Name: two-step approach to explore early- and late-stages of organ formation in the avian model: the thymus and parathyroid glands organogenesis paradigm
Uploaded: 2018-06-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two-step Approach to Explore Early- and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm at JoVE.co

著者は原稿、ビデオ ナレーションのパドマ Akkapeddi の批判的アントニオ Cidadão、イザベル Alcobia レオノル パレイラし感謝しているし、セルバンテス ・ デ ・ Histologia e の組織サービスからビトー プロアに Biologia を行うDesenvolvimento、Faculdade ・ デ ・ メディチーナ ・ デ ・ リスボア、パラナ ・ デ ・ リスボア、テクニカル サポートのため。Faculdade ・ デ ・ Unidade ・ デ ・ audiovisuais (視聴覚ユニット) からサンパウロ Caeiro とヒューゴ ・ シルバに特にお世話になっておりますメディチーナ ・ デ ・ リスボア、このビデオの生産への顕著なコミットメントのパラナ ・ デ ・ リスボア。我々 は親切提供するビデオ システムと Interaves を装備した堅実ライカマイクロシス テムズ株式会社を認める - Sociedade 農業 Pecuária、ウズラに貢献してくれて S.A 受精卵。この作品は、Faculdade ・ デ ・によって支えられたメディチーナ ・ デ ・ リスボア、パラナ de Lisboa (FMUL)。

これらすべての実験動物の世話やセントロ Académico ・ デ ・ メディチーナ ・ デ ・倫理的なガイドラインに従うリスボア。
1. 受精ウズラと鶏の卵の孵化
<ol><li>それぞれ、3 と 8 日間ウズラ (について) と鶏 (ギャラス) 受精卵をインキュベートしてください。<ol>
<li>空気室 (卵の鈍い端) 38 ° C で加湿のインキュベーターで上向きに卵を配置します。</li>
		<li>この実験を実行するのに約 20 のウズラの卵と 40 の鶏の卵を使用します。 注: 初めてこの手順を確立するとき、これらの番号を倍増する必要があります。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 胸腺、副甲状腺の基礎の推定領域を含むウズラ胚領域の分離
メモ: 実行卵水平層流フードと滅菌器具と材料を使用して無菌状態で操作手順。
<ol><li>について大規模なホウケイ酸ガラスのボウルを準備 3/4 冷たいリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 液でいっぱい。</li>
	<li>シェルをタップ、曲線はさみでその鈍い端の反対側に円形の開口部を切断して 3 日間の培養後ウズラ卵を開きます。慎重に殻の部分を削除し、胚を冷 PBS で満たされたガラス ボウルに転送します。</li>
	<li>E3 でウズラ (q) 胚を保持 (qE3) (鶏の HH ステージ 21 に対応するウズラ ステージ) 細い鉗子の助けを借りて。曲線はさみを使用して卵黄を包み込む膜の膜へのカットをします。胚体外血管の周囲に外部から前後をカットし続けます。</li>
	<li>転送小さい胚ボウル 3/4 細い鉗子の助けを借りて冷 PBS でいっぱい。接続されている残りの卵黄から胚を徹底的に洗います。</li>
	<li>スキマーを使用して 100 ミリメートルのガラス シャーレと黒のベースに胚を転送する (材料の表を参照してください) 10 mL の冷 PBS を含みます。</li>
	<li>ペトリ皿を顕微鏡の下に配置します。 注: このポイントから、進歩的な倍率の顕微鏡下マイクロサージェリー手順を実行します。照明のソースとしては、限られた熱負荷を考慮した、顕微鏡や光ファイバーを組み込んだ LED ライトを使用することをお勧めします。</li>
	<li>薄い昆虫ピンとプレートの底に胚を保持します。胚体外域正方形の形成 4 本のピンを配置します。</li>
	<li>細い鉗子の助けを借りて、頭部領域の胚体外膜を外し、そこに 5 ピンを配置します。 注: 胚が正しく配置されている場合、耳胞、心臓の管と 1st、2ndと 3rd咽頭アーチ (PAs) が表示されます。</li>
	<li>時空警察ヴェッカーシグナ目はさみを使用しての関心、すなわち、3rd 4thの咽頭アーチ領域 (3/4PAR)、萌芽期の地域を分析します。<ol>
<li>長手方向と平行に体節神経・ チューブ領域と PAs の間の胚軸切断を開始します。</li>
		<li>それを切断することによって腹位置中心の管を削除します。同じ位置にはさみを維持する、カットの方向によると胚を再配置するシャーレを回転させます。</li>
		<li>2ndと 3rd PAs の間と 4thペンシルバニアの下カットします。</li>
		<li>細い鉗子の助けを借りて 3/4PAR から残りの膜をデタッチします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>隔離されたティッシュ (3/4PAR) と冷 PBS 2 mL 滅菌プラスチック ピペットを使用して 3/4 ガラスの皿に満ちて転送を吸い出しなさい。 注: 以下、組織 h 48 まで育てられた生体外ですることができます。 または E8 でニワトリ胚のカムに接木されるすぐに。</li>
	<li>生体外の試金の準備の間に氷の上分離 3/4PAR を含むガラスの皿を保ちます。</li>
</ol>3 切片培養の試金: 胸腺、副甲状腺の基礎の推定領域を含む萌芽期の地域の文化。
<ol><li>10 %fbs と 1% ペニシリン/ストレプトマイシン RPMI 1640 培で培養液を準備します。 注: 可溶性の薬理学的試薬は媒体 (たとえば、LY 411.575 (Ly) ・ ディ ・ benzazepine または cyclopamine とビスモデギブ、ノッチとハリネズミ (Hh) シグナル伝達経路、それぞれを阻害する追加できます。この試金のため 3 Notch シグナルを阻害する Ly の 50-200 nM または・ ディ ・ benzazepine の 5-15 μ M を使用して/4PAR. 3/4PAR5Hh シグナルを抑制する cyclopamine の 20 μ M またはビスモデギブの 10 μ M を使用します。</li>
	<li>6 ウェル プレートで 3/4 pp 外植体の in vitro文化を準備します。<ol>
<li>5 ml の培地の 6 ウェル プレートから 1 つの井戸を埋めます。24 ミリメートル ポリカーボネート膜挿入の場所 (材料表参照) 細い鉗子の助けを借りても。</li>
		<li>、実体顕微鏡下で 3/4PAR 外植体ガラス皿からに転送膜表面移植スプーン (またはヘラ) の助けを借りてをスライドさせて、と薄い鉗子。腹側と背側膜外植片を配置します。膜挿入ごとに最大 7 つの植を追加します。3.4 の手順に進みます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>また、文化外植体膜フィルターを浮<ol>
<li>35 mm 5 ml の培地のシャーレを準備します。細い鉗子、フロート膜フィルター (材料の表を参照) と乾燥空気との接触を保つための助けを借りて。</li>
		<li>、実体顕微鏡下で 3/4PAR 植から転送ガラス皿をメンブラン フィルター移植スプーン (またはヘラ) の助けを借りて穏やかなスライドし、薄い鉗子。腹側と背側膜外植片を配置します。メンブレン フィルターあたり最大 8 植を追加します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>植 3.2 と 3.3 5% CO2と 37 ° C で加湿のインキュベーターでの手順で準備して慎重に置きます。</li>
	<li>48 時間の潜伏期間の後に、インキュベーターから 6 ウェル プレートと 35 mm のペトリ皿を削除します。<ol>
<li>6 ウェル プレートの膜挿入から培養植を収集します。<ol>
<li>常温 (RT) 膜挿入に PBS を追加します。</li>
			<li>2 mL 滅菌プラスチック ピペットを使用して積極的なフラッシュによって膜から植をデタッチします。</li>
			<li>ヘラと細い鉗子の助けを借りて、転送した PBS でいっぱい 3/4 ガラスの皿に培養の植</li>
		</ol>
</li>
		<li>同様に、35 mm のペトリ皿でフローティングの膜フィルターから培養植を収集します。<ol>
<li>室温 PBS でいっぱい新しい 35 mm のペトリ皿に細い鉗子でメンブラン フィルターを転送します。</li>
			<li>2 mL の滅菌プラスチック ピペットを使用する積極的なピペッティングしてメンブレン フィルターから植をデタッチします。</li>
			<li>細い鉗子の助けを借りて、それを接続外植片が残存していないことを確認した後植無料メンブラン フィルターを放電します。</li>
			<li>ヘラと細い鉗子、外植片を室温 PBS でいっぱいガラス皿に転送します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>総 RNA の隔離のための試薬 1 mL にヘラで培養植を転送し、遺伝子発現の研究で使用します。 注意:この試薬への暴露は、深刻な健康被害をすることができます (材料の表を参照してください)。適切な保護眼鏡、衣類および手袋を着用します。取扱説明書に従うし、製造元から提供された安全性データシートを読みます。</li>
	<li>また、E8 で鶏胚のカムに培養組織を移植します。手順 4 に従ってください。</li>
</ol>4. カムの準備
<ol><li>インキュベーターから萌芽期の開発の 8 日間で鶏の卵を削除します。 注: 卵加湿のインキュベーターで 38 ° C で上向きに直面している空気室で培養。</li>
	<li>シェルの部分が空気室に陥るを防ぐために透明なプラスチック テープで卵の鈍端をカバーします。シェルをタップし、曲線はさみで卵円形の開口部をカットします。空気室が表示されます。</li>
	<li>細い鉗子で空気室の白い膜を慎重に削除します。カムは、表示され、異所性組織移植のアクセスです。 注: は、PBS をスライドさせ、外植片の存在を促進するため、カムを移植、前後に水和物に PBS を使用しないでください。膜が乾く場合は、卵を破棄します。</li>
</ol>5. カムに培養外植片の移植
<ol><li>ホルダーに microscalpel カムの小さい船の小血管病変/傷を作成します。 注: は、余分な出血の場合毛管現象によって血液を削除するのにパスツール ピペットの先端を使用します。</li>
	<li>ヘラと細い鉗子を使用して、カムの負傷者の領域に培養外植体を転送します。</li>
	<li>外植体よりわずかに大きいフィルター紙の一部をカットし、外植体の上に置きます。 注: フィルター ペーパー カムに開発後植場所を追跡ことができます。また、許可外植体への毎日の薬物送達ovo で開発中に必要な場合 (5.6 の手順で説明します)。</li>
	<li>透明なプラスチック テープで卵ウィンドウを密封し、木炭ペンシルを使用してそれを識別します。 注: プラスチック テープは、潜伏期間中に脱水から胚を保護します。</li>
	<li>38 ° C で加湿のインキュベーターで 10 日間の操作の卵を孵化させなさい手順 6 に従ってください。</li>
	<li>オプションのステップ: 毎日潜伏期間薬剤投与。<ol>
<li>フィルターにアクセスするため部分的にプラスチック テープを持ち上げて取り外します。一滴ずつ紙の上に薬液の 100 μ L を追加します。ウィンドウを再シールし、38 ° C で加湿のインキュベーターに卵を置き 注: この試金のため cyclopamine の 20 μ M の用量が抑制 Hh がovo で開発5時伝達します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6 Ovo の開発の 10 日後、カム異所性器官形成
<ol><li>培養 10 日後卵をインキュベーターから削除し、慎重にプラスチック テープを撤回します。</li>
	<li>小さなガラスにろ紙をカム派生植ボウル 3/4 冷 PBS でいっぱい曲線はさみと転送を使用して、フィルター領域の周りには、カムをカットします。</li>
	<li>細い鉗子の助けを借りて、10 mL の PBS を含むブラック ベースで 100 mm のペトリ皿にカム由来外植体を転送します。フィルター紙と時空警察ヴェッカーシグナ目はさみや細い鉗子を使用して膜の過剰を慎重に取り外します。</li>
	<li>カム外植体を固定液に転送 (3.7 %pbs で PFA) スキマーで。大きなはさみの助けを借りて、胎児の頸部の正確なカットすることによって、卵から削除せず鶏胚を安楽死させます。</li>
	<li>従来の組織および免疫組織化学によってカム派生植のパラフィン切片における器官形成を評価します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nogent+Institute-50+years+of+embryology.">The Nogent Institute-50 years of embryology.</a> Int J Dev Biol. 49 (2-3), 85-103 (2005).</li><li>Chuong, C. M., Wu, P., Plikus, M., Jiang, T. X., Bruce Widelitz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+stem+cells+into+organs:+topobiological+transformations+demonstrated+by+beak,+feather,+and+other+ectodermal+organ+morphogenesis.">Engineering stem cells into organs: topobiological transformations demonstrated by beak, feather, and other ectodermal organ morphogenesis.</a> Curr Top Dev Biol. 72, 237-274 (2006).</li><li>Davey, M. G., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chicken+as+a+model+for+embryonic+development.">The chicken as a model for embryonic development.</a> Cytogenet Genome Res. 117 (1-4), 231-239 (2007).</li><li>Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chicken+chorioallantoic+membrane+model+in+biology,+medicine+and+bioengineering.">The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering.</a> Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).</li><li>Figueiredo, M., Silva, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+and+Hedgehog+in+the+thymus/parathyroid+common+primordium:+Crosstalk+in+organ+formation.">Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation.</a> Dev Biol. 418 (2), 268-282 (2016).</li><li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+6+-+Recent+Advances+in+Developmental+Biology.">Chapter 6 - Recent Advances in Developmental Biology.</a> Scientific Frontiers in Developmental Toxicology and Risk Assessment. , (2000).</li><li>Moura, R. S., Coutinho-Borges, J. P., Pacheco, A. P., Damota, P. O., Correia-Pinto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+signalling+pathway+in+the+developing+chick+lung:+expression+and+inhibition+studies.">FGF signalling pathway in the developing chick lung: expression and inhibition studies.</a> PLoS One. 6 (3), e17660 (2011).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J. Morphol. 88, 49-92 (1951).</li><li>Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelio-mesenchymal+interactions+are+critical+for+Quox+7+expression+and+membrane+bone+differentiation+in+the+neural+crest+derived+mandibular+mesenchyme.">Epithelio-mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme.</a> EMBO J. 10 (9), 2387-2393 (1991).</li><li>Maeda, Y., Noda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+development+of+embryonic+long+bone+on+chorioallantoic+membrane+in+ovo+prevents+perichondrium-derived+suppressive+signals+against+cartilage+growth.">Coordinated development of embryonic long bone on chorioallantoic membrane in ovo prevents perichondrium-derived suppressive signals against cartilage growth.</a> Bone. 32 (1), 27-34 (2003).</li><li>Ishida, K., Mitsui, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+bioengineered+feather+buds+on+a+reconstructed+chick+skin+from+dissociated+epithelial+and+mesenchymal+cells.">Generation of bioengineered feather buds on a reconstructed chick skin from dissociated epithelial and mesenchymal cells.</a> Dev Growth Differ. 58 (3), 303-314 (2016).</li><li>Le Douarin, N. M., Jotereau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+of+cells+of+the+avian+thymus+trough+embryonic+life+in+interspecific+chimeras.">Tracing of cells of the avian thymus trough embryonic life in interspecific chimeras.</a> J. Exp. Med. 142, 17-40 (1975).</li><li>Farley, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+thymus+organogenesis+and+colonization+in+early+human+development.">Dynamics of thymus organogenesis and colonization in early human development.</a> Development. 140, 2015-2026 (2013).</li><li>Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gcm2+and+Foxn1+mark+early+parathyroid-+and+thymus-specific+domains+in+the+developing+third+pharyngeal+pouch.">Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal pouch.</a> Mech Dev. 103, 141-143 (2001).</li><li>Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Bmp4+signalling+in+the+epithelial-mesenchymal+interactions+that+take+place+in+early+thymus+and+parathyroid+development+in+avian+embryos.">Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos.</a> Dev Biol. 361 (2), 208-219 (2012).</li><li>Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DiGeorge+syndrome+phenotype+in+mice+mutant+for+the+T-box+gene,+Tbx1.">DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1.</a> Nat Genet. 27 (3), 286-291 (2001).</li><li>Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+Bmp4+from+the+Tbx1+expression+domain+causes+abnormal+pharyngeal+arch+artery+and+cardiac+outflow+tract+remodeling.">Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling.</a> Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).</li><li>Zou, D., Silvius, D., Davenport, J., Grifone, R., Maire, P., Xu, P. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+of+the+third+pharyngeal+pouch+into+thymus/parathyroid+by+Six+and+Eya1.">Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1.</a> Dev Biol. 293 (2), 499-512 (2006).</li><li>Uematsu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+in+ovo.+chorioallantoic+membrane+engraftment+to+culture+testes+from+neonatal+mice.">Use of in ovo. chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice.</a> Comp Med. 64 (4), 264-269 (2014).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

このメソッドの成功のための重要な側面は、ニワトリおよびウズラの両方の品質の卵。Ovoアッセイ、鶏の卵の質の良い、特に中に、長い潜伏期間の向上を考慮した生存率はプロシージャの最後で (90% 以下)。これを達成するために、別の業者から卵をテストします。長時間非操作の卵を孵化させなさい (最大 16-17 日) とその開発をチェックします。質の良いバッチを考えられる胚の 80% ?...

鳥類胚は、種子発達生物学で広く使用されています。鳥のモデルの主な利点は、卵、胚、マイクロマニピュレーションを実行する能力に比較的簡単にアクセスを開く可能性を含まれます。いくつかの例は細胞運命1カム1,3、異所性の細胞構造の成長と胚2、特定の成長因子の応用を勉強するためクラシック ウズラ鶏キメラ システムを構成します。 4。
器官形成の段階に新たな洞察を得る、萌芽期ティッシュ5体外操作と接木技術を組み合わせた方法最近開発しました。2 段階のアプローチにより、差別と探査の両方 - と後期 - の初期段階器官形成、非常にダイナミックで複雑な組織の相互作用2のために制限されます。さらに、適切な組織特異的マーカーの欠乏頻繁の使用を制限遺伝子組み換え動物モデル6。この 2 段階のアプローチ法は主としてこのような制限を克服します。
最初のステップで、器官形成の初期段階を研究するには、将来の臓器の原基を構成するウズラ胚領域は分離、48 時間培養切片システムで栽培します。この期間中に特定のシグナル伝達経路の薬理学的変調は培養培地5,7に薬を追加することによって実行できます。さらに、培養組織が体外で成長のあらゆる段階で収集され遺伝子発現プローブ ( qPCR、マイクロ アレイなどのメソッドを使用して)。
2 番目の手順では、48 h 培養組織が、接ぎ木 (cE8) (E) 8 日 (c) 鶏胚のカム (ハンバーガーとハミルトン (HH)-33-35 の段階)8。カムは栄養素の血管サプライヤーとして動作し、ガス交換1,3,4移植組織を有効にその開発ovo で時間の長い期間のためにことができます。この実験の手順は特に適しています器官形成の後期段階を研究するovo で開発5,9,10,11 の 10 日後、完全に形成された器官を得ることができるよう.形態素解析は簡単に適切な器官形成を確認する従来の組織によって実行され、(すなわち、MAb ウズラ核 (QCPN)) 特異的抗体を用いた免疫組織化学によってドナー細胞の起源を識別できます。カムの潜伏期間中に、移植できる薬理学的エージェントの存在下で成長してがも、器官形成の進行を評価するための開発のあらゆる段階で収集します。
深さで、ここで説明されている 2 段階のアプローチは、フィゲイレドらですでに採用されています。5鳥副甲状腺/胸腺共通原基開発を探検します。したがって、以下、萌芽期の地域の固有の特性と、胸腺・副甲状腺腺の器官形成に関与する開発の段階の設定が表示されます。
胸腺と副甲状腺腺上皮、咽頭の袋の内胚葉からも機能的に異なるを派生すると (PP)12。鳥、これらの器官の上皮に属します、3 番目と 4 番目 PP 内胚葉 (3/4 pp)12、哺乳類で、3PP から派生する胸腺の上皮と副甲状腺腺上皮に由来する 3PP と 3/4 pp マウスと人間、それぞれ13,14。
これらの器官の形成の初期の段階の一つは、離散胸腺・副甲状腺ドメイン共通の原基での登場です。鶏、E4.515、特定の分子マーカーの in situハイブリダイゼーションによるこれらのドメインを識別できます。開発が進むにつれて、これらの器官の基礎が個性し、神経堤由来細胞によって形成される薄い葉カプセル (E5; でそれらを囲む中咽頭から分離HH-stage 27)。後に、胸腺の上皮は造血前駆細胞 (E6.5; で植民地化します。HH-stage 30)12。
古典的なウズラ鶏研究1,12のように 2 段階のアプローチ、すなわち胸腺5リンパ ・造血器官の形成を研究に便利です。移植し、器官原基で、ウズラが外植体として鶏血液媒介性前駆細胞浸潤ウズラ胸腺上皮相手造血前駆細胞の植民地化前に鶏胚におけるキメラ胸腺が形成されて。このメソッドは、したがって、鳥の血液・ リンパ系の開発で造血細胞の貢献を探索する便利なツールです。

<table><tbody><tr><td>Chicken fertilized eggs (&lt;em&gt;Gallus gallus&lt;/em&gt;)</td><td>Pintobar, Portugal</td><td></td><td>Poultry farm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Quail fertilized eggs (&lt;em&gt;Coturnix coturnix&lt;/em&gt;)</td><td>Interaves, Portugal</td><td></td><td>Bird farm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>15 mL PP centrifuge tubes</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>50 mL PP centrifuge tubes</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>60 x 20 mm pyrex dishes</td><td>Duran group</td><td>21 755 41</td><td></td></tr><tr><td>100 x 20 mm pyrex dishes</td><td>Duran group</td><td>21 755 48</td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonate Membrane Insert&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>3412</td><td>24 mm transwell with 0.4 mm Pore Polycarbonate Membrane Insert&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Membrane filter</td><td>Millipore</td><td>DTTP01300</td><td>0.6 mm Isopore membrane filter</td></tr><tr><td>6-well culture plates</td><td>Nunc, Thermo Fisher Scientific</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish, 35 x 10 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5112&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex bowls</td><td></td><td></td><td>from supermarket&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Transfer pipettes</td><td>Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific</td><td>2041S</td><td>2 mL plastic pipet</td></tr><tr><td>Glass pasteur pipette</td><td>normax</td><td>5426015</td><td></td></tr><tr><td>Whatman&amp;nbsp;qualitative filter paper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA1001090</td><td>Filter paper</td></tr><tr><td>Clear plastic tape</td><td></td><td></td><td>from supermarket&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5</td><td>BMA Biomedicals</td><td>T-1302</td><td></td></tr><tr><td>Cyclopamine hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4116</td><td>Pharmacological inhibitor of Hh signalling</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Standart FBS</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>GIBCO, Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>QCPN antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>QCPN</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement&amp;nbsp;</td><td>GIBCO, Thermo Fisher Scientific</td><td>61870010</td><td></td></tr><tr><td>Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit</td><td>ELKEM/Silmid</td><td>RH141001KG</td><td>To prepare the back base for petri dish</td></tr><tr><td>Stemolecule LY411575</td><td>Stemgent</td><td>04-0054</td><td>Pharmacological inhibitor of Notch signalling</td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td>Reagent for total RNA isolation</td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30&amp;nbsp;</td><td>Thin forceps</td></tr><tr><td>Extra fine Bonn scissors, curved</td><td>Fine Science Tools</td><td>14085-08</td><td>Curved scissors</td></tr><tr><td>Insect pins&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>26001-30</td><td></td></tr><tr><td>Micro spatula&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>10087-12</td><td>Transplantation spoon</td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td>Microscalpel</td></tr><tr><td>Moria Nickel Plated Pin Holder</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td>Holder</td></tr><tr><td>Moria Perforated Spoon</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-17</td><td>Skimmer</td></tr><tr><td>Wecker Eye Scissor</td><td>Fine Science Tools</td><td>15010-11</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Leica Microsystems&amp;nbsp;</td><td>MC170 HD</td><td></td></tr><tr><td>Stereoscope</td><td>Leica Microsystems&amp;nbsp;</td><td>Leica M80</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica Microsystems&amp;nbsp;</td><td>DM2500</td><td></td></tr></tbody></table>

two-step approach to explore early- and late-stages of organ formation in the avian model: the thymus and parathyroid glands organogenesis paradigm

鳥類胚実験モデルとしてされている精液の発見の最も重要な発生生物学。いくつかのアプローチ、ウズラ鶏キメラ形成および漿膜 (CAM) の最後の世紀に戻る日を異所性組織の開発を維持するために使用です。今日では、最近の in vitro方法論とこれらの古典的な手法の組み合わせはさらに器官形成を探索する新しい見通しを提供しています。
ここ初期- と - の後期段階の器官形成を研究する 2 段階のアプローチを記述します。簡単に言えば、臓器の推定領域を含む萌芽期の地域は (48 h) 最大の器官システムでウズラ胚および成長の in vitroから分離されます。培養組織にその後鶏胚のカムに接木されます。Ovo の開発の 10 日後、完全に形成された臓器は移植組織から取得されます。このメソッドでは、薬理学的エージェントの通常の管理と生体外でそしてovo発達ステップ全体にわたって組織遺伝子操作によるシグナル伝達経路の調節もできます。さらに、組織の開発は遺伝子発現プロファイル (量的な PCR (qPCR)、マイクロ アレイ等を用いた)、形態 (従来の組織像と免疫評価) を分析する任意の期間で収集できます。
外に完全に形成された器官形成の初期段階と機能の器官からの鳥の胎児の器官形成に従うツールとして記述されていた実験プロシージャを使用できます。

上記のプロトコルの詳細調査の両方 - と後半-初期頻繁複雑な細胞および分子相互作用によって限られる器官形成を可能にするメソッド。
以前フィゲイレードらの手法は5ノッチと Hh 鳥副甲状腺/胸腺共通原基開発におけるシグナル伝達の役割を解明します。
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-pa...

Watch this Scientific Journal Video about Two-step Approach to Explore Early- and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm at JoVE.co

Two-step Approach to Explore Early- and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm

初期と後期-段鳥モデルにおける器官形成を探索する 2 段階のアプローチ: 胸腺、副甲状腺腺器官パラダイム

この資料では、新規生体外でそしてovo実験手順を組み合わせることによって器官の形成を研究する古典的なウズラ鶏キメラ システムへの更新されたアプローチを提供します。

The avian embryo, as an experimental model, has been of utmost importance for seminal discoveries in developmental biology. Among several approaches, the ...

two-step-approach-to-explore-early-late-stages-organ-formation-avian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.4K ビュー.  Universidade de Lisboa. この資料では、新規生体外でそしてovo実験手順を組み合わせることによって器官の形成を研究する古典的なウズラ鶏キメラ システムへの更新されたアプローチを提供します。

ビデオ: Two-step Approach to Explore Early- and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse this scaffold in a highly coordinated temporal and spatial order while sequentially passing obligatory check points, i.e., T cell lineage commitment, followed by T cell receptor repertoire generation and selection prior to their export into the periphery. The two major resident cell types forming this scaffold are cortical (cTECs) and medullary thymic epithelial cells (mTECs). A key feature of mTECs is the so-called promiscuous expression of numerous tissue-restricted antigens. These tissue-restricted antigens are presented to immature thymocytes directly or indirectly by mTECs or thymic dendritic cells, respectively resulting in self-tolerance.
Suitable in vitro models emulating the developmental pathways and functions of cTECs and mTECs are currently lacking. This lack of adequate experimental models has for instance hampered the analysis of promiscuous gene expression, which is still poorly understood at the cellular and molecular level. We adapted a 3D organotypic co-culture model to culture ex vivo isolated mTECs. This model was originally devised to cultivate keratinocytes in such a way as to generate a skin equivalent in vitro. The 3D model preserved key functional features of mTEC biology: (i) proliferation and terminal differentiation of CD80lo, Aire-negative into CD80hi, Aire-positive mTECs, (ii) responsiveness to RANKL, and (iii) sustained expression of FoxN1, Aire and tissue-restricted genes in CD80hi mTECs.

Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein - a modified skin organotypic culture model - has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression.

髄質胸腺上皮細胞の増殖、分化および無差別遺伝子発現を支える3D器官共培養モデル

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

発生生物学

Quantitative Analysis of Cancer Metastasis using an Avian Embryo Model

During metastasis cancer cells disseminate from the primary tumor, invade into surrounding tissues, and spread to distant organs. Metastasis is a complex process that can involve many tissue types, span variable time periods, and often occur deep within organs, making it difficult to investigate and quantify. In addition, the efficacy of the metastatic process is influenced by multiple steps in the metastatic cascade making it difficult to evaluate the contribution of a single aspect of tumor cell behavior. As a consequence, metastasis assays are frequently performed in experimental animals to provide a necessarily realistic context in which to study metastasis. Unfortunately, these models are further complicated by their complex physiology. The chick embryo is a unique in vivo model that overcomes many limitations to studying metastasis, due to the accessibility of the chorioallantoic membrane (CAM), a well-vascularized extra-embryonic tissue located underneath the eggshell that is receptive to the xenografting of tumor cells (figure 1). Moreover, since the chick embryo is naturally immunodeficient, the CAM readily supports the engraftment of both normal and tumor tissues. Most importantly, the avian CAM successfully supports most cancer cell characteristics including growth, invasion, angiogenesis, and remodeling of the microenvironment. This makes the model exceptionally useful for the investigation of the pathways that lead to cancer metastasis and to predict the response of metastatic cancer to new potential therapeutics. The detection of disseminated cells by species-specific Alu PCR makes it possible to quantitatively assess metastasis in organs that are colonized by as few as 25 cells. Using the Human Epidermoid Carcinoma cell line (HEp3) we use this model to analyze spontaneous metastasis of cancer cells to distant organs, including the chick liver and lung. Furthermore, using the Alu-PCR protocol we demonstrate the sensitivity and reproducibility of the assay as a tool to analyze and quantitate intravasation, arrest, extravasation, and colonization as individual elements of metastasis.

Using quantitative PCR, we demonstrate how the well-established chick CAM model can be used to quantitatively analyze the metastasis of human tumor cells to distant organs.

鳥類胚のモデルを使用して、がんの転移の定量的解析

During metastasis cancer cells disseminate from the primary tumor, invade into surrounding tissues, and spread to distant organs. Metastasis is a complex ...

医学

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).

This video demonstrates the dissection and removal of the fetal thymus as well the preparation of ex vivo cultures of 2-dGuo-treated thymus.

2 - dGuo処理した胸腺器官培養の準備

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

生物学

Isolation of Embryonic Tissues and Formation of Quail-Chicken Chimeric Organs Using The Thymus Example

The capacity to isolate embryonic tissues was an essential step for establishing the quail-chicken chimera system, which in turn has provided undisputed contributions to unveiling key processes in developmental biology.
Herein is described an optimized method to isolate embryonic tissues from quail and chickens by microsurgery and enzymatic digestion while preserving its biological properties. After isolation, tissues from both species are associated in an in vitro organotypic assay for 48 h. Quail and chicken tissues can be discriminated by distinct nuclear features and molecular markers allowing the study of the cellular cross-talk between heterospecific association of tissues. This approach is, therefore, a useful tool for studying complex tissue interactions in developmental processes with highly dynamic spatial modifications, such as those occurring during pharyngeal morphogenesis and the formation of the foregut endoderm-derived organs. This experimental approach was first developed to study the epithelial-mesenchymal interactions during early-stages of thymus formation. In this, the endoderm-derived prospective thymic rudiment and mesoderm-derived mesenchyme, were isolated from quail and chicken embryos, respectively.
The capacity of the associated tissues to generate organs can be further tested by grafting them onto the chorioallantoic membrane (CAM) of a chicken embryo. The CAM provides nutrients and allows gas exchanges to the explanted tissues. After 10 days of in ovo development, the chimeric organs can be analyzed in the harvested explants by conventional morphological methods. This procedure also allows studying tissue-specific contributions during organ formation, from its initial development (in vitro development) to the final stages of organogenesis (in ovo development).
Finally, the improved isolation method also provides three-dimensionally (3D) preserved embryonic tissues, that can also be used for high-resolution topographical analysis of tissue-specific gene-expression patterns.

This article provides a method to isolate pure embryonic tissues from quail and chicken embryos that can be combined to form ex vivo chimeric organs.

萌芽期ティッシュと胸腺の例を使用してウズラ鶏キメラ器官の形成の分離

The capacity to isolate embryonic tissues was an essential step for establishing the quail-chicken chimera system, which in turn has provided undisputed ...

Creating Avian Forebrain Chimeras to Assess Facial Development

The avian embryo has been used as a model system for more than a century and has led to fundamental understanding of vertebrate development. One of the strengths of this model system is that the effect of, and interaction among, tissues can be directly assessed in chimeric embryos. We have previously shown that signals from the forebrain contribute to facial morphogenesis by regulating the shape of the expression domain of Sonic hedgehog (SHH) in the Frontonasal Ectodermal Zone (FEZ). In this article, the method of generating the forebrain chimeras and provide illustrations of the outcomes of these experiments is described.

This article describes a tissue transplantation technique that was designed to test the signaling and patterning properties of basal forebrain&#160;during craniofacial development.

顔の発達を評価するための鳥類前脳キメラの作成

The avian embryo has been used as a model system for more than a century and has led to fundamental understanding of vertebrate development. One of the ...

鳥類胚性皮膚外植片培養プロトコルの包括的なレビュー

Using Avian Skin Explants to Study Tissue Patterning and Organogenesis

The developing avian skin during embryogenesis is a unique model that can provide valuable insights into tissue patterning. Here three variations on skin explant cultures to examine different aspects of skin development are described. First, ex vivo organ cultures and manipulations offer researchers opportunities to observe and study the development of feather buds directly. Skin explant culture can grow for 7 days enabling direct analysis of cellular behavior and 4D imaging at intervals during this growth period. This also allows for physical and molecular manipulations of culture conditions to visualize tissue response. For example, growth factor-coated beads can be applied locally to induce changes in feather patterning in a limited area. Alternatively, viral transduction can be delivered globally in the culture media to up or downregulate gene expression. Second, the skin recombination protocol allows researchers to investigate tissue interactions between the epidermis and mesenchyme that are derived from different skin regions, different life stages, or different species. This affords an opportunity to test the time window in which the epithelium is competent to respond to signals and its ability to form different skin appendages in response to signals from different mesenchymal sources. Third, skin reconstitution using dissociated dermal cells overlaid with intact epithelium resets skin development and enables the study of the initial processes of periodic patterning. This approach also enhances our ability to manipulate gene expression among the dissociated cells before creating the reconstituted skin explant. This paper provides the three culture protocols and exemplary experiments to demonstrate their utility.

著者スポットライト:現在の実験的鳥類皮膚外植片方法論への洞察

Here we describe protocols for three types of avian embryonic skin explant cultures that can be used to examine tissue interactions, 4D imaging timelapse movie (3D plus time), global or local perturbation of molecular function, and systems biology characterization.

鳥類の皮膚外植片を用いた組織パターン形成と器官形成の研究

The developing avian skin during embryogenesis is a unique model that can provide valuable insights into tissue patterning. Here three variations on skin ...

<meta charset="utf8"></head><body>iPS細胞由来オルガノイドによる胸腺微小環境の再現

Formation of Human Thymus Organoids in Three-Dimensional Fibrin Hydrogels

Generation of a functional and self-tolerant T cell repertoire is a complex process dependent on the thymic microenvironment and, primarily, on the properties of its extracellular matrix (ECM). Thymic epithelial cells (TECs) are crucial in thymopoiesis, nurturing and selecting developing T cells by filtering self-reactive clones. TECs have been empirically demonstrated to be particularly sensitive to physical and chemical clues supplied by the ECM and classical monolayer cell culture leads to a quick loss of functionality until their death. Because of this delicate maintenance combined with relative rarity, and despite the high stakes in modeling thymus biology in vitro, models able to faithfully mimic the TEC niche at scale and over time are still lacking. Here, we describe the formation of a multicellular human thymic organoid model, in which the TEC compartment is derived from human induced pluripotent stem cells (iPSC) and reaggregated with primary early thymocyte progenitors in a three-dimensional (3D) fibrin-based hydrogel. This model answers current needs for a scalable culture system that reproduces the thymic microenvironment ex vivo and demonstrates functionality, i.e., the ability to produce T cells and to support thymus organoid growth over several weeks. Thus, we propose a practical in vitro model of thymus functionality through iPSC-derived organoids that would benefit research on TEC biology and T cell generation ex vivo.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:ヒト胸腺オルガノイドによる胸腺上皮細胞とT細胞研究の進歩

Here, we describe a protocol for the formation of human iPSC-derived thymus organoids grown in 3D fibrin hydrogels aiming to support thymic epithelial cell (TEC) maturation and prolonged maintenance, as well as thymopoiesis in vitro.

三次元フィブリンハイドロゲルにおけるヒト胸腺オルガノイドの形成

Generation of a functional and self-tolerant T cell repertoire is a complex process dependent on the thymic microenvironment and, primarily, on the ...

初期と後期-段鳥モデルにおける器官形成を探索する 2 段階のアプローチ: 胸腺、副甲状腺腺器官パラダイム

要約

さらに動画を探す

この動画の章

髄質胸腺上皮細胞の増殖、分化および無差別遺伝子発現を支える3D器官共培養モデル

鳥類胚のモデルを使用して、がんの転移の定量的解析

2 - dGuo処理した胸腺器官培養の準備

萌芽期ティッシュと胸腺の例を使用してウズラ鶏キメラ器官の形成の分離

顔の発達を評価するための鳥類前脳キメラの作成

鳥類の皮膚外植片を用いた組織パターン形成と器官形成の研究

鳥類の皮膚外植片を用いた組織パターン形成と器官形成の研究

鳥類の皮膚外植片を用いた組織パターン形成と器官形成の研究

三次元フィブリンハイドロゲルにおけるヒト胸腺オルガノイドの形成

三次元フィブリンハイドロゲルにおけるヒト胸腺オルガノイドの形成