。我々 は最近篩分析のための適切なモデル システムとしてナタネ (ナタネ) を設立、シロイヌナズナの近親と師管液のいくつかマイクロリットルを示されている小切開から取得できますので高純度4,8,20であります。さらに、ナタネのゲノム塩基配列は 2014年21にリリースされました。
アブラムシの stylectomy を除いて説明すべての師部コレクション方法は周囲のサンプリング、現場組織の損傷を含めるし、師管液の組成は、損傷に応答変更可能性があります。したがってサンプリング法に関係なく、師部サンプルの品質をチェックする不可欠です。例えばRNase 活動22,23Rubisco8,24プライマーと PCR または砂糖の分析による決定により収集された師部 sap の品質管理のさまざまな方法があります。組成8。
サイズ排除クロマトグラフィー、ショ糖密度遠心明確な分子量カット膜によるサンプルろ過などを分離し、タンパク質複合体を分離するさまざまな方法を適用できるトレードオフです。ただし、これらのアプローチは高解像度を許さない。最初 Schäggerらによって記述された青ネイティブ ページ (BN-PAGE) と呼ばれる手法。25日は解像度の面で優れています。それは正常に様々 な細胞小器官や細胞可溶化物の相対的な存在量26,27から大規模なネイティブ タンパク質の分子量を決定するため使用されました。
さらにタンパク質の複雑な組成の解明、複雑な部品の完全な分解につながる条件の変化の下で個々 のコンポーネントを分離する必要は。これは SDS ページ28,29またはより高い解像度を実現、等電集中 (IEF) の 2 番目の次元で続いて SDS ページ30の third dimension との識別をその後に 2 番目の次元によって達成することができます。質量分析法を用いたタンパク質。
このプロトコルでは、ナタネ植物から純粋な師部樹液の採取・ BN-PAGE-トリス-トリシン-尿素-ページおよび SDS のページを組み合わせて 3 D 電気泳動のアプローチを使用してこのような師部サンプルからタンパク質複合体の分析について説明します。複雑なコンポーネントは、質量分析法による識別されますその後分離されたタンパク質。さらに、紹介するブルー ネイティブ北しみが付くこと大きい RNP 複合体4Rna の検出を許可する方法としてアプローチの適用性を拡張します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL reaction tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 well comb for SDS PAGE, thickness 1 mm</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>131090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 % Acrylamide-bisacrylamide solution (29:1) solution</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 % Acrylamide-bisacrylamide solution (37.5:1) solution</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 % Ethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum sulfate-(14-18)-hydrate</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>141101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium peroxodisulfate (APS)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9592.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Tris</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal concentrators e.g. Vivaspin 500 (Mwco 10 kDa)</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatography papers e.g. 3 mm CHR</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>3030-153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolBox M30 System</td>
			<td>Biocision</td>
			<td>BCS-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie brilliant Blue G-250</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol abs.</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Imaging system e.g. Chemidoc Touch</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 1kb plus</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SM1331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>141339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>131340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block TS1</td>
			<td>Biometra</td>
			<td>846-051-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven e.g. GFL Hybridization Incubator 7601</td>
			<td>GFL</td>
			<td>7601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic needle (0.8 mm)</td>
			<td>B Braun</td>
			<td>4658309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPG gel comb, thickness 1 mm</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1653367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling of RNA e.g.Biotin 3&#39;end DNA Labeling Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Native gradient gel e.g. Novex NativePAGE 4&#8211;16% Bis-Tris protein gel</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>BN1002BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon membrane e.g. Hybond-N+</td>
			<td>Amersham Pharmacia</td>
			<td>RPN203B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ortho-phosphoric acid</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6366.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler prestained protein ladder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply for Gel electrophoresis EPS</td>
			<td>Amersham Pharmacia</td>
			<td>18-1130-01</td>
			<td>available from GE Healthcare</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Cleanup Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi dry blot e.g. Fastblot 43B semi dry Blot</td>
			<td>Biometra</td>
			<td>846-015-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>142363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthesis of cDNA e.g. RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K1621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricine</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-sodium citrate dihydrate</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ULTRAhyb Ultrasensitive Hybridization Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM8670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Crosslinker e.g. Stratalinker 2400</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>NC0477671</td>
			<td>from Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical electrophoresis apparatus e.g.The XCell SureLock Mini-Cell or Mini-Protean III System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific or BioRad</td>
			<td>EI0001 or 1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wipers e.g. KIMWIPES Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phloem sap sampling from brassica napus for 3d-page of protein and ribonucleoprotein complexes

高等植物の篩管液をサンプリング、しばしば骨の折れると植物種に大きく依存。ただし、別の植物種の変性条件下のプロテオーム研究を達成できます。ネイティブ蛋白質: 蛋白質および蛋白質: 師部のサンプルから核酸複合体、まだやっとのことで分析されているこの特殊な区画の維持または長距離シグナル伝達で重要な役割を果たしている可能性が。大きな分子は、青ネイティブ ゲル電気泳動法 (BN] ページ) を使用して分離できます。その後ナトリウム ドデシル硫酸ページ (SDS-PAGE) による、タンパク質成分を分離できます。ただし、同じような分子量が付いている蛋白質共同移行、質量分析法によるタンパク質の同定を妨げることができるか。BN-PAGE-を組み合わせて 2 つ異なる変性ゲル電気泳動手順、すなわちトリス トリシン尿素と SDS ページの親水性/疎水性に従ってタンパク質を追加分離できます、解像度と成功を増やしますタンパク質同定。それも違いだけで、翻訳後修飾タンパク質を区別することができます。さらに、高分子複合体の RNA コンポーネントを識別するには、青いネイティブ北しみが付くことを適用できます。我々 のプロトコルが蛋白質およびネイティブ蛋白質: 蛋白質および師部のサンプルで発生するリボ核タンパク質 (RNP) 複合体の RNA 成分の解明に適していることを示します。青を組み合わせること 2 つの異なる変化ページ手順でネイティブ ページは異なった種類の大きい蛋白質の複合体を分離することができ、質量分析法による部品の高められた識別率ができます。さらに、プロトコルは同時に 1 つの蛋白質の複合体の内で潜在的にバインドされている核酸を検出する十分な堅牢です。

Watch this Scientific Journal Video about Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes at JoVE.com

タンパク質およびリボ核タンパク質複合体の 3D-PAGE のためのアブラナ属セイヨウアブラナからの師部樹液のサンプリング |生物学 |ビデオ

Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

タンパク質とリボ核蛋白質複合体の 3 D ページのナタネから師部 Sap サンプリング

大規模なネイティブ蛋白質: 蛋白質および蛋白質の蛋白質組成を分析するためのプロトコルの紹介: ナタネから核酸複合体 (ナタネ)ブルーを組み合わせて 3 D ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (ページ) アプローチを使用して篩部の滲出液ネイティブ (BN) 質量分析による同定が続く変化の 2 つのページを持つ。

Sampling the phloem of higher plants is often laborious and significantly dependent on the plant species. However, proteome studies under denaturing ...

phloem-sap-sampling-from-brassica-napus-for-3d-page-protein

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

Fundamentals

Macromolecules

SCIENTISTS IN ACTION

13.7K ビュー.  Universität Hamburg. 大規模なネイティブ蛋白質: 蛋白質および蛋白質の蛋白質組成を分析するためのプロトコルの紹介: ナタネから核酸複合体 (ナタネ)ブルーを組み合わせて 3 D ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (ページ) アプローチを使用して篩部の滲出液ネイティブ (BN) 質量分析による同定が続く変化の 2 つのページを持つ。

ビデオ: Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A nucleoprotein (NP) into viral ribonulceoprotein particles (vRNPs). The influenza vRNPs are enclosed within the viral envelope. During cell entry, however, these vRNP complexes are released into the cytoplasm, where they gain access to the host nuclear transport machinery. In order to study the nuclear import of influenza vRNPs and the replication of the influenza genome, it is useful to work with isolated vRNPs so that other components of the virus do not interfere with these processes. Here, we describe a procedure to purify these vRNPs from the influenza A virus. The procedure starts with the disruption of the influenza A virion with detergents in order to release the vRNP complexes from the enveloped virion. The vRNPs are then separated from the other components of the influenza A virion on a 33-70% discontinuous glycerol gradient by velocity sedimentation. The fractions obtained from the glycerol gradient are then analyzed on via SDS-PAGE after staining with Coomassie blue. The peak fractions containing NP are then pooled together and concentrated by centrifugation. After concentration, the integrity of the vRNPs is verified by visualization of the vRNPs by transmission electron microscopy after negative staining. The glycerol gradient purification is a modification of that from Kemler et al. (1994)1, and the negative staining has been performed by Wu et al. (2007).2

The genome of the influenza A virus consists of eight separate complexes of RNA and proteins, termed viral ribonucleoprotein complexes (vRNPs). This paper describes the glycerol gradient purification and transmission electron microscopy visualization of influenza A vRNPs.

インフルエンザウイルスリボ核タンパク質複合体の精製と可視化

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

生物学

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

S. cerevisiaeの定量的プロテオミクスとタンパク質の複合体の同定

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

液相の回復と分子量ベース画用GELFREE 8100分別システムの使用

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

構造質量分析法によって大きなタンパク質複合体の分析

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

見つけにくい小型哺乳類から高品質のDNAを得るために非侵襲ヘアサンプリング法

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, including transcription factors (e.g. nuclear receptors, p53) and protein kinases (e.g. Src, Raf, Akt kinase) involved in cell cycling, tumorigenesis, apoptosis, and multiple eukaryotic signaling pathways 1,2. Of these many 'client' proteins for hsp90, the assembly of steroid receptor&bull;hsp90 complexes is the best defined (Figure 1). We present here an adaptable glucocorticoid receptor (GR) immunoprecipitation assay and in vitro GR&bull;hsp90 reconstitution method that may be readily used to probe eukaryotic hsp90 functional activity, hsp90-mediated steroid receptor ligand binding, and molecular chaperone cofactor requirements. For example, this assay can be used to test hsp90 cofactor requirements and the effects of adding exogenous compounds to the reconstitution process. 
The GR has been a particularly useful system for studying hsp90 because the receptor must be bound to hsp90 to have an open ligand binding cleft that is accessible to steroid 3. Endogenous, unliganded GR is present in the cytoplasm of mammalian cells noncovalently bound to hsp90. As found in the endogenous GR&bull;hsp90 heterocomplex, the GR ligand binding cleft is open and capable of binding steroid. If hsp90 dissociates from the GR or if its function is inhibited, the receptor is unable to bind steroid and requires reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex before steroid binding activity is restored 4 . GR can be immunoprecipitated from cell cytosol using a monoclonal antibody, and proteins such as hsp90 complexed to the GR can be assayed by western blot. Steroid binding activity of the immunoprecipitated GR can be determined by incubating the immunopellet with [3H]steroid. 
Previous experiments have shown hsp90-mediated opening of the GR ligand binding cleft requires hsp70, a second molecular chaperone also essential for eukaryotic cell viability. Biochemical activity of hsp90 and hsp70 are catalyzed by co-chaperone proteins Hop, hsp40, and p23 5. A multiprotein chaperone machinery containing hsp90, hsp70, Hop, and hsp40 are endogenously present in eukaryotic cell cytoplasm, and reticulocyte lysate provides a chaperone-rich protein source 6. 
In the method presented, GR is immunoadsorbed from cell cytosol and stripped of the endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery using mild salt conditions. The salt-stripped GR is then incubated with reticulocyte lysate, ATP, and K+, which results in the reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex and reactivation of steroid binding activity 7. This method can be utilized to test the effects of various chaperone cofactors, novel proteins, and experimental hsp90 or GR inhibitors in order to determine their functional significance on hsp90-mediated steroid binding 8-11.

An in vitro method for preparing functional glucocorticoid receptor (GR)&#x2022;hsp90 protein complexes from purified proteins and cellular lysates is described. The method utilizes immunoadsorption of recombinant GR followed by salt-stripping and protein complex reconstitution. The importance of cofactors and buffer conditions are discussed, as are potential method applications.

ステロイド受容体の生化学的再構成には、•Hsp90のタンパク質複合体とリガンド結合の再活性化

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and readily available form of data collection. In many research and disease models however, steady state levels of target gene mRNA does not always directly correlate with steady state protein levels. Post-transcriptional gene regulation is a likely explanation of the divergence between the two. Driven by the binding of RNA Binding Proteins (RBP), post-transcriptional regulation affects mRNA localization, stability and translation by forming a Ribonucleoprotein (RNP) complex with target mRNAs. Identifying these unknown de novo mRNA targets from cellular extracts in the RNP complex is pivotal to understanding mechanisms and functions of the RBP and their resulting effect on protein output. This protocol outlines a method termed RNP immunoprecipitation-microarray (RIP-Chip), which allows for the identification of specific mRNAs associated in the ribonucleoprotein complex, under changing experimental conditions, along with options to further optimize an experiment for the individual researcher. With this important experimental tool, researchers can explore the intricate mechanisms associated with post-transcriptional gene regulation as well as other ribonucleoprotein interactions.

A step by step protocol to isolating and identifying RNA associated complexes through RIP-Chip.

RIP-チップを用いた細胞抽出物からmRNAを、マイクロRNAとリボ核タンパク質複合体のタンパク質成分の分離と​​同定するための方法

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

植物タンパク質複合体の翻訳後修飾の同定

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to assemble. Therefore, to identify these functional protein complexes, it is important to stabilize them in vivo before cell lysis and subsequent purification. Here we describe a method used to isolate large bona fide protein complexes from Drosophila embryos. This method is based on embryo permeabilization and stabilization of the complexes inside the embryos by in vivo crosslinking using a low concentration of formaldehyde, which can easily cross the cell membrane. Subsequently, the protein complex of interest is immunopurified followed by gel purification and analyzed by mass spectrometry. We illustrate this method using purification of a Tudor protein complex, which is essential for germline development. Tudor is a large protein, which contains multiple Tudor domains - small modules that interact with methylated arginines or lysines of target proteins. This method can be adapted for isolation of native protein complexes from different organisms and tissues.

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Multi-component protein complexes play crucial roles during cellular function and development. Here we describe a method used to isolate native protein complexes from Drosophila embryos after in vivo crosslinking followed by purification of the crosslinked complexes for subsequent structure-function analysis.

アン in vivoで</emからのタンパク質複合体を分離するために>架橋アプローチショウジョウバエ胚

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, proteins, and glucose, yet the composition of the blood is dynamically regulated and easily perturbed. One factor that can change the blood composition is the stress response triggered by the sampling procedure, which can contribute to variability in the measures of interest. Here we describe a procedure for blood sampling from the lateral tail vein in the rat. This procedure offers significant advantages over other more commonly used techniques. It permits rapid sampling with minimal pain or invasiveness, without anesthesia or analgesia. Additionally, it can be used to obtain large volume samples (upwards of 1 ml in some rats), and it may be used repeatedly across experimental days. By minimizing the stress response and pain resulting from blood sampling, measures can more accurately reflect the true basal state of the animal, with minimal influence from the sampling procedure itself.

Blood samples are useful for assessing biomarkers of physiological states or disease in vivo. Here we describe the methodology to sample blood from the lateral tail vein in the rat. This method provides rapid samples with minimal pain and invasiveness.

ラットの外側尾静脈から血液をサンプリング

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...